Pengumpulan Spesimen Urin Setelah Hubungan Seksual Konsensual Metode

Pengumpulan Bukti-Bukti Forensik Untuk Y-Dna Dan Spermatozoa.

Abstrak:

Tujuan dari penelitian prospektif adalah untuk mengevaluasi manfaat spesimen urin
sebagai koleksi teknik untuk bukti forensik biologis pada sukarelawan dewasa setelah
hubungan seksual. Untuk mendeteksi materi Y-kromosomal Buccal Swab Spin Protocol®
digunakan dalam ekstraksi dan pemurnian DNA dan sampel dianalisis dengan QuantIFiler Y
Human Male DNA Quantification Kit®. Jangka waktu untuk Y-DNA positif dievaluasi.
Segera mikroskop untuk deteksi spermatozoa dilakukan.
Y-DNA terdeteksi pada 173/205 (84,4%) sampel urin. Dari 86 sampel urine void post-
coital pertama yang tersedia, Y-DNA terdeteksi pada 83 (96,5%) spesimen. Dari 119 sampel
urin dari relawan dengan aktivitas pasca-kopling, Y-DNA masih dapat diukur pada 70
(58,8%) spesimen urin. Jumlah DNA pria di bawah 0,023 ng / ml dalam 28/153 (18,3%)
sampel urin. Dari 22 sampel urin yang diperoleh setelah 24 jam post-coital, 9 (40,9%) masih
positif Y-DNA.
Tidak ada hubungan yang ditemukan antara coital durance, frekuensi coital selama
dua minggu sebelum studi hubungan seksual, kegiatan pasca-koital, dan sampel urin Y-DNA
positif. Dari 111 sampel urin di mana mikroskop segera dilakukan, di 66 (59,5%) sampel
spermatozoa diverifikasi dan satu sampel bahkan mengandung motil spermatozoa.
Mikroskopi terdeteksi 66 (67,3%) dan gagal mendeteksi spermatozoa pada 32 (32,7%)
sampel positif Y-DNA.
Selain teknik swab invasif konvensional, sampel urin tampaknya menjadi metode
pengumpulan jejak biologis yang efektif untuk Y-DNA dan spermatozoa dalam 24 jam
setelah penetrasi penis-vagina.
Selanjutnya, ini dapat dianggap sebagai metode pengumpulan non-invasif dalam
dugaan kasus pelecehan seksual anak akut untuk mengurangi waktu tunda dalam
pengumpulan bukti forensik dan untuk meningkatkan sikap positif pasien terhadap
pengumpulan bukti.
 1. Pendahuluan
Dalam dugaan kekerasan seksual, bukti jejak biologis paling sering dikumpulkan
dengan penyeka dari area anogenital. Kemungkinan menggunakan urin sebagi alat untuk
pengumpulan bukti jarang dipertimbangkan.
Ide pengumpulan sampel urin untuk tujuan forensik didasarkan pada anatomi dan
fisiologi manusia. Pada wanita, lubang uretra di daerah vulva terletak di sebelah pembukaan
himen vagina. Selama berkemih (kencing) , aliran sekresi vagina meningkat karena relaksasi
fisiologis dasar panggul dan karena peningkatan tekanan perut. Urin membilas area vulvar
periuretral dan lubang vagina dan dapat dikumpulkan untuk analisis lebih lanjut.
Kami menemukan hanya satu penelitian di Australia baru-baru ini di mana frekuensi
spermatozoa dianalisis dari spesimen urin pertama. Mereka mendeteksi spermatozoa pada
35% spesimen urin pertama yang diambil setelah diduga setelah ada penetrasi penis-vagina.
Sepengetahuan kami, tidak ada penelitian yang diterbitkan yang menganalisis frekuensi
spermatozoa untuk periode yang lebih lama daripada dari void(kencing) urin pertama.
Meskipun identifikasi DNA digunakan untuk mendapatkan bukti dalam serangan seksual,
analisis Y-DNA urin belum dilakukan untuk tujuan forensik.
Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengevaluasi tingkat deteksi YDNA dalam
sampel urin post-coital dan untuk mengevaluasi kerangka waktu untuk Y-DNA positif setelah
hubungan seksual dan tingkat deteksi spermatozoa dalam sampel urin.
2. Bahan dan Metode
2.1 Karakteristik Peserta
Relawan wanita, yang terdiri dari mahasiswa kedokteran atau laboratorium, karyawan
atau kenalan rumah sakit, diundang untuk berpartisipasi dalam penelitian yang
mengumpulkan dan menganalisis sampel urin setelah hubungan seksual melalui vagina dari
Mei 2008 hingga Desember 2009 baik oleh undangan pribadi atau oleh undangan kolektif
setelah ceramah. 90 relawan mengambil bagian dalam penelitian ini. Dua relawan
dikeluarkan karena kesalahpahaman dalam mengisi formulir informasi studi. 88 relawan
dilibatkan dalam penelitian ini. Sebagian besar peserta studi telah berpartisipasi juga dalam
penelitian lain yang mengevaluasi pengumpulan bukti forensik.
Para wanita diinstruksikan untuk mencatat waktu hubungan terakhir mereka sebelum
pengumpulan urin yang diteliti, waktu pengumpulan sampel urin dan mana dari kekosongan
post-coital berturut-turut (1, 2 dll.) Dikumpulkan sebagai spesimen. Riwayat medis diberikan
oleh relawan menggunakan formulir. Kontrasepsi, waktu hubungan seksual sebelum
hubungan seksual untuk pengambilan sampel, frekuensi hubungan seksual dalam dua minggu
terakhir sebelum pengambilan sampel, kegiatan setelah berhubungan seksual (menyeka,
mencuci, mandi, pergi ke sauna, buang air kecil, buang air besar) dan durasi hubungan
seksual dicatat.
2.2 Koleksi Sampel
Setelah hubungan seksual, relawan disarankan untuk membatalkan ke dalam botol
koleksi (volume 500 ml, Sarstedt prod. No 77.582, Jerman) sehingga tepi botol koleksi akan
menempel erat ke perineum. Tujuannya adalah untuk mengumpulkan aliran cairan vagina
sebanyak mungkin ke dalam botol koleksi ketika secara fisiologis mengendurkan otot-otot
dasar panggul saat buang air kecil. Volume urin dikumpulkan sebanyak mungkin ke dalam
botol koleksi. Para relawan disarankan untuk tidak khawatir jika volume urin melebihi
volume botol koleksi. Sampel urin post-coital voiding pertama diinstruksikan untuk
dikumpulkan tanpa mencuci atau tanpa kegiatan pasca-coital lainnya. Kegiatan pasca-
kooperasi diizinkan untuk sampel urin yang dikumpulkan berikut.
Botol koleksi sekali pakai digunakan untuk setiap episode pengosongan. Botol koleksi
urin (s) digunakan untuk melestarikan urin di lemari es. Botol koleksi diberi label oleh (1)
nomor studi yang diberikan kepada sukarelawan sebelumnya selama undangan dan relawan
(2) menghitung waktu pengosongan post-coital dan menandainya di sisi botol koleksi. Botol
koleksi dikembalikan ke pemeriksa sesegera mungkin tetapi tidak lebih dari 5 hari.
Waktu dari hubungan seks yang diteliti, waktu dari sampel urin yang terkumpul,
kegiatan pasca-koital, dan penomoran waktu pengosongan post-coital dicatat pada formulir
informasi penelitian.
2.3 Ekstraksi dan kuantifikasi DNA
Jumlah urin dan pH urin diukur. Seluruh volume dalam sampel urin disentrifugasi
selama 10 menit pada 3000 rpm dan supernatan dituangkan. Setelah sentrifugasi supernatan
(urin) dituangkan keluar dan deposit seluler di dasar tabung centrifuge dikumpulkan untuk
analisis. Dari 200 µl sel pellet DNA diekstraksi menggunakan QIAamp DNA Mini Kit®
(Qiagen, Jerman). Langkah-langkah sentrifugasi dilakukan pada suhu kamar sesuai dengan
protokol.
