ManualLabBioteCultCelulares v.2017

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA
MANUAL DE LABORATORIO DE
BIOTECNOLOGÍA DE CULTIVOS CELULARES
Ingeniería Farmacéutica
Departamento de Bioprocesos
Elaborado por:
M. en F. D. Karen Gisela Moreno Guerrero
M. en B. Donají Ariadna Ramírez López
Enero -2017
Manual de laboratorio de Biotecnología de Cultivos Celulares
PRÓLOGO
El presente manual presenta las prácticas correspondientes a la asignatura Biotecnología de Cultivos

Celulares del cuarto nivel de la carrera de Ingeniería Farmacéutica.
Éste pretende ser un acercamiento a la Biotecnología aplicable al ámbito farmacéutico a través de
prácticas que permitan al alumno identificar la participación de diferentes técnicas biotecnológicas
para obtención de productos de importancia o aplicación farmacéutica.
Así mismo, busca ser una guía para el entrenamiento práctico de los alumnos, al promover el trabajo
experimental individual y en equipo, además de la manipulación de equipos y materiales de
laboratorio y biológicos.
De igual forma, se favorece la capacidad crítica del alumno al promover sesiones de discusión y
análisis de resultados, además de permitir la participación del alumno a través de la investigación y
diseño de un experimento en base a un protocolo experimental base.
REGLAMENTO DEL LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA

1.- Las personas que trabajen en el laboratorio de Biotecnología deberán utilizar bata, así como los
accesorios necesarios para un trabajo seguro (guantes, anteojos de protección, tapabocas,etc).
2.- Los alumnos deberán traer el siguiente material durante las sesiones de laboratorio: papel
higiénico, franela, cerillos, masking tape, etc. Dentro del material que los alumnos deberán dejar en
el laboratorio están, jabón, ligas y frascos de vidrio o plástico.
3.- Queda estrictamente prohibido ingerir alimentos, beber o fumar dentro del laboratorio de
Biotecnología.
4.- Las personas que se encuentran en el laboratorio de Biotecnología, deberán observar un
comportamiento adecuado.
5.- Los reactivos y materiales se pedirán con vale, el cual contendrá: los materiales solicitados, el
nombre del solicitante, proyecto o materia en la que trabaja, así como el nombre del profesor
responsable, y se deberá dejar una identificación del responsable para cualquier problema que
surgiese con el material. Es responsabilidad del usuario entregar el material limpio, seco y en buen
estado.
6.- Debido al uso constante del material, se pedirá solamente aquel material que sea requerido
durante la sesión de trabajo, y el mismo se deberá entregar a la brevedad posible.
7.- En caso de pérdida o ruptura del material, la persona responsable del mismo tendrá que
reponerlo antes de finalizar el semestre correspondiente, de lo contrario no se liberará la credencial,
y no se extenderán cartas de no adeudo de material de laboratorio.
8.- Los usuarios de equipos deberán anotar su nombre, fecha, hora y material con el que se trabaje
en la bitácora correspondiente. Al concluir el trabajo se deberá apagar, limpiar y/o tapar el equipo.
9.- Se deberán seguir las indicaciones señaladas para el uso del equipo, y en caso de duda se
preguntará a los profesores, o bien, al responsable del laboratorio de Biotecnología. En caso de
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encontrar alguna falla se avisará inmediatamente al profesor encargado y al técnico docente o

responsable del laboratorio de Biotecnología.
10.- Cuando un equipo requiera estar prendido por un cierto periodo, se deberá avisar al
responsable del laboratorio, se registrará en la bitácora y se colocará una etiqueta en un lugar visible
indicando: el periodo por el cual permanecerá prendido, las condiciones de uso. El nombre del
profesor responsable, el nombre de la materia o proyecto, fecha y hora.
11.- En caso de trabajos extra-clase en el laboratorio, estos se consideran extensiones del
laboratorio en cuestión, por lo cual, alguno de los profesores encargados de la materia tendrá que
hacerse cargo del grupo.
12.- Al concluir la sesión de trabajo, se deberá entregar el material limpio y seco, limpiar el área de
trabajo, revisar y cerrar las llaves de agua y gas, así como verificar que los equipos estén apagados.
13.- Todo material que se deje almacenado en el refrigerador, congelador u otra parte del
laboratorio de Biotecnología, deberá ser debidamente etiquetado indicando: fecha, nombre,
material o sustancia almacenada. Todo material que no cumpla con esta condición será desechado.
14.- No se admitirán personas ajenas al laboratorio de Biotecnología, toda persona no acreditada
para trabajar en dicho laboratorio será invitada a retirarse.
15.- Todos los usuarios son responsables de vigilar la limpieza, calibración y buen funcionamiento
de los equipos del laboratorio de Biotecnología. Ello con objeto de darle un buen uso y
mantenimiento para el funcionamiento óptimo de los equipos.
16.- Ningún equipo puede ser extraído del laboratorio de Biotecnología sin consentimiento; por lo
que para objeto de préstamo de equipo y materiales, se deberá llenar el vale de préstamo, en donde
el solicitante se compromete a responsabilizarse del equipo y a contribuir de forma económica en
caso de que el equipo requiera reparación como consecuencia del préstamo.
17.- Los profesores que utilicen el laboratorio de Biotecnología deberán obedecer el presente
reglamento. Y es su responsabilidad hacer respetar el mismo por los estudiantes, así como mantener
en buenas condiciones de funcionamiento y limpieza los equipos e instalaciones del laboratorio.
18.- Todo profesor que efectúa una práctica de laboratorio, o dirección de proyectos de
investigación, deberá estar al pendiente de sus estudiantes, experimentos y responsabilizarse de
todo incidente que ocurra durante la utilización del laboratorio.
19.- Todo usuario deberá respetar la clasificación y el orden de los reactivos y materiales existentes
en el laboratorio de Biotecnología.
20.- Todo profesor con acceso al almacén del laboratorio, deberá respetar el orden de los equipos,
material y sustancias ahí almacenadas. Así también deberá controlar el préstamo de los mismos a
los alumnos, lo cuales no tienen derecho a entrar o tomar reactivos, equipos o material del almacén
bajo ninguna circunstancia, para lo cual el profesor responsable debe solicitar la previa elaboración
de un vale, tras lo cual procederá a la entrega del material.
21.- El responsable del laboratorio, junto con el Presidente de Academia de Biotecnología realizarán
las demandas necesarias al jefe del Departamento de Bioprocesos, en relación al abasto de
reactivos, materiales de seguridad, materiales y equipos de forma que la seguridad y la capacidad
de atención a alumnos sea mantenida.
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22.- Toda persona que incumpla el presente reglamento, será sancionada por la Academia de
Biotecnología en base a la infracción cometida.
CRITERIOS DE EVALUACIÓN Y ACREDITACIÓN DEL CURSO PRÁCTICO
1. La tolerancia para ingresar al laboratorio es de 15 minutos. Después de ese tiempo se tomará

asistencia y no se permitirá la entrada al laboratorio a ningún alumno.
2. Todo alumno debe respetar los lineamientos que establece el reglamento interno del laboratorio.
En caso contrario, se hará acreedor a una sanción y no se le permitirá la entrada a las
instalaciones.
3. Para acreditar el laboratorio y tener derecho a presentar el examen extraordinario es requisito

indispensable contar con el 80% de asistencia como mínimo. Las inasistencias deberán
justificarse apropiada y oportunamente por los alumnos. Si se desea presentar el extraordinario
para elevar el promedio del alumno, éste deberá renunciar a su calificación obtenida en
ordinario y aceptar la evaluación extraordinaria como definitiva.
4. La justificación de la inasistencia no acredita el trabajo de laboratorio de las sesiones a las que no

se asistió.
5. El trabajo de laboratorio y la asistencia se evalúan en cada sesión práctica.
6. El grupo y todos los equipos deben de contar con su material de trabajo, en caso contrario no se
permitirá el ingreso a las instalaciones. El material mínimo para trabajar en el laboratorio es el
que se describe en la siguiente tabla:
MATERIAL DE LABORATORIO POR GRUPO POR EQUIPO

‐ 6 frascos gerber de boca ancha
‐ 1 rollo de papel aluminio ‐ 1 lámpara de alcohol
‐ 1 paquete de papel kraft o estraza ‐ 2 mangos para bisturí No. 4
‐ 1 rollo de algodón ‐ 5 hojas (min) para bisturí
‐ 1 rollo de película plástica p/alimentos ‐ 2 franelas
‐ 1 rollo de gasa ‐ 1 frasco chico de jabón líquido p/trastes
‐ 2 pinzas de disección planas
‐ 2 asas bacteriológicas
‐ 1 botella de Etanol 96° GL (1 L)
‐ 1 botella de cloro comercial
‐ 1 agitador magnético de 1”
‐ 1 atomizador
‐ Guántes de nitrilo o látex libres de talco
‐ Cubrebocas
‐ Tijeras, plumón indeleble, masking tape, diurex,
ligas.
7. La entrega de bitácoras, informes escritos, investigaciones previas, así como la presentación de
resultados y cualquier actividad intra o extra clase deberán realizarse en las fechas indicadas en
el cronograma. No se aceptan entregas extemporáneas.
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8. La bitácora es personal. Para efectos de evaluación sólo se revisará una bitácora por equipo y la
calificación que obtenga será para todos los integrantes del equipo. Los cuestionarios
adicionales deberán incorporarse a la bitácora y se contemplarán dentro del porcentaje de
evaluación que ésta tiene.
9. Para las prácticas que lo requieran, se asignarán actividades y horarios calendarizados para
designar responsables de llevarlas a cabo. En caso de no realizarlas se penalizará sobre la
calificación del laboratorio.
10. El examen extraordinario consta de tres partes: un examen oral (30%), un examen escrito (30%)
y un examen práctico (40%). Para poder presentar el examen extraordinario, además de la
asistencia, es necesario aprobar primero los exámenes oral y escrito. De no aprobar alguna de
las partes, se asentará como extraordinaria la calificación obtenida en la evaluación ordinaria.
11. La calificación total del laboratorio corresponde al 20% de la calificación de la asignatura. Para
acreditarla, es requisito indispensable obtener una calificación mínima aprobatoria de 6.0 tanto
en teoría como en el laboratorio.
12. Los porcentajes y aspectos a evaluar en cada periodo parcial se especifican en la siguiente tabla:
Indicador 1er parcial 2º parcial 3er parcial
Trabajo de laboratorio 40% 35% 30%
Examen 25% 15% 10%
Informe escrito NA 30% 30%
Investigación previa o protocolo de 25% NA 15%
lab
Diagrama de flujo 5% 5% NA
Bitácora 5% 5% 5%
Discusión NA 10% 10%
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ÍNDICE DE PRÁCTICAS
Prólogo ................................................................................................................................................ 2
Práctica 1. Efecto de los reguladores de crecimiento en un cultivo de callos de zanahoria .............. 7
Práctica 2. Cultivo de células vegetales en suspensión para la obtención de β-carotenoides. ........ 12
Práctica 3.- producción de tetraciclina en cultivo líquido por streptomyces aureofaciens en medio
sintético. ............................................................................................................................................ 17
Práctica 4.- producción de penicilina por fermentación en estado sólido (Fes) y fermentación en
estado líquido (Fel) con Penicillium sp. ............................................................................................. 25
Práctica 5.- cultivo de células animales. Obtención de un cultivo primario de células

polimorfonucleares de sangre periférica .......................................................................................... 38
Práctica 6. Evaluación de la citotoxicidad de diferentes sustancias de uso farmacéutico sobre

células adherentes ............................................................................................................................ 43
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PRÁCTICA 1. EFECTO DE LOS REGULADORES DE CRECIMIENTO EN UN CULTIVO DE

CALLOS DE ZANAHORIA
Elaboraron: M. en B. Donají A. Ramírez López
M. en F. D. Karen Gisela Moreno Guerrero
INTRODUCCIÓN
El cultivo de tejidos es un conjunto de técnicas que permiten el establecimiento de cultivos en

condiciones controladas (condiciones in vitro, “en vidrio” en referencia a que se hacía en
contenedores donde se tenía un cultivo confinado) a partir de anteras, meristemos, embriones y
órganos de una planta, a lo que se conoce como explante(Pérez Molphe Balch, et al. 1999).
Estas técnicas permiten el establecimiento de cultivos con base en el fenómeno de la
totipotencialidad de las células vegetales; ésta peculiaridad de las células vegetales, permite la
regeneración tanto de órganos bien diferenciados, como células en un estadío no diferenciado,
similar a las células meristemáticas, sin ser necesario que el explante de origen, sea del mismo tipo
celular, o que se encuentre en el mismo estadío fisiológico (Pierik,1990).
La capacidad de regeneración de las células vegetales, es lo que permite que, al ser inducidas, con
reguladores de crecimiento sintéticos (auxinas y citocininas), estas nos brinden una respuesta
asociada con la formación de nuevos órganos o el desarrollo de la estructura vegetal completa La
inducción de tejidos o células vegetales con reguladores puede llevar a diferentes respuestas
dependiendo del tipo de regulador, la concentración y el tipo de explante que vaya a usarse.
Un callo es una masa amorfa de células vegetales en un estadío fisiológico poco diferenciado y cuya
característica principal es la rápida proliferación. En condiciones naturales este tejido aparece como
un mecanismo de cicatrización cuando se presentan heridas o bien tumores; está compuesto por
células que muestran características similares a las del parénquima; y se obtiene por el aislamiento
de explantes de órganos o tejidos, los cuales son llevados a la desdiferenciación celular.
OBJETIVOS
General
Evaluar el efecto de la adición de reguladores de crecimiento vegetal (RCV) sobre la inducción y

crecimiento de callos a partir de explantes de cambium de zanahoria (Daucus carota).
Específicos
Identificar el efecto de la adición de 2 tipos de RCV (auxinas y citocininas) sobre la inducción de

