ISOLASI DNA DARI SAMPEL DAGING DAN SIRIP DELAPAN

SPESIES IKAN LAUT UNTUK PCR-RFLP

PUTRI EKANDINI

FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN

INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
 PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN SUMBER
INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA

Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Isolasi DNA dari
Sampel Daging dan Sirip Delapan Spesies Ikan Laut untuk PCR-RFLP adalah
benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan
dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang
berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari
penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di
bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, September 2014

Putri Ekandini
NIM B04100015
 ABSTRAK
PUTRI EKANDINI. Isolasi DNA dari Sampel Daging dan Sirip Delapan Spesies
Ikan Laut untuk PCR-RFLP. Dibimbing oleh KUSDIANTORO MOHAMAD dan
WAHONO ESTHI PRASETYANINGTYAS.

Penelitian ini bertujuan untuk membandingkan konsentrasi, tingkat

kemurnian, visualisasi elektroforesis, dan penggunaan DNA hasil isolasi untuk
polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-
RFLP) dari delapan spesies ikan laut. Sampel DNA yang diperoleh dari daging
dan sirip ikan baronang (Siganus javus), kerapu (Epinephelus sp), ekor kuning
(Caesionidae sp), kakap merah (Lutjanus campechanus), kurisi (Nemipterus
nematophorus), kue (Caranx melampygus), bawal hitam (Parastromateus niger),
dan selar (Selaroides leptolepis) diisolasi menggunakan metode presipitasi
amonium asetat. Primer universal sitokrom b digunakan untuk mengamplifikasi
mtDNA menggunakan PCR. Amplikon dipotong menggunakan enzim restriksi
Hinf I. Hasil menunjukkan bahwa konsentrasi dan kemurnian DNA sampel daging
dan sirip tidak berbeda nyata (P>0.05) yaitu berturut-turut 22.01±20.29 dan
1.44±0.27 untuk konsentrasi dan kemurnian DNA sampel daging, serta
52.86±41.37 dan 1.54±0.23 untuk konsentrasi dan kemurnian DNA sampel sirip.
Sampel DNA ikan laut dapat diisolasi dari seluruh sampel daging dan sirip tetapi
hanya satu sampel yaitu dari sirip ikan selar yang memiliki konsentrasi yang
tinggi (150.50 ng/μl) dan kemurnian yang baik (rasio A260/280=1.91) serta
menunjukkan hasil positif setelah PCR-RFLP dengan enzim Hinf I dan
menghasilkan dua pita dengan ukuran 332 bp dan 27 bp.

Kata kunci: DNA, ikan laut, kemurnian, konsentrasi, PCR-RFLP

 ABSTRACT

PUTRI EKANDINI. DNA Isolation from Meat and Fin of Eight Marine Fish
Specieses for PCR-RFLP. Supervised by KUSDIANTORO MOHAMAD and
WAHONO ESTHI PRASETYANINGYAS.

The aim of this research is to compare DNA concentration, purity,

electrophoresis visualization, and capability of DNA for polymerase chain
reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) analysis from
eight marine fishes. The DNA samples were isolated from meat and fin tissues of
streaked spinefoot (Siganus javus), grouper (Epinephelus sp), fusiliers
(Caesionidae sp), red snapper (Lutjanus campechanus), double whip thread fin
bream (Nemipterus nematophorus), trevally (Caranx melampygus), black pomfret
(Parastromateus niger), and yellow stripe scad (Selaroides leptolepis) fishes
using ammonium acetate precipitation method. Universal primer of cytochrome b
was used to amplify mtDNA using PCR and the amplicon was digested using
restriction enzyme Hinf I. The result showed that the average of concentration and
purity value of fish DNA were no different (P>0.05) between meat and fin
samples (22.29±20.29 and 1.44±0.27 for DNA concentration and purity value of
meat samples, respectively; and 52.86±41.37 and 1.54±0.23 for DNA
concentration and purity value of fin samples, respectively). Marine fish DNA
could be isolated from all samples but only one sample from fin of yellow striped
scad fish showed high concentration (150.50 ng/μl) with good purity
(A260/280=1.91) and this DNA was succesfully separated into two bands with
332 bp and 27 bp after PCR–RFLP using enzyme Hinf I.

Keywords: concentration, DNA, marine fish, PCR-RFLP, purity

ISOLASI DNA DARI SAMPEL DAGING DAN SIRIP DELAPAN
SPESIES IKAN LAUT UNTUK PCR-RFLP

PUTRI EKANDINI

Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Kedokteran Hewan pada
Fakultas Kedokteran Hewan

FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN

INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
 Judul Skripsi : Isolasi DNA dari Sampel Daging dan Sirip Delapan Spesies Ikan
Laut untuk PCR-RFLP
Nama : Putri Ekandini
NIM : B04100015

Disetujui oleh

Drh Kusdiantoro Mohamad, MSi PAVet Drh Wahono Esthi Prasetyaningtyas, MSi PAVet
Pembimbing I Pembimbing II

Diketahui oleh

Drh Agus Setiyono, MS PhD APVet

Wakil Dekan

Tanggal Lulus:
 PRAKATA

Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah Subhanahu Wa Ta’ala atas
segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Judul yang
dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan pada bulan Januari sampai Juli 2014
ini adalah Isolasi DNA dari Sampel Daging dan Sirip Delapan Spesies Ikan Laut
untuk PCR-RFLP.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Bapak Drh Kusdiantoro Mohamad,
MSi PAVet dan Ibu Drh Wahono Esthi Prasetyaningtyas, MSi PAVet selaku
pembimbing, Dr Drh Ita Djuwita, Mphil PAVet (K) (alm) yang telah merancang,
membimbing, dan memberikan bantuan dana penelitian, serta Dr Drh Ni Luh Putu
Ika Mayasari yang telah memberikan bantuan bahan penelitian. Di samping itu,
penghargaan penulis sampaikan kepada Wahyudin, Amd selaku staf Laboratorium
Embriologi Fakultas Kedokteran Hewan Institut Pertanian Bogor dan teman-
teman sesama penelitian (Dwi Budiono, Juita Siregar, Fitri Susana, Siti Khadijah,
Deny Putra Romadhon, dan Fatimah). Penulis menyadari bahwa penelitian ini
masih banyak kekurangan karena keterbatasan yang dimiliki. Oleh karena itu,
penulis sangat mengharapkan saran yang membangun untuk memperlancar dan
memperoleh hasil penelitian selanjutnya yang lebih baik.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.

