Anda di halaman 1dari 8

PEWARNAAN BAKTERI GRAM POSITIF DAN NEGATIF

1. TUJUAN : Mengetahui dan memahami prosedur pewarnaan gram dan mengelompokan


bakteri kedalam kelompok gram negatif

2. DASAR TEORI
Bakteri adalah domain yang terdiri dari makhluk hidup yang tidak memiliki membran
inti (prokariota). Bakteri memiliki beragam variasi bentuk,seperti coccus, basil, dan spiral,
serta dapat hidup soliter maupun berkoloni.Habitat bakteri sangat bervariasi, dari air, tanah,
udara, hingga dalam tubuhhewan, (Betsy dan Keogh. 2005). Bakteri umumnya tidak memiliki
pigmensehingga tidak berwarna dan hampir tidak kelihatan karena tidak kontrasdengan
medium dimana mereka hidup.

Oleh karena itu, perlu dilakukanpewarnaan agar bakteri tampak jelas bila diamati dengan
mikroskop (Harleydan Presscot, 2002). Pewarnaan dikelompokkan menjadi pewarnaan
langsungdengan pewarnaan basa, pewarnaan tak langsung atau pewarnaan negatif
danpewarnaan gram (Dwidjoseputro, 2003). Pewarnaan basa adalah pewarnaanyang langsung
mewarnai bakteri. Pewarnaan negatif adalah pewarnaan yangtidak langsung mewarnai
bakteri, melainkan mewarnai latar belakang preparatbakteri tersebut. Pewarnaan ini dilakukan
dengan menggunakan pewarna yangbersifat asam seperti nigrosin atau tinta cina (Harley dan
Presscot, 2002).

Pewarnaan gram merupakan pewarnaan umum dalam bidang bakteriologi.Dengan pewarnaan


ini, kelompok bakteri dibedakan menjadi dua yaitu bakterigram positif dan bakteri gram
negatif (Ramona dkk, 2007). Hasil akhir daripewarnaan gram adalah bakteri gram positif akan
berwarna ungu/biru,sementara bakteri gram negatif akan berwarna merah (Harley dan
Presscot,2002)

Pewarnaan garam atau metode Gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan spesies
bakteri menjadi dua kelompok besar, gram positif dan gram negatif, berdasarkan sifat kimia
dan fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuan
Denmark Hans Cristian Gram (1853-1938) yang mengembangkan tehnik ini pada tahun 1884
untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri klebsiella pneumoniae.

Bakteri gram negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada
metode pewarnaan gram bakteri gram positif akan mempertahankan warna ungu gelap setelah
dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram negatif tidak. Pada uji pewarnaan gram, suatu
pewarnaan penimbang (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu yang membuat semua
bakteri gram negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk
mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka.

Banyak spesies bakteri gram negatif yang bersifat patogen,yang berarti mereka berbahaya
bagi organisme inang. Sifat potogen ini berkaitan dengan komponen tertentu pada dinding sel
gram negatif, terutama lapisan lipopolisakarida (dikenal juga dengan LPS atau Endotoksin).

Tujuan pewarnaan yaitu :

 Mempermudah melihat bentuk jasad, baik bakteri, ragi, ataupu fungi.


 Memperjelas ukuran dan bentuk jasad.
 Melihat struktur luar dan kalau memungkinkan juga struktur dalam jasad.
 Melihat reaksi jasad terhadap pewarna yang di berikan sehingga sifat-sifat fisik dan kimia
yang ada akan dapat di ketahui.
Pewarnaan pada bakteri dibagi menjadi tiga, yaitu :

1. Pewarnaan sederhana
Pewarnaan sederhana merupakan teknik pewarnaan yang paling banyak digunakan. Disebut
sederhana karena hanya menggunakan satu jenis zat warna untuk mewarnai organisme
tersebut. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarnaan-pewarnaan sederhana karena
sitoplasamanya bersifat basofilik (suka dengan basa). Zat-zat warna yang digunakan untuk
pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkolin. Dengan pewarnaan sederhana dapat
mengetahui bentuk dan rangkaian sel-sel bakteri. Pewarna basa yang biasa digunakan untuk
pewarnaan sederhana ialah metilen biru, kristal violet, dan karbol fuehsin yang mana
pewarnaan sederhana ini dibagi lagi menjadi dua jenis pewarnaan.

1. Pewarnaan Asam
Merupakan pewarnaan yang menggunakan satu macam zat warna dengan tujuan hanya untuk
melihat bentuk sel. Adapun zat warna yang dipakai dalam pewarnaan positif adalah metilen
biru dan air furksin.

1. Pewarnaan Basa
Pewarnaan basa atau negatif merupakan metode pewarnaan untuk mewarnai bakteri tetapi
mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan ini mikroorganisme
kelihatan transparan (tembus pandang). Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan
ukuran sel. Metode ini menggunakan cat nigrosin atau tinta cina.
2. Pewarnaan Diferensial (Gram)
Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan spesies
bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram positif dan gram negatif, berdasarkan sifat
kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan
Denmark Hans Christian Gram (1853–1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun
1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae. Bakteri
Gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode
pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan zat warna metil ungu gelap
setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram negatif tidak. Pada uji pewarnaan
Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat
semua bakteri gram negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna
untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel
mereka.