Quantifiler Y Human DNA Quantification Kit® (Applied Biosystems, USA)
digunakan untuk mengukur jumlah total DNA manusia manusia yang dapat diperkuat. Reaksi
PCR dan analisis dilakukan dengan AbiPrism® 7000 HT Sequence Detection System
(AppliedBiosystems, USA) sesuai dengan petunjuk yang diberikan. PCR metode QuantIFiler
Y Human Kit DNA Characterification Kit® adalah standar dan kami menggunakan air yang
direkomendasikan sebagai kontrol kosong di samping langkah-langkah pemurnian dan
amplifikasi. Sampel dianggap positif jika jumlah DNA yang dapat diukur terdeteksi. Batas
cut-off untuk kemungkinan identifikasi DNA laki-laki dianggap 0,01 ng / ml dan sesuai
dengan batas cutoff yang direkomendasikan 0,023 ng / µl untuk Quantifiler Y.
2.4 Analisis mikroskopis
Mikroskopi segera dilakukan dalam subset dari 111 (54,1%) sampel urin dari 47
relawan di laboratorium forensik. Parameter berikut diperiksa: volume, motilitas dan
kepadatan sperma. Kepadatan dikategorikan ke tidak ada sperma, beberapa sperma (1-10 /
slide), jumlah sedang (10-50 / slide), dan banyak (> 50 / slide). Pemeriksaan dilakukan sesuai
dengan manual laboratorium WHO 1999. Setiap sampel ditangguhkan pada slide dengan
mencampur sampel dengan sejumlah kecil media kultur (5 ml). Persiapan tertutup diperiksa
di bawah mikroskop. Semua sampel diperiksa dengan mikroskop fase kontras (pembesaran
10 x 20).
2.5. Masalah kontaminasi
Kemungkinan kontaminasi harus dipertimbangkan. Semua proses sampel urin,
ekstraksi dan langkah amplifikasi dilakukan oleh peneliti wanita yang sama untuk
menghindari kontaminasi YDNA sekunder. Sarung tangan bebas-bedak sekali pakai
digunakan dan sering diganti untuk meminimalkan risiko kontaminasi.
2.6. Pertimbangan etis
Protokol penelitian telah disetujui oleh Komite Etika (# R08018) dari Putimaa
Hospital District, Finlandia. Persetujuan tertulis diperlukan untuk partisipasi dalam
penelitian, untuk analisis laboratorium forensik dan untuk tujuan publikasi. Tidak ada data
dari rekam medis pasien yang dikumpulkan. Anonimitas penuh dijamin dalam penyimpanan
dan analisis laboratorium.
2.7. Pertimbangan statistik
Hasilnya diringkas oleh statistik deskriptif; median dengan rentang atau frekuensi (n)
dan persentase (%). Perbedaan antara deteksi Y-DNA dan spermatozoa dianalisis
menggunakan tes McNemar. Uji Chi-square digunakan untuk membandingkan hasil
mikroskopi kami pada tingkat spermatozoa terdeteksi di urin void pertama hasil penelitian
oleh Smith et al. (2014). SPSS 21 digunakan untuk analisis data (IBM Corp Dirilis 2012.
IBM SPSS Statistics untuk Windows, Versi 21.0. Armonk, NY: IBM Corp).
About Google TranslateCommunityMobileAbout GooglePrivacy & TermsHelpSend
feedback.
3. Hasil
3.1. Karakteristik relawan
Rentang usia adalah 20-52 tahun (median umur 26,5 tahun). Delapan korban
relawan Kaukasus perempuan dilibatkan dalam penelitian ini. Semua penetrasi penis-
vagina yang dilaporkan. Sebagian besar relawan berpartisipasi dalam studi klinis lainnya
oleh kelompok studi.