callos de zanahoria.
Identificar la combinación de RCV que induce la formación de callos en mayor proporción y con
mayor friabilidad sobre el explante sometido a la experimentación.
Obtener callos de zanahoria, de tamaño y friabilidad adecuados para el establecimiento de cultivos

de células en suspensión.
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MATERIALES Y REACTIVOS:
Material biológico:
- 2 a 3 raíces de Zanahoria (Daucus carota) de entre 15 y 20 cm de longitud y 3 a 4 cm de
diámetro, sin signos de enfermedad, frescas, no congeladas.
Material de laboratorio:
- 3 vasos de precipitado de 250 ml
- 2 pipetas de 1 ml
- 1 pizeta de 250 ml
- 2 cajas de Petri
- 2 círculos de papel filtro del diámetro de la caja petri
- Algodón
- Mango de Bisturí (preferentemente No. 4)
- Hojas para mango de bisturí (No. 24)
- Pinzas de disección planas (no de diente de ratón)
- Frascos gerber de boca ancha
- Tapas de PP para frascos gerber
- 1 agitador magnético o de varilla
- 1 matraz Erlenmeyer de 500 ml o 1 frasco de medio de cultivo
- 1 pela papas
Reactivos:
- Etanol al 70%
- Solución de hipoclorito de sodio comercial al 5%
- HCl 1.0 N
- NaOH 1.0 N
- Sacarosa
- Vitaminas MS (Murashige y Skoog) 1000X
- Medio basal MS (NH4N03, KN03, CaCl~H20, MgS04.2H20, KH2 Po4, NaH2 P04.H20, KI, H3B03,
MnS04.4H20, ZnS04.4H20, NaMoOs .2H20, CuS04.5H20, CoCl2.6H20, Na2EDTA.2H20,
FeS02.7H20.)
- Agar o Phytagel
- Soluciones madre de reguladores de crecimiento:
- 2, 4‐D 1 mg/ml
- BAP 1 mg/ml
- ANA 0.1 mg/ml
Metodología
a) Preparación del medio de cultivo.

Preparar 150 ml de medio MS, considerando 30 ml para cada frasco gerber, como se indica a
continuación.
• Medir el medio basal MS (macro y micronutrientes), considerar si se encuentra a alguna
concentración en específico, para el volumen a utilizar y disolver en agitación en 50 ml de agua
destilada, adicionar 150 l de una solución 1000X de vitaminas MS.
• Enseguida, suplementar el medio con los reguladores de crecimiento según la relación que se
muestra a continuación, considerando que la concentración 1X es de 1 mg/L para 2,4‐D y BAP y
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0.1 mg/L para ANA. Así, si en la tabla se indica concentración 2X, será doblar la concentración
original.
Tabla 1.- Concentraciones y combinaciones de los RCV a utilizar.
Regulador Concentración final en el medio de cultivo MS
Auxina 0.5X 1X 2X 4X 6X
Citocinina 5X 4X 2X 1X 0.5X
 Posteriormente agregar 20 g/l de sacarosa y disolver. Ajustar entonces el pH del medio con
NaOH 1N o H2SO4 1N a 5.6-5.8.
• Agregar 6 g/L de agar‐agar, o bien 3 g/L de Phytagel y completar el volumen total del medio.
Homogenizar y clarificar la solución.
• Vaciar a cada frasco gerber el volumen de medio requerido. Cubrir cada uno con una tapa de
polipropileno y rotular sobre ésta.
• Esterilizar a 121°C durante 15 min. Enfriar y colocar un sello de ega‐pack en la tapa de cada frasco.
b) Establecimiento del cultivo de callos de zanahoria
1.- Preparar y esterilizar con anticipación el siguiente material:

 1 matraz con 500 ml de agua destilada para enjuagues
 1 vaso de precipitados de 250 ml con 1 agitador magnético para enjuagues
 1 caja Petri con 1 disco de papel filtro para hacer los cortes de zanahoria
 Pinzas de disección, mango de bisturí y agitador de varilla envueltos individualmente.
2.- Seleccionar con ayuda del profesor las zanahorias a utilizar en el cultivo.
3.- Lavar los vegetales con agua corriente y jabón frotando suavemente con las manos o una
esponja.
4.- Pelar las zanahorias con el pela papas, procurando eliminar no más de 2 mm del tejido
epidérmico.
5.- Partir en dos o tres secciones las zanahorias (retirando las puntas) y sumergirlas en una solución
de etanol al 70% por 30 seg en un vaso de precipitados.
NOTA: A PARTIR DE ÉSTE PASO TRABAJAR DENTRO DE LA CAMPANA DE FLUJO LAMINAR
6.- Enseguida, sumergir los trozos de zanahoria en una solución de hipoclorito de sodio comercial al
5%, durante 5-7 minutos.
7.- Lavar el material vegetal de 4 a 5 veces con agua destilada estéril, con agitación dentro de un
vaso de precipitados estéril, durante 30 seg.
8.- Del vaso de precipitados, tomar uno a uno los trozos de zanahoria, colocarlos sobre el papel filtro
en la caja Petri y con ayuda del bisturí y las pinzas de disección, obtener rebanadas de 0.5 -0.7
cm de grosor. Las rebanadas que provienen de las puntas expuestas a las soluciones de
desinfección deberán ser desechadas.
9.- De cada rebanada cortar en forma de cuadrado alrededor del cambium, procurando no tomar
los tejidos adyacentes (ver figura 1). Posteriormente, cortar el cuadrado en 4 partes para
obtener cubos, los cuales contendrán parte del xilema y el cambium de la zanahoria (ver Figura
2).
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Figura 1.- Diagrama de corte de las rebanadas de zanahoria para separar los explantes de cambium.
10.- Colocar de 3 a 4 cortes (cubos) de cambium por frasco, procurando mantener la polaridad del
explante, al poner sobre la superficie del medio de cultivo.
11.- Incubar a 24‐26°C con un fotoperiodo de 16/8 (luz/obscuridad).
12.- Observar periódicamente los cultivos y registrar en una tabla: cambios en el medio de cultivo,
cambios en el tejido, aparición del callo, contaminaciones (tipo e incidencia en los frascos),
apariencia de los callos.
NOTA: Deberán registrarse los cambios de todos los cultivos del grupo para tener la suficiente
información sobre el efecto de los reguladores de crecimiento.
Figura 2.-Diagrama de una zanahoria

Imagen tomada de: http://www.biologia.edu.ar/botanica/tema3/tema3_2geofito.htm
GUÍA PARA EL ANÁLISIS DE RESULTADOS.

Investigar sobre los principales efectos de los reguladores de crecimiento empleados en la práctica.
¿Cómo es la sinergia entre ellos?
¿Qué combinación de reguladores fue la que dio un mejor resultado?
¿Cuáles son las posibles explicaciones?
¿Qué resultados se reportan en la literatura para los cultivos de callos de zanahoria?
INVESTIGACIÓN PREVIA (SUSTITUYE AL INFORME DE PRÁCTICA EN EL PRIMER DEPARTAMENTAL)
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Realizar por equipo una investigación documental sobre alguna planta de interés farmacéutico
donde se emplee alguna técnica de cultivo de tejidos vegetales para obtener un metabolito
secundario con aplicación en este sector. Para ello, se establecen los siguientes puntos como guía:
1. Seleccionar una especie vegetal y buscar por lo menos tres artículos científicos referentes al
empleo de este vegetal como fuente de metabolito secundario útil como principio activo o de
uso terapéutico. En los artículos además deberá emplearse alguna de las técnicas de cultivo de
tejidos o células vegetales.
2. Elaborar una ficha técnica que describa al vegetal seleccionado: nombre común, nombre
científico, tipo de metabolito(s) producidos, usos terapéuticos, efectos colaterales, etc.
3. Como texto introductorio, describir brevemente los artículos seleccionados, qué metabolitos se
obtienen de la planta y cuál es su aplicación farmacéutica, qué técnicas de cultivos vegetales se
emplean, bajo qué condiciones se llevan a cabo.
4. Elaborar un cuadro comparativo que concentre la información de los artículos seleccionados,
relativo a: tipo de explante empleado y mecanismo de obtención, uso de reguladores de
crecimiento vegetal (tipo, concentraciones, etc.), medio de cultivo empleado, condiciones de
incubación empleadas (fotoperiodo, temperatura, presencia de elicitores, etc.) y resultados
observados.
5. Enseguida del cuadro comparativo, elaborar un análisis comparativo, empleando como
referencia los puntos anteriores y determinar: cuáles son las condiciones que inducen la
producción de un metabolito secundario en el vegetal, cuál es el efecto de los reguladores de
crecimiento vegetal, el tipo de explante y las condiciones de incubación en el crecimiento y/o
diferenciación celular, así como en la obtención de metabolitos secundarios, ¿se emplea alguna
condición particular (por ejemplo estrés) para promover la síntesis de metabolitos? Esta
investigación deberá estar respaldada por libros, textos, artículos y demás material, adicional a
los tres artículos seleccionados y deberán citarse estas referencias en el análisis.
6. Establecer conclusiones generales respecto a la especie vegetal seleccionada y las condiciones
óptimas para: establecer un cultivo de callos; promover la diferenciación y organización celular;
producir metabolitos secundarios.
CUESTIONARIO PREVIO
1. Investiga y clasifica los componentes del medio de cultivo MS
2. Elabora un diagrama de bloques que describa el procedimiento para prepararlo.
3. Define que es la totipotencialidad
4. ¿Qué es un tejido meristemático?
5. ¿Qué es un callo vegetal?
6. ¿Qué es el cambium? Realiza un esquema que ilustre el cambium de zanahoria
7. ¿Qué es una solución stock o solución madre y cómo se prepara?
8. ¿Cuáles son los disolventes comúnmente empleados para preparar soluciones de 2,4‐D, ANA,
BAP y zinetina?
9. ¿Qué es la técnica aséptica?
10. ¿Qué es el fotoperiodo? ¿En qué unidades de mide? ¿Cuáles son los rangos de intensidad y
duración de luz más comunes?
FUENTES DE CONSULTA:
DIXON, R., González, R. Plant cell culture. A practical approach.2nd ed. Oxford University Press
HURTADO. Cultivo de tejidos vegetales. Trillas.
LESZEK, S. Reguladores del crecimiento, desarrollo y resistencia en plantas. Propiedades y acción.
UACh.
11
PRÁCTICA 2. CULTIVO DE CÉLULAS VEGETALES EN SUSPENSIÓN PARA LA

OBTENCIÓN DE Β-CAROTENOIDES.
Elaboró: M. en B. Donají A. Ramírez López
INTRODUCCIÓN
El establecimiento de un cultivo en suspensión de células vegetales se lleva a cabo al transferir

pequeños fragmentos de tejido calloso a un medio líquido el cual es puesto en agitación constante
para promover que las células se disgreguen en forma individual y en pequeños agregados celulares,
llamados microcallos (Mineo,1990).
Los cultivos en suspensión pueden lograrse a partir de un fragmento de callo que presente alta
friablidad, es decir, alta capacidad de disgregación; y mantenerse a través de la resiembra en medio
de cultivo fresco con agitación, lo que le provee la oxigenación necesaria; además de temperatura
e intensidad de luz constante.
Estas células, al provenir de un tejido vegetal son totipotenciales y también poseen el potencial para
sintetizar cualquier compuesto asociado normalmente con la planta integra (Allan, 1996). Sin
embargo, se ha observado que los cultivos en suspensión pueden ser más inestables que los cultivos
de callos ya que al realizar la transferencia del callo al medio líquido se pueden promover cambios
en la fisiología celular e incluso cambios en la genética de las células, debido a los pases sucesivos
de las células (Petersen y Alfermann, 1995).
Las células en suspensión poseen tasas de duplicación más lentas que las de los microorganismos,
normalmente de 2-5 días, y su crecimiento en cultivo en lote presenta las mismas fases
características de los cultivos microbianos (Phillips et. al, 1995), sin embargo, la mayor ventaja que
poseen es que pueden realizar la síntesis de productos naturales con diversas funciones
farmacológicas.
Los carotenoides son compuestos orgánicos vegetales derivados de la ruta de biosíntesis del
isopreno (isoprenoides) que abarca la síntesis de una amplia variedad de compuestos con diferentes
utilidades en las plantas. El caroteno más comúnmente encontrado es el b-caroteno, y normalmente
constituye entre el 25-30 % del contenido total de carotenoides en las plantas, es sintetizado en el
espacio intermembranal del cloroplasto; y al igual que la clorofila cumple funciones de captación de
luz en el proceso fotosintético, pero a longitudes de onda diferentes (Nelson y Cox, 2008).
El uso principal del b-caroteno es como precursor de la vitamina A, ya que ésta molécula se puede
dividir en dos moléculas de vitamina A (retinol), en un proceso que ocurre en el intestino de
animales superiores, de forma que farmacológicamente posee utilidad como suplemento
alimenticio, antioxidante, entre otros (Martínez, 2003)
OBJETIVOS
General
Establecer cultivos de células en suspensión en medio MS líquido, a partir de callos de zanahoria

