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TECNOLOGIA DO DNA

RECOMBINANTE
CONCEITOS BÁSICOS
• Essa tecnologia foi desenvolvida a partir da
década de 70 quando foram descobertas as
endonucleases de restrição ou enzimas de
restrição.

• Conjunto de técnicas que permitem a


manipulação de moléculas de DNA,
considerando sequências específicas, com a
perpetuação de tal seqüência in vivo.
VETORES DE CLONAGEM

ENZIMAS DE RESTRIÇÃO

CÉLULA HOSPEDEIRA

DNA LIGASE

SELEÇÃO
CONCEITO DE CLONAGEM
A origem do termo clonagem vem da genética bacteriana

A técnica central do DNA recombinante é a clonagem molecular

Consiste no isolamento e propagação de moléculas de DNA idênticas


Estágios da Clonagem Molecular

INSERTO TRANSFORMANTE
VETOR OU CÉLULA
TRANSFORMADA

DNA
RECOMBINANTE

TRANSFORMAÇÃO
ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
• Enzimas Especializadas em degradar DNA
exógeno em bactérias.

• Função: reconhecer e clivar um DNA estranho.

• Sistema de restrição e modificação.


Duas classes de enzimas colocam-se para gerar e
propagar o DNA recombinante:

• Endonucleases de restrição.

• DNA ligases
• Existem três tipos de endonucleases de
restrição: I, II e III;

• I e II geralmente grandes complexos com


múltiplas subunidades contendo tanto a
atividade endonucleásica como metilase; sua
clivagem é aleatória;

• III cliva o DNA a cerca de 25pb da sequência


de reconhecimento.
Há 2 tipos distintos de clivagens:
• Extremidades abruptas: os dois cortes
ocorrem no eixo de simetria da sequência
específica.
• Extremidades coesivas: os cortes são feitos
simetricamente, porém, fora do eixo de
simetria.
• EcoRI é purificada de uma Escherichia coli que
carrega um fator de transferência de
resistência RI.
• Hind III é isolada da Haemophilus influenzae,
linhagem d III.
INTERESSE

ENZIMAS DE RESTRIÇÃO

IMPORTÂNCIA

FAMÍLIA ÚNICA DE
FRAGMENTOS
DNA LIGASE
• Promove a ligação dos fragmentos de DNA em
vetores previamente clivados por
endonucleases de restrição.
Junção de duas fitas de DNA

A DNA ligase requer um grupo OH livre na extremidade 3' de uma das cadeias de
DNA e um grupo fosfato na extremidade 5' da outra cadeia
CONSTRUÇÃO DO DNA
RECOMBINANTE
A função das ligases na célula é
reparar quebras em fitas individuais,
que surgem em moléculas de DNA de
fita dupla durante a replicação do DNA

Ela atua na clonagem molecular unindo o


fragmento de interesse ao vetor utilizado,
formando um híbrido vetor/fragmento.
Fragmentos de DNA

• Fragmentos com extremidades coesivas;

• Fragmentos com extremidades não coesivas;


A. Adição de polidesoxiadenina na extremidade
3’ de um fragmento de DNA, e
polidesoxitimina na extremidade 3’ de um
outro fragmento de DNA;

B. Adição de adaptadores às extremidades não


coesivas.
CLONAGEM
Fragmentos de DNA com extremidades não coesivas podem ser
transformadas em coesivas pela adição de poli (A) e poli (T).
Fragmentos de DNA com extremidades não coesivas podem ser
transformados em coesivas pela adição de adaptadores e posterior
tratamento com a enzima de restrição que reconhece o adaptador.
TRASFORMAÇÃO
BACTERIANA

TRANSFORMAÇÃO CAPTAÇÃO DO DNA


INDUZIDA
CLONAGEM
- As bactérias e o vetor são misturados com uma solução de cloreto
de cálcio seguido de um choque térmico de curta duração.
- Os íons cálcio têm a função de neutralizar as cargas do DNA e da
membrana bacteriana, facilitando a passagem do vetor pela
membrana no momento do choque térmico.
Vetor - Conceito
• Um vetor pode definir-se como um agente
capaz de promover uma ou mais etapas no
processo global de transferência de material
genético.
• Plasmídeos
• Bacteriófago λ
• BACs
VETORES UTILIZADOS EM ANIMAIS
üLipossomos
üRetrovírus ( integram seu DNA ao do
hospedeiro)
üAdenovírus
üMicroinjeção pronuclear
üTransferência de genes por bombardeamento
de partículas (biobalística)
LIPOSSOMOS (in vitro)

MICROINJETADOS

TRANSCRIÇÃO E TRADUÇÃO

TODO ESSE PROCESSO É INDUZIDO


VETORES RETROVIRAIS
• Transcriptase reversa
(RNA – DNA) e integrase;
• Retrovírus: sequências
LTR e ψ e gene
exógeno;
• Vírus assistentes
Genes gag,pol e env
( sem ψ – requerida para o
empacotamento )
MICROINJEÇÃO EM PRONÚCLEO

PIPETA MICROCAPILAR MICROSCÓPIO INVERTIDO


Micro injeção: gene para fator de crescimento humano
IMPORTÂNCIA DA APLICAÇÃO DESSA
TÉCNICAS
• O fim da seleção artificial

• Xenotransplante

• Biorreatores

• Terapia gênica
QUESTÕES RELACIONADAS COM A
TRANSGENIA
• Bioéticas

• Ecológicas

• Econômicas

• Científicas