LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI LINGKUNGAN

MODUL 08
AKTIVITAS BIOKIMIA MIKROORGANISME

Nama Praktikan/NIM : M. Nasrullah Ahmad /15715001

Saffanah Gumilangsari/15715003
Mariah Bening / 15715020
Kelompok : 03

Tanggal Praktikum : Senin, 31 Oktober 2016

PJ Modul : Saniar Rabithoh W.

Asisten yang Bertugas : Ratrisa Priska K.

Astiaranti
Hurriyah M.
Roidah Zihni A.
Mirra Hasna Nurdini
Saniar Rabithoh W.

Analis : Didit Trihartomo

PROGRAM STUDI REKAYASA INFRASTRUKTUR LINGKUNGAN

FAKULTAS TEKNIK SIPIL DAN LINGKUNGAN
INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG
2016
 MODUL 08 - PERCOBAAN 19

I. JUDUL : Aktivitas Enzim Intraseluler : Uji Fermentasi dan Oksidasi

II. TUJUAN
1. Menentukan mikroorganisme yang dapat mendegradasi dan memfermentasi
karbohidrat dengan menghasilkan asam atau gas
2. Menentukan mikroorganisme yang mampu menghasilkan enzim untuk reaksi
biooksidasi

III. PRINSIP DASAR

Bakteri memperoleh energi melalui dua jalur metabolik (bioksidasi) yaitu respirasi dan
fermentasi. Pada respirasi aerob, molekul organik didegradasi secara sempurna menjadi
karbondioksida dan air dengan oksigen sebagai akseptor electron. Kemampuan bakteri untuk
menggunakan oksigen bebas bergantung pada sistem enzim sitokrom. Sedangkan pada
organisme fermentatif, juga digunakan senyawa organik tanpa sistem sitokrom. Organisme ini
menghasilkan karbondioksida dan air selain produk sampingan seperti alkohol, asam dan
aldehida. Pada organisme ini, oksigen bukan merupakan akseptor elektron dan reaksi terjadi
tanpa kehadiran oksigen. Senyawa organik bertindak baik sebagai akseptor maupun donor
elektron. Kedua reaksi bioksidasi ini dapat terjadi pada bakteri anaerob fakultatif kecuali bakteri
asam laktat dimana fermentasi terjadi sama sekali tanpa oksigen. Beberapa reaksi bioksidasi
misalnya fermentasi karbohidrat, produksi katalase, oksidase dan reduksi nitrat.

IV. TEORI DASAR

4.1 Medium Karbohidrat

a. Glukosa
Glukosa, suatu gula monosakarida, adalah salah satu karbohidrat
terpenting yang digunakan sebagai sumber tenaga bagi hewan dan tumbuhan.
Glukosa merupakan salah satu hasil utama fotosintesis dan awal bagi respirasi.
Bentuk alami (D-glukosa) disebut juga dekstrosa, terutama pada industri pangan.
kebanyakan karbohidrat dalam makanan diserap ke dalam aliran darah sebagai
glukosa, dan gula lain diubahmenjadi glukosa di hati. Glukosa adalah prekursor
 untuk sintesis semuakarbohidrat lain di tubuh, termasuk glikogen untuk
penyimpanan; ribosa dandeoksiribosa dalam asam nukleat; galaktosa dalam laktosa
susu, dalam glikolipid, dan sebagai kombinasi dengan protein dalam glikoprotein dan
proteoglikan (Murray, Granner, dan Rodwell, 2006).
b. Sukrosa
Sukrosa, atau sering disebut gula, merupakan disakarida dengan rumus kimia
C12H22O11 (ß-D-fructofuranosyl-α-D-glucopyranoside). Secara komersial sukrosa
umumnya diperoleh dari tebu (Saccharum officinarum) yang merupakan tanaman
daerah tropis dan beet (beta vulgaris) yang merupakan tanaman subtropis. Sukrosa
merupakan senyawa nonionik dalam bentuk bebas dan mempunyai sifat pengemulsi
(emusifying), pembusaan (foaming), deterjensi (detergency) dan pelarutan
(solubizing) yang sangat baik. (Debbi, 2006)
c. Laktosa
Laktosa (gula susu) adalah disakarida yang dapat ditemukan pada susu dari
beberapa jenis mamalia dan produk susu (Linko, 1982). Laktosa terbentuk dari
kondensasi dua monosakarida, yakitu galaktosa dan glukosa, yang membentuk ikatan
kovalen a b-1-4 glycosidic. Nama sistem dari laktosa adalah b-D-galactopyranosyl-(1-
4)-D-glucose. Glukosa pembentuknya dapat berbentuk a-pyranose form or the b-
pyranose form. Sedangkan untuk galaktosa hanya memiliki bentuk b-pyranose. Jadi
laktosa hanya memiliki 2 variasi. A-lactose dan b-lactose. Konsentrasi laktosa dalam
beberapa jenis mamalia antara 4-9%. Susu dari manusia memiliki konsentrasi laktosa
tertinggi yaitu 9%. Sapi sekitar 5 % laktosa dan ditemukan kadar yang sama pada
susu kerbau atau domba (Silanikove et al. 2010).
d. Mannitol
Manitol adalah polialkohol nonmetabolik C-6 dengan berat molekul 182, dan
merupakan agen diuretik tertua serta paling banyak digunakan sebagai osmotik.
Selain menjadi agen hiperosmotik, manitol juga telah terbukti sebagai scavenger
efektif radikal hidroksil bebas dalam berbagai sistem biologis termasuk ekstraselular
(Better dkk, 1997).