1. Bakteri Gram Negatif


Bakteri gram negative adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada
metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan warna ungu gelap
setelah dicuci dengan alcohol, sementara bakteri gram negative tidak.

1. Bakteri Gram Positif


Bakteri gram positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna metil ungu sewaktu
proses pewarnaan Gram. Bakteri jenis ini akan berwarna biru atau ungu di bawah mikroskop,
sedangkan bakteri gram negative akan berwarna merah muda. Perbedaan klasifikasi antara
kedua jenis bakteri ini terutama didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel bakteri
(Aditya,2010)

Bakteri gram negatif memiliki 3 lapisan dinding sel. Lapisan terluar yaitu lipoposakarida
(lipid) kemungkinan tercuci oleh alkohol, sehingga pada saat diwarnai dengan safranin akan
berwarna merah. Bakteri gram positif memiliki selapis dinding sel berupa peptidoglikan yang
tebal. Setelah pewarnaan dengan kristal violet, pori-pori dinding sel menyempit akibat
dekolorisasi oleh alkohol sehingga dinding sel tetap menahan warna biru (Fitria, 2009).

Sel bakteri gram positif mungkin akan tampak merah jika waktu dekolorisasi terlalu lama.
Sedangkan bakteri gram negatif akan tampak ungu bila waktu dekolorisasi terlalu pendek
(Fitria, 2009).
Perbedaan relatif sifat bakteri gram positif dan gram negatif.

Sifat Bakteri garam (+) Bakteri gram negatif(-)

Kandungan lipid rendah (1-


Komposisi dinding sel 4%) Kandungan lipid tinggi

Ketahanan terhadap
penisilin Lebih sensitif Lebih tahan

Penghambatan oleh
pewarna basa (VK) Lebih dihambat Kurang dihambat

Kebanyakan spesies relatif


Kebutuhan nutrisi kompleks Relatif sederhana

Ketahanaa terhadap
perlakuan fisik
Lebih tahan Kurang tahan
(Manurung, 2010).

Pewarnaan tahan asam yang umum digunakan adalah pewarnaan Zieh – Neelson dengan
pewarna utama karbol fuksin dengan pemanasan dan pewarna tandingan metilen blue
Loeffler. Perlakuan panas tersebut diganti dengan penggunaan pembasah yaitu suatu deterjen
untuk mengurangi tegangan permukaan lemak, untuk menjamin penetrasi. Pewarna yang
mengandung pembasah ini disebut pewarna Kinyoun (Purwoko, 2010).

3. Metode
 Alat dan Bahan
 Alat
i) Kaca Objek
ii) kapas.
iii) Mikroskop
iv) Jarum Ose
v) Pembakar Spirtus
 Bahan
(i) Aquadset steril
(ii) Cat : crystal violet, lugol, etanol, safranin
(iii) Biakan murni: kliebsiella
 Cara Kerja
1. Dibersihkan dengan menggunakan spirtus Dikeringkan dengan cara dianging-anginkan
pada api Kaca objek yang telah steril Ditetesi aquades
2. Jarum ose dibakar sampai merah
3. Sampel Diambil menggunakan jarum ose (medianya jangan sampai terambil). Disimpan
di atas kaca objek Aduk pelan-pelan sampai tercampur dengan aquades yang telah ada
pada kaca objek
4. Kaca objek yang telah berisi sampel Dikeringkan dengan cara dipanaskan di atas api
kecil.
5. Ditetesi violet sampai sampel bakteri terendam (diamkan selama 1 menit) Dicuci
dengan air yang mengalir
6. Ditetesi lugol sampai sampel bakteri terendam (diamkan selama 1 menit) Dicuci dengan
air yang mengalir
7. Ditetesi etanol ( diamkan selama 45 detik) Dicuci dengan air yang mengalir
8. Ditetesi safranin sampai sampel bakteri terendam (diamkan selama 1 menit) Dicuci
dengan air yang mengalir Dikeringkan pada udara terbuka

