Bioteknologi Farmasi

Teknik Analisis Protein Western Blot

Nama anggota kelompok :
Thiara Eka A (152210101016)
Riza Avifah (162210101092)
M Febrian Bachtiar (162210101096)
Tri Ananda A (162210101110)
Afalah Zulfa L (162210101118)
Apa itu Western Blot??
metode untuk mengidentifikasi antibodi spesifik
pada suatu protein dengan berat molekul tertentu
yang telah diseparasi. Pada awalnya berat molekul
protein diseparasi atau dipisahkan dengan
menggunakan SDS-PAGE elektroforesis kemudian
ditransfer ke kertas nitrocellulose (NC) untuk
melakukan western blot.
 Western Blotting
Untuk mengetahui keberadaan protein tertentu dalam suatu
sampel diperlukan prosedur imunodeteksi menggunakan
antibodi yang spesifik terhadap protein target. Imunodeteksi
tidak dapat dilakukan pada gel karena gel mudah rapuh
apabila diinkubasi dalam waktu lama dan dicuci berulang
kali. Oleh karena itu, protein harus diblot pada membran.
Transfer protein dari gel ke membran ini dinamakan
western blotting atau protein blotting atau imunoblotting
(Fatchiyah dkk., 2011)
Tahapan Western Blot
Elektroblotting
Elektroblotting
Imunnodeteksi
Hasil Western Blot
Prosedur Kerja
1. Menyiapkan sampel
2. Menyiapkan dapar agar pH tetap stabil
3. Menyiapkan antibodi yang digunakan sebagi pelacak
4. Melisiskan sel untuk mengeluarkan protein yang diinginkan dari sel
5. Gel elektroforesis,misalnya SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate-
Polyacrilamide Gel Electrophoresis) yang mampu mendenaturasi
polipeptida yang sebelumnya dibuang struktur sekunder dan tersiernya.
Sampel dimasukkan ke dalam sumur gel yang nantinya protein sampel
akan memiliki muatan yang sama dengan SDS yaitu negatif sehingga
bergerak menuju elektroda positif melalui jaring-jaring akrilamid
6. Transfer gel. Protein harus dipindahkan ke kertas membran misalnya
nitroselulosa atau PVDF agar dapat diakses oleh antibodi
7. Dilakukan deteksi menggunakan antibodi yang telah dimodifikasi dengan
reporter enzim. Deteksi dilakukan dengan dua tahap yaitu dengan
antibodi primer dan antibodi sekunder
8. Dilakukan analisis yang terdiri dari Colometric detection ,
Chemiluminescent, Radioactive detection, Fluorescent detection.
 Metode Blotting
Southern blot
Kegunaan Western Blot dalam
Bidang Kesehatan
• Untuk mendeteksi adanya antigen dalam tubuh
sebagai teknik diagnosa suatu penyakit yang
berbahaya seperti HIV/AIDS, Mad-Cow, Lyme,
Hepatitis.
• Transfer protein
• Penelitian mengenai spesifitas dan sensitifitas
antibodi anti eRF3 ragi Saccharomyces cerevisia
• Identifikasi dan memposisikan protein berdasarkan
kemampuannya untuk berikatan dengan antibodi yng
spesifik
• Untuk memberikan informasi terkait dengan ukuran
dari protein untuk transfer protein ke pasien
Daftar Pustaka
• Fatchiyah, E. L. Arumingtyas, S. Widyarti, dan S. Rahayu. 2011. Biologi
Molekular Prinsip Dasar Analisis. Jakarta: Erlangga.
• Jensen, E. C. 2012. The basics of western blotting. Anatomical Record.
295(3):369–371.
• Kurien, B. T. dan R. H. Scofield. 2003. Protein blotting: a review. Journal of
Immunological Methods. 274(1–2):1–15.
• MacPhee, D. J. 2010. Methodological considerations for improving western
blot analysis. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods.
61(2):171–177.
• Mahmood, T. dan P. C. Yang. 2012. Western blot: technique, theory, and
trouble shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4(9):429–
434.
• Bollag DM, Edelstein SJ. 1991. Protein Methods. New York : Wiley-Liss
• Kurien,B.T.,R.H Scofield. 2006. Western blotting (Methods 38 hal 283-293).
Oklahoma City: Elsevier
•
TERIMA KASIH