VIII.

Analisis dan Pembahasan

Percobaan Penentuan Kadar Protein dengan Metode Biuret ini bertujuan untuk
menentukan kadar protein yang ada pada sampel ikan lele dengan menggunakan
metode biuret. Alasan menggunakan metode biuret dari pada metode lainnya seperti
metode lowry maupun metode kejdahl dalam penentuan kadar protein pada sampel ikan
lele adalah sebagai berikut:
1. Murah
2. Cepat
3. Penyimpangan warna jarang ditemukan dibandingkan dengan metode lain.
4. N dari non peptide dan non peptide tidak terdeteksi
Dengan adanya ikatan peptida, ion tembaga (II) pada reagen biuret membentuk
senyawa kompleks berwarna ungu dalam larutan alkali. Penentuan kadar protein secara
biuret didasarkan atas pengukuran absorbansi oleh senyawa kompleks yang berwarna
ungu menggunakan spektrofotometri UV-Vis. Sesuai dengan hukum Lambert-beer,
konsentrasi protein berbanding lurus dengan absorbansi pada panjang gelombang
maksimum.

Warna cahaya yang diserap dan warna cahaya yang tampak

λ yang diserap (nm) Warna yang diserap Warna yang tampak

380-450 Ungu Kuning-hijau

450-495 Biru Kuning

495-570 Hijau Ungu

570-590 Kuning Biru

590-620 Jingga Hijau-biru

620-750 Merah Biru-hijau

Pada percobaan ini untuk pengukuran absorbansi semuanya dilakukan pada

panjang gelombang 540 nm. Sesuai dengan tabel di atas pada panjang gelombang tersebut
warna yang diserap sampel terkomplekskan untuk mengahasilkan warna ungu terletak
pada rentang panjang gelombang 495-570 nm.

1. Persiapan sampel

Persiapan sampel dilakukan dengan cara menimbang 1,0039 gram sampel ikan
lele yang akan dilakukan uji protein dengan metode biuret. Lalu di tumbuk
menggunakan mortal alu sampai halus supaya mudah dalam pelarutannya. Sampel
yang sudah halus kemudian ditambahkan 10 mL akuades dan dimasukkan ke dalam
tabung sentrifuge. Kemudian disentrifuge dengan kecepatan 3500 rpm selama 10
menit. Setelah disentrifuge sampel didekantasi untuk memisahkan filtrat dan residu.
Diperoleh filtrat berwarna putih keruh dan residu berwarna putih keabu-abuan. Filtrat
diambil untuk dilakukan uji protein dengan metode biuret.

2. Pembuatan standar

Pembuatan serta penetapan absorbansi larutan standard bertujuan untuk

membuat kurva standar dimana diperlukan larutan standar protein dengan konsentrasi
1 mg/mL, 2 mg/mL, 3 mg/mL, 4 mg/mL dan 5 mg/mL.. Dalam membuat larutan
standar, disiapkan larutan protein dengan konsentrasi 10 mg/mL yang berupa larutan
jernih tidak berwarna. Lalu larutan induk tersebut diencerkan dalam 1mg/mL, 2
mg/mL, 3 mg/mL, 4 mg/mL, dan 5 mg/mL. Labu ukur yang digunakan untuk
pengenceran adalah labu ukur 10 mL. Kemudian kelima larutan standart dengan
berbagai konsentrasi tersebut diambil 1 mL dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi.
Kemudian kelima larutan standar tersebut ditambahkan reagen biuret sebanyak 5 mL.
Reagen biuret ini berfungsi untuk mengidentifikasi adanya ikatan peptida pada protein.
Reagen ini mengandung NaOH dan CuSO4. Penambahan reagen biuret akan
menghasilkan warna ungu dimana warna ungu dihasilkan dari reaksi antara reagen
biuret dengan protein yang menghasilkan suatu senyawa kompleks. Warna dari larutan
protein berbeda-beda dari berbagai konsentrasi. Semakin besar konsentrasi yang
digunakan maka semakin pekat warna yang terbentuk, dan begitu juga sebaliknya.