(Daucus carota) para la extracción de b-caroteno.
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Particulares
Identificar las características necesarias en un callo vegetal para ser utilizado como explante para
un cultivo en suspensión.
Observar el efecto de los RCV adicionados al medio de cultivo sobre la proliferación, disgregación y
diferenciación de células en un medio líquido.
Analizar cualitativamente la producción y extracción de b-caroteno a partir cultivos de células en

suspensión de zanahoria (Daucus carota).
DESARROLLO EXPERIMENTAL
Reactivos
- Sacarosa
- Medio MS (Murashige y Skoog): NH4N03, KN03, CaCl~H20, MgS04.2H20, KH2 Po4, NaH2
P04.H20, KI, H3B03, MnS04.4H20, ZnS04.4H20, NaMoOs .2H20, CuS04.5H20, CoCl2.6H20,
Na2EDTA.2H20, FeS02.7H20.
- Solución de vitaminas MS a concentración 1000X
- Azul de Tripano
- Agua desionizada y bidestilada
- Alcohol etilico al 70%
- Alcohol etilico al 96%
Materiales
- 1 probeta de 100 mL
- 1 probeta de 10 mL
- 2 matraces Erlenmeyer de 125 mL
- 2 vasos de p.p. de 250 mL
- Pinzas metálicas de disección
- Mango de bisturí con navaja nueva
- Agitador magnético
- 2 tubos Falcon de 50 mL
- Tapones de algodón
- Puntas estériles de 1 ml
Equipos
- Campana de flujo laminar

- Parilla de agitación
- Autoclave
- Potenciómetro
- Micropipeta de 1000
- lncubadora con agitación y temperatura controlada
- Microscopio
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- Sonicador
METODOLOGÍA
Preparación de medio MS líquido
1.- Medir la cantidad necesaria de medio MS para preparar 100 mL de medio MS con la misma
formulación previamente utilizada para la preparación de medio MS para callos de zanahoria.
2.- Adicionar 100 mL de solución de vitaminas 1000X y Sacarosa en una concentración de 30 g/L.
3.- Agregar la cantidad de RCV (ANA y BAP) necesarios para alcanzar la concentración final. NOTA:
Esta concentración se identifica a partir del trabajo experimental de la práctica 1 y sus resultados.
4.- Ajustar el pH con NaOH 1.0 N o con HCl 1.0 N entre 5.6-5.8.
5.- Colocar 50 mL de medio de cultivo en un matraz de 125 mL.
6.- Esterilizar el medio en autoclave a 121 °C y 15 psi durante 15 minutos. Dejar enfriar previo a su
uso.
Inoculación de los matraces
1.- En condiciones de esterilidad, se toma un callo previamente desarrollado y se coloca en una caja
Petri con papel filtro.
2.- Se separa el explante original (cubo de cambium de zanahoria) del callo haciendo uso de las
pinzas y el bisturí estériles, procurando no dañar el callo y eliminando lo más posible del explante
original.
3.- Se colocan los callos en los matraces con medio MS líquido y se tapan.
4.- Los matraces con los callos deben colocarse en agitación a 150 rpm, en condiciones de oscuridad
y 25 °C.
NOTA: Es recomendable determinar el peso del callo inoculado, para lo cual se debe pesar el matraz
con el medio de cultivo antes y después de la inoculación con el callo para determinar el peso por
diferencias.
Monitorear el cultivo cada semana y anotar observaciones. Tras 15 días de cultivo, tomar una
muestra de 1 mL y hacer una preparación en fresco. Teñir con azul de Tripano y anotar sus
observaciones.
Extracción de b-caroteno
1.- Tras 15 días de cultivo, colocar el medio de cultivo junto con las células vegetales en un tubo
Falcon de 50 mL.
2.- Someter la muestra a sonicación por 5-10 minutos para promover la liberación de los b-
carotenos.
14
3.- Centrifugar el tubo y separar el sobrenadante. Colocar 5 mL del sobrenadante en un tubo de

ensaye de vidrio.
Prueba cualitativa para la presencia de b-carotenos
(Prueba de Lieberman-Buchnard para terpenoides)
1.- Teniendo las muestras en tubos de ensaye de vidrio, agregar 1 mL de anhídro acético y 1 mL de
cloroformo y enfriar a 0°C.
2.- Agregar 0.1 a 0.2 mL de ácido sulfúrico y observar la reacción.
Se debe observar la formación de un anillo azul en el fondo que sólo se mantiene por un tiempo
máximo de 10 segundos. Puede observarse la formación de anillos de color amarillo o café que
refleja el estado de oxidación de los carotenoides.
CUESTIONARIO
1.- ¿Que es la friabilidad?
2.- Menciona, por lo menos una estrategia para incremental la friabilidad de las células.
3.- ¿Cuál es la función del crecimiento en condiciones de obscuridad en el cultivo en suspensión?
4.- Investiga y comenta un ejemplo de la aplicación de cultivo de células en suspensión aplicado a

la farmacología.
5.- Menciona al menos 2 métodos de recuperación de la biomasa o de algún metabolito en un

cultivo de células en suspensión.
6.- Menciona las ventajas que tiene el cultivo de células vegetales frente a los cultivos microbianos
y de células animales.
ANEXO
Solución de Azul de Tripano
Azul de Tripano a1 20 % en PBS (Azul de tripano solución Sigma T-8154, Solución 0.4%. preparada
en 0.81 7% de NaCl y 0.6% de fosfato de potasio dibasico), PBS (regulador de fosfatos: NaCl 8.75g/L,
Na2HP04 2.25g/L, KH2P04 0.2g/L, KCl 0.2g/L a pH 7.2 - 7.3).
FUENTES DE CONSULTA
Allan E (1996). Plant cell culture. In: Stafford A, Warren G (eds),P lant Cell and Tissue Culture, pp.
1-23. Chichester: John Wiley and Sons.
Phillips GC, Hubstenberger JF, Hansen EE (1995). Plant regeneration by organogenesis from callus
and cell suspension cultures. In: Gamborg OL, Phillips GC (eds), Plant Cell, Tissue and Organ
Culture, pp. 67- 78. Heidelberg: Springer and Verlag. Sitio en internet. Sigma - Aldrich. USA.
15
Mineo, L. 1990. Plant tissue culture techniques. Pages 151-174, in Tested studies for laboratory
teaching. Volume 11. (C. A. Goldman, Editor). Proceedings of the Eleventh Workshop/Conference
of the Association for Biology Laboratory Education (ABLE), 195 pages.
http://www.sigmaaldrich.com/Area~of~lnterest/Life~Science/Plant~Biotechnology/Plant~Tissue~
Culture .html
Nelson, David y Cox, Michael. 2008. Lehninger.Principios de Bioquímica. Freeman and Company.
16
PRÁCTICA 3.- PRODUCCIÓN DE TETRACICLINA EN CULTIVO LÍQUIDO POR

STREPTOMYCES AUREOFACIENS EN MEDIO SINTÉTICO.
Elaboró: M. en F. D. Karen Gisela Moreno Guerrero
INTRODUCCIÓN.
Desde tiempos remotos el hombre ha sacado provecho de los microorganismos,
utilizándolos en su beneficio para producir alimentos y bebidas principalmente. Sin embargo, desde
el descubrimiento de la penicilina en 1929, también se han utilizado y cada vez en mayor medida
para producir antibióticos.
Los antibióticos son sustancias producidas naturalmente por los microorganismos pero que
no son esenciales para su crecimiento. Su función en la naturaleza es la de brindar al
microorganismo productor una ventaja competitiva sobre otra u otras poblaciones microbianas al
contar con un “arma” que las elimine del medio por el que compiten. Su uso terapéutico y medicinal
en seres humanos, plantas y animales es destruir o detener el crecimiento de microorganismos
infecciosos que afecten al organismo vivo.
Fue la imperiosa necesidad de antibióticos durante la Primera Guerra Mundial lo que llevó
primero a la búsqueda de métodos más eficaces para la producción de penicilina, el primer
antibiótico usado masivamente y descubierto por Alexander Flemming en 1929. Posteriormente, la
investigación se encaminó también a la búsqueda de nuevos antibióticos, siendo la mayoría
obtenidos de bacterias aisladas del suelo, principalmente de las pertenecientes al género
streptomyces. Así por ejemplo, tenemos a la actinomicina, descubierta por Waksman en 1940, la
estreptomicina, estreptotricina, tetraciclina y clortetraciclina, por mencionar solo algunos de los
más conocidos.
Las tetraciclinas son un grupo de antibióticos de amplio espectro que se pueden obtener
por síntesis química o bien por síntesis microbiana a partir de cultivos de Streptomyces aureofaciens,
aunque se prefiere ésta última sobre la síntesis química por su bajo costo. Básicamente, la estructura
química de los tres derivados de tetraciclina es un sistema de anillos de naftaceno al que se añaden
diferentes átomos constituyentes. Así, la clortetraciclina tiene un átomo de cloro mientras que la
oxitetraciclina un grupo oxhidrilo.
Evaluación de la actividad de un antibiótico.
El método más utilizado para evaluar la actividad de un antibiótico o bien la sensibilidad de uno o
más microorganismos a éste es el antibiograma. Existen dos métodos comunes para realizar un
antibiograma: por difusión en placa y por dilución en caldo. El primer método, también conocido
como método Kirby-Bauer, consiste en sembrar sobre una placa de agar al microorganismo de
prueba y exponerlo a la acción del o los antibióticos a probar, que se colocan sobre el medio sólido
en discos de papel filtro o cilindros metálicos para localizar su difusión. Al cabo de cierto periodo de
incubación (comúnmente 24 horas) aparecerá un halo de inhibición alrededor del disco del o los
antibióticos que indica la resistencia del microorganismo. En el segundo, en tubos con caldo de
cultivo se colocan distintas diluciones del antibiótico de concentración conocida. Los tubos se
17
inoculan con el microorganismo de prueba y al término del periodo de incubación se descartaran

aquellos tubos en los que haya turbiedad en el medio debida al crecimiento microbiano. El tubo que
contenga ausencia de microorganismos contendrá la concentración adecuada del antibiótico.
OBJETIVOS
General
 Utilizar un cultivo del actinomiceto Streptomyces aureofaciens para producir el antibiótico

tetraciclina por fermentación líquida en un medio sintético.
Particulares
• Evaluar la diferencia en la producción de la tetraciclina al utilizar dos medios de cultivo

sintéticos de diferente composición.
• Evaluar la actividad antimicrobiana y el rendimiento en la producción del antibiótico en el

medio de cultivo contra un estándar comercial de tetraciclina realizando un antibiograma.
Materiales:
Cepas microbiológicas
Streptomyces aureofaciens
Escherichia coli
Staphylococcus aureus
Para la preparación de la cepa de Streptomyces
Reactivos Encendedor
Glucosa
Peptona
KH2PO4 Equipo
MgSO4*7H2O Autoclave
Agar-agar Balanza analítica
Agua destilada Campana de flujo laminar
Incubadora a T=30ºC
Materiales Lámparas de alcohol
1 caja Petri de 100x15 mm
1 matraz Erlenmeyer 250 mL 1 probeta graduada de 100 mL
1 espátula de acero inoxidable 1 vaso de precipitados de 100 mL
Charolas de polipropileno o aluminio para
pesar
18
Para la preparación del inóculo
Reactivos 1 probeta graduada de 100 mL

NaCl 1 vaso de precipitados de 100 mL
Sucrosa 1 espátula de acero inoxidable
Harina de soya
Citrato de sodio
Ácido acético Algodón
(NH4)2SO4 Charolas de polipropileno o aluminio para
MgSO4*7H2O pesar
KH2PO4 Encendedor
K2HPO4 1 clip
CaCO3 Propipeta
MnSO4*4H2O
ZnSO4*7H2O
K2Cr2O7 Equipo
Agua destilada Autoclave
Balanza analítica
Materiales Campana de flujo laminar
3 tubos de ensaye roscados de 16x150 mm Incubadora con agitación reciprocante o
1 matraz Erlenmeyer de 125 mL rotatoria a T=30ºC
3 Pipetas graduadas de 10 mL Lámparas de alcohol
Para la fermentación líquida
Reactivos 1 probeta graduada de 50 mL

Sucrosa 1 pipeta de 5 mL
Ácido acético 1 propipeta
Ácido cítrico 1 espátula de acero inoxidable
Citrato de sodio*5H2O Algodón
(NH4)2SO4 Charolas de polipropileno o aluminio para
MgSO4*7H2O pesar
KH2PO4 Encendedor
K2HPO4 1 clip
CaCO3
MnSO4*4H2O Equipo
ZnSO4*7H2O Autoclave
K2Cr2O7 Balanza analítica
Agua destilada Campana de flujo laminar
Incubadora con agitación rotatoria a T=30ºC
Materiales y 200 rpm
1 matraz Erlenmeyer de 125 mL Lámparas de alcohol
19
Para el antibiograma
Reactivos 1 swinex c/membrana o acrodisco estéril

Medio para antibióticos No.1 y 2 o Agar 1 jeringa estéril de 60 mL
Mueller-Hinton 1 vial estéril
Caldo Luria o Caldo nutritivo Pinzas de disección
Estándar de tetraciclina comercial Encendedor
Agua destilada Plumón indeleble
Vernier o regla milimétrica
Materiales
Embudo Equipo
1 matraz Kitazato de 125 mL Balanza analítica
1 matraz Erlenmeyer de 125 mL Bomba de vacío
Desecador Campana de flujo laminar
Estufa de secado
5 tubos Eppendorf Micropipeta de volumen variable de 100-
Puntas azules estériles 1000 µL
1 hisopo Incubadora
Lámparas de alcohol
Preparación de la cepa para iniciar el cultivo

Preparar las cajas Petri de 15 x 100 mm conteniendo cada una por lo menos 30 mL de Agar
Waksman, de acuerdo con la siguiente formulación:
Componente g/L
Glucosa 10.0
Peptona 5.0
KH2PO4 1.0
MgSO4*7H2O 0.5
Agar agar 20
Inocular las cajas Petri con suspensión de esporas o micelio de Streptomyces aureofaciens. Incubar
a 30ºC por un periodo de 10 días para favorecer la esporulación.
Preparación del inóculo para la fermentación

Preparar el medio para el inóculo de acuerdo con la siguiente formulación:
Componente Cantidad/L
Sucrosa 30.0 g
Harina de soya 5.0 g
Citrato de sodio (Na3C6H5O7*5H2O) 1.0 g
(NH4)2SO4 3.3 g
20
MgSO4*7H2O 0.25 g
KH2PO4 0.10 g
K2HPO4 0.10 g
CaCO3 1.00 g
MnSO4*4H2O 0.01 g
ZnSO4*7H2O 0.04 g
K2Cr2O7 0.016 mg
Ácido acético (CH3COOH) 0.40 mL
Colocar 50 mL de medio en un matraz Erlenmeyer de 125 mL y esterilizar a 121ºC por 15 minutos.

