Elektroforesis adalah suatu cara analisis kimiawi yang didasarkan pada pergerakan molekul-molekul

protein bermuatan di dalam medan listrik (titik isoelektrik). Pergerakan molekul dalam medan listrik
dipengaruhi oleh bentuk, ukuran, besar muatan dan sifat kimia dari molekul (Titrawani, 1996).
Molekul terlarut dalam medan listrik bergerak atau migrasi dengan kecepatan yang ditentukan oleh
rasio muatan dan massa. Sebagai contoh jika dua molekul mempunyai massa dan bentuk yang sama,
molekul dengan muatan lebih besar akan bergerak lebih cepat ke elektrode. (David G. Watson,
2007). Bila arus listrik dialirkan pada suatu medium penyangga yang telah berisi protein plasma
maka komponen-komponen protein tersebut akan mulai bermigrasi (Ricardson dkk. 1986).
Kecepatan molekul yang bergerak pada medan listrik tergantung pada muatan, bentuk dan ukuran.
Dengan demikian elektroforesis dapat digunakan untuk separasi makromolekul (seperti protein dan
asam nukleat). Elektroforesis untuk makromolekul memerlukan matriks penyangga untuk mencegah
terjadinya difusi karena timbulnya panas dari arus listrik yang digunakan. (Magdeldin, 2012).

Elektroforesis adalah suatu teknik pemisahan molekul selular berdasarkan ukurannya, dengan
menggunakan medan listrik yang dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel yang
dipisahkan. Teknik ini dapat digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada pada
makromolekul, misalnya DNA yang bermuatan negatif. Jika molekul yang bermuatan negatif
dilewatkan melalui suatu medium, misalnya gel agarose, kemudian dialiri arus listrik dari satu kutub
ke kutb yang berlawanan muatannya, maka molekul tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke
kutub positif (Yuwono 2005).

Elektroforesis adalah suatu proses migrasi molekul bermuatan di dalam suatu

media yang bermuatan listrik, dimana kecepatan migrasinya tergantung pada
muatan, ukuran, dan bentuk setiap molekul yang terlibat. Pada saat arus listrik
diberikan, molekul bermigrasi melalui media (biasanya berupa gel). Molekul yang
kecil akan bermigrasi lebih cepat daripada yang besar sehingga akan terjadi
pemisahan. Ada dua jenis elektroforesis yaitu elektroforesis vertikal dengan gel
akrilamid untuk analisis protein dan ektroforesis horizontal dengan gel agarosa
untuk analisis DNA.

Dasar elektroforesis adalah pembentukan suatu ketidakhomogenan atau gradasi konsentrasi

sepanjang sistem. Pemisahan dapat dilakukan bila senyawa-senyawa yang telah terpisah tidak secara
spontan bercampur kembali akibat sirkulasi konvektif. Pada elektroforesis, medan listrik dialirkan
pada suatu medium yang mengandung sampel yang akan dipisahkan. (Martin, 1996)

Prinsip kerja dari elektroforesis berdasarkan pergerakan partikel-partikel bermuatan negatif (anion),
dalam hal tersebut DNA, yang bergerak menuju kutub positif (anode), sedangkan partikel-partikel
bermuatan positif (kation) akan bergerak menuju kutub negatif (anode) (Klug & Cummings, 1994: A
6). Prinsip inilah yang dipakai dalam elektroforesis untuk memisahkan molekul-molekul berdasarkan
muatannya sehingga pergerakan molekul-molekul tersebut pada suatu fase diam (stationary phase)
dalam sebuah medan listrik akan berbeda-beda. Kemampuan perpindahan pergerakan muatan
molekul tersebut menuju ke arah kutub yang berlawanan merupakan suatu parameter kecepatan
dalam proses elektroforesis yang dinyatakan sebagai mobilitas elektroforetik (Lisdiyanti, 1997)..
Mobilitas elektroforetik merupakan laju perpindahan partikel bermuatan dalam cm per detik yang
disebabkan karena pengaruh medan listrik 1 V per cm, dinyatakan dalam cm2V-1s-1.