Dibawah ini merupakan reaksi dari reagen biuret dengan protein:

CuSO4.5H2O + 2NaOH Cu(OH)2 + Na2SO4 + 5H2O

Cu(OH)2 ↔ Cu2+ + 2OH-

 (aq) + Cu2+ (aq) → (aq)
Setelah penambahan biuret, larutan dikocok dan diinkubasikan pada suhu
37ºC selama 10 menit sampai terbentuk warna ungu yang stabil atau sempurna.
Inkubasi menggunakan penangas air, suhunya diukur sampai 37 ºC, kemudian diambil
dan didiamkan pada suhu ruang. Inkubasi/pemanasan yang dilakukan untuk
mempertajam warna dari hasil reaksi larutan protein dengan reagen biuret.

Dengan terbentuknya kompleks berwarna ungu tersebut maka larutan

dapat di uji pada instrumen sprktofotometer UV-Vis karena pada instrumen tersebut
hanya dapat membaca rentang panjang gelombang pada daerah visible. Warna ungu
yang terbentuk membuatnya dapat terdeteksi karena pada dasarnya warna ungu ada
pada rentan panjang gelombang daerah visible yaitu sekita 495-570 nm. Pada
percobaan ini semua larutan diukur absorbansinya pada panjang gelombang 540 nm.
Setelah di uji pada instrumen spektrofotometer UV-VIS di dapatkan data sebagai
berikut :

Konsentrasi
(mg/mL) absorbansi
1 0,061
2 0,089
3 0,125
4 0,131
5 0,175

Yang menunjukkan grafik seperti dibawah ini :

 Kurva Standar Protein
0.2
0.18 y = 0.027x + 0.0352
0.16 R² = 0.9667
0.14
0.12
0.1
0.08
0.06
0.04
0.02
0
0 1 2 3 4 5 6

Kurva ini menunjukkan bahwa hasil percobaan sesuai dengan teori bahwa
konsentrasi protein berbanding lurus dengan absorbansi pada panjang gelombang
maksimum. Semakin tinggi konsentrasi larutan maka semakin pekat warna larutan, dan
didapatkan persamaan regresi y = 0,027x + 0,0352.

3. Penetapan absorbansi larutan blanko

Penetapan absorbansi larutan blanko berfungsi sebagai faktor pengurang dari

absorbansi standar dan sampel. Untuk penetapan absorbansi pada larutan blanko
memiliki perlakuan yang sama pada pembuatan standar. Namun pada percobaan
penentuan absorbansi larutan blanko hanya memerlukan 1 tabung reaksi. Tabung reaksi
diisi dengan 1 ml aquades, kemudian ditambahkan 5 ml reagen biuret ke dalam tabung.
Reagen biuret ini berfungsi untuk mengidentifikasi adanya ikatan peptida pada protein.
Aquades tidak mengandung protein jadi warna larutan menjadi seperti reagen biuret,
yaitu biru jernih.

Lalu diinkubasikan pada suhu 37oC selama 10 menit sampai terbentuk warna
ungu yang stabil atau sempurna. Inkubasi menggunakan penangas air, suhunya diukur
sampai 37ºC, Inkubasi yang dilakukan untuk mempertajam warna dari hasil reaksi
larutan dengan reagen biuret. Warna larutan yang diperoleh setelah inkubasi ini adalah
biru jernih. Kemudian diukur absorbansi aquades pada panjang gelombang 540 nm
dengan alat spektrofotometri UV-Vis. Aquades menghasilkan nilai absobansi = 0.
4. Penentuan absorbansi larutan sampel

Penetapan hasil absorbansi ini digunakan untuk menentukan konsentrasi

sampel. Tabung reaksi diisi 1 mL sampel, kemudian ditambahkan 5 mL reagen biuret
ke dalam tabung. Warnanya menjadi biru. Reagen biuret ini berfungsi untuk
mengidentifikasi adanya ikatan peptida pada protein.