4.2 Fermentasi Karbohidrat

 Ada beberapa cara uji fermentasi karbohidrat. Kemampuan memfermentasikan berbagai
karbohidrat dan produk fermentasi yang dihasilkan merupakan ciri yang sangat berguna dalam
identifikasi mikroorganisme. Hasil akhir fermentasi karbohidrat ditentukan oleh sifat mikroba,
media biakan yang digunakan serta faktor lingkungan, antara lain suhu dan pH. Media
fermentasi harus mengandung senyawa yang dapat dioksidasikan dan difermentasikan oleh
mikroorganisme. Untuk menentukan adanya fermentasi karbohidrat, di laboratorium digunakan
media kaldu karbohidrat dan media MR-VP (Methyl Red-Voges Proskauer). Kaldu karbohidrat
yang digunakan mengandung 0,5-1% karbohidrat. Karbohidrat yang sering dipakai adalah
glukosa, sukrosa, laktosa, manitol dan maltosa. Selain karbohidrat ke dalam media ditambahkan
juga ekstrak daging dan pepton sebagai sumber nitrogen, vitamin dan mineral.

Bakteri yang ditumbuhkan dalam media biakan cair karbohidrat, akan mengalami
fermentasi dan menghasilkan asam. Asam yang dihasilkan akan menurunkan pH media biakan.
Untuk mendeteksi ada tidaknya penurunan pH maka digunakan indikator. Indikator yang sering
digunakan ialah merah fenol, brom kresol ungu atau brom timol biru. Bila terjadi penurunan pH
maka akan terjadi perubahan warna menjadi warna kuning. Pada pH diatas 7 merah fenol
berwarna merah dan brom kresol ungu berwarna ungu sedangkan brom timol biru berwarna biru.

Kaldu karbohidrat selain digunakan untuk uji pembentukan asam juga digunakan untuk
uji pembentukan gas. Pembentukan gas dapat ditentukan dengan menggunakan tabung
Smith atau tabung Durham. Tabung Smith digunakan bila jumlah dan macam gas yang
dihasilkan harus ditentukan, sedangkan tabung Durham digunakan bila hanya ingin mengetahui
ada tidaknya gas yang terbentuk tanpa harus mengetahui jumlah gas yang terbentuk dan jenis gas
yang terbentuk. Bila terbentuk gas, maka gas akan masuk ke dalam tabung Durham dan
mendesak cairan dalam tabung Durham. Gas yang terbentuk terlihat sebagai gelembung udara
yang terperangkap dalam tabung Durham. Setelah diinkubasi diamati perubahan warna dan
pembentukan gas dalam tabung Durham. Hal ini dapat menjadi tanda senyawa apa yang
difermentasikan dan dapat menjadi dasar acuan dalam identifikasi bakteri (Lay, 1994).