3.2. Deteksi Y-DNA dalam sampel urin
Penelitian ini terdiri dari 205 spesimen urin. Volume urine rata-rata adalah 175 ml
(kisaran 2-550 ml, Q1 = 90 ml, Q3 = 290 ml). PH urin rata-rata adalah 6,3 (kisaran 4,8 -
8,2). Tidak ada hubungan yang ditemukan antara volume urin, pH urine dan pengukuran
DNA pria.
Y-DNA dapat diukur dalam 173/205 (84,4%) spesimen urin, median 0,68 ng / µl
(kisaran 0,0009-121,8 ng /µl). Dari 86 spesimen void urin post-coital pertama yang
tersedia, Y-DNA terdeteksi pada 83 (96,5%) spesimen. Y-DNA masih dapat diukur dalam
spesimen urin dari 70/119 (58,8%) dari relawan dengan kegiatan pasca-koital (Tabel 1).
Waktu median dari hubungan seksual konsensual untuk koleksi spesimen urin
adalah 5 jam (kisaran 0,08-96,33 jam). Waktu median untuk DNA pria yang dapat diukur
adalah 9,2 jam (kisaran 0,08-52,5 jam). Sebagian besar (89,3%) dari spesimen urin
dikumpulkan dalam 24 jam post-coital (Gambar 1 dan 2). Setelah 24 jam post-coital Y-
DNA dapat diukur dalam 9/22 (40,9%) spesimen urin.
Tidak ada hubungan yang ditemukan antara durasi hubungan, frekuensi coital
selama dua minggu sebelum studi hubungan seksual, kegiatan pasca-koital, dan spesimen
spesimen Y-DNA.
3.3. Batas cut-off untuk kemungkinan identifikasi DNA dalam sampel urin
Batas cut-off untuk kemungkinan identifikasi DNA laki-laki secara hipotetis
dianggap 0,01 ng / µl. Y-DNA> 0,01 ng / µl dihitung dalam 153/205 (74,6%) spesimen
urin. Rerata> 0,01 ng / µl kuantitas Y-DNA adalah 4,2 ng / µl (median 0,9 ng / µl; kisaran
0,01-121,8 ng / µl) (Gambar 3). Identifikasi DNA hipotetis juga diperkirakan sesuai
dengan batas cut-off yang direkomendasikan sebesar 0,023 ng / µl untuk Quantifiler Y.
Jumlah DNA pria di bawah 0,023 ng / µl dalam 28/153 (18,3%) sampel urin.
Setelah 24 jam post-coital Y-DNA tetap terukur dalam spesimen urin 9/22 (40,9%;
kisaran 0,0013-6,6 ng / µl). Dan dalam lima spesimen yang dapat diukur, Y-DNA
dikuantifikasi lebih dari 0,01 ng / µl. Salah satu spesimen urin positif bahkan pada 52,5
 jam yang mengandung 0,025 ng / µl Y-DNA, sehingga masih cukup untuk identifikasi
DNA yang mungkin.
Tabel 1
DNA laki-laki yang terukur dalam spesimen urin yang dikumpulkan setelah hubungan
seksual berdasarkan konsensual sesuai dengan jumlah post-coital berkemih.

3.4. Mikroskop fase kontras segera

Mikroskopi fase kontras segera dilakukan pada subset dari 111 spesimen urin dari 47
relawan. Mikroskopi segera diverifikasi spermatozoa dalam 24 jam di 66 (59,5%) sampel;
beberapa di 29 (26,1%), jumlah moderat dalam 15 (13,5%) dan banyak di 22 (19,8%) sampel
pada 10 x 20 pembesaran.
Spermatozoa terdeteksi pada 37/44 (84,1%) pada spesimen pertama yang kosong.
Tingkat spermatozoa yang secara signifikan lebih tinggi terdeteksi ketika dibandingkan
dengan penelitian terbaru tentang Smith et al. (2014) spesimen urin air seni pertama dalam
dugaan kasus kekerasan seksual, 84% vs 35% (p <0,001).