CuSO4.5H2O + 2NaOH Cu(OH)2 + Na2SO4 + 5H2O

Cu(OH)2 ↔ Cu2+ + 2OH-

(aq) + Cu2+ (aq) → (aq)

Lalu diinkubasikan pada suhu 37 ºC selama 10 menit sampai terbentuk warna ungu
yang stabil. Inkubasi menggunakan penangas air, suhunya diukur sampai 37 ºC.
Inkubasi yang dilakukan untuk mempertajam warna dari hasil reaksi larutan dengan
reagen biuret. Warna larutan yang terbentuk setelah diinkubasi selama 10 menit
berwarna biru. Kemudian diukur absorbansi larutan sampel pada panjang gelombang
540 nm dengan alat spektrofotometri UV-Vis. Untuk mendapatkan kadar protein pada
sampel ikan lele maka diperlukan nilai persamaan regresi yang terdapat pada larutan
standar tadi. Dengan perhitungan sebagai berikut :

Dimana :
Y (absorbansi sampel) = 0,359
X (konsentrasi protein)
Y = 0,027 x + 0,0352
0,359 = 0,027 x + 0,0352
0,359 - 0,0352= 0,027 x
0,3238 = 0,027 x
x = 11,99 mg/mL
 Dari data hasil percobaan didapatkan konsentrasi sampel sebesar 11,99 mg/mL. Dan
di peroleh kadar protein dalam ikan lele dengan perhitungan sebagai berikut :

𝑘𝑜𝑛𝑠𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑠𝑖 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙
%kadar = 𝑥100%
𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙
11,99
%kadar = 𝑥100%
1003,9
= 11,94%
Berdasarkan perhitungan didapatkan kadar protein pada sampel ikan lele sebesar
11,94% . Sedangkan kadar protein dalam ikan lele secara teori adalah 17,7 %
(Astawan, 2008).

IX. Kesimpulan
Berdasarkan percobaan yang telah dilakukan, dapat disimpulkan bahwa :
1. Uji biuret dapat digunakan untuk uji protein secara umum karena reagen biuret
hanya akan berikatan dengan ikatan polipeptida pada protein.
2. Di dapatkan nilai persamaan regresi sebesar y = 0,027x + 0,0352.
3. Didapatkan kadar protein pada sampel ikan lele sebesar 11,94%.
Jawaban Pertanyaan
1. Buatlah kurva standar konsentrasi vs absorbansi! Dengan bantuan kurva standar tersebut,
tentukan kadar protein sampel!

kurva standar konsentrasi vs absorbansi

0.2
0.18 y = 0.027x + 0.0352
0.16 R² = 0.9667
0.14
0.12
0.1
0.08
0.06
0.04
0.02
0
0 1 2 3 4 5 6

Kadar protein pada sampel dapat ditentukan dengan menghitung dari konsentrasi
saat pengujian UV-Vis, dengan mensubstitisi persamaan regresi yang telah didapat
perhitungan sebagai berikut :

Y (absorbansi sampel) = 0,359

X (konsentrasi protein)
Y = 0,027 x + 0,0352
0,359 = 0,027 x + 0,0352
0,359 - 0,0352= 0,027 x
0,3238 = 0,027 x
x = 11,99 mg/mL

Perhitungan %kadar protein pada sampel :

𝑘𝑜𝑛𝑠𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑠𝑖 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙
%kadar = 𝑥100%
𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙
11,99
%kadar = 𝑥100%
1003,9
= 11,94%
2. Apakah peptida akan memberikan reaksi positif terhadap pereaksi biuret? Jika
benar demikian, bagaimana menemukan kadar protein yang tercampur dengan
peptida ?

Peptida akan memberikan reaksi positif terhadap pereaksi biuret. Untuk

menemukan kadar protein yang tercampur dengan peptida yaitu dengan melakukan uji
protein dengan metode biuret. Metode biuret bertujuan untuk menguji adanya ikatan
peptida pada protein yang akan diuji. Dalam reaksi ini sampel protein ditambahkan
beberapa tetes larutan CuSO4 dan ditambah larutan NaOH sehingga akan menghasilkan
larutan yang berwarna merah kemudian berubah menjadi warna ungu. Dalam keadaan
basa, dengan metode biuret akan memberikan warna violet dengan adanya senyawa
CuSO4.