Berdasarkan hasil fermentasi karbohidrat bakteri dapat dikelompokkan menjadi 5 kelompok

yaitu:
 1. Bakteri asam laktat (BAL) homofermentatif yang hanya mampu menghasilkan asam
laktat, dengan hasil uji berupa warna media berubah menjadi warna kuning atau lebih
kuning dari warna tabung kontrol dan tidak terbentuk gas pada tabung Durham.
2. Bakteri asam laktat (BAL) heterofermentatif yang mampu menghasilkan asam laktat, etil
alkohol, serta gas CO2, dengan hasil uji berupa warna media berubah menjadi warna
kuning atau lebih kuning dari warna tabung kontrol dan terbentuk gas pada tabung
Durham.
3. Bakteri aseton, butil alkohol yang mampu menghasilkan aseton, butil alkohol, asam
butirat, isopropil alkohol, asam asetat, asam format serta gas CO2 dan H2, dengan hasil
uji berupa warna media tidak berubah dan terbentuk gas dalam tabung Durham
(Lay, 1994).
4. Bakteri coli-aerogeneses tifoid yang mampu menghasilkan 2,3 butana diol, asam format,
asam asetat, asam suksinat, etil alkohol serta gas CO2 dan H2, dengan hasil uji berupa
warna media berubah menjadi warna kuning atau lebih kuning dari warna tabung kontrol
dan terbentuk gas pada tabung Durham, namun pada uji VP memberikan hasil uji positif
dan uji MR memberikan hasil uji yang bervariasi (tergantung genus dan spesies bakteri).
5. Bakteri asam propionat yang mampu menghasilkan asam propionat, asam asetat dan
CO2, dengan hasil uji berupa warna media berubah menjadi warna kuning atau lebih
kuning dari warna tabung kontrol dan terbentuk gas pada tabung Durham, namun pada uji
MR memberikan hasil uji positif dan uji VP memberikan hasil uji yang bervariasi
(tergantung genus dan spesies bakteri) (Pelczar et al., 1998).

4.3 Reduksi Nitrat

Reduksi nitrat pada mikroorganisme fakultatif anaerob terjadi pada kondisi tanpa oksigen
atau kondisi anaerob. Pada proses ini, bakteri menggunakan senyawa anorganik seperti nitrat
atau sulfat sebagai akseptor elektron terminal. Enzim nitrat reduktase mengkatalisasi transfer
elektron dari sitokrom b sehingga nitrat tereduksi menjadi nitrit seperti reaksi berikut :

NO3- + 2e - + 2H+ nitrat reduktase NO2- + H2O

Kemampuan bakteri untuk mereduksi nitrat dapat ditentukan dengan menganalisa kehadiran
nitrit. Kultur yang ditumbuhkan pada medium kaldu nitrat yang mengandung potassium nitrat
(KNO3) sebagai sumber nitrat. Kehadiran nitrit ditentukan oleh dua reagen yaitu Reagen A
berupa sulfanilic acid diikuti reagen B yaitu alphanaphthylamine. Penambahan kedua reagen ini
akan menyebabkan medium berubah warna menjadi merah, bila positif atau terdapat nitrit.
Sedangkan hasil negatif, dapat berarti nitrat tidak tereduksi atau nitrat sudah lebih jauh direduksi
oleh organisme menjadi amoniak bahkan gas nitrogen. Untuk membedakan kedua kemungkinan
tersebut ditambahkan bubuk zinc atau seng pada pengujian yang memberikan hasil negatif. Seng
akan bereaksi mereduksi nitrat dan menyebabkan terbentuknya warna merah, yang menandakan
nitrat belum tereduksi (hasil negatif). Bila warna medium tetap tidak berubah, menunjukkan
nitrat sudah tereduksi melewati nitrit menjadi amoniak atau gas nitrogen ( hasil positif )

4.4 Reaksi Katalase

Enzim katalase mampu mengkatalasis reaksi penguraian hidrogen peroksida (H2O2)

melalui dua mekanisme kerja yaitu katalitik dan peroksidatik. Mekanisme enzim katalase sebagai
antioksidan melalui proses katalitik terjadi bila enzim katalase menggunakan molekul H2O2
sebagai substrat atau donor elektron dan molekul H2O2 yang lain sebagai oksidan atau akseptor
elektron. Melalui enzim katalase yang terdapat dalam peroksisom (peroxysome) hidrogen yang
dihasilkan dari metabolism alkohol dapat mengubah keadaan redoks, dan pada pemakaian
alkohol yang lama dapat mengecil. Perubahan ini dapat menimbulkan perubahan metabolisme
lemak dan karbohidrat, yang menyebabkan bertambahnya jaringan kolagen dan dalam keadaan
tertentu dapat menghambat sintesa protein ( Zakhari, 2006)