Bogor, September 2014

Putri Ekandini
 DAFTAR ISI

DAFTAR TABEL xii

DAFTAR GAMBAR xii
DAFTAR LAMPIRAN xii
PENDAHULUAN 1
Latar Belakang 1
Tujuan Penelitian 2
Manfaat Penelitian 2
TINJAUAN PUSTAKA 2
Ikan Laut 2
Isolasi DNA 3
PCR-RFLP 3
Analisis Kuantitatif dan Kualitatif DNA 4
METODE 5
Tempat dan Waktu Penelitian 5
Bahan Penelitian 5
Alat Penelitian 6
Prosedur Penelitian 6
Pengumpulan Sampel 6
Isolasi DNA 6
Amplifikasi Fragmen DNA Mitokondria 7
Pemotongan Amplikon DNA 7
Visualisasi Hasil Isolasi Dengan Elektroforesis 7
Penghitungan Ukuran Fragmen Restriksi 7
Pengukuran Konsentrasi dan Kemurnian DNA 8
HASIL DAN PEMBAHASAN 8
Visualisasi DNA Hasil Isolasi 8
Konsentrasi dan Kemurnian DNA Hasil Isolasi 10
PCR-RFLP DNA Hasil Isolasi 11
SIMPULAN DAN SARAN 12
Simpulan 12
Saran 12
DAFTAR PUSTAKA 13
LAMPIRAN 16
 DAFTAR TABEL
1 Taksonomi delapan jenis ikan laut 2
2 Kualitas visualisasi hasil isolasi sampel daging dan sirip ikan laut 9
3 Konsentrasi dan kemurnian DNA yang dikoleksi dari berbagai jenis
ikan laut 10

DAFTAR GAMBAR
1 Visualisasi DNA hasil isolasi sampel daging dan sirip ikan laut pada gel
agarosa 0.8% dan 1% 8
2 Visualisasi amplikon DNA sirip ikan selar setelah PCR dengan primer
cyt b dan setelah PCR dilanjutkan dengan pemotongan dengan enzim
Hinf I 11

DAFTAR LAMPIRAN
1 Analisis ragam jumlah rata-rata konsentrasi sampel DNA daging dan
sirip ikan laut 16
2 Analisis ragam jumlah rata-rata tingkat kemurnian sampel DNA dan
sirip ikan laut 17
3 Perhitungan manual fragmen restriksi Hinf I ikan selar 18
 PENDAHULUAN
Latar Belakang

Identifikasi spesies ikan sangat penting terutama untuk menjaga

keberagaman jenis hewan, proses karantina, diagnostik klinik, dan kontrol sampel
makanan. Identifikasi spesies ikan dapat dilakukan menggunakan morfologi luar
seperti bentuk tubuh, pola dan warna, jumlah dan ukuran sisik, jumlah dan posisi
sirip, serta jumlah dan tipe sirip renang. Namun dengan keberagaman morfologi
yang ada akan menjadi sulit untuk mengidentifikasi dengan menggunakan
perbedaan morfologi saja. Terdapat keterbatasan untuk identifikasi spesies bahkan
dengan spesimen utuh, karena beberapa jenis ikan memiliki variasi atau perbedaan
yang kecil antar spesies. Selain itu, apabila salah satu ciri khas morfologi hilang
karena suatu proses (misal canning atau filetting), identifikasi akan semakin sulit
dilakukan (Teletchea 2009).
Indonesia memiliki kekayaan jenis ikan yang beragam. Terbukti bahwa
seperempat jenis ikan laut dan ikan air tawar dari seluruh dunia terdapat di
Indonesia, namun informasi mengenai variasi genetik jenis ikan di Indonesia
belum banyak dipelajari. Salah satu teknik untuk mengetahui data molekuler
spesies hewan adalah dengan menggunakan metode polymerase chain reaction-
restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP), karena menurut
Minarovic et al. (2010) penggunaan PCR pada DNA mitokondria merupakan
metode modern untuk mengidentifikasi spesies hewan.
Isolasi DNA merupakan tahap awal dari rangkaian berbagai teknologi
analisis DNA. Proses pemecahan membran sel dan membran inti dibutuhkan
untuk mengisolasi DNA kemudian dilanjutkan dengan pemisahan DNA dari
berbagai komponen sel lain. Pada saat melakukannya, DNA harus dijaga agar
tidak rusak dan dalam bentuk rantai panjang (Fatchiyah et al. 2011).
Isolasi DNA digunakan dalam berbagai macam aplikasi sains, medis, dan
forensik. Isolat DNA asal hewan atau tumbuhan dapat dimanfaatkan untuk
analisis single nucleotide polymorphism (SNP), analisis metilasi DNA, copy
number variation (CNV) atau comparative genomic hybridization (CGH), PCR,
dan lain-lain. Banyak penelitian telah dilakukan dengan berbagai metode isolasi
DNA dengan kualitas dan kuantitas DNA yang berbeda-beda.
Berbagai macam sampel jaringan dapat digunakan untuk mengisolasi DNA
dari ikan antara lain daging (Saputra 2009), sirip dan sisik (Wasko et al. 2003),
mukus (Vin et al. 2011), serta darah (Turtinen dan Juran 1998). Metode
pengambilan sampel untuk isolasi DNA terbagi menjadi metode invasif dan non
invasif. Metode non invasif dalam pengambilan sampel DNA akan menghindari
kerusakan komoditas. Jenis sampel yang termasuk non invasif pada ikan yaitu
sisik, sirip, dan mukus. Pada mamalia dan unggas, sampel yang umum digunakan
dengan metode non invasif yaitu folikel rambut, buccal swab, dan urin.
Penelitian ini dilakukan untuk mengisolasi DNA dari ikan laut
menggunakan sampel daging dan sirip dengan metode presipitasi amonium asetat
berdasarkan pada Sambrook et al. (1982). DNA hasil isolasi dari sampel daging
dan sirip akan diperbandingkan, kemudian konsentrasi dan tingkat kemurniannya
dihitung menggunakan spektrofotometer. Sampel DNA yang telah diisolasi dapat
digunakan untuk berbagai macam uji seperti analisis hewan purba dan DNA
2

barcoding (Teletchea 2009), serta PCR–RFLP untuk identifikasi spesies (Wolf et

al. 1999).

Tujuan Penelitian

Tujuan dari penelitian ini adalah membandingkan konsentrasi, tingkat

kemurnian, visualisasi elektroforesis, dan penggunaan DNA hasil isolasi untuk
PCR-RFLP dari delapan spesies ikan laut menggunakan sampel daging dan sirip.

Manfaat Penelitian

Teknik isolasi DNA ikan laut ini dapat digunakan untuk berbagai keperluan
analisis molekuler seperti PCR-RFLP, sequencing, mikrosatelit, hibridisasi, dan
lain-lain. Penelitian ini diharapkan dapat memberikan referensi mengenai jenis
sampel yang tepat untuk isolasi DNA pada ikan laut sehingga diperoleh sampel
DNA dengan konsentrasi dan kemurnian yang lebih tinggi.

TINJAUAN PUSTAKA
Ikan Laut

Lautan Indonesia merupakan wilayah marine mega biodiversity terbesar di

dunia dengan kekayaan 8500 spesies ikan, 555 spesies rumput laut, dan 950
spesies biota terumbu karang (Noegroho 2013). Menurut kamus besar bahasa
indonesia (KBBI 2008), ikan merupakan binatang bertulang belakang yang hidup
dalam air, berdarah dingin, umumnya bernafas dengan insang, biasanya tubuhnya
bersisik, bergerak dan menjaga keseimbangan badannya menggunakan sirip.
Ikan terbagi menjadi dua golongan berdasar habitatnya yaitu ikan laut dan
ikan air tawar. Pada penelitian ini, jenis ikan yang akan diteliti adalah ikan air laut
yang biasa dikonsumsi, terdiri dari baronang, kerapu, ekor kuning, kakap merah,
kurisi, kue, bawal hitam, dan selar. Kedelapan jenis ikan tersebut termasuk dalam
filum chordata, kelas actinopterygii, dan ordo perciformes dengan famili, genus,
dan spesies dapat dilihat pada Tabel 1.