Menurut Stenesh dalam Titrawani (1996) teknik elektroforesis dapat dibedakan menjadi dua cara,
yaitu : elektroforesis larutan (moving boundary electrophoresis) dan elektroforesis daerah (zone
electrophoresis). Pada teknik elektroforesis larutan, larutan penyangga yang mengandung makro-
molekul ditempatkan dalam suatu kamar tertutup dan dialiri arus listrik. Kecepatan migrasi dari
makro-molekul diukur dengan jalan melihat terjadinya pemisahan dari molekul (terlihat seperti pita)
di dalam pelarut. Sedangkan teknik elektroforesis daerah adalah menggunakan suatu bahan padat
yang berfungsi sebagai media penunjang yang berisi (diberi) larutan penyangga. Media penunjang
yang biasa dipakai adalah gel agarose, gel pati, gel poliakrilamida dan kertas sellulose poliasetat.
(David, 2009).

Adapun menurut Sargent & George (1975) elektroforesis daerah disebut sebagai elektroforesis gel
dengan dua buah model yaitu horizontal dan vertikal. Metode yang biasa digunakan adalah model
horizontal, karena mempunyai beberapa keuntungan yaitu peralatan yang digunakan sangat
sederhana, relatif murah dan pemisahan untuk enzim tertentu dapat menghasilkan pemisahan yang
lebih baik.

Elektroforesis biasanya memerlukan media penyangga sebagai tempat bemigrasinya molekul-

mulekul biologi. Media penyangganya bermacam-macam tergantung pada tujuan dan bahan yang
akan dianalisa. Media penyangga yang sering dipakai dalam elektroforesis antara lain yaitu kertas,
selulose, asetat dan gel. Gel poliakrilamid dan agarosa merupakan matriks penyangga yang banyak
dipakai untuk separasi protein dan asam nukleat.

Beberapa faktor mempengaruhi kecepatan migrasi dari molekul protein yakni: (Soedarmadji, 1996)
1. Ukuran molekul protein 2. Konsentrasi gel 3. Bufer (penyangga) 4. Medium penyangga 5.
Kekuatan voltase 6. Temperatur medium

Elektroforesis gel digunakan untuk memisahkan atau melihat kemurnian DNA atau protein yang
tidak bisa diperoleh dengan metode lain seperti gradient sentrifugasi. Media yang banyak dipakai
dalam proses pemisahan ini adalah agarose atau akrilamid. Agarose digunakan untuk memisahkan
molekul-molekul yang lebih besar karena memiliki ukuran partikel yang lebih besar. Sehingga daya
pisah dari agarose (resolusi) lebih kasar (lebih lemah) dibandingkan akrilamid. Akrilamid memiliki
ukuran partikel yang lebih halus sehingga daya pemisahannya lebih baik. Elektroforesis melalui gel
agarosa atau poliakrilamid merupakan teknik yang sederhana, cepat, dan dapat memisahkan
molekul yang diinginkan dari matriksnya yang tidak dapat dilakukan oleh prosedur lainnya, seperti
sentrifugasi gradient.