V. ALAT DAN BAHAN

a. Alat

1.Pembakar Bunsen,

2.Jarum Inokulasi,

3. Pipet Tetes

b. Bahan
1. Kultur bakteri Escherichia coli, Pseudomonas aerugiosa, bakteri A dan bakteri B,
2. Kaldu laktosa, kaldu glukosa, kaldu sukrosa dan kaldu mannitol dalam tabung
3. Kaldu Nitrat
4. Reagen A (sulfanilic acid), Reagen B (alphanaphthylamine) dan bubuk zinc,
5. Biakan murni Staphylococcus aureus, Sarcina lutea, dan Bacillus substilis dalam cawan petri
steril
6. Reagen 3% hydrogen peroksida
7. Agar nutrisi miring dalam tabung
8. Cawan petri steril

VI. DATA DAN PENGAMATAN

A1. Uji Fermentasi dan Oksidasi

a. Nama Bakteri : Escherichia coli

Kontrol Hasil Pengamatan Keterangan

Tanggal Pengamatan: 1-11-

2016
Nama Bakteri : Escherichia
coli
Media : Kaldu Glukosa
Suhu : 37oC
Keterangan : Warna menjadi
kuning & Terdapat banyak
gelembung
Sumber : Kelompok 1
 Tanggal Pengamatan: 1-11-
2016
Nama Bakteri : Escherichia
coli
Media : Kaldu Sukrosa
Suhu : 37oC
Keterangan : Warna menjadi
kuning & Terdapat sedikit
gelembung
Sumber : Kelompok 1

Tanggal Pengamatan: 1-11-

2016
Nama Bakteri : Escherichia
coli
Media : Kaldu Laktosa
Suhu : 37oC
Keterangan : Warna menjadi
kuning & Terdapat
gelembung
Sumber : Kelompok 1

Tanggal Pengamatan: 1-11-

2016
Nama Bakteri : Escherichia
coli
Media : Kaldu Mannitol
Suhu : 37oC
Keterangan : Warna menjadi
kuning & Terdapat sedikit
gelembung
Sumber : Kelompok 1

b. Nama Bakteri : Pseudomonas aerugiosa

Kontrol Hasil Pengamatan Keterangan

Tanggal Pengamatan: 1-
11-2016
Nama Bakteri :
Pseudomonas aerugiosa

Media : Kaldu Glukosa

Suhu : 37oC
Keterangan :
Sumber : Kelompok 10

Tanggal Pengamatan: 1-
11-2016
Nama Bakteri :
Pseudomonas aerugiosa

Media : Kaldu Sukrosa

Suhu : 37oC
Keterangan :
Sumber : Kelompok 10

Tanggal Pengamatan: 1-
11-2016
Nama Bakteri :
Pseudomonas aerugiosa

Media : Kaldu Laktosa

Suhu : 37oC
Keterangan :
Sumber : Kelompok 10
 Tanggal Pengamatan: 1-
11-2016
Nama Bakteri :
Pseudomonas aerugiosa

Media : Kaldu Mannitol

Suhu : 37oC
Keterangan :
Sumber : Kelompok 10

c. Nama Bakteri : Bakteri A

Kontrol Hasil Pengamatan Keterangan

Tanggal Pengamatan: 1-
11-2016
Nama Bakteri : Bakteri A
Media : Kaldu Glukosa
Suhu : 37oC
Keterangan : Warna
menjadi kuning. Tidak
ada gelembung
Sumber : Kelompok 3

Tanggal Pengamatan: 1-
11-2016
Nama Bakteri : Bakteri A
Media : Kaldu Sukrosa
Suhu : 37oC
Keterangan : Warna
menjadi kuning. Tidak
ada gelembung
Sumber : Kelompok 3
 Tanggal Pengamatan: 1-
11-2016
Nama Bakteri : Bakteri A
Media : Kaldu Laktosa
Suhu : 37oC
Keterangan : Warna
tetap Tidak ada
gelembung
Sumber : Kelompok 3