Inocular con suspensión de esporas o suspensión miceliar (hechas con solución salina) de
Streptomyces aureofaciens obtenidos de la cepa inoculada en el agar Waksman. Incubar a 30ºC de
48 a 72 hr con agitación reciprocante con 3 ½ in a 97 ciclos/min o agitación rotatoria a 200 rpm.
Fermentación líquida
Preparar el medio A o B, según la siguiente formulación:
Medio A Medio B
Componente Cantidad/L Cantidad/L
Sucrosa 30 g 40 g
Ácido cítrico
-------- 12.8 g
(H3C6H5O7*H2O
Citrato de sodio
2.5 g --------
(Na3C6H5O7*5H2O)
(NH4)2SO4 3.3 g 6.0 g
MgSO4*7H2O 0.25 g 0.25 g
KH2PO4 0.10 g 0.15 g
K2HPO4 0.10 g --------
CaCO3 1.0 g 11.0 g
Ácido acético (CH3COOH) 0.40 mL --------
MnSO4*4H2O 0.01g 0.01 g
ZnSO4*7H2O 0.04 g 0.04 g
K2Cr2O7 0.016 mg 0.016 mg
Colocar 50 mL de medio en un matraz Erlenmeyer de 125 mL y esterilizar a 121ºC por 15 minutos.

Inocular el medio para fermentación con 2.5 mL del inóculo. Incubar a 30ºC durante 4 a 6 días con
agitación rotatoria a 200 rpm.
Antibiograma para la evaluación de la actividad antimicrobiana y concentración de la tetraciclina

en los medios de cultivo A y B.
21
Preparación de las placas para el antibiograma.
Preparar 1 caja Petri con 20 mL de medio para antibióticos 1 y 2 o agar Mueller-Hinton.

Paralelamente, preparar un cultivo de 24 horas de Escherichia coli en caldo Luria o Staphylococcus
aureus en caldo nutritivo. Empapar un hisopo estéril en la suspensión del cultivo cuidando de retirar
el exceso presionando y rodando el hisopo sobre las paredes del tubo antes de retirarlo. Extender
de forma homogénea (ver el esquema) en tres direcciones sobre toda la superficie de la placa de
agar, cuidando de no dejar sitios sin cubrir. Incubar en posición invertida a 37ºC durante 24 horas
una vez que han sido colocados los discos con el antibiótico.
1 2 3
Figura 1. Esquema para la siembra del inóculo en las placas para antibiograma.
Determinación de la biomasa (en peso seco) y clarificación del medio de cultivo
Retirar el matraz de fermentación de la incubadora y filtrar el medio al vacío a través de un disco de

papel filtro Whatman No. 4 (previamente tarado a peso constante) para retener la biomasa. NO
DESECHAR EL MEDIO FILTRADO. Posteriormente, colocar el papel filtro en un horno de secado a
60ºC durante 1 hora. Dejar enfriar en un desecador y determinar la biomasa producida en peso
seco.
Aparte, recuperar el medio y filtrarlo nuevamente a través de una membrana de 0.45 µm en

condiciones de esterilidad. Filtrar por lo menos 5 mL de medio para utilizarlo en el antibiograma.
c) Antibiograma para determinar la actividad y concentración de la tetraciclina

Preparar una solución madre de 1000 µg/mL a partir de un estándar comercial de tetraciclina. De la
solución madre preparar las siguientes diluciones: 125 µg/mL, 250 µg/mL, 500 µg/mL y 750 µg/mL.
Colocar sobre las placas de agar Mueller-Hinton o medio para antibióticos 1 y 2 previamente
inoculadas con el microorganismo de prueba cinco círculos de papel filtro como lo muestra el
esquema, previamente embebidos en 200 µL de cada una de las diluciones del estándar de
tetraciclina, incluida la dilución madre. En el centro de la caja Petri colocar un sexto círculo de papel
filtro embebido en 200 µL del medio de cultivo filtrado en condiciones de esterilidad. Marcar sobre
la tapa de la caja las concentraciones correspondientes de tetraciclina. Incubar las cajas en posición
invertida a 37ºC durante 24 horas.
22
250
250
µg/mL
µg/mL
125
125 500
500
µg/mL
µg/mL Medio µg/mL
µg/mL
Medio
de
de
cultivo
cultivo
1000
1000 750
750
µg/mL
µg/mL µg/mL
µg/mL
Figura 2. Esquema para la colocación de los círculos de papel filtro en la caja Petri.
Al término de la incubación, medir el diámetro de los halos de inhibición en los estándares de

tetraciclina y el medio de cultivo.
Para calcular la concentración del antibiótico en el medio de cultivo, graficar el logaritmo de la

concentración de las diluciones de tetraciclina contra el diámetro del halo de inhibición. Interpolar
en el gráfico el diámetro del halo en el papel embebido con el medio de cultivo para conocer la
concentración de antibiótico en el mismo. La ausencia de halo de inhibición en el sexto círculo
indicará que no hubo producción de antibiótico.
Resultados
Reportar los periodos reales y temperaturas de incubación durante la fermentación y en el ensayo
del antibiograma.
Reportar la biomasa producida en el medio de cultivo de fermentación en peso seco.
Esquematizar o fotografiar los resultados de los antibiogramas para cada antibiótico obtenido con
los medios A y B.
antibiótico en los medios A y B.
Reportar el diámetro del halo de inhibición para los antibióticos obtenidos en los medios A y B.
Análisis de resultados
Hacer un comparativo de las diferencias obtenidas en cantidad de biomasa, actividad y producción
de antibiótico entre los medios A y B, sustentando de manera concisa y comprobable las respuestas
con la bibliografía consultada.
Explicar si las diferencias obtenidas se deben a solo unos constituyentes del medio de cultivo en
particular o toda la formulación en conjunto. Explicar también el efecto de los componentes del
medio de cultivo sobre la producción del antibiótico.
23
Explicar también si el antibiótico obtenido es tetraciclina, oxitetraciclina o clortetraciclina y por qué.
CONCLUSIONES
Concluya de manera clara y concisa sobre :

Tipo de antibiótico obtenido y relación de la formulación del medio de cultivo con la cantidad de
antibiótico producido.
Puntos críticos de la recuperación de antibiótico
Interpretación e interferencias del método de cuantificación
CUESTIONARIO PREVIO
Describe las características del genero Streptomyces.
¿Qué otro microorganismo es utilizado para producir tetraciclina además del Streptomyces
aureofaciens?
Esquematiza la molécula base de la tetraciclina con los diferentes átomos constituyentes para
obtener los derivados oxitetraciclina y clortetraciclina.
¿Cuál es el mecanismo de acción de la tetraciclina?
¿A qué se refiere el término “espectro” de un antibiótico?
¿Qué otros géneros microbianos son productores de sustancias antibióticas?
¿Cuál es la diferencia entre un agente bacteriostático, bacteriolítico y bactericida?
¿Cuáles son los metabolitos primarios y secundarios? ¿A cuál de ellos pertenece la tetraciclina?
¿Qué son un medio sintético y uno no sintético?
Describe al menos un método empleado para la purificación de antibióticos.
¿Por qué otro método, aparte de la fermentación líquida, es posible producir antibióticos?
Descríbelo.
Explica al menos un método para la obtención y selección de cepas mutantes sobreproductoras de
antibióticos.
Menciona al menos tres microorganismos comúnmente empleados en los antibiogramas. Menciona
también las características del Agar Mueller-Hinton, que lo hacen un medio ideal para las pruebas
de sensibilidad a antibióticos.
¿Cuáles son las otras aplicaciones de los antibiogramas, además de utilizarse para cuantificar un
antibiótico?
Describe el procedimiento que comúnmente se utiliza para aislar nuevas cepas productoras de
antibióticos.
FUENTES DE CONSULTA
Brock D.T., Madigan T.M. Microbiología. 6a ed. Prentice Hall. México 1993
Darken, Berenson, Shirk, Sjolander. Production of tetracycline by Streptomyces aureofaciens in
synthetic media. Applied Microbiology. 1960 January; 8(1): 46–51
Scragg, A. Biotecnología para Ingenieros. Sistemas Biológicos en Procesos Tecnológicos. Ed. Limusa.
México 1992
ENCB-IPN. Microbiología Práctica. 2ª ed. México 1998
ENCB-IPN. Manual de Prácticas de Bacteriología Médica. México 2003
24
PRÁCTICA 4.- PRODUCCIÓN DE PENICILINA POR FERMENTACIÓN EN ESTADO

SÓLIDO (FES) Y FERMENTACIÓN EN ESTADO LÍQUIDO (FEL) CON PENICILLIUM SP.
Elaboró: M. en F. D. Karen G. Moreno Guerrero
INTRODUCCIÓN
Dentro de los metabolitos secundarios obtenidos a partir de microorganismos, los

antibióticos tienen un papel preponderante dentro del área farmacéutica. Desde el descubrimiento
de Fleming en 1929 sobre la penicilina y su uso como antibiótico los sistemas de producción de
antibióticos han tenido diferentes cambios incluyendo: formulaciones de medios de cultivo,
creación de cepas súper productoras y la producción del antibiótico en diferentes sistemas de
cultivo.
Entre estos últimos, la fermentación sumergida fue el primer sistema de producción para diferentes
metabolitos secundarios, incluyendo los antibióticos beta-lactámicos como la penicilina. Este
sistema de fermentación originalmente montado como cultivo en lote, ha sido probado también
como cultivo alimentado, con la finalidad de incrementar la producción del antibiótico. En la
fermentación sumergida o en estado líquido la fase continua está constituida por el medio líquido,
fase que contiene también disueltos en ella la fase sólida (biomasa, nutrientes) y la fase gaseosa
(oxígeno, CO2).Si bien la fermentación en estado líquido es un sistema de cultivo donde el control-
monitoreo de variables y parámetros de proceso es relativamente fácil, hablando en términos de
producción de metabolitos con microorganismos miceliares como los hongos, presenta algunas
desventajas, tales como: problemas difusionales de nutrientes y gases con la fase biótica cuando
ésta crece en forma de pellets, grandes volúmenes de medio de cultivo y por ende mayores costos
de producción, mayor número de operaciones unitarias “downstream” para la recuperación del
producto, entre otros.
La fermentación en estado sólido (FES o SSF), definida como un cultivo donde los procesos de
biotransformación se llevan a cabo en ausencia de agua libre, ha permitido superar varios de esos
inconvenientes mejorar la relación costo-beneficio en la producción de antibióticos por factores
tales como: 1) La utilización de residuos o subproductos de la industria agrícola como soporte del
sistema, que por ser un material de desecho se adquiere a muy bajo costo; 2) El volumen requerido
de medio de cultivo en el sistema es infinitamente menor que en el sistema sumergido, pues este
sistema opera con baja actividad de agua; las condiciones del cultivo (pH ácido, baja cantidad de
agua disponible, etc.) es un ambiente “estresante”, que no favorece la proliferación de
microorganismos que pudieran contaminar el cultivo, mientras que los microorganismos miceliares
son lo suficientemente aptos para crecer en estas condiciones, a la vez que el estrés ambiental y
nutricional al que los somete el cultivo favorece la producción de metabolitos secundarios; la
recuperación del metabolito implica menos pasos que en el cultivo sumergido, lo que disminuye
también los costos de producción.
Si bien existen diferencias en rendimientos, insumos, volúmenes y productividades de ambos

sistemas, las etapas del proceso son las mismas:
1. Preparación y propagación del inóculo
2. Formulación y preparación de los medios de cultivo
3. Acondicionamiento del soporte, únicamente en FES
4. Inoculación del medio
25
5. Fermentación o etapa de producción

6. Recuperación y cuantificación del producto
OBJETIVO GENERAL
- Producir el antibiótico penicilina G por fermentación en estado líquido (FEL) y sólido (FES)
utilizando Penicillium sp, para identificar y analizar diferencias, ventajas y desventajas de ambos
sistemas de cultivo.
OBJETIVOS PARTICULARES
- Analizar el efecto del uso de precursores para incrementar la producción del antibiótico en
ambos sistemas de cultivo.
- Identificar la relación entre las fases de crecimiento del microorganismo y la producción del
antibiótico.
- Analizar los factores con mayor influencia en la producción del antibiótico en ambos sistemas
de cultivo: inóculo, tipo y cantidad de medio de cultivo, condiciones de incubación, condiciones
para la recuperación del antibiótico, etc.
- Analizar las principales ventajas y desventajas de los sistemas FES y FEL en lo relativo a:
crecimiento del microorganismo, monitoreo y control de las condiciones de proceso, costos,
productividades o rendimientos, tiempo total de cultivo, etc.
- Determinar, bajo las condiciones utilizadas en el laboratorio, cuál es el sistema óptimo para la
producción de penicilina.
MATERIAL Y REACTIVOS:
1) Propagación del inóculo

 2 placas Petri de 20 x 100 mm. Pueden sustituirse por placas de 10 x 100 mm
 1 matraz Erlenmeyer de 125 Ml
 1 asa micológica
 Tapón de gasa con algodón para el matraz
 Papel kraft
 Incubadoras orbital y de cámara
Reactivos:
 Caldo papa dextrosa
 Agar Czapeck-Dox
 Cloruro de sodio
 Agua destilada
Cepa microbiológica:
 Penicillium sp. En tubo inclinado o medio líquido
2) Formulación del medio de cultivo para producción y del precursor de penicilina