Elekroforesis gel bermanfaat untuk mengetahui ukuran fragmen DNA dari produk PCR, m
emisahkan produk DNA dari hasil digesti yang berbeda ukuran, lalu dapat disequencing, dan
juga untuk pemurnian atau purifikasi DNA. Elektroforesis dapat diaplikasikan untuk berbagai
jenis kegiatan, antara lain membandingkan gen homolog dari spesies yang berbeda, mengeta
hui susunan sekuens berbagai genom, DNA finger printing, mengetahui ada atau tidaknya ge
n-
gen penyebab kelainan genetik atau penyakit tertentu, mendeteksi lokasi dan jumlah mRNA d
alam sel atau jaringan tertentu, mengetahui aktivitas gen selama perkembangan berbagai sel o
rganism atau aktivitas gen sebelum dan sesudah diberi perlakuan tertentu, mempelajari tingka
t evolusi di tingkat molekuler, mengetahui variasi genetik dalam populasi natural di alam, me
nentukan berat molekul fragmen DNA, RNA, protein dan aktivitas enzimatik, menganalisa fr
agmen DNA yang diamplifikasi melalui PCR, mengidentifikasi persamaan dan perbedaan ge
netik antara individu dan menentukan jumlah fragmen DNA yang diklon dalam rekombinan p
lasmid DNA (Russell, 1994).
Disamping itu, elektroforesis gel juga memiliki kekurangan yaitu pada deteksi atau i
dentifikasi amplikon. Penggunaan elektroforesis gen dirasakan kurang efisien karena pengerj
aanya lama dan terbatasnya jumlah sampel yang dapat diperiksa. Terkadang hasil PCR dalam
gel, muncul pita yang tidak terbentuk atau pita yang terlampau banyak sehingga hasilnya suli
t diinterpretasikan (Tarigan, 2011).
Protein-
protein dapat terpisah karena adanya proses separasi pada protein yang memisahkan molekul-
molekul protein menjadi pita-pita yang masing-
masing terdiri dari molekul protein dengan panjang yang sama. Protein dapat terpisah dengan
cara member gaya pada protein tersebut untuk melewati medium yang berisi gel (poliakrilam
id) yang dibantu dengan adanya listrik. Protein yang bermuatan listrik ditempatkan pada medi
um berisi tenaga listrik. Moleku-
molekul protein akan bermigrasi menuju kutub positif atau kutub negati berdasarkan muatan
yang terkandung di dalamnya. Pemisahan molekul protein berdasarkan pada tingkat migrasi d
an berat molek.ulnya dalam sebuah medan listrik (Wibowo, 2010)

Pada gel elektroforeisis untuk DNA, enzim restriksi memotong DNA menjadi
beberapa fragmen dengan panjang bervariasi. Larutan yang mengandung fragmen
ini ditempatkan dalam suatu gel tebal. Bila arus listrik diberikan pada gel tersebut,
maka pada sisi gel akan bermuatan positif sedangkan sisi lainnya akan bermuatan
negatif. Semua fragmen akan bergerak dari sisi gel yang bermuatan negatif ke arah
sisi gel yang bermuatan positif. Fragmen akan terlihat seperti bentuk barcode.

Elektroforesis gel menggunakan alat-alat yang mempunyai fungsi dan peranan

masing-masing (gambar 1). Alat-alat tersebut yaitu mikropipet, apparatus
elektroforesis, power supply, sumber sinar UV, dan sarung tangan. Mikropipet
berfungsi untuk memindahkan sampel dan larutan lainnya
dari tube kedalam sumuran gel (gambar 2 dan 3). Aparatus elektroforesis terdiri
atas comb (sisir) yang membentuk well (sumur) pada gel agarosa, tray yang
merupakan wadah cetakan gel, dan chamber yang merupakan medium tempat
berlangsungnya proses elektroforesis. Power Supply (DC) sebagai sumber energi
untuk aparatus elektroforesis. Sumber Sinar UV berfungsi untuk membantu
mengamati hasil band yang tampak sehingga terlihat lebih jelas (Amersham
Biosciences 1999 : 7).

Jenis-jenis Elektroforesis Gel a. Elektroforesis gel agarosa

Metode standar yang digunakan untuk memisahkan, mengidentifikasi dan memurnikan fragmen
DNA adalah elektroforesis gel agorose. Teknik ini sederhana, cepat terbentuk, dan mampu
memisahkan campuran potongan DNA sesuai dengan ukurannya secara akurat, dibanding dengan
densitas gradient sentrifugasi. (Maniatis T. et al, 1982). DNA dari 200 basa sampai 50 kilo basa dapat
dipisahkan dengan gel agarosa dengan berbagai konsentrasi agarosa. Gel agarosa biasanya dilakukan
dalam konfigurasi horizontal dalam kekuatan medan listrik dan arah tetap. (David G. Watson, 2007