3.5. Sensitivitas dan spesifisitas mikroskopi kontras fase segera dibandingkan dengan Y-
DNA dalam spesimen urin
Hubungan yang signifikan (p <0,001) ditemukan antara Y-DNA positif dan deteksi
sperma pada mikroskopi kontras fase segera. Mikroskopi mendeteksi 66 (67,3%) sampel Y-
DNA positif dan gagal mendeteksi spermatozoa pada 32 (32,7%) sampel positif Y-DNA.
Dibandingkan dengan Y-DNA, sensitivitas fase kontras mikroskop adalah 67,4% (95% CI;
57,1-76,5%), tetapi spesifisitas adalah 100% (95% CI; 82,2% 100%).
 4. Diskusi
Sepengetahuan kami, ini adalah studi pertama yang mengevaluasi nilai spesimen urin
setelah hubungan seksual sebagai metode pengumpulan forensik klinis untuk identifikasi Y-
DNA dan deteksi spermatozoa.
4.1. Deteksi Y-DNA dan spermatozoa
Tingkat deteksi Y-DNA dalam spesimen urin sangat tinggi ketika dikumpulkan dalam
waktu 18 jam post-coital. Secara keseluruhan, kerangka waktu untuk deteksi positif Y-DNA
adalah selama lebih dari dua hari pasca-coital(setelah berhubungan), sedangkan spermatozoa
dideteksi hingga 24 jam post-coital (setelah berhubungan) dalam spesimen urin yang
dikumpulkan. Sebagian besar spesimen urin dikumpulkan dalam 24 jam pasca-koital, tetapi
masih dalam 40% spesimen urin Y-DNA dikuantifikasi setelah 24 jam. Selanjutnya,
kemungkinan hipotetis untuk identifikasi DNA laki-laki dianggap dalam 75% spesimen urin.
Hasil kami menunjukkan bahwa spesimen urin untuk tujuan forensik dapat dikumpulkan
bahkan hingga tiga hari dalam dugaan kekerasan seksual.
Penelitian kami mendeteksi tingkat spermatozoa yang lebih tinggi secara signifikan
(84%) pada spesimen urin pertama setelah hubungan seksual ketika dibandingkan dengan
studi yang dilaporkan baru-baru ini tentang dugaan kasus kekerasan seksual di mana tingkat
deteksi spermatozoa urin pertama void adalah 35%. Perbedaan dalam tingkat deteksi
mungkin setidaknya sebagian disebabkan oleh tingkat ejakulasi yang lebih rendah dalam
kasus-kasus penyerangan.
Jumlah DNA pria yang dapat diukur (median 0,68 ng / µl) dalam spesimen urin post-
coital tampaknya lebih tinggi bila dibandingkan dengan swab vagina (median 0,06 ng / µl),
swab serviks (median 0,01 ng / µl), dan ke serviks sampel sikat (median 0,02 ng / µl)
dianalisis dengan metode kuantifikasi yang sama.
Manfaat dari spesimen urin yang dikumpulkan dengan benar adalah bahwa ia
mengumpulkan DNA pria dalam jumlah yang lebih banyak dalam sampel, dan itu adalah
metode pengumpulan non-invasif untuk tujuan forensik. Juga dapat dianggap sebagai metode
pengumpulan bukti forensik yang baik dalam kasus-kasus pelecehan seksual anak yang
diduga akut, untuk mengurangi penundaan waktu, dan untuk meningkatkan sikap positif
pasien terhadap pengumpulan bukti.
 DNA pria terdeteksi dalam sampel urin sesuai dengan waktu dari hubungan seksual
konsensual untuk koleksi spesimen urin

Proporsi DNA pria positif dalam sampel urin sesuai dengan waktu dari hubungan
seksual konsensual ke koleksi spesimen urin.