Tabel 1 Taksonomi delapan jenis ikan laut yang digunakan dalam penelitian
Jenis Famili Genus Spesies
Baronang Siganidae Siganus S. javus
Kerapu Serranidae Epinephelus Ephinephelus sp.
Ekor Kuning Caesionidae Caesionida Caesionidae sp
Kakap Merah Lutjanidae Lutjanus L. camphenatus
Kurisi Nemipteridae Nemipterus N. nematophorus
Kue Carangidae Caranx C. melampygus
Bawal Hitam Carangidae Parastromateus P. niger
Selar Carangidae Selaroides S. letolepis
Sumber: Froese dan Pauly (2014)
 3

Isolasi DNA

Isolasi DNA merupakan tahap pertama dari berbagai teknologi analisis

DNA yang diperoleh dari kromosom inti maupun dari organel, yaitu mitokondria
dan kloroplas. Langkah-langkah yang diperlukan terdiri dari pemecahan membran
sel dan membran inti yang dilanjutkan dengan pemisahan DNA dari berbagai
komponen sel lain. Isolat DNA harus dijaga agar tidak rusak dan didapatkan
dalam bentuk rantai yang panjang (Fatchiyah et al. 2011). Hasil isolasi DNA
dapat berupa DNA genom, yaitu keseluruhan DNA yang terdapat dalam suatu sel
atau DNA fragmen, keduanya dapat digunakan untuk analisis molekuler lanjutan.
Tujuan dari isolasi yaitu menghasilkan DNA yang berkualitas serta dapat diukur
konsentrasi dan tingkat kemurniannya. DNA yang berkualitas memiliki
kontaminan yang rendah dan dapat tervisualisasi pada saat elektroforesis (Putri
2010).
Sebagai bahan dasar untuk analisis lanjutan seperti PCR, RFLP, kloning
atau sequencing, maka DNA yang digunakan harus bersih dari kontaminan
(mempunyai kemurnian yang tinggi) dan memiliki berat molekul yang tinggi
(rantai yang panjang). Selama proses ekstrasi DNA, beberapa kerusakan yang
dapat terjadi antara lain fragmentasi selama proses isolasi, degradasi oleh enzim
nuklease, kontaminasi oleh polisakarida, dan metabolit sekunder saat isolasi
(Fatchiyah et al. 2011)
Terdapat beberapa jenis prosedur yang berbeda untuk isolasi DNA di
antaranya metode presipitasi amonium asetat (Sambrook et al.1982), metode
CTAB (cationic hexadecyl trimethyl ammonium bromide) (Rogers dan Bendich
1994), metode menggunakan thermal lysis (Buwono dan Rosidah 2010), dan
metode isolasi dengan menggunakan berbagai jenis kit komersial.

PCR-RFLP

Polymerase chain reaction (PCR) merupakan teknik yang sensitif untuk

mengamplifikasi segmen spesifik pada DNA dengan cepat. Teknik ini dapat
membentuk milyaran salinan fragmen DNA spesifik atau gen untuk mendeteksi
dan mengidentifikasi sekuens gen melalui tahapan uji selanjutnya. Setiap uji PCR
membutuhkan DNA template, primer nukleotida, dan DNA polimerase. Enzim
DNA polimerase penting karena menghubungkan nukleotida yang terpisah
menjadi satu kesatuan untuk membentuk produk PCR.
Proses PCR terdiri dari tiga tahapan yang berulang. Pertama, larutan reaksi
akan dipanaskan di atas titik didih dari dua untai DNA komplemen sehingga DNA
target yang akan membuat untaian tersebut menjadi terpisah, proses ini disebut
denaturasi. Kemudian suhu diturunkan sehingga primer yang spesifik akan
berikatan dengan DNA target, proses ini disebut hibridisasi atau annealing. Tahap
terakhir, suhu akan dinaikkan kembali, pada saat ini DNA polimerase dapat
memanjangkan primer dengan cara menambahkan nukleotida pada untai DNA.
Setiap pengulangan dari tiga tahapan ini akan menambah jumlah salinan molekul
DNA menjadi dua kali lipat (Garibyan dan Avashia 2013).
Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-
RFLP) mengamplifikasi DNA kemudian memotong fragmen pada tempat yang
4

spesifik dengan enzim endonuklease. Pemotongan ini akan menghasilkan fragmen

yang lebih kecil dengan ukuran berbeda-beda tergantung pada letak titik
pemotongan. Fragmen yang berbeda ini akan dipisahkan melalui elektroforesis
agarosa (Teletchea 2009). Enzim endonuklease atau enzim restriksi merupakan
kunci penting dalam pemotongan fragmen DNA. Enzim bakterial ini akan
berikatan pada daerah spesifik pada DNA kemudian memotong rantai pada kedua
untai. Setiap enzim restriksi memiliki target sekuens yang berbeda pada setiap
spesies (Becker et al 2000) oleh karena itu, setiap spesies akan memiliki pola
daerah pemotongan yang berbeda (Clark dan Pazdernik 2011). Apabila DNA dari
organisme yang berbeda dipotong oleh enzim restriksi yang sama, maka dapat
dihasilkan pola fragmen yang berbeda. Teknik ini juga dapat diaplikasikan pada
DNA dari dua individu dari spesies yang sama. Apabila perbedaan sekuens jatuh
pada daerah enzim restriksi yang dikenali, maka akan terlihat polimorfologi
panjang fragmen restriksi (Clark dan Pazdernik 2011).
Menurut Fatchiyah dan Arumingtyas (2011), aplikasi teknik PCR-RFLP
biasa digunakan untuk mendeteksi diversitas genetik, hubungan kekerabatan,
sejarah domestikasi, asal dan evolusi suatu spesies, aliran gen (genetic drift) dan
seleksi, pemetaan keseluruhan genom, pengamanan gen-gen target yang
diekspresikan (tagging gene), isolasi gen-gen yang berguna dari spesies liar, serta
mengonstruksi pustaka DNA. Pascoal et al. (2004) melaporkan bahwa metode
PCR-RFLP adalah metode yang cepat dan mudah untuk dilakukan dalam
menganalisis dan mengidentifikasi daging, baik dari daging yang matang maupun
mentah yang mengandung satu atau lebih spesies yang berbeda.
Kelebihan dari PCR-RFLP di antaranya adalah akurasi yang tinggi dan
mudah ditransfer antar laboratorium. Selain itu, RFLP dapat mendeteksi adanya
heterozigositas meskipun tanpa informasi sekuens target. PCR-RFLP sering
direkomendasikan untuk analisis filogenetik antar spesies yang berkerabat karena
didasarkan homolog sekuens. Sedangkan kekurangan dari teknik ini adalah
dibutuhkan DNA dengan kemurnian tinggi dalam jumlah banyak, beberapa
spesies mempunyai level polimorfisme yang rendah sehingga sedikit lokus yang
terdeteksi diperlukan pustaka probe yang sesuai, dibutuhkan waktu yang banyak
dan biaya yang relatif besar. Selain itu, kerugian dari metode ini yaitu pemrosesan
yang tidak lengkap dapat terjadi dan variasi yang spesifik dapat terhapus atau
bahkan tercipta tambahan daerah pemotongan (Lockley dan Bardsley 2000).