 1 Matraz Erlenmeyer de 250 Ml
 1 matraz Erlenmeyer de 125 Ml
 1 Vaso de precipitados 250 Ml
 1 Espátula
 Papel encerado
26
 Potenciómetro
 Gasa y algodón
Reactivos:
 Pharmamedia
 Carbonato de Calcio
 Hidróxido de sodio
 Ácido fenilacético
 Sólidos de macerado de maíz. Puede sustituirse por maíz precocido
 Extracto de levadura
 Lactosa
 Sulfato de amonio
 Agua destilada
 Ácido y base diluida para ajuste de Ph
 Amortiguadores de calibración Ph 7 y Ph 4
3) Inoculación de medios de cultivo y acondicionamiento del soporte para FES

 Cámara de Neubauer
 Puntas azules o pipetas de 1 Ml estériles
 Micropipeta 100 – 1000 µL
 1 vaso de pp de 25 Ml estéril
 1 Tubo Falcon de 50 Ml con agua destilada estéril
Para el acondicionamiento del soporte

 2 matraces Erlenmeyer de 250 Ml
 2 tapones de algodón para los matraces
 Papel aluminio
 Tijeras, cutter y palangana de plástico de aprox. 4 L de capacidad
 Colador
 Papel kraft
 Balanza analítica
 Estufa de secado
 Cápsulas de porcelana o charolas de aluminio a peso constante
4) Producción
 2 Microtubos de 2 Ml estériles
 Puntas azules recortadas, estériles.
 Palangana para baño de agua
 Incubadora orbital
 Agitador vortex
5) Recuperación del antibiótico

 2 tubos Falcón estériles
 Agitador orbital
 Sistema de filtración a vacío
27
 Discos de papel filtro de 100 mm poro medio (No. 1, Whatman)

 Centrífuga con rotor para tubos Falcón de 50 Ml
Reactivos
 Fosfato de K monobásico
 Fosfato de K dibásico
Cuantificación del antibiótico

 3 placas Petri de 10 x 100 mm
 1 matraz Erlenmeyer 250 Ml con tapón de algodón
 Puntas blancas estériles
 5 microtubos de 2 Ml estériles
 Micropipeta 0-20 µL
 12 Discos de papel filtro poro fino, calibre grueso
 1 hisopo estéril
 1 pinzas de disección planas
 1 tubo Falcon de 50 Ml
 Incubadora
Reactivos:
 Agar Mueller-Hinton
 Caldo LB
 Estándar de penicilina Sigma-Aldrich
 Agua destilada estéril
Cepa microbiológica
 Bacillus subtilis
Se presenta a continuación el esquema general de actividades para la realización de la práctica a fin
de realizar la calendarización de actividades específicas dentro del cronograma de actividades del
laboratorio.
Semana 1 Semana 2 Semana 3 Semana 4
- Activación de la - Preparación de - Inoculación de los - Recuperación del
cepa de P. sp. material Fases 1) sistemas extracto crudo de
- Propagación del a 3) - Inicia proceso de penicilina en FES
microorganismo - Recuperación de producción y FEL
- Inicia cultivo para esporas para - Toma de muestras - Cuantificación
obtención de inóculo de FEL en 3 puntos por antibiograma
esporas - Preparación de de la producción
- Selección y los sistemas - Preparación de
pretratamiento líquido y sólido material fase 5)
del soporte - Propagación de
microorganismo
de prueba para
antibiograma
28
1) Activación de la cepa y propagación del inóculo de Penicillium sp.
- De la cepa criopreservada, tomar un inóculo de esporas con el asa micológica y sembrar en 50

Ml de caldo papa dextrosa. Poner en incubación de 48 a 72 horas (deberá observarse la
progresión y velocidad de crecimiento alcanzada), con agitación de 150 rpm y 28°C de
temperatura.
- Una vez que la cepa se ha activado, recuperar micelio y/o esporas del cultivo y sembrar de forma
masiva sobre placas de agar Czapeck-Dox (2 placas). Incubar las placas de forma invertida entre
3 y 5 días o hasta que las colonias hayan esporulado y se observe el “césped” verde de
estructuras característico del hongo (Ver Figura 1).
Figura 1. Colonias de Penicillium sp., donde se observa el color verde obscuro característico debido
a la acumulación de esporas del centro a la periferia de la colonia. El borde blanco exterior
corresponde al micelio vegetativo más joven, que aún no ha esporulado.
NOTA: El trabajo en este paso debe ser en condiciones asépticas.
- De las colonias obtenidas, recuperar las esporas haciendo un raspado con el asa micológica para
liberarlas del micelio. Enseguida, verter pequeños volúmenes de solución salina y recuperar la
solución de esporas en un tubo Falcon estéril. Debe procurarse recuperar todas las esporas en
un volumen pequeño, no mayor a 10 ml, a fin de alcanzar la densidad de esporas requerida para
el inóculo.
- Con la cámara de Neubauer, hacer un conteo preliminar de la densidad de esporas en la solución
y ajustar la densidad final a 1x106 esporas/Ml. La dilución deberá hacerse con solución salina
estéril.
- Si la solución de esporas no es utilizada inmediatamente, refrigerar a 4°C en condiciones de
esterilidad, hasta su uso en la inoculación de medios.
2) Formulación y preparación de los medios de producción de peniclina

- Preparar 75 – 100 Ml del medio enlistado abajo, pero en concentración final 2X. En este
paso es conveniente preparar el medio para todo el grupo en conjunto, debido a las altas
concentraciones y los pequeños volúmenes que se utilizarán.
29
Medio complejo para la producción de penicilina

Componente Cantidad (g/L) 1X
Pharmamedia 20
Sólidos de macerado de maíz 20
Lactosa 50
(NH4)2SO4 4
CaCO3 5
Agua destilada 1
Ph 6.1
Fenilacetato
potásico……………………0.4%
Adaptado de Martín, G. J. Un autoinductor de la biosíntesis de penicilina en Penicillium

chrysogenum. Tesis doctoral. U. de León. México, 2010.
- Del volumen total preparado en concentración 2x, tomar 50 Ml y diluir a la concentración

final 1x. Este será el medio de producción para el sistema líquido, con un volumen final de
100 Ml.
- Reservar el resto del medio 2X (25-50 ml) en un tubo Falcon. Esterilizar ambos medios (1X
y 2X) a 121°C durante 15 minutos.
- Aparte, esterilizar 50 Ml de agua destilada para la posterior dilución del medio 2X y la
estandarización de %Humedad del soporte en los sistemas FES.
Preparación del precursor Fenilacetato de potasio

- Preparar 25 ml de solución de Hidróxido de potasio al 40%. Como se trata de una solución
sobresaturada es posible que se requiera calentar para su disolución.
- Agregar 20 g de ácido fenilacético y disolver adicionando 25 Ml de Agua a la solución. El Ph
final debe ser 8.0 – 8.2
- Esterilizar a 121°C durante 15 minutos.
- La proporción de inductor a utilizar es de 2.5 Ml/L de medio
3) Acondicionamiento del soporte para los sistemas FES
Los soportes a elegir para la FES deberán ser residuos agroindustriales lignocelulósicos, libres de
carbohidratos simples, inertes y no aprovechables como sustrato, en una cantidad aproximada de
50 – 100 g, dependiendo de la naturaleza del soporte.
Entre los soportes que se pueden utilizar están:
 Bagazo de caña
 Bagazo de betabel
 Hoja de maíz
 Viruta de madera
 Cáscaras de cacahuate
 Cáscaras de naranja
 Fibra de Ixtle
 Cáscara de coco
 Paja de cereales (trigo, avena, cebada)
 Cascarilla o residuos de café
30
Una vez seleccionado el soporte para cada equipo de trabajo, consulte con el profesor las
particularidades para preparar cada soporte y si ambos sistemas se harán por duplicado o no. En
general, el procedimiento será:
- Lavar el soporte para retirar rastros de suciedad o azúcares residuales y secar al aire por 24
horas (antes de iniciar la práctica).
- Reducir el tamaño de partícula del soporte entre 3 y 10 mm de longitud en la suficiente cantidad

para que el soporte cubra el fondo de un matraz Erlenmeyer de 250 Ml hasta la marca de 100
Ml. Consulte al profesor sobre el tamaño de partícula más adecuado para su soporte en
particular.
- Determinar la masa en g del soporte a colocar en el matraz. Esta y el contenido de humedad

serán la base de cálculo para el volumen de agua y medio de cultivo que deberán utilizarse
posteriormente.
- Una vez colocado el soporte dentro del matraz, colocar un tapón de gasa y esterilizar a 121°C
durante 15 minutos.
- Aparte, determinar el % de humedad inicial del soporte colocando 1-3 g (el peso deberá
determinarse exactamente) sobre una charola de aluminio previamente tarada a peso
constante. Secar en el horno a 60°C por 24 horas y determinar el peso de la muestra ya seca. El
% de humedad será calculado con la siguiente fórmula:
%HSoporte = [(Peso húmedo – Peso seco) / Peso húmedo]*100
- Adicionalmente, consultar en la literatura el % de saturación (%Sat) o retención de agua del

soporte escogido, pues éste valor será el límite de líquido a utilizar en el soporte para su
humectación sin correr riesgo de sobresaturarlo. Los valores pueden estar entre el 50% y 200%,
dependiendo del material elegido. En caso de no encontrarlo, determinarlo experimentalmente
humectando 10 g de soporte en un vaso de precipitados, con volúmenes medidos de agua
destilada hasta que se encuentre húmedo en su totalidad pero sin presentar goteos o
escurrimientos. Calcular el %P/V de agua retenida en los 10 gramos de soporte.
- Con los porcentajes de humedad inicial y de saturación, calcular el volumen total de líquido
(VolTliq) para humectar el soporte, donde, el 50% de ese volumen corresponderá a un volumen
de agua destilada estéril y el resto será el volumen de medio de cultivo (concentración 2X), para
llegar a una concentración final de 1X, equivalente a la empleada en la fermentación en estado
líquido.
VolTliq = %Sat - %Hsoporte [ = ] ml/g

= VolH2O + VolMedio2x
- Si el %Hsoporte es menor al 10%, puede considerarse despreciable la contribución de humedad y
por lo tanto tomar el % de saturación como la cantidad de líquido a utilizar.
Ejemplo:
31
%Sat = 250%
% Humedad Inicial = 3%  No significativo
VolTliq = 250 ml/100 g de soporte seco = 125 ml de agua + 125 ml de medio de cultivo 2X.
- Determinados los volúmenes de agua y medio de cultivo, esterilizarlos por separado en tubos
Falcón a 121°C durante 15 minutos. Esterilizar también el soporte sólido en un matraz, como
se indicó previamente.
o NOTA: EL SOPORTE NO DEBERÁ HUMECTARSE ANTES DE SER ESTERILIZADO, PARA
EVITAR PÉRDIDAS POR EVAPORACIÓN.
4) Inoculación de los medios de producción
Fermentación en estado líquido

- Inocular el medio con 10% v/v de una suspensión de esporas de Penicillium de concentración
1x106 esporas/ml. Si se tiene una suspensión de micelio en forma de pellet en lugar de la
suspensión de esporas, inocular con 10% v/v de la suspensión, procurando vaciar la mayor
cantidad de biomasa en el inóculo. En este caso, deberá determinarse posteriormente, la
cantidad de biomasa (g/L) inoculada en la suspensión.
- Homogenizar el cultivo e incubar a 28°C y 160-180 rpm en una incubadora de agitación orbital.
Fermentación en estado sólido

- Previamente a la inoculación, humectar el soporte con el volumen de agua destilada calculado
y agitar manualmente hasta que se observe homogeneidad en la humectación. Enseguida,
adicionar el volumen calculado de medio de cultivo 2X y homogenizar nuevamente.
PRECAUCIÓN: Es necesario agitar el medio de cultivo antes de adicionarlo, debido a la gran cantidad
de sólidos en suspensión que posee. No deben quedarse restos de medio de cultivo en el tubo
Falcon para no alterar las concentraciones de nutrientes.
- Determinar con ayuda del profesor si el soporte se encuentra correctamente humectado. En
caso contrario, deberán agregarse y cuantificarse pequeños volúmenes de medio y agua
destilada hasta lograrlo. De forma empírica, una manera de determinarlo es cuando se observa
una película de líquido que cubre únicamente el fondo del matraz pero no hay flotación del
soporte.
- Cuando el soporte ya se encuentre humectado, tomar como referencia el volumen final total
utilizado (agua + medio de cultivo) e inocular con 10% v/v el sistema con una suspensión de
esporas de Penicillium de concentración 1x106 esporas/ml. Si se tiene una suspensión de micelio
en forma de pellet en lugar de la suspensión de esporas, inocular con 10% v/v de la suspensión,
procurando vaciar la mayor cantidad de biomasa en el inóculo. En este caso, deberá
determinarse posteriormente, la cantidad de biomasa (g/L) inoculada en la suspensión.
- Homogenizar el sistema agitando manualmente, a fin de distribuir el inóculo en todo el soporte.
Incubar el sistema a 28°C en una incubadora con cámara de humedad, para evitar la desecación
de los soportes.
5) Producción de penicilina
Fermentación en estado líquido
- Después de la inoculación, los sistemas se incubarán en agitación constante (160-180 rpm). Sin
embargo, deberá verificarse la pertinencia de la agitación elegida, mediante observación visual
de los pellets formados conforme el microorganismo crece en el medio de cultivo: si se forman
pellets de más de 3 mm de diámetro será necesario aumentar la velocidad de agitación. Lo
32
mismo aplica si se observa que los sólidos del medio de cultivo (macerado de maíz o
Pharmamedia) no se resuspenden adecuadamente. Deberá consultarse con el profesor
previamente, cualquier modificación a las condiciones de cultivo.
- Con base en la investigación bibliográfica (ver Cuestionario previo) determinar el tiempo (en
horas) de adición del precursor (fenilacetato de potasio) en el cultivo, para favorecer la
producción de penicilina G.
- Adicionar el precursor en una proporción de 2.5 ml/L de medio de producción. La adición del
inductor deberá realizarse en condiciones asépticas. Si éste se encuentra cristalizado al
momento de su uso, puede calentarse a baño maría hasta disolverlo nuevamente.
- Homogenizar el cultivo e incubar en las condiciones anteriores durante 14 días. En caso de que
se observe agotamiento de nutrientes y/o proliferación excesiva de biomasa alrededor de los 7-
10 días, el cultivo podrá retirarse de la incubadora y mantenerse en refrigeración hasta la etapa
de cuantificación.
- Si bien no se realizará una cinética minuciosa de producción, es necesaria la observación
periódica y detallada del cultivo. Deberán registrarse como parte de los resultados los cambios
progresivos que se observen: acumulación de biomasa, formación de pellets, cambio en la
coloración, densidad, apariencia, etc. del medio de cultivo, por mencionar algunos, durante el
tiempo que dure la etapa de producción.
Fermentación en estado sólido