4.2 Keterbatasan studi
Faktor pembaur seperti kesalahpahaman dalam mengisi formulir informasi
studi adalah mungkin. Volume botol koleksi mungkin terlalu kecil untuk
pengumpulan volume total yang mungkin menyebabkan bias dalam volume urin.
Para relawan disarankan untuk tidak khawatir jika volume urin melebihi volume
botol koleksi. Kami berasumsi bahwa volume urin dalam koleksi sampel tidak
sepenting pengumpulan aliran cairan vagina saat buang air kecil.
Ukuran sampel pada saat ini agak kecil dan sehingga perlu untuk studi yang
lebih besar.
 Risiko kontaminasi perlu dipertimbangkan dalam penelitian ini.
Untuk mengurangi risiko kontaminasi, semua pekerjaan laboratorium adalah
dilakukan oleh peneliti perempuan. DNA pria yang dikuantifikasi mungkin
juga hasil dari sumber selain spermatozoa atau air mani seperti
sel epitel jantan.
Keterbatasan tertentu dari penelitian ini adalah kurangnya penggunaan tunggal
Y-DNA kuantifikasi PCR dan tidak menggunakan profiling Y-STR. Itu
DNA pria terdeteksi dari 0,0009 ng/µl dianggap terukur
karena kami berasumsi bahwa Y-DNA tidak dapat dideteksi dari perempuan
spesimen urin selain dari kontak dekat dengan laki-laki
orang, karena kontaminasi, atau karena XY-kromosom langka
sindrom pada wanita. Mendeteksi DNA pria dari cairan vagina wanita
kemungkinan besar bukti kontak laki-laki. Deteksi spermatozoa
dari sekresi vagina adalah bukti hubungan seksual dengan
laki-laki kecuali ada pengobatan infertilitas intra
inseminasi uterus dilakukan sesaat sebelum spesimen
koleksi. Kami tidak dapat mengesampingkan kehadiran 'laki-laki non-sperma'
DNA meskipun tidak dikenal vasektomi, azoo atau oligospermia
dilaporkan oleh para relawan. Kami tidak memiliki izin untuk itu
mengevaluasi rekam medis para sukarelawan atau pasangan mereka.
Penelitian ini mengevaluasi terutama nilai pengumpulan bukti
teknik spesimen urin untuk deteksi Y-DNA dan bukan laboratorium
teknik-teknik eksperimen PCR kuantitatif. Batasan lain
adalah stabilitas DNA yang belum terpecahkan dari urin, karena
perbedaan komposisi urin terutama dalam penyimpanan jangka panjang
kondisi, yang masih dalam pembahasan.
Sayangnya, para relawan tidak diminta pendapat mereka
kemungkinan ejakulasi atau azoospermia yang diketahui, yang mungkin
menjelaskan bagian dari hasil negatif Y-DNA. Kami berasumsi penetrasi vagina
secara sukarela untuk memasukkan ejakulasi.
 Kuantifikasi DNA laki-laki manusia dalam sampel urin yang dikumpulkan
setelah hubungan seksual sesuai waktu dan > 0,01 ng / ml batas cut-off. Satu
spesimen (121,84 ng / µl, dikumpulkan 50 menit setelah hubungan seksual)
dihilangkan dari gambar sebagai pencilan(sebuah datum yang menyimpang sangat
jauh dari datum lainnya di dalam satu sampel atau kumpulan datum (kumpulan
datum disebut data).

5. Kesimpulan
Bersama dengan teknik swab invasif konvensional, spesimen urin
koleksi dapat digunakan sebagai jejak biologis tambahan
metode pengumpulan untuk tujuan forensik. Ini bisa dianggap sebagai
teknik pengumpulan non-invasif terutama pada kecurigaan akut
kasus pelecehan seksual anak untuk mengurangi waktu tunda dan untuk
meningkatkan sikap positif pasien terhadap pengumpulan bukti. Lebih tinggi
jumlah DNA pria yang terdeteksi dalam spesimen urin akan ditawarkan
peluang yang lebih baik untuk identifikasi DNA bila dibandingkan dengan
konvensional penyeka.