Analisis Kuantitatif dan Kualitatif DNA

Analisis kuantitatif dilakukan untuk mengetahui kualitas hasil isolasi DNA

meliputi konsentrasi dan tingkat kemurnian DNA genom. Analisis ini dapat
dilakukan dengan menggunakan alat spektrofotometer. Analisis kualitatif DNA
genom dapat dilakukan dengan elektroforesis pada gel agarosa.
Pengukuran konsentrasi DNA menggunakan spektrofotometer didasarkan
pada prinsip radiasi sinar ultra violet yang diserap oleh nukleotida. Asam nukleat
dapat menyerap cahaya dengan kuat pada panjang gelombang () 260 nm (Putri
2010). Apabila kepadatan optik pada panjang gelombang A260 nm sama dengan
satu, maka konsentrasi molekul DNA setara dengan 50 µg/ml untuk DNA heliks
ganda dan 40 µg/ml untuk DNA untai tunggal (Muladno 2002). Tingkat
 5

kemurnian DNA berkorelasi dengan kualitasnya. DNA dikatakan berkualitas jika

memiliki tingkat kemurnian yang tinggi, karena telah termurnikan dari
kontaminan seperti RNA, protein, dan lipid. Tingkat kemurnian DNA diukur
dengan membandingkan absorbansi asam nukleat pada panjang gelombang A260
nm dan protein pada A280 nm. Kontaminasi DNA dapat dilihat dengan semakin
meningkatnya nilai absorbansi protein.
Analisis kualitatif DNA genom menggunakan elektroforesis pada gel
agarosa merupakan metode standar yang digunakan untuk identifikasi, pemisahan,
dan purifikasi fragmen DNA. Pewarna ethidium bromida digunakan sebagai alat
identifikasi dan mengukur semikualitatif fragmen DNA yang terpisah di dalam gel.
Ethidium bromida akan terikat di antara dua untai ganda DNA sehingga pita DNA
dalam gel agarosa akan berpendar karena pewarna ini mengandung zat fluoresen.
Ikatan DNA dengan ethidium bromida ini akan terekspos pada sinar UV tingkat
medium, sekitar panjang gelombang () 300 nm (Fatchiyah 2011). Intensitas
fluoresen dapat diukur dengan menggunakan DNA penanda standar sehingga
kuantitas DNA dapat diperkirakan, misalnya antara 0.5020 µg/ml.

METODE

Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Pendidikan dan Layanan

Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor dalam kurun waktu
Januari–Juli 2014.

Bahan Penelitian

Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah sampel jaringan

tubuh berupa daging dan srip bagian kaudal dari ikan baronang (Siganus javus),
kerapu (Epinephelus sp), ekor kuning (Caesionidae sp), kakap merah (Lutjanus
campechanus), kurisi (Nemipterus nematophorus), kue (Caranx melampygus),
bawal hitam (Parastromateus niger), dan selar (Selaroides leptolepis). Bahan lain
adalah pure water (milliQ) steril, larutan lysis buffer (Tris-HCl 10 mM, EDTA 25
mM, NaCl 100 mM, SDS 0.5% pada pH 8), proteinase K (10 mg/ml), larutan
RNAse (20 mg/ml), larutan amonium asetat 5 M, isopropanol, etanol 70%, larutan
TAE (Tris Asetat EDTA), agarosa, loading dye (bromophenol blue 0.25%), xylene
cryanol RF 0.25% sucruze dalam H2O 40%, ethidium bromida, Invitrogen® PCR
Reagen Supermix, primer universal oligonukleotida sitokrom b dengan urutan
basa cyt b-1 -5’CCATCCAACATC TCCAGCATG ATGAAA3’ dan cyt b-2 -
5’CCCCTCAGAATGATATTTGTCC TCA3’ (359 bp), serta enzim restriksi Hinf
I (10 U/μl) .
6

Alat Penelitian

Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah alat diseksi, timbangan
analitik, pipet mikro (ukuran 1–10 μl, 10–100 μl, dan 100–1000 μl), tip mikro,
tabung sampel, tabung mikro 1.5 ml, erlenmeyer, gelas piala, parafilm, vortex,
waterbath, microwave, elektroforesis gel agarosa, sentrifus (Kokusan
H1500DR®), spektrofotometer (NanoDrop 2000 Thermo Scientific®), mesin PCR
(AB Gene Amp® PCR System 9700).

Prosedur Penelitian

Pengumpulan Sampel
Sampel delapan ikan laut konsumsi yaitu ikan baronang (Siganus javus),
kerapu (Epinephelus sp), ekor kuning (Caesionidae sp), kakap merah (Lutjanus
campechanus), kurisi (Nemipterus nematophorus), kue (Caranx melampygus),
bawal hitam (Parastromateus niger), dan selar (Selaroides leptolepis) diperoleh
dari pasar sekitar Bogor, kemudian sampel tersebut disimpan di dalam freezer di
suhu -20 °C sampai proses selanjutnya.

Isolasi DNA
Metode isolasi yang digunakan mengacu pada Sambrook et al. (1982).
Sebanyak 100 mg masing-masing sampel dihaluskan di dalam tabung mikro 1.5
ml menggunakan gunting. Sampel yang telah halus ditambah larutan lysis buffer
sebanyak 500 μl, kemudian diinkubasi pada suhu 55 °C selama 1 jam dan
digoyang sekali-sekali. Kemudian 6 μl proteinase K (10 mg/ml) ditambahkan ke
dalam larutan tersebut dan diinkubasi kembali di suhu 55 °C selama 3 jam.
Sebanyak 3 μl (20 mg/ml) RNAse ditambahkan ke dalam tabung kemudian
tabung dibolak-balik sebanyak 25 kali, lalu diinkubasi pada suhu 37 °C selama
1530 menit. Setelah itu tabung yang berisi larutan tersebut disimpan di dalam
pecahan es selama 30 menit dan dilanjutkan dengan sentrifugasi pada kecepatan
9000 g selama 30 menit.
Supernatan yang diperoleh dimasukkan ke dalam tabung baru dan
ditambahkan larutan amonium asetat 5 M sebanyak 500 μl, divortex selama 20
detik pada kecepatan maksimum, kemudian didiamkan selama 10 menit pada suhu
ruang. Selanjutnya tabung disentrifugasi pada kecepatan 4300 g pada suhu 4 °C
selama 15 menit, supernatan dipindahkan ke dalam tabung baru dan disentrifugasi
kembali pada kecepatan 4300 g pada suhu 4 °C selama 15 menit. Supernatan hasil
sentrifugasi dipindahkan ke dalam tabung baru yang sudah diisi isopropanol
absolut sebanyak 600 μl, sampel dicampur dengan cara dibolak-balik, kemudian
didiamkan selama 1 malam pada suhu ruang sampai terbentuk endapan Setelah itu
dilakukan sentrifugasi pada kecepatan 4300 g pada suhu 4 °C selama 5 menit
sehingga DNA akan terlihat sebagai endapan putih kecil di dasar tabung.
Supernatan dibuang kemudian alkohol 70% dingin ditambahkan sebanyak
500 μl, lalu tabung dibolak-balikkan untuk membantu pencucian DNA. Kemudian
sentrifugasi dilakukan pada kecepatan 16 000 g selama 3 menit. Alkohol di dalam
tabung dibuang dengan hati-hati dengan pipet supaya endapan DNA yang
menempel di dinding tabung tidak ikut terbuang, kemudian DNA di dalam tabung
 7

dikeringkan dengan cara didiamkan pada suhu ruang semalam atau diinkubasi
pada suhu 75 °C selama 5 menit. MilliQ steril ditambahkan ke dalam tabung
mikro yang berisi endapan DNA sebanyak 3050 μl lalu diinkubasi pada suhu 60
°C selama 3 menit. Tabung yang berisi DNA diberi label dan disegel
menggunakan parafilm kemudian disimpan di dalam freezer (-20 °C).