Tanggal Pengamatan: 1-
11-2016
Nama Bakteri : Bakteri A
Media : Kaldu Mannitol
Suhu : 37oC
Keterangan : Warna
tetap Tidak ada
gelembung
Sumber : Kelompok 3

d. Nama Bakteri : Bakteri B

Kontrol Hasil Pengamatan Keterangan

Tanggal Pengamatan: 1-11-

2016
Nama Bakteri : Bakteri B
Media : Kaldu Glukosa
Suhu : 37oC
Keterangan :
Sumber : Kelompok 4
Tanggal Pengamatan: 1-11-
2016
Nama Bakteri : Bakteri B
Media : Kaldu Sukrosa
Suhu : 37oC
Keterangan :
Sumber : Kelompok 4

Tanggal Pengamatan: 1-11-

2016
Nama Bakteri : Bakteri B
Media : Kaldu Laktosa
Suhu : 37oC
Keterangan :
Sumber : Kelompok 4

Tanggal Pengamatan: 1-11-

2016
Nama Bakteri : Bakteri B
Media : Kaldu Mannitol
Suhu : 37oC
Keterangan :
Sumber : Kelompok 4
 A2. Uji Nitrat
Konrol Hasil Pengamatan Keterangan

Tanggal Pengamatan: 1-
11-2016
Nama Bakteri :
Escherichia coli
Media : Kaldu Nitrat
Suhu : 37oC
Keterangan : +Reangen
A&B -> Merah
Sumber : Kelompok 1

Tanggal Pengamatan: 1-
11-2016
Nama Bakteri :
Pseudomonas aerugiosa

Media : Kaldu Nitrat

Suhu : 37oC
Keterangan :
Sumber : Kelompok 10

Tanggal Pengamatan: 1-
11-2016
Nama Bakteri : Bakteri A
Media : Kaldu Nitrat
Suhu : 37oC
Keterangan :
Sumber : Kelompok 3
 Tanggal Pengamatan: 1-
11-2016
Nama Bakteri : Bakteri B
Media : Kaldu Nitrat
Suhu : 37oC
Keterangan :
Sumber : Kelompok 4

A3. Katalase
Hasil Pengamatan Keterangan

Tanggal Pengamatan: 1-11-2016

Nama Bakteri : Staphylococcus
aureus & Sarcina sp.
Media : Agar Nutrisi
Suhu : 37oC
Keterangan :
Staphylococcus->Muncul
gelembung
Sarcina -> Tidak ada gekembung
Sumber : Kelompok 1&2
\
 Tanggal Pengamatan: 1-11-2016
Nama Bakteri : Bacillus sp.
Media : Agar Nutrisi
Suhu : 37oC
Keterangan :
Sumber : Kelompok 8

Tanggal Pengamatan: 1-11-2016

Nama Bakteri : Bakteri A & B
Media : Agar Nutrisi
Suhu : 37oC
Keterangan :
Sumber : Kelompok 9 & 10

VII. ANALISIS

7.1 Analisis Cara Kerja

a. Fermentasi Karbohidrat

Setiap bakteri diinokulasi pada setiap jenis medium pada dua belas tabung. Sedangkan
empat tabung tersisa yang masing-masing berisi kaldu laktosa, kaldu glukosa dan kaldu manitol
menjadi kontrol percobaan. Diperlukan adanya kontrol untuk membandingkan sebelum dan
sesudah bakteri melakukan reaksi terhadp lingkungannya. Inokulasi dilakukan dengan hati-hati,
jangan sampai tabung terguncang atau terkocok karena dapat menyebabkan terbentuknya gas
yang akan terperangkap pada tabung Durham dan menyebabkan pengamatan tidak sesuai.
Semua tabung diinkubasi selama 24-48 jam pada suhu 370C. Percobaan ini harus diamati
dalam jangka waktu paling lama 48 jam, karena perpanjangan waktu inkubasi dapat
menyembunyikan hasil produksi asam dengan dihasilkannya kondisi basa dari aksi enzim
lainnya pada substrat selain karbohidrat pada medium.
Digunakan 4 medium untuk membandingkan kemampuan dalam melakukan fermentasi.
Dimana laktosa dan mannitol terdiri dari polimer sedang sukrosa dan glukosa adalah monomer.
Kemampuan fermentasi yang lebih tinggi akan dapat memfermentasi keempat medium, dan yang
kemampuannya rendah kemungkinan hanya akan dapat memfermentasi monosakarida. Sehingga
pada pengamatannya nanti akan ditemukan keempat medium ada yang negatif dan positif untuk
bakteri yang sama.