- Igual que en la fermentación líquida, determinar el tiempo (en horas) de adición del precursor
(fenilacetato de potasio) en el cultivo, para favorecer la producción de penicilina G y adicionar
el precursor en una proporción de 2.5 ml/L de medio de producción, tomando como referencia
para este cálculo el volumen total de líquido añadido al sistema. La adición del inductor deberá
realizarse en condiciones asépticas.
NOTA: A diferencia del sistema en estado líquido, el sistema sólido requiere que el fenilacetato se
mezcle previamente con un pequeño volumen de agua destilada estéril, a fin de favorecer su
distribución por todo el soporte. Consultar previamente con el profesor el volumen adecuado para
esta operación.
- Una vez añadido el volumen de inductor, homogenizar con agitación manual el sistema y
continuar con la incubación en las condiciones previamente establecidas durante 14 días.
- Igual que en la fermentación en estado líquido, registrar los cambios observados en el sistema:
pérdida de humedad, crecimiento de biomasa, esporulación, etc.
6) Recuperación y cuantificación del antibiótico

Recuperación del extracto crudo de penicilina en la Fermentación en estado líquido
- En un tubo Falcon estéril, recuperar 10 ml del caldo de fermentación y centrifugar a 4000-5000
rpm durante 10 min. Reservar 500 µL del sobrenadante (extracto crudo) para cuantificación del
antibiótico.
- Si el medio se torna viscoso y/o no se logra una separación adecuada con la centrifugación,
filtrar un volumen a vacío y posteriormente centrifugar para clarificar el filtrado. La recuperación
del medio debe realizarse en condiciones asépticas. Reservar 500 µL del sobrenadante (extracto
crudo) para cuantificación del antibiótico.
Recuperación del extracto crudo de penicilina en la Fermentación en estado sólido

- Lavar el soporte con solución amortiguadora de fosfatos (de sodio o potasio) 0.1M a Ph 6.0 en
proporción 1:1, 2:1 o 3.1. Con base en el porcentaje de saturación del soporte, consultar con el
33
profesor la proporción adecuada para eluir el antibiótico sin provocar una dilución excesiva. El
lavado debe realizarse en frio.
- Para hacer el lavado, vaciar el amortiguador de fosfatos en el matraz de cultivo y poner en
agitación orbital (180-200 rpm) durante 30 minutos.
- Pasado el tiempo de lavado, decantar la solución del matraz y recuperar en un microtubo por lo
menos 500 µL. Centrifugar a 4000-5000 rpm durante 5 min para clarificar y reservar el clarificado
para la cuantificación.
Cuantificación del antibiótico

- Preparar 3 cajas Petri con 20 Ml de medio para antibióticos 1 y 2 o agar Mueller-Hinton.
Paralelamente, preparar un cultivo de 24 horas de Bacillus subtilis en caldo nutritivo. Empapar
un hisopo estéril en la suspensión del cultivo cuidando de retirar el exceso presionando y
rodando el hisopo sobre las paredes del tubo antes de retirarlo. Extender de forma homogénea
(ver el esquema) en tres direcciones sobre toda la superficie de la placa de agar, cuidando de
no dejar sitios sin cubrir. Incubar en posición invertida a 37ºC durante 24 horas una vez que han
sido colocados los discos con el antibiótico.
1 2 3
Figura 2. Esquema para la siembra del inóculo en las placas para antibiograma.
- Aparte, preparar con agua destilada estéril en el volumen mínimo posible (por ejemplo 5 Ml)
una solución madre de 10,000 UI penicilina/Ml. A partir de ella, elaborar por lo menos 5
diluciones en un intervalo de 0 – 100 UI de peniclina/Ml. Para determinar la concentración
original de la solución madre será necesario consultar la actividad en UI/mg reportada por el
fabricante para el estándar de referencia.
- Colocar sobre las placas de agar Mueller-Hinton o medio para antibióticos 1 y 2 previamente
inoculadas con el microorganismo de prueba cinco círculos de papel filtro como lo muestra el
esquema (Figura 3), previamente embebidos en 15 µL de cada una de las diluciones del estándar
de penicilina. Esta placa corresponderá a la curva tipo para el cálculo de [penicilina] obtenida
en los extractos crudos. Marcar en la caja las concentraciones correspondientes de penicilina.
Incubar las cajas en posición invertida a 37ºC durante 24 horas.
34
STD 2
STD 1 STD 3
0
UI/mL
STD 5 STD 4
Figura 3. Esquema para la distribución de los círculos de papel filtro en la caja Petri para elaborar la
curva patrón de penicilina.
- En las placas restantes de Agar Mueller-Hinton, repetir la operación con los extractos crudos de
fermentación en estado sólido y líquido, como indica el siguiente esquema.
-
Figura 4. Arreglo y distribución de los discos de papel filtro para cuantificación de penicilina en los
extractos crudos de los sistemas FES y FEL.
- Incubar las placas durante 24 horas a 37°C. Al término de la incubación, medir el diámetro de
los halos de inhibición en los estándares de penicilina y el medio de cultivo. Verificar a contraluz
el crecimiento en las placas, ya que puede verse sólo atenuado y no inhibido en su totalidad.
Aun así, deberá tomarse ese halo como referencia para la estimación del antibiótico producido.
Para calcular la concentración del antibiótico en el medio de cultivo, graficar el logaritmo de la

concentración de las diluciones de penicilina contra el diámetro del halo de inhibición. Interpolar en
el gráfico el diámetro del halo en el papel embebido con el medio de cultivo para conocer la
concentración de antibiótico en el mismo. La ausencia de halo de inhibición en el sexto círculo
indicará que no hubo producción de antibiótico.
Para el cálculo de la concentración de penicilina en FES, hay que tomar en cuenta que existe un
factor de dilución del medio, a partir del lavado del soporte, por lo tanto, la concentración real de
antibiótico deberá obtenerse utilizando este factor de dilución, calculado con los volúmenes finales
de medio de cultivo y amortiguador de fosfatos utilizado.
35
GUÍA PARA EL ANÁLISIS DE RESULTADOS

 Elaborar un cuadro comparativo para concentrar los resultados grupales de los sistemas FES y
FEL, con los siguientes puntos:
o Para FEL
 Volumen de medio de cultivo
 Volumen de inóculo y concentración de esporas/ml o g de biomasa/ml de
inóculo
 Características del inóculo utilizado: apariencia, crecimiento, presencia de
esporas, hifas o pellets, tamaño de pellets, apariencia del medio de cultivo.
 Apariencia y características de la placa del antibiograma realizado
 Concentración final de penicilina (UI/ml)
 Tiempo de adición del precursor de penicilina
o Para FES
 Tipo y cantidad (g) de soporte utilizado
 Volumen de medio utilizado
 Volumen de inóculo y concentración de esporas/ml o g de biomasa/ml de
inóculo
 Características del sistema sólido: crecimiento e invasión del soporte por el
micelio, presencia de esporas, agotamiento del medio o desecación del soporte,
efectividad del proceso de lavado en la recuperación de antibiótico.
 Tiempo y forma de adición del precursor de penicilina
 Con los resultados anteriores, calcular el rendimiento de antibiótico por militro de medio de
cultivo empleado y por gramo de soporte y determinar con ello cuál sistema (FES o FES) fue el
más apto para la producción del antibiótico.
 Integrar al análisis el efecto del inóculo, de las operaciones de acondicionamiento del soporte,
el tiempo de adición del precursor y el control de las condiciones de operación (agitación,
humedad, temperatura) sobre el antibiótico producido.
 Explicar también el efecto del método de recuperación y de las interferencias del método de
cuantificación empleado sobre los resultados obtenidos, para determinar su veracidad y
confiabilidad.
CUESTIONARIO PREVIO
1. ¿Cuáles son las características generales del género Penicillium?
2. Investigar la velocidad de crecimiento o tiempo de duplicación de Penicillium, curva típica de
crecimiento (biomasa vs tiempo) y tiempo en el que alcanza la fase estacionaria, así como las
condiciones que favorecen su esporulación.
3. ¿Qué tipo de metabolito es la penicilina y cuál es su ruta metabólica de síntesis?
4. ¿Qué condiciones (ambientales, nutrimentales, etc.) pueden inhibir la producción de este
metabolito a partir de Penicillium sp?
5. ¿Cuál es la diferencia entre precursor e inductor? En el caso de la síntesis de penicilina, en qué
etapa de la ruta metabólica de síntesis se involucra al fenilacetato de potasio y qué tipo de
penicilina se producirá con él?
6. Definir las características de los sistemas de fermentación sumergida o fermentación en estado
líquido (FEL) y fermentación en estado sólido (FES), así como los productos metabólicos y tipos
de microorganismos con los que se emplean más frecuentemente.
7. Esquematiza y explica los fenómenos de transporte de materiales y energía que se originan en
una fermentación es estado sólido, entre todos sus componentes: fase gaseosa, biomasa, fase
líquida, soporte, etc.
36
8. ¿Qué características deben tener los materiales que se utilizan como soportes en los cultivos en
estado sólido? Explica detalladamente y enlista algunos ejemplos de los soportes más utilizados
en la producción de penicilina.
9. ¿Qué es una concentración mínima inhibitoria (CMI)? ¿Cuál es la CMI de penicilina que actúa
sobre Bacillus subtilis?
10. ¿Qué tipo de antibiótico es la penicilina? ¿Cuál es su mecanismo de acción? ¿Su acción
terapéutica depende de la concentración o del tiempo?
11. Con las respuestas de las preguntas 8 y 9, determinar y justificar cuáles serán las
concentraciones a utilizarse para elaborar la curva patrón de penicilina.
12. ¿Qué interferencias puede presentar el método de antibiograma utilizado para cuantificar el
antibiótico producido?
FUENTES DE CONSULTA
GONZÁLEZ, M. Un autoinductor de la síntesis de penicilina en Penicillium chrysogenum:
caracterización molecular y estudio de la respuesta del proteoma a la adición del inductor. Tesis
doctoral. UANL, México 2010.
Handbook of fungal biotechnology. 2nd ed, revised and expaned. Chaps. 7, 20, 30. Marcell Decker
Inc. USA, 2004.
MCNEAL & Harvey. Practical fermentation technology. Wiley & Sons. UK, 2008.
MITCHEL, Krieger, Verovic. Solid-State fermentation bioreactors. Fundamentals of design and
operation. Springer Verlag. Germany, 2006.
37
PRÁCTICA 5.- CULTIVO DE CÉLULAS ANIMALES. OBTENCIÓN DE UN CULTIVO

PRIMARIO DE CÉLULAS POLIMORFONUCLEARES DE SANGRE PERIFÉRICA
Elaboró: M. en F. D. Karen Gisela Moreno Guerrero
INTRODUCCIÓN
El cultivo de células recién aisladas de sangre u otro líquido fisiológico o de un tejido sólido,
tanto sano como enfermo, se denomina cultivo primario. En muchos procedimientos se utilizan
estas células como tal a las pocas horas o días de iniciado el cultivo.
El primer paso para establecer el cultivo primario es preparar una suspensión de células
individualizadas, dañándolas lo menos posible. Si se obtienen de líquidos, bastará con aisladas
por centrifugación. Si proceden de tejidos sólidos, será necesario dispersarlas disgregando la
matriz intercelular. Se emplean medios mecánicos (rotura con material de disección), seguidos,
cuando sea necesario, de digestión enzimática suave.
OBJETIVO GENERAL
Obtener un cultivo primario de células polimorfonucleares (CPMN) a partir de una muestra de

sangre periférica mediante la técnica de separación por gradiente de densidad.
Material:
1 jeringa estéril de 3 mL con aguja (color verde)
1 ligadura
1 tubo heparinizado con EDTA
1 tubo Falcon de 15 mL
1 par de guantes estériles (látex o nitrilo) libres de talco
1 micropipeta de 100-
1 frasco con puntas azules con 2-3 mm de la punta removidos, estériles.
1 torunda de algodón y cinta micropore o banditas adhesivas

microscopio óptico
encendedor
plumón indeleble
franela o gasas para limpieza
jabón antibacterial
Reactivos
Ficoll-Hypaque
Colorante Wright
Portaobjetos rectangulares
Hipoclorito de cloro comercial para desinfección
Etanol 96° GL
Amortiguador salino de fosfatos (PBS)
38
DESARROLLO EXPERIMENTAL:
1. Obtener con una jeringa estéril 2 mL de sangre periférica de un donador sano con al menos
6 horas previas de ayuno.
2. Retirar la aguja de la jeringa y desecharla en el contenedor de residuos punzo cortantes.
3. NOTA: A partir de éste paso trabajar en un ambiente aséptico. Si no es posible trabajar en

la campana de flujo laminar puede trabajarse con ayuda de mecheros Fischer sobre la mesa
de laboratorio, cuidando de NO ACERCAR EL TUBO CON FICOLL-HYPAQUE AL MECHERO, YA
QUE ES FLAMABLE.
4. Lentamente, vaciar los dos mL de sangre dentro de un tubo Falcón de 15 mL que contiene
4 mL de Ficoll-Hypaque (proporción 1:2). El vaciado debe realizarse sobre la pared del tubo
y de forma lenta para evitar mezclar los dos fluidos. Deben observarse dos fases definidas
en el tubo, como se observa en las siguientes imágenes.
a) Vaciado de sangre inicial sobre el Ficoll. b) Al finalizar el vaciado de sangre se observar