Amplifikasi Fragmen DNA Mitokondria (mtDNA)

Proses amplifikasi fragmen mtDNA dilakukan dengan menggunakan
metode PCR. Reaksi PCR menggunakan primer universal sitokrom b. Larutan
reaksi terdiri dari 3 μl DNA template, primer sitokrom b1 (10 μM) dan primer
sitokrom b2 (10 μM) masing-masing 1 μl, Invitrogen® PCR Reagen Supermix 45
μl, sehingga diperoleh total volume dalam 1× reaksi PCR adalah 50 μl.
Tabung PCR yang sudah berisi larutan tersebut dimasukkan ke dalam mesin
PCR yang sudah diprogram dengan siklus yang digunakan dimulai dengan 1
siklus denaturasi awal pada suhu 95 °C selama 5 menit, dilanjutkan 35 siklus yang
terdiri dari denaturasi pada suhu 95 °C selama 45 detik, annealing primer pada
suhu 55 °C selama 45 detik, extention pada suhu 72 °C selama 1 menit, dan 1
siklus extention akhir pada suhu 72 °C selama 3 menit.

Pemotongan Amplikon DNA

Proses pemotongan amplikon DNA sirip ikan selar dalam penelitian ini
dilakukan menggunakan enzim Hinf I (10 U/μl). Reagen yang digunakan dalam
pemotongan DNA hasil PCR dengan Hinf I secara berurutan adalah ddH2O sebanyak
12 μl, buffer sebanyak 2.5 μl, enzim Hinf I sebanyak 0.5 μl, DNA hasil PCR sebanyak
10 μl. Kemudian DNA hasil PCR diinkubasi pada suhu 37 °C selama 2 jam.

Visualisasi Hasil Ektraksi dengan Elektroforesis

Hasil isolasi DNA dan PCR-RFLP dari sirip dan daging delapan spesies
ikan air laut konsumsi divisualisasikan menggunakan gel elektroforesis yang
kemudian diamati dengan ultraviolet (UV) transluminator. Proses visualisasi
DNA menggunakan gel agarosa 0.8% dengan komposisi 0.4 gram agarosa
dicampur dengan 50 ml TAE atau agarosa 1% dengan komposisi 0.5 gram agarosa
dicampur dengan 50 ml TAE. Hasil PCR divisualisasi menggunakan
elektroforesis gel agarosa 1%, sedangkan hasil pemotongan amplikon
divisualisasi menggunakan elektroforesis gel agarosa 1.5% dengan komposisi
0.375 gram agarosa dicampur dengan 25 ml TAE. Larutan gel agarosa dipanaskan
dalam microwave kemudian didinginkan di dalam air, lalu ditambahkan 2.5 μl
ethidium bromida (5mg/ml), setelah itu dibuat sumur untuk memasukkan DNA
dengan cara memasukkan sisir pembentuk pada cetakan. Setelah gel agarosa
dituangkan ke dalam cetakan, gel agarosa didiamkan hingga menjadi padat.
Masing-masing sampel DNA dimasukkan ke dalam sumur setelah ditambahkan
loading dye dengan perbandingan 1:1 yaitu 3 μl DNA dan 3 μl loading dye.
Proses elektroforesis dilakukan dengan voltase 100 V selama 45 menit.

Penghitungan Ukuran Fragmen Restriksi

Fragmen DNA hasil restriksi diukur secara manual menurut Sambrook et
al. (1982). Langkah pertama dalam pengukuran DNA sampel secara manual
adalah menentukan sumbu y untuk berat molekul (base pair atau bp) serta sumbu
 8

x untuk jarak migrasi DNA (cm). Langkah kedua migrasi DNA ladder diukur
pada foto atau gambar kemudian diplot pada kertas Semi-Log sehingga terbentuk
garis lurus atau garis miring. Langkah berikutnya adalah pengukuran migrasi
DNA setiap fragmen restriksi dan diplot pada kertas Semi-Log sama seperti
sebelumnya sehingga dapat diketahui berat molekul DNA setiap fragmen restriksi
(Sambrook et al. 1982).

Pengukuran Konsentrasi dan Kemurnian DNA

Pengukuran konsentrasi dan kemurnian 16 sampel DNA yang telah diisolasi
dilakukan di laboratorium Institut Pertanian Bogor Culture Collection (IPBCC)
dengan menggunakan spektrofotometer. Sebanyak 1 μl dari masing-masing
sampel DNA diletakkan di atas pedestal bagian bawah, kemudian ditutup
menggunakan pedestal bagian atas. Kabel fiber optik akan berkontak dengan
sampel dan pengukuran spektro dilakukan menggunakan software pada komputer.
Pengukuran dilakukan pada panjang gelombang A260 dan A280 dengan
pengulangan dilakukan sebanyak dua kali.
Data-data konsentrasi dan kemurnian dari sampel DNA yang diperoleh
dianalisa menggunakan program statistical package for the social sciences (SPSS)
v.22 dengan metode analysis of variance (ANOVA) satu arah.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Visualisasi DNA Hasil Isolasi

Hasil elektroforesis DNA hasil isolasi yang berasal dari delapan spesies ikan
laut konsumsi menunjukkan hanya sampel DNA daging ikan baronang dan sirip
selar yang terlihat jelas pada gel agarosa 0.8%. Setelah menggunakan gel agarosa
1%, maka sampel DNA daging ikan baronang, daging kerapu, sirip bawal hitam,
dan sirip selar terlihat jelas pada hasil elektroforesis (Gambar 1, Tabel 2).

a b

Gambar 1 Visualisasi DNA hasil isolasi sampel daging dan sirip ikan laut pada
gel agarosa 0.8% (a) dan 1% (b)
 9

Sampel DNA daging ikan kerapu dan sirip ikan bawal hitam tidak terlihat
setelah dielektroforesis pada gel agarosa 0.8% tetapi terlihat pada gel agarosa 1%.
Sementara itu jenis sampel daging dan sirip dari jenis ikan lain tidak terlihat baik
pada gel agarosa 0.8% dan 1%. Hal ini dipengaruhi beberapa faktor di antaranya
ukuran molekul DNA dan konsentrasi gel agarosa. Molekul yang lebih besar akan
bergerak lebih lambat dibanding molekul yang lebih kecil dan DNA linier
bergerak lebih cepat dibanding DNA sirkuler. Konsentrasi gel agarosa yang lebih
rendah memiliki pori yang lebih renggang dibanding gel agarosa dengan
konsentrasi tinggi memungkinkan molekul DNA akan lebih cepat bergerak
melewati gel agarosa.
Menurut Fatchiyah (2010), laju migrasi elektroforesis DNA dipengaruhi
beberapa faktor yaitu ukuran molekul DNA, konsentrasi gel agarosa, konformasi
DNA, penggunaan voltase dan arah bidang elektris, komposisi basa DNA atau
temperatur, keberadaan pewarna DNA, serta komposisi buffer elektroforesis.