Gel agarosa dibuat dengan melelehkan agarosa dengan buffer dan kemudian dituangkan pada
cetakan dan diamkan sampai dingin. Setelah mengeras, agarosa membentuk matriks dengan
kerapatan yang ditentukan oleh konsentrasi agarosa. Jika medan magnet diberikan antara kedua
ujung gel, DNA yang bermuatan negatif pada pH netral, bergerak ke anoda. Kecepatan migrasi ini
ditentukan oleh ukuran (panjang) DNA, konformasi DNA, konsentrasi agarosa dan besaran tegangan
yang digunakan. (David G. Watson, 2007) Molekul DNA untai ganda linear, yanag diletakkan pada
salah satu ujung gel, bergerak melalui matriks gel pada kecepatan yang berbanding terbalik terhadap
log jumlah asam basa. Molekul yang lebih besar bergerak lebih lama karena terjadi gesekan lebih
besar. (David G. Watson, 2007) Hal ini disebabkan DNA harus melewati pori-pori gel sehingga kurang
efisien lajunya daripada molekul yang lebih kecil.Fragmen DNA linear dengan panjang tertentu
bermigrasi dengan kecepatan yang berbeda pada gel yang mengandung konsentrasi agarosa
berbeda. (David G. Watson, 2007

Elektroforesis agarose dapat digunakan untuk memisahkan asam nukleat ataufragmentnya yang
bermuatan negative sesuai dengan arus listrik. Pada sistem elektroforesistersebut, agarose
merupakan bahan media yang berfungsi sebagai alas atau medium pemisahyang diletakkan diantara
anoda dan katoda alat elektroforesis. Medium pemisah tidak bergerakatau fase stationer. Molekul
yang ingin dipisahkan diletakkan pada medium pemisah dan dibawasesuai dengan muatan listrik
oleh karena medium pemisah direndam dengan larutan ionic.Molekul yang besar bergerak lebih
lambat daripada molekul lebih keci. Gel agarose disiapkandengan etidium bromide yang mengikat
DNA dan menampilkan warna orange apabila disinaridengan cahaya ultraviolet

Gel agarose dibuat dengan melelehkan agarose dalam buffer dan kemudian dituangkan pada
cetakan dan diamkan sampai dingin. Setelah mengras, agarose membentuk matriks dengan
kerapatan yang ditentukan oleh konsentrasi agarose. Jika medan magnet diberikan antara kedua
ujung gel, DNA yang bermuatan negatif pada pH netral akan bergerak ke anoda. Kecepatan migrasi
ini ditentukan oleh ukuran DNA, konformasi DNA, konsentrasi agarose, dan besaran tegangan yang
digunakan (Sudjadi 2008).

b. Elektroforesis Gel Poliakrilamid Akrilamid merupakan suatu monomer, yang jika ada radikal
bebas, biasanya diberikan oleh ammonium persulfat dan distabilkan oleh TEMED, terjadi reaksi
berantai sehingga monomer terpolimerisasi menjadi rantai panjang. Gel poliakrilamid dibuat dengan
cara menuangkan antar dua lempeng kaca yang dipisahkan dengan pembatas dengan ketebalan
tertentu. Gel poliakrilamid berukuran dari 5 cm sampai 50 cm panjangnya tergantung pada
keperluannya dan dilakukan elektroforesis dengan cara vertikal. (David G. Watson, 2007)

c. Elektroforesis Gel Poliakrilamid-SDS ( SDS-PAGE) Protein dapat dipisahkan berdasarkan ukuran

massanya dengan elektroforesis gel poliakrilamid dengan system gerak. Sebelumnya, campuran
protein dipanasi dengan natrium dedosil suldat (SDS), suatu detergen anionik utnuk menyelubungi
molekul protein. Penyelubungan ini menyebabkan interaksi nonkovalen terganggu sehingga molekul
protein dalam struktur primer. Anion SDS berikatan dengan rantai utama dengan rasio satu molekul
SDS untuk dua residu asam amino. . (David G. Watson, 2007) Kompleks SDS dengan protein
terdenaturasi mempunyai jumlah muatan negatif yang sebanding dengan ukuran protein. Muatan
negatif yuang terdapat pada ikatan SDS ini jauh lebih besar daripada muatan pada protein asli.
Kompleks protein SDS kemudian dielektroforesis, sehingga semua molekul protein bergerak menuju
kutub positif. Ketika elektroforesis selesai, protein dalam gel dapat ditampakkan oleh pewarnaan
dengan perak atau zat warna seperti Coonassie biru, yang akan menampakkan beberapa pita. (David
G. Watson, 2007).