Obsérvese que debe formarse una capa inicial dos fases definidas en el tubo. El Ficoll (fase
de sangre sobre la que se depositará el resto inferior) no debe mezclarse con la sangre.
de la muestra.
5. Rotular y centrifugar a 4000 rpm por 15 minutos.
6. Retirar el tubo de la centrífuga y verificar la separación de las fases según su densidad, como
se muestra en la siguiente figura. En caso de no ser así, descartar el tubo y suspender el
procedimiento.
39
c) Fases obtenidas en el tubo después de centrifugación. La capa de CPMN está ubicada

entre el plasma y el Ficoll. Es de color blanco-amarillo y puede presentar alta viscosidad.
7. Una vez identificada la banda de células polimorfonucleares, recuperarlas con ayuda de una
pipeta, procurando no mezclarla con Ficoll o plasma. De ser necesario, remover la capa
superior y enseguida recuperar la capa lechosa de CPMN. Las células recuperadas deben
Capa de
CPMN
d) Fases separadas después de la e) Remoción de la capa de plasma para

centrifugación: 1) Plasma; 2) CPMN; 3) Ficoll. separar las CPMN
8. Mezclar por inversión suave las células con el PBS y centrifugar a 13,000 rpm por 5 minutos.
9. Descartar el sobrenadante por decantación y resuspender el botón

PBS.
10. Adicionar a la suspensión de células 2 gotas de colorante Wright. Mezclar por inversión y
dejar en reposo durante 4 minutos.
40
11. Pasado el tiempo de tinción, tomar una gota de la suspensión y observar al microscopio las
células separadas de la muestra de sangre. Deben encontrarse especies como las mostradas
en la siguiente imagen.
f) Células sanguíneas polimorfonucleares con tinción de Wright vistas al microscopio.
12. Registrar cantidad por campo, integridad y viabilidad de las células obtenidas.
13. Adicionar hipoclorito de sodio comercial al tubo con sangre y cualquier objeto con restos de
material de biológico y lavar posteriormente.
14. Desinfectar con etanol 96° las superficies y materiales de trabajo.
Analizar la importancia de la calidad de la muestra para la obtención de un cultivo primario

adecuado para uso en cultivo celular.
¿Fue adecuado el procedimiento de obtención y manipulación de la muestra?
¿Qué tipo y cantidad de células se obtuvieron? ¿Cómo se determina que las células obtenidas son
las esperadas?
¿Cómo influyó el procedimiento seguido en las características del cultivo? ¿Hubo errores en la
manipulación de la muestra, tiempos de centrifugación, etc.?
¿Cuáles fueron las diferencias entre las muestras obtenidas con los otros equipos? ¿A qué se
debieron?
¿Cuáles son los puntos críticos en esta técnica para obtener un cultivo primario?
41
¿Qué consecuencias tiene la calidad del cultivo primario obtenido en el cultivo posterior ya sea para
obtener un cultivo secundario o una línea celular?
¿Cómo se separarían los diferentes tipos celulares de la muestra para seleccionar uno en particular
que posteriormente se cultivará?
¿Es necesaria una digestión mecánica o enzimática adicional de la muestra?
¿Qué tipo de células (adherentes, no adherentes) son las obtenidas de sangre periférica?
CUESTIONARIO PREVIO
¿Cuáles son las células mononucleares? Descríbelas y esquematízalas.

¿Cuál es la composición del Ficoll-Hypaque? Describe la función de cada componente.
¿En qué consiste la técnica de separación por densidades para aislar células polimorfonucleares de
sangre periférica (PBMC)?
¿Por qué en este protocolo no se utiliza una digestión con tripsina?
¿Qué es el PBS y cuál es su formulación? ¿Para qué se utiliza en este protocolo?
Describe cómo se realizaría la obtención de un cultivo primario a partir de un tejido sólido, como
bazo o timo.
¿En qué medios de cultivo y recipientes pueden cultivarse las células obtenidas en la práctica?
Describir por lo menos dos medios y la función de cada componente y dos recipientes.
Una de las aplicaciones del cultivo de células son los ensayos de citotoxicidad, ya sea por infecciones
virales o bien por efecto de fármacos. Describe brevemente cómo se realizan estos ensayos.
Una prueba común para verificar la viabilidad celular es el ensayo con MTT. Describe cómo se hace
el ensayo.
Describe por lo menos una aplicación en farmacología del cultivo de células animales.
FUENTES DE CONSULTA
FRESHNEY, R. Culture of animal cells. A manual of basic techniques. 5a ed. Wiley.

HELGASON, C.D., Miller, C. L. Basic cell culture protocols. 3a ed. Humana Press
JACOBY, W.D., Pastan, I. Cell culture. Methods in enzymology series.
42
PRÁCTICA 6. EVALUACIÓN DE LA CITOTOXICIDAD DE DIFERENTES SUSTANCIAS DE

USO FARMACÉUTICO SOBRE CÉLULAS ADHERENTES
Elaboró: M. en F. D. Karen G. Moreno Guerrero
INTRODUCCIÓN
Las técnicas de cultivo de células se inició a principios del siglo XX con Harrison (1907) y A. Cairel
(1912) y hasta hace poco más de dos décadas existían solo 50 laboratorios en todo el mundo que
hacían uso de ellas. Sin embargo su uso en los estudios toxicológicos, principalmente de productos
de uso farmacéutico, se ha incrementado en los últimos años por varias razones, tales como:
1. La cantidad de substancias químicas que aparecen en el mercado continuamente como

parte de las formulaciones farmacéuticas, cuya inocuidad es necesario comprobar antes de
ser utilizadas, a fin de asegurar un impacto no negativo en la salud pública o ambiental.
2. La eliminación de problemas operativos (requerimiento de espacios grandes, gran cantidad
de personal para el mantenimiento de los animales, el control de las condiciones
ambientales, nutricionales, etc.) que conlleva hacer estudios in vivo con animales de
experimentación.
3. Los cuestionamientos éticos respecto al sufrimiento y la calidad de vida de los animales de
experimentación, aunado al aumento global de las campañas en contra del uso de animales.
4. El hecho de ser una técnica que permite realizar pruebas de toxicidad con un número de
muestras grande en un período corto (lo cual no se puede hacer en animales de
experimentación), por lo que resulta más económica, además de que se logra la
estandarización de los métodos y la reproducibilidad de los ensayos de forma más precisa
que en los ensayos in vivo.
En este contexto, la citotoxicidad celular se define como una alteración de las funciones
celulares básicas que trae como consecuencia daños a las células a diferentes niveles (metabólico,
morfológico, estructural, genético, etc.) que pueden ser evaluados de diferentes maneras.
En la actualidad, los ensayos de citotoxicidad han ampliado su uso debido a que son capaces de
detectar mediante diferentes mecanismos celulares conocidos, los efectos adversos de
interferencia con estructura y/o propiedades esenciales para la supervivencia celular, proliferación
43
y/o funciones, como por ejemplo la integridad de la membrana y del citoesqueleto, metabolismo,
síntesis y degradación, liberación de constituyentes celulares o productos, regulación iónica y
división celular. Su uso se ha extendido no sólo a la rama de la toxicología sino a la farmacología y
la farmacogenómica, encaminando los esfuerzos a la terapia individualizada de diferentes
padecimientos, como por ejemplo el cáncer, dónde se busca prever los efectos positivos o negativos
en la respuesta de un paciente hacia el tratamiento, antes de su administración.
Una vía para determinar los efectos adversos de un fármaco es evaluar morfológicamente la
interferencia con estructuras y propiedades esenciales para la proliferación, supervivencia o
mantenimiento de las funciones metabólicas de las células. Dentro de las características a evaluar
se encuentran la integridad de la membrana, organelos, citoplasma y citoesqueleto, metabolismo,
síntesis de productos o degradación, liberación de componentes celulares entre otros. Cuando la
evaluación se realiza sobre líneas celulares (por ejemplo células adherentes) puedes evaluarse
características adicionales, tales como la adherencia y formación e integridad de la monocapa.
OBJETIVOS
General
- Evaluar morfológicamente la citotoxicidad de diferentes sustancias químicas de uso

farmacéutico en un cultivo de células adherentes.
Particulares
- Establecer un cultivo de células adhrentes en medio Leibovitz (L-15).

- Mediante observación en el microscopio óptico, evaluar el efecto citotóxico de diferentes
sustancias de uso farmacéutico, aplicando la tinción de Giemsa a las células cultivadas.
MATERIALES Y MÉTODOS
Fármacos a ensayar (por lo menos dos fármacos): sulfato de atropina, cafeína, pentobarbital sódico,
insulina, sulfato de atropina, metanol, etanol, propanol.
44
Líneas celulares con posibilidad de utilizarse
No tumorales
Tumorales
(Preferentemente de un mismo organismo)
HeLa (cáncer cervicouterino) Hígado Pulmón
SH-SY5Y (neuroblastoma) Riñon Intestino delgado
HEK-293 (fibroblastos de riñón
Bazo Piel
transformados con adenovirus Tipo 5)
Reactivos
Agua inyectable
Suero fetal bovino (opcional)
Piruvato de sodio
Amortiguador de fosfatos (PBS) pH 7.4
Colorante Giemsa
Medios de cultivo (De acuerdo a la línea celular utilizada y la disponibilidad de incubadora de CO2)
Leibovitz (L-15)
DMEM
RPMI-40
Recipientes de cultivo
Placas estériles de 6 pozos de 4 cm de diámetro
Cubreobjetos de vidrio de 18 x 18 mm
Materiales adicionales
Micropipeta y puntas estériles de 100-1000 µL
Micropipeta y puntas estériles de 20-200 µL
Pinzas de disección planas
Frascos Coplin o puentes de Tinción
Toallas de papel
Cámara de Neubauer
Portafiltro de 2 cm de diámetro
Membranas de 0.22µm y 2 cm de diámetro
45
Equipo
Microscopio óptico de campo claro
Micropipetas de 100-1000 µL y 20-200 µL
Establecimiento del cultivo de células adherentes
NOTA: TODO EL TRABAJO EXPERIMENTAL DEBE REALIZARSE DENTRO DE LA CAMPANA DE FLUJO
LAMINAR.
Preparar 60 mL de medio Leibovitz (ver instrucciones del fabricante) y suplementarlo con 5% de
suero fetal bovino, 1% de solución de penicilina/estreptomicina y 5 mM de piruvato de sodio. Si la
preparación del medio no se ha llevado a cabo en condiciones de esterilidad deberá filtrarse con
una membrana estéril de 0.22µm.
1) En una placa de cultivo de 6 pozos, colocar en el fondo de cada uno un portaobjetos limpio y
estéril y sobre él verter cuidadosamente (en forma de goteo y por la pared del pozo) 2 mL de
medio de cultivo. Enseguida, colocar en cada uno 100 µL de una suspensión celular con densidad
celular de 5x106 cel/mL. Sellar las cajas e incubar a 37°C por 24-48 hrs. El cultivo deberá revisarse
periódicamente hasta que alcance aproximadamente el 80% de confluencia sobre la superficie
del cubreobjetos. Opcionalmente puede utilizarse la velocidad específica de crecimiento o el
tiempo de duplicación de la línea celular utilizada para estimar éste tiempo. Los pozos deberán
identificarse de la siguiente manera:
Testig Conc 1 Conc
Testig Conc 3 Conc 4
Figura 1. Esquema de identificación de los pozos de cultivo para realizar el ensayo de

citotoxicidad.
46
Tinción para evaluación de las estructuras y crecimiento celular.
2) Alcanzado el porcentaje de confluencia requerido, evaluar el crecimiento celular de la

monocapa obtenida y la apariencia del cultivo antes del tratamiento, con el cultivo identificado
como Testigo 1, mediante observación al microscopio como sigue a continuación.
3) Retirar asépticamente el portaobjetos del pozo de cultivo con ayuda de pinzas para disección
cuidando de no tocar la monocapa con ellas. Hacer un lavado con agua inyectable o PBS (Ver
Anexo para la preparación del PBS) y colocar sobre un portaobjetos, cuidando siempre que la
monocapa quede en la parte superior.
4) Sobre un puente de tinción cubrir totalmente el portaobjetos con colorante Giemsa con
amortiguador (Ver Anexo para la preparación del colorante) y esperar 5 minutos para teñir las
células. Si se cuenta con los frascos Coplin, cuidar de sumergir completamente los cubreobjetos.
No es necesario llenar el frasco al borde para portaobjetos.
5) Pasado el tiempo, retirar el colorante y enjuagar nuevamente la preparación con agua
inyectable o PBS, cuidando retirar todo exceso de colorante del cubreobjetos y el portaobjetos.
6) Observar al microscopio en seco débil (10x) la distribución de la monocapa sobre el
cubreobjetos, evaluando los bordes y adhesión de la monocapa, la uniformidad y distribución
de las células, confluencia alcanzada, etc. (Ver Cuadro de Resultados)
7) Observar en seco fuerte las estructuras celulares: forma de la célula, viabilidad e integridad de
la membrana, apariencia del citoplasma y organelos principales, estructuras teñidas, etc.
8) Registrar minuciosa y detalladamente todas las observaciones realizadas, ya que serán el punto
de comparación para evaluar el efecto citotóxico de los fármacos a probar sobre las células.
9) Registrar en un cuadro comparativo, incluyendo imágenes o esquemas, todas las observaciones
realizadas a detalle, incluyendo la apariencia del medio de cultivo.
Ensayo de citotoxicidad
10) Una vez que se evaluaron las características iniciales del cultivo, realizar el ensayo de
citotoxicidad sobre los pozos restantes de la placa, identificados como Testigo 2 y Conc 1, 2, 3 y
4, retirando el medio agotado con ayuda de una micropipeta y puntas estériles. Enseguida, lavar
el cultivo cuidadosamente (para no desprender la monocapa formada) con 2 mL de PBS estéril.
11) Paralelamente, preparar con agua inyectable las soluciones problema de cada fármaco a probar.
Puede seguirse el siguiente esquema:
47
Concentración final (mg/mL)