Tabel 2 Kualitas visualisasi DNA hasil isolasi sampel daging dan sirip ikan
laut
Hasil Elektroforesis
Jenis Ikan Jenis Sampel
Gel agarosa 0.8% Gel agarosa 1%
Daging ++ +++
Baronang
Sirip - -
Daging - ++
Kerapu
Sirip - -
Daging - -
Ekor Kuning
Sirip - -
Daging - -
Kakap Merah
Sirip - -
Daging - -
Kurisi
Sirip - -
Daging - -
Kue
Sirip - -
Daging - -
Bawal Hitam
Sirip - ++
Daging - -
Selar
Sirip + +++
- : Tidak terlihat, +: Terlihat cukup jelas, ++ : Terlihat jelas, +++ : Terlihat sangat jelas

Menurut Muladno (2002), isolasi DNA merupakan langkah penting dalam

memurnikan DNA dimana DNA dipisahkan dari komponen seluler lain seperti
protein, RNA, dan lipid. Terdapat banyak jenis prosedur yang berbeda untuk
isolasi DNA, dimulai dengan melisiskan sel, diikuti deproteinasi dan terakhir
memulihkan DNA. Perbedaan dari berbagai macam prosedur tersebut terletak
pada proses deproteinasi dan hasil berat molekul DNA yang diperoleh.
Berbagai metode isolasi DNA yang telah dilakukan dalam berbagai
penelitian memungkinkan kualitas dan kuantitas hasil DNA yang berbeda-beda.
Hasil yang diperoleh tergantung pada jenis metode yang digunakan dan ketelitian
dalam pengerjaan isolasi DNA. Teknik molekuler bervariasi dalam cara
pelaksanaan untuk mendapat data, baik tekniknya maupun tingkatan target data
10

yang diinginkan sesuai kemudahan pelaksanaan, ketersediaan sumber daya

manusia, fasilitas, dan dana (Ardiana 2009).
Metode standar yang digunakan untuk memisahkan, mengidentifikasi, dan
memurnikan fragmen DNA adalah elektroforesis gel agarosa. Teknik ini
sederhana, cepat, dan mampu memisahkan campuran potongan DNA sesuai
dengan ukurannya secara akurat. Pewarna yang mengandung fluoresen seperti
ethidium bromida digunakan untuk mendeteksi potongan-potongan DNA berupa
pita DNA pada gel agarosa (Fatchiyah 2010).
Jenis sampel yang pernah digunakan untuk isolasi DNA dari ikan antara lain
daging (Saputra 2009), sirip dan sisik (Wasko et al. 2003), mukus (Vin et al.
2011), serta darah (Turtinen dan Juran 1998) dengan menggunakan metode yang
berbeda-beda. Dalam penelitian ini, jenis sampel sirip lebih disukai karena
bersifat non invasif dan dapat dilakukan ketika hewan masih hidup. Sedangkan
jenis sampel daging bersifat invasif dan dapat merusak ikan sebagai komoditas
makanan. Oleh karena itu, sampel sirip dapat digunakan sebagai alternatif untuk
menggantikan sampel daging.

Konsentrasi dan Kemurnian DNA Hasil Isolasi

Hasil spektrofotometer untuk mengukur konsentrasi dan tingkat kemurnian

menunjukkan sampel DNA yang berasal dari sirip ikan memiliki konsentrasi dan
kemurnian yang tidak berbeda (P>0.05) dibandingkan dengan sampel DNA yang
berasal dari daging ikan (Tabel 3).

Tabel 3 Konsentrasi dan kemurnian DNA yang dikoleksi dari berbagai

jenis ikan laut
Konsentrasi DNA Kemurnian DNA
Jenis Sampel (ng/μl) (Rasio A260/280)
Daging Sirip Daging Sirip
Baronang 70.15 31.20 1.70 0.96
Kerapu 15.60 50.45 1.49 1.50
Ekor Kuning 31.60 55.80 1.48 1.44
Kakap Merah 27.25 23.35 1.47 1.47
Kurisi 5.30 24.50 1.12 1.57
Kue 9.80 51.10 1.48 1.34
Bawal Hitam 9.70 36.00 1.66 1.27
Selar 6.70 150.50 1.91 1.91
Rata-rata ±SD 22.01±20.29a 52.86±41.37a 1.54±0.23 b
1.44±0.27b
Superscript yang sama diperbandingkan dan menunjukan hasil yang tidak berbeda nyata (P>0.05)
SD = simpangan baku

Secara umum nilai rata-rata konsentrasi DNA sampel sirip lebih tinggi
dibanding konsentrasi DNA dari sampel daging, tetapi keduanya memiliki standar
deviasi yang tinggi menyebabkan rentang rata-rata kedua konsentrasi menjadi
bersinggungan sehingga dikatakan tidak berbeda nyata (P>0.05). Standar deviasi
menunjukkan keheterogenan yang terjadi dalam data. Semakin besar nilai standar
deviasi, menandakan data pengamatan semakin menyebar dan memiliki
kecendurangan setiap data berbeda satu sama lain (Salkind 2007).
 11

Pengukuran spektrofotometer biasa dilakukan dengan cara membandingkan

nilai absorbansi A260 nm untuk DNA dan nilai absorbansi A280 nm untuk
protein. Nilai perbandingan (rasio) A260/280 normal untuk DNA adalah 1.82.0.
Jika nilai rasio lebih rendah dari 1.8 maka terdapat kontaminan protein atau fenol,
tetapi jika nilai rasio lebih tinggi dari 2.0 maka terdapat kontaminan berupa RNA
(Tataurov et al. 2008, Fatchiyah 2011).
Sebanyak tujuh dari delapan sampel daging dan sirip menghasilkan DNA
dengan rasio A260/280 yang lebih rendah dari 1.8, mengindikasikan adanya
kontaminasi dari protein atau fenol. DNA yang murni harus bebas dari protein dan
oligopeptida. Kontaminasi oleh protein dapat berasal dari komponen sel yang
tidak lisis selama proses isolasi atau berasal dari fenol sebagai bahan yang
ditambahkan pada proses isolasi untuk mempresipitasi DNA (Bellard et al. 1973).
Pada penelitian ini kontaminasi yang mungkin terjadi adalah kontaminan fenol
sebagai akibat proses penghilangan fenol saat isolasi tidak sempurna. Pemurnian
DNA yang terkontaminasi dapat dilakukan dengan menggunakan berbagai jenis
kit komersial.