4. Hasil dan Pembahasan

Pewarnaan Gram adalah pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan paling
banyak digunakan dalam laboratorium mikrobiologi, karena merupakan tahapan penting
dalam langkah awal identifikasi. Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau tipisnya
lapisan peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak pada membran
sel bakteri. Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan gram dibagi menjadi dua yaitu gram
positif dan gram negatif. Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang tebal dan
membran selselapis. Sedangkan baktri gram negatif mempunyai dinding sel tipis yang
berada di antara dua lapis membran sel (Manurung, 2010).Penambahan violet pada
bakteri. Kristal violet merupakan reagen yang berwarna ungu. Kristal violet ini
merupakan pewarna primer (utama) yang akan memberi warna pada mikroorganisme
target. Kristal violet bersifat basa sehingga mampu berikatan dengan sel mikroorganisme
yang bersifat asam. Dengan perlakuan seperti itu, sel mikroorganisme yang transparan
akan terlihat berwarna (ungu). Pemberian kristal violet pada bakteri gram positif akan
meninggalkan warna ungu muda. Perbedaan respon terhadap mekanisme pewarnaan gram
pada bakteri adalah didasarkan pada struktur dan komposisi dinding sel bakteri. Bakteri
gram negatif mengandung lemak dalam persentasi lebih tinggi dan dinding selnya tipis.
Kristal violet yang diteteskan didiamkan selama 1 menit bertujuan agar cat atau pewarna
ini dapat melekat sempurna pada dinding sel bakteri.Penambahan lugol pada bakteri.
Lugol merupakan pewarna Mordan, yaitu pewarna yang berfungsi memfiksasi pewarna
primer yang diserap mikroorganisme target atau mengintensifkan warna utama.
Pemberian lugol pada pengecatan Gram dimaksudkan untuk memperkuat pengikatan
warna oleh bakteri. Kompleks zat lugol terperangkap antara dinding sel dan membran
sitoplasma organisme gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel
organisme gram negatif dengan pencucian etanol memungkinkan hilang dari sel. Lugol
yang diteteskan didiamkan selama 1 menit bertujuan agar pengikatan warna oleh bakteri
menjadi semakin lebih kuat. Selanjutnya, 1 tetes etanol diteteskan di atas objek glass
tersebut kemudian didiamkan selama 45 detik. Setelah itu, kaca objek dibilas dengan air
hingga warnanya hilang. Etanol merupakan solven organik yang berfungsi untuk
membilas (mencuci)atau melunturkan kelebihan zat warna pada sel bakteri
(mikroorganisme). Tercuci tidaknya warna dasar tergantung pada komposisi dinding sel,
bila komponen dinding selkuat mengikat warna, maka warna tidak akan tercuci
sedangkan bila komponen dinding sel tidak kuat menelan warna dasar, maka warna akan
tercuci. Pemberian etanol pada pengecatan ini dapat mengakibatkan terjadinya dua
kemungkinan yaitu mikroorganisme(bakteri) akan tetap berwarna ungu atau bakteri
menjadi tidak berwarna. Pemberian etanol juga menyebabkan terekstraksi lipid sehingga
memperbesar permeabilitas dinding sel.Selanjutnya diteteskan 1 tetes safranin di atas
kaca objek tersebut kemudian didiamkan selama 1 menit. Setelah itu, kaca objek dibilas
dengan air hingga warnanya hilang. Safranin merupakan pewarna tandingan atau pewarna
sekunder. Zat ini berfungsi untuk mewarnai kembali sel-sel yang telah kehilangan
pewarna utama setelah perlakuan dengan alkohol. Dengan kata lain, safranin memberikan
warna pada mikroorganisme non targetserta menghabiskan sisa-sisa cat atau pewarna.
Pewarnaan safranin masuk ke dalam seldan menyebabkan sel menjadi berwarna merah
pada bakteri gram negatif .Pemberian reagen atau pewarna yang berganti dari satu
pewarna ke pewarna lain dengan waktu yang telah ditentukan disebabkan karena zat-zat
warna tersebut dapat berikatan dengan komponen dinding sel bakteri dalam waktu
singkat. Karena itulah rentang waktu pemberian zat warna yang satu ke yang lainnya
tidak lama sehingga proses identifikasi bakteri berlangsung cepat. Setiap akhir pemberian
reagen atau pewarna, selalu dilakukan pembilasan terhadap kaca objek dengan
menggunakan air. pembilasan ini bertujuan untuk mengurangi kelebihan setiap zat warna
yang sedang diberikan. Setiap akhir pembilasan pada masing-masing reagen, perlu
dilakukan penyerapan air bilasan dari air dengan menggunakan kertas tissu agar aquades
tidak tercampur dengan reagen atau pewarna baru yang akan diberikan. Setelah
pembilasan terakhir, gelas benda dikeringkan dan diamati di bawah mikroskop. Jika
terbentuk warna ungu maka termasuk golongan bakteri gram positif , dan jika terbentuk
warna merah atau merah muda maka termasuk golongan bakteri gram negatif.
5. Kesimpulan
Dari praktikum ini dapat disimpulkan bahwa, bakteri kliebsiella yang berwarna merah
merupakan gram negatif

Daftar Pustaka

Aditya,Mushoffa.2010.
TeknikPewarnaanBakteri.
http://mushoffaditya.blogspot.com/2010/01/teknik-pewarnaan-bakteri.html. 11 November
2010
[http://mushoffaditya.blogspot.com/2010/01/teknik-pewarnaan-bakteri.html.
%2011%20November%202010]
Fitria, Bayu. 2009.
Pewarnaan Gram (Gram positif dan Gram Negatif).
http://biobakteri.wordpress.com/2009/06/07/7-pewarnaan-gram-gram-positif-dan-gram-
negatif.11 November 2010
[http://biobakteri.wordpress.com/2009/06/07/7-pewarnaan-gram-gram-positif-dan-
gram-negatif.%2011%20November%202010]
.Hadioetomo, R. S. 1993.
Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek
. Jakarta : Gramedia