Fármaco pH
Estándar 1 2 3 4
Bitartrato de epinefrina 3.5 6 1 0.037 0.012 0.004
Teofilina 4.6 4.5 0.756 0.084 0.028 0.003
Cafeína 5 33 5.55 0.617 0.205 0.022
Pentobarbital sódico 10 20 3.33 0.370 0.123 0.013
Sulfato de atropina 4.5 6 1 0.111 0.037 0.004
Bromhidrato de
5 6 1 0.111 0.037 0.004
escopolamina
Cafeína
Propanol 7 39.5 13.16 4.3 0.48 0.05
Etanol 9 39.5 13.16 4.3 0.48 0.05
Metanol 8 39.5 13.16 4.3 0.48 0.05
Si se opta por otro fármaco no incluido en la lista, deberá investigarse la concentración ideal
necesaria para entrar en el rango de citotoxicidad y solubilidad de cada sustancia, adecuadas para
el ensayo.
Si la línea celular utilizada es tumoral, opcionalmente pueden utilizarse compuestos con actividad
antineoplásica conocida, por ejemplo metotrexato (MTX), con el siguiente esquema.
Concentración final (mg/mL)

Fármaco pH
Estándar 1 2 3 4
MTX (ametopterina) 7.0 10 1 0.5 0.25 0.1

NOTA: Utilizar guantes para manipular las soluciones y el material en contacto con el MTX.
12) Colocar en cada pozo 2 mL de medio de cultivo fresco y 1000 µL de las soluciones del fármaco
problema en los pozos marcados como Conc 1, 2, 3 y 4, dejando el Testigo 2 únicamente con 3
mL de medio de cultivo para evaluar el posible efecto citotóxico por agotamiento del medio.
Incubar las placas a 37°C durante 7 días. Es indispensable revisar el cultivo a las 24 y 48 horas
48
para detectar cualquier cambio en el medio que indique contaminación del mismo. Si es el caso,
el cultivo contaminado deberá descartarse.
13) Pasado el tiempo de incubación, retirar de los pozos los portaobjetos y repetir la tinción tal
como se hizo con el cubreobjetos del Testigo 1.
NOTA: Este último paso puede realizarse ya fuera de la campana de flujo laminar, ya que el
cultivo ha finalizado y no es necesario seguir conservando las condiciones de esterilidad en el
medio.
14) Observar y evaluar al microscopio para cada uno de los portaobjetos restantes las siguientes
características:
a. Adhesión celular: Si la monocapa se desprendió de la superficie de cultivo y/o a simple
vista se observan células en suspensión.
b. Proliferación celular: Si hubo aumento de la monocapa (100% de confluencia) o
permaneció igual la densidad celular inicialmente observada.
c. Forma. Si las células cambiaron de forma, adquiriendo forma redonda, poliédrica, etc.
d. Integridad de la membrana y viabilidad celular. Si la membrana celular se ve íntegra y
conserva sus propiedades morfológicas iniciales o bien hay franca lisis celular.
Adicionalmente se puede hacer una tinción con azul de tripán para corroborar si hay
muerte celular.
e. Apariencia del citoplasma. Si existe vacuolización y cuáles son las características de las
vacuolas (forma, tamaño, contenido aparente), hay desplazamiento de organelos,
formación de gránulos o cuerpos de inclusión al interior de la célula.
f. Cambios en el medio de cultivo. Relativos al cambio de color, si hubo formación de algún
precipitado, hay turbidez no atribuible a la línea celular y cualquier otra característica
no observada en el medio de cultivo al inicio del ensayo.
15) Terminadas las observaciones de cada tinción, lavar todo el material con agua y jabón libre de
fosfatos. Si algún material quedó teñido con Giemsa, puede desteñirse con un algodón
humedecido con etanol comercial al 70%. A menos que se hayan contaminado, no es necesario
esterilizar las placas de cultivo. Únicamente pueden lavarse con solución jabonosa e hipoclorito
de sodio, al igual que los cubreobjetos. Las placas de cultivo no deberán reutilizarse.
49
RESULTADOS
 Registrar las observaciones realizadas en un cuadro como el que sigue, incluyendo

esquemas o fotografías de las observaciones realizadas:
Fármaco:
Día 1 DÍA 7
Evaluación de la
citotoxicidad Testigo 1 Testigo 2 Conc 1 Conc 2 Conc 3 Conc 4
Adherencia celular y
formación de monocapa
Proliferación y viabilidad
ceular
Integridad de la
membrana y forma
celular
Apariencia del
citoplasma y organelos
 Con base en las observaciones morfológicas determinar cuál es la concentración citotóxica

mayor (CT100) y cuál la menor (CT0). A partir de estos datos estimar la concentración media
(CT50) y hacer una estimación con la media geométrica para cada fármaco ensayado y
reportarlas en un cuadro comparativo.
Línea celular:
Fármaco CT0 CT100 CT50
50
- Registrar y describir la apariencia del medio de cultivo al T =0 días y los cambios sufridos por
el mismo al T=7.
Característica T-0 T-7
pH
Color
Turbidez/Opacidad
Observaciones adicionales:
- ¿Los testigos presentaron alguna característica morfológioca atribuible a citotoxicidad por el

medio de cultivo? ¿A qué factores puede deberse si la respuesta es afirmativa?
- ¿Cómo discriminar el efecto citotóxico ocasionado por el medio de cultivo de aquel causado por
los efectos de un fármaco?
- ¿Cuál es la relación que existe entre tipo y concentración del fármaco y el tiempo de exposición?
- ¿Qué diferencias habría en los resultados si el ensayo se realizara in vivo?
- Si las líneas celulares utilizadas fueron tumorales, ¿Hubo diferencias significativas en la
citotoxicidad mostrada por los diferentes fármacos sobre las líneas celulares? ¿A qué factores
pueden atribuirse esas diferencias? ¿Cómo pueden interpretarse y emplearse los resultados del
experimento para determinar su efectividad en un tratamiento farmacológico sin que llegue a
ser tóxico en su administración a un paciente?
- Si las líneas celulares utilizadas fueron normales o no transformadas, ¿Qué diferencias existen
entre la sensibilidad mostrada por los diferentes órganos a la administración de un mismo
fármaco?
- ¿Cómo se extrapolan los resultados del experimento hacia el tratamiento farmacológico
aplicado a un paciente?
- La sensibilidad mostrada por los diferentes tipos de células está relacionada con: a) El tipo de
órgano de del que provienen?; b) La concentración del fármaco; c) el tiempo de exposición.
Justifica tu respuesta.
51
- ¿Cómo pueden aplicarse los resultados de evaluación de citotoxicidad de fármacos en:

o El diseño de terapias farmacológicas individualizadas
o La búsqueda de nuevos blancos terapéuticos y el desarrollo de nuevos fármacos para el
tratamiento de enfermedades como el cáncer.
CUESTIONARIO PREVIO
1. Investigar el uso terapéutico, mecanismo de acción y metabolismo de los fármacos a utilizar

en la práctica.
2. Definir los términos genotoxicidad y citotoxicidad.
3. Qué son y cómo se calculan las concentraciones citotóxicas nula, media y alta (CT0, CT50,
CT100, respectivamente).
4. Describir por lo menos cinco de las principales ventajas y desventajas de realizar estudios
de citotoxicidad in vitro e in vivo?
5. ¿Cuál es la diferencia entre muerte celular, lisis celular y apoptosis celular? Esquematiza
cada una de ellas.
6. Aparte de la evaluación morfológica al microscopio, describe por lo menos otro método con
que se evalúa, directa o indirectamente, el efecto citotóxico en líneas celulares.
7. ¿Cuál es la constitución y el principio de tinción del colorante Giemsa? ¿Qué otro colorante
puede utilizarse en la práctica para observar la morfología celular?
8. Esquematiza las estructuras principales de una célula animal y menciona brevemente la
función de cada una de ellas.
FUENTES DE CONSULTA
FRESHNEY, Ian. Culture of animal cells. A manual of basic techniques. 5th ed. Wiley & Sons, 2005.
GARZA Ocaña, L. Citotoxicidad in vitro: estudio del potencial de diversas líneas celulares en la
evaluación de toxicidad de diversas sustancias. Tesis doctoral. Universidad Autónoma de Nuevo
León. México, 1990.
HELGASON, C., Miller, C. Basic cell culture protocols. Methods in molecular biology, Vol. 290. 3th
ed. Humana Press.
MATHER, J., Barnes, D. Animal cell culture methods. Methods in cell biology, Vol. 57. Academic
Press. USA, 1998.
52

ManualLabBioteCultCelulares v.2017

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4. La justificación de la inasistencia no acredita el trabajo de laboratorio de las sesiones a las que no

5. El trabajo de laboratorio y la asistencia se evalúan en cada sesión práctica.

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Práctica 1. Efecto de los reguladores de crecimiento en un cultivo de callos de zanahoria .............. 7

Práctica 2. Cultivo de células vegetales en suspensión para la obtención de β-carotenoides. ........ 12

Práctica 5.- cultivo de células animales. Obtención de un cultivo primario de células

Práctica 6. Evaluación de la citotoxicidad de diferentes sustancias de uso farmacéutico sobre

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Identificar el efecto de la adición de 2 tipos de RCV (auxinas y citocininas) sobre la inducción de

Obtener callos de zanahoria, de tamaño y friabilidad adecuados para el establecimiento de cultivos

a) Preparación del medio de cultivo.

b) Establecimiento del cultivo de callos de zanahoria

1.- Preparar y esterilizar con anticipación el siguiente material:

NOTA: A PARTIR DE ÉSTE PASO TRABAJAR DENTRO DE LA CAMPANA DE FLUJO LAMINAR

Figura 2.-Diagrama de una zanahoria

GUÍA PARA EL ANÁLISIS DE RESULTADOS.

INVESTIGACIÓN PREVIA (SUSTITUYE AL INFORME DE PRÁCTICA EN EL PRIMER DEPARTAMENTAL)

PRÁCTICA 2. CULTIVO DE CÉLULAS VEGETALES EN SUSPENSIÓN PARA LA

El establecimiento de un cultivo en suspensión de células vegetales se lleva a cabo al transferir

Establecer cultivos de células en suspensión en medio MS líquido, a partir de callos de zanahoria

Analizar cualitativamente la producción y extracción de b-caroteno a partir cultivos de células en

- Campana de flujo laminar

Preparación de medio MS líquido

5.- Colocar 50 mL de medio de cultivo en un matraz de 125 mL.

Inoculación de los matraces

3.- Centrifugar el tubo y separar el sobrenadante. Colocar 5 mL del sobrenadante en un tubo de

Prueba cualitativa para la presencia de b-carotenos

(Prueba de Lieberman-Buchnard para terpenoides)

2.- Agregar 0.1 a 0.2 mL de ácido sulfúrico y observar la reacción.

1.- ¿Que es la friabilidad?

3.- ¿Cuál es la función del crecimiento en condiciones de obscuridad en el cultivo en suspensión?

4.- Investiga y comenta un ejemplo de la aplicación de cultivo de células en suspensión aplicado a

5.- Menciona al menos 2 métodos de recuperación de la biomasa o de algún metabolito en un

Solución de Azul de Tripano

PRÁCTICA 3.- PRODUCCIÓN DE TETRACICLINA EN CULTIVO LÍQUIDO POR

Evaluación de la actividad de un antibiótico.

inoculan con el microorganismo de prueba y al término del periodo de incubación se descartaran

 Utilizar un cultivo del actinomiceto Streptomyces aureofaciens para producir el antibiótico

• Evaluar la diferencia en la producción de la tetraciclina al utilizar dos medios de cultivo

• Evaluar la actividad antimicrobiana y el rendimiento en la producción del antibiótico en el

Para la preparación de la cepa de Streptomyces

Para la preparación del inóculo

Reactivos 1 probeta graduada de 100 mL

Para la fermentación líquida

Reactivos 1 probeta graduada de 50 mL

Reactivos 1 swinex c/membrana o acrodisco estéril

Preparación de la cepa para iniciar el cultivo

Preparación del inóculo para la fermentación

Colocar 50 mL de medio en un matraz Erlenmeyer de 125 mL y esterilizar a 121ºC por 15 minutos.

Colocar 50 mL de medio en un matraz Erlenmeyer de 125 mL y esterilizar a 121ºC por 15 minutos.

Antibiograma para la evaluación de la actividad antimicrobiana y concentración de la tetraciclina

Preparación de las placas para el antibiograma.

Preparar 1 caja Petri con 20 mL de medio para antibióticos 1 y 2 o agar Mueller-Hinton.

Determinación de la biomasa (en peso seco) y clarificación del medio de cultivo