PCR-RFLP DNA Hasil Isolasi

Setelah dilakukan proses PCR pada seluruh sampel DNA hasil isolasi,
hanya diperoleh satu sampel DNA yaitu dari sirip ikan selar yang menunjukkan
hasil positif pita pada 359 bp setelah dielektroforesis (Gambar 2a). Kocher dan
White (1989) menyatakan bahwa penggunaan primer universal sitokrom b akan
menghasilkan amplikon dengan panjang 359 bp. Kemudian amplikon dipotong
dengan menggunakan enzim restriksi Hinf I dan terpotong menjadi dua fragmen
(Gambar 2b). Setelah dilakukan pengukuran secara manual, maka diketahui
bahwa panjang fragmen amplikon tersebut adalah 332 bp dan 27 bp (Lampiran 3).

Gambar 2 Visualisasi amplikon DNA sirip ikan selar setelah PCR dengan primer
cyt b (a) dan setelah PCR dilanjutkan dengan pemotongan dengan
enzim Hinf I (b)

Salah satu faktor keberhasilan proses amplifikasi DNA dengan PCR adalah
DNA yang akan diamplifikasi memiliki konsentrasi dan kemurnian yang baik
(Sambrook et al. 1989), dalam penelitian ini hanya sampel dari sirip ikan selar
yang memiliki kriteria ini (konsentrasi 150.50 ng/μl; rasio A260/280 = 1.91, lihat
12

Tabel 3). Konsentrasi template DNA 1 ng merupakan konsentrasi minimal yang

dapat digunakan dalam proses PCR (Grunewald 2003). Amplifikasi yang tidak
berhasil disebabkan karena DNA tidak bebas dari kontaminan seperti protein atau
bahan-bahan sisa proses isolasi seperti alkohol dan fenol dan ditunjukkan oleh
rasio A260/280 di bawah 1.8 atau di atas 2.0.
Hasil amplifikasi PCR dapat dipotong dengan menggunakan enzim restriksi
Hinf I karena memiliki titik restriksi yang sesuai untuk enzim tersebut. Enzim
restriksi tertentu akan memotong pada urutan pengenal dan tidak memotong
daerah urutan lainnya. Enzim Hinf I dapat mengenali urutan pentanukleotida
dengan urutan basa GANTC dan memotong pada titik di antara basa G dan A
(Fatchiyah dan Aruminingtyas 2011). Selain pada penelitian ini, enzim Hinf I
telah dilaporkan sebelumnya dapat membedakan spesies ikan Scomber scombrus
dan Ruvettus pretiosus menggunakan primer universal cyt b (Nebola et al. 2010).
Teknik PCR-RFLP memiliki banyak kegunaan dan aplikasi di bidang
biologi dan keanekaragaman hayati, di antaranya ialah identifikasi spesies. Selain
itu teknik ini lebih mudah dalam pelaksanaannya dibandingkan dengan teknik
molekuler yang lain seperti sequencing, mikrosatelit, dan lain-lain. Berbagai jenis
spesies ikan air tawar (Saputra 2009), satwa liar (Wolf 1999), dan hewan
domestik (Bravi et al. 2004) telah berhasil diidentifikasi menggunakan teknik ini
berdasarkan perbedaan potongan DNA setelah dipotong dengan enzim restriksi
tertentu.
Uji DNA diperlukan di Indonesia untuk mengidentifikasi jenis spesies
ikan baru (UNDIP 2013), identifikasi stok ikan (Syahailatua 2010), membedakan
ikan dari kekerabatan yang dekat (species identification) (Ariyanti 2012), kasus
pencurian (illegal fishing), serta keperluan perdagangan (terutama untuk ikan-ikan
yang mahal). Hal ini menunjukkan bahwa teknik ini berguna untuk negara seperti
Indonesia yang memiliki keanekaragaman hayati yang tinggi.

SIMPULAN DAN SARAN

SIMPULAN

Isolasi DNA delapan ikan laut menunjukkan konsentrasi dan kemurnian

yang tidak berbeda antara sampel daging dan sampel sirip, yaitu 22.01±20.29 dan
1.44±0.27 untuk konsentrasi dan kemurnian DNA sampel daging, serta
52.86±41.37 dan 1.54±0.23 berturut-turut untuk konsentrasi dan kemurnian DNA
sampel sirip. Sampel DNA ikan laut dapat diisolasi dari daging dan sirip namun
hanya satu sampel dari sirip ikan selar yang memiliki konsentrasi yang tinggi
(150.50 ng/μl) dan kemurnian yang baik (rasio A260/280=1.91) serta
menunjukkan hasil positif setelah PCR-RFLP dengan enzim Hinf I dan
menghasilkan dua pita dengan ukuran 332 bp dan 27 bp.

SARAN

Elektroforesis DNA hasil isolasi lebih baik menggunakan gel agarosa 1%

karena memberikan visualisasi DNA yang lebih baik. Pemilihan sampel sirip
 13

untuk isolasi DNA dari ikan lebih disarankan karena bersifat non invasif dan
menghasilkan nilai konsentrasi dan tingkat kemurnian yang tidak berbeda nyata
dibanding sampel daging yang bersifat invasif. Konsentrasi dan tingkat kemurnian
DNA perlu diperhatikan agar proses amplifikasi PCR dapat berlangsung secara
optimal.

DAFTAR PUSTAKA

Ardiana DW. 2009. Teknik isolasi DNA genom tanaman pepaya dan jeruk dengan
menggunakan modifikasi buffer CTAB. Bul Tek Pertan. 14 (1):12-16.
Ariyanti Y. 2012. Aplikasi DNA barcode pada penentuan spesies ikan danau laut
tawar, Nanggroe Aceh Darussalam [skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian
Bogor.
Becker WM, Kleinsmith LJ, Hardin J. 2000. The World of The Cell. Ed ke-4.
New York (US): The Benjamin Publishing Company.
Bellard MG, Outdet P, Chambon P. 1973. Isolation of high molecular weight
DNA from mammalian cells. Eur J Biochem. 36:32-38.
Bravi CM, Liron JP, Mirol PM, Ripoli MV, Garcia PP, Giovambattista G. 2004.
A simple method for domestic animal identification in Argentina using
PCR-RFLP analysis of cytochrome b gene. Leg Med. 6:246-251.
Buwono ID, Rosidah. 2010. Uji Sensitifitas Metode One Step dan Nested PCR
terhadap Deteksi Penyakit KHV pada Ikan Mas (Cyprinus carpio).
Lembaga Penelitian dan Pengembangan Masyarakat Universitas
Padjajaran.
Clark DP, Pazdernik NJ. 2011. Biotechnology: Academic Cell. Massachusetts
(US): Academic Press.
Fatchiyah. 2010. DNA qualitative and quantitative analysis [Internet]. [diacu 2014
Agustus 13]. Tersedia dari: http://fatchiyah.lecture.ub.ac.id/teaching-res
ponsibility/general/dna-qualitative-quantitative-analysis/.
Fatchiyah, Rahayu S, Aruminingtyas EL. 2011. Isolasi DNA. Di dalam : Fatchiyah,
Arumingtyas EL, Widyarti S, Rahayu S. Biologi Molekular-Prinsip Dasar
Analisis. Jakarta (ID): Erlangga. hlm 21-32.
Fatchiyah. 2011. Uji Kuantitatif dan Kualitatif. Di dalam: Fatchiyah, Arumingtyas
EL, Widyarti S, Rahayu S. Biologi Molekular-Prinsip Dasar Analisis.
Jakarta (ID): Erlangga. hlm 34-37.
Fatchiyah, Aruminingtyas EL. 2011. Restriction Fragment Length Polymorphism
(RFLP). Di dalam: Fatchiyah, Arumingtyas EL, Widyarti S, Rahayu S.
Biologi Molekular-Prinsip Dasar Analisis. Jakarta (ID): Erlangga. hlm 42-
45.
Froese R, Pauly D. 2014. Fish base [Internet]. [diacu 2014 September 9]. Tersedia
dari: http://www.fishbase.org.
Garibyan L, Avashia N. 2013. Polymerase chain reaction. J Invest dermatol. 133
(6):1-4.
Grunenwald H. 2003. Optimization of Polymerase Chain Reaction. Di dalam:
Barlett JMS, Stirling D, editor. PCR Protocols Ed ke-2. New Jersey (US):
Humana Press Inc. hlm 90-95.
14