b. Reduksi Nitrat

Setiap bakteri diinokulasi pada medium kaldu nitrat dan tabung terakhir disisakan sebagai
medium kontrol sebagai pembanding sebelum dan sesudah bakteri bereaksi. Tabung kemudian
diinubasi untuk bakteri dapat melakukan reaksi terhadap lingkungannya. Pengamatan dilakukan
dengan menambahkan reagen A dan reagen B. Penambahan kedua reagen ditujukan untuk
menunjukkan keberadaan nitrit yang merupakan hasil reduksi nitrat. Penggunaan reagen A dan B
akan menghasilkan warna merah jika positif. Namun, hasil dari reagen A dan B tersebut bisa
juga menunjukkan bahwa nitrat sudah lebih jauh direduksi oleh organisme menjadi amoniak
bahkan gas nitrogen. Oleh karena itu jika hasilnya negatif dari reagen A dan B ditambah lagi
bubuk zinc yang akan bereaksi mereduksi nitrat dan menyebabkan terbentuknya warna merah,
yang menandakan nitrat belum tereduksi (hasil negatif). Bila warna medium tetap tidak berubah,
menunjukkan nitrat sudah tereduksi melewati nitrit menjadi amoniak atau gas nitrogen ( hasil
positif ). Reagen A dan B yang dapat memberikan warna merah saat bereaksi dengan nitrit
diidentiikasi sebagai alfa-naftilamin dan asam sulfanilat. Bakteri yang melakukan reduksi nitrat
berarti sedang melakukan denitrifikasi pada metabolismenya.

c. Keaksi Katalase

Medium dicairkan dan dituang ke dalam cawan dan dibiarkan membeku. Agar
harus dalam keadaan membeku untuk siap diinokulasi. Secara aseptik tiap medium diinokulasi
dengan dua jenis kultur bakteri. Dilakukan 2 bakteri pada satu cawan petri untuk memudahkan
perbandingan antara yang memiliki enzim katalase dan yang tidak juga menggunakan cawan
petri yang digunakan lebih sedikit. Media diinkubasi selama 24-28 jam dengan suhu 37 oC yang
merupakan suhu optimum untuk bakteri mesofil. Untuk menentukan ada tidaknya enzim
katalase, maka h2O2 sebagai substrat diteteskan. Adanya gelembung menandakan bahwa ada
enzim katalase yang dapar merubah H2O2 menjadi H2O dan O2. H2O2 juga diteteskan ada area
yang tidak ditumbuhi koloni ntuk mengecek ada tidaknya gelembung untuk hasil yang lebih
meyakinkan.

7.2 Analisis Hasil

a. Fermentasi Karobohidrat

Pada pengamatan Escherichia coli, di keempat media glukosa, sukrosa, mannitol,

dan laktosa. Semuanya menunjukkan hasil yang positif dimana warna kaldu kontrol
adalah ungu dan setelah direaksikan dengan Escherichia coli berubah warna menjadi
kuning dan dikeempat tabung durham juga terdapat gelembung gas yang menunjukkan
produk dari fermentasinya adalah asam dan gas. Hal ini juga menunjukkan kemampuan
Escherichia coli untuk memfermentasi karbohidrat sangat baik karena tidak hanya bisa
memfermentasi monomer seperti glukosa dan sukrosa, tetapi juga polimer seperti pada
mannitol dan laktosa. Dari hasil pengamantan juga Escherichia coli digolongkan sebagai
Bakteri asam laktat (BAL) heterofermentatif yang mampu menghasilkan asam laktat, etil
alkohol, serta gas CO2, dengan hasil uji berupa warna media berubah menjadi warna
kuning atau lebih kuning dari warna tabung kontrol dan terbentuk gas pada tabung
Durham.

Hasil positif juga ditunjukkan dari hasil pngamatan bakteri A. Namun, berbeda
dengan Escherichia coli, Yang menunjukkan hasil positif dengan perubahan warna
hanya pada sukrosa dan glukosa, sedangkan mannitol dan laktosanya tetap ungu. Selain
itu untuk gelembung gas tidak dapat teramati pada keempat tabung dan