[KBBI] Kamus Besar Bahasa Indonesia. 2008. Ikan [Internet]. [diacu 2014
September 6]. Tersedia dari: bahasa.kemdiknas.go.id/kbbi/index.php.
Kocher TD, White TJ. 1989. Evolutionary analysis via PCR. Di dalam: Erlich H
A, editor. PCR Technology: Principles and Aplication for DNA
amplification. New York (US): Stockton Press. hlm 137-147.
Lockley A, Bardsley R. 2000. Novel method for discrimination of tuna (Thunnus
thynnus) and bonito (Sarda sarda) DNA. J Agric Food Chem. 48:4463-
4468.
Minarovic T, Trakovicka A, Rafayova A, Lieskovska Z. 2010. Animal species
identification by PCR-RFLP of cytochrome b. Anim Sci Biotechnol. 43
(1):296-299.
Muladno. 2002. Seputar Teknologi Rekayasa Genetika. Bogor (ID): Pustaka
Wirausaha Muda.
Nebola M, Borilova G, Kasalova J. 2010. PCR-RFLP analysis of DNA for the
differentiation of fish species in seafood samples. Bull Vet Inst Pulawy. 54:
49-53.
Noegroho A. 2013. Keanekaragaman hayati laut Indonesia terbesar di dunia
[Internet]. [diacu 2014 Agustus 27]. Tersedia dari: http://kkp.go.id/
index.php/arsip/c/9822/keanekaragaman-hayati-laut-indonesia-terbesar-di-
dunia/?category_id=.
Pascoal A, Prado M, Castro J, Cepeda A, Barrosvelasquez J. 2004. Survey of
authenticity of meat species in food products subjected to different
technological processes, by means of PCR-RFLP analysis. Eur Food Res
Technol. 218: 306-312.
Putri NTAF. 2010. Karakterisasi spesies bahan baku ikan air tawar komersial
berbasis PCR-sequencing dan perbandingan metode ekstraksi DNA
[skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
Roger SO, Bendich. 1994. Extraction of Total Cellular DNA from Plant, Algae,
and Fungi. Molecular Biology Manual.
Salkind NJ. 2007. Encyclopedia of Measurement and Statistics Volume 1.
California (US): Sage Publications Inc.
Sambrook J, Fritsch FF, Maniastis T. 1982. Molecular Cloning. A laboratory
manual. Ed ke-1. New York (US): Cold Spring Harbor Laboratory.
Sambrook J, Fritsch FF, Maniastis T. 1989. Molecular Cloning. A laboratory
manual. Ed ke-2. New York (US): Cold Spring Harbor Laboratory.
Saputra D. 2009. Gambaran restriction fragment length polymorphism (RFLP)
gen sitokrom b DNA mitokondria dari sembilan spesies ikan air tawar
konsumsi [skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
Syahailatua A. 2010. Identifikasi stok ikan, prinsip dan kegunaannya. Oseana.
18(2):55-63.
Tataurov AV, You Y, Owczarzy R. 2008. Predicting ultraviolet spectrum of
single stranded and double stranded deoxyribonucleic acids. Biophys
Chem. 133 (1-3):66-70.
Teletchea F. 2009. Molecular dentification methods of fish species: reassesment
and possible applications. Rev Fish Biol Fish. 19:265-293.
Turtinen LW, Juran BD. 1998. Protein salting-out method applied to genomic
DNA isolation from fish whole blood. Bio Tech. 24:238-239.
 15

[UNDIP] Universitas Diponegoro (ID). 2013. Uji DNA untuk identifikasi ikan
spesies baru dari Kaimana Papua [Internet]. [diacu 2014 Agustus 25].
Tersedia dari: http://msdp.undip.ac.id/s3/berita-143-uji-dna-untuk-identifi
kasi-ikan-spesies-baru-dari-kaimana-papua.html.
Vin ALL, Adam A, Tedder A, Arnold KA, Mable BK. 2011. Validation of swabs
as non destructive and relatively non-invasive DNA sampling method in
fish. Mol Ecol Resour. 11 (1):107-109.
Wasko AP, Martins C, Oliveira C, Foresti F. 2003. Non-destructive genetic
sampling in fish. An improved method for DNA isolation from fish fins
and scales. Her. 138:161-165.
Wolf C, Rentsch J, Hubner P. 1999. PCR-RFLP analysis of mitochondrial DNA: a
reliable method for species identification. J Agric Food Chem. 47
(4):1350-1355.
16

Lampiran 1 Analisis ragam jumlah rata-rata konsentrasi sampel DNA daging dan
sirip ikan laut
 17

Lampiran 2 Analisis ragam jumlah rata-rata tingkat kemurnian sampel DNA

daging dan sirip ikan laut
 18

Lampiran 3 Perhitungan manual fragmen restriksi Hinf I sirip ikan selar

Berat molekul (bp)

Jarak migrasi DNA (cm)

Keterangan : DNA Ladder : 100 bp : 3.1 cm

200 bp : 2.6 cm
300 bp : 2.4 cm
400 bp : 2.1 cm
Fragmen restriksi sirip selar : 2.3 cm (332 bp)
 19

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Sukabumi pada 13 Agustus 1993. Penulis merupakan

anak pertama dari tiga bersaudara dari pasangan Yudhi Rhahadian dan Leni
Nuraeni. Penulis bersekolah dari sekolah dasar (SD) sampai dengan sekolah
menengah atas (SMA) di Kota Sukabumi. SD Negeri Brawijaya Kota Sukabumi
ditempuh penulis selama enam tahun dan lulus pada tahun 2005. Jenjang
pendidikan selanjutnya adalah SMP Negeri 1 Kota Sukabumi yang ditempuh
selama dua tahun dan lulus pada tahun 2007. Setelah lulus SMP, penulis
melanjutkan bersekolah di SMA Negeri 1 Kota Sukabumi dan lulus pada tahun
2010. Penulis diterima di IPB melalui jalur undangan seleksi masuk IPB (USMI)
pada tahun 2010.
Selama menjadi mahasiswa FKH IPB, penulis pernah menjadi anggota
pengurus PC IMAKAHI IPB dan anggota Divisi Informasi dan Komunikasi
Himpro Ornithologi dan Unggas pada tahun kepengurusan 2011/2012 serta ketua
divisi internal Himpro Ornithologi dan Unggas pada tahun kepengurusan
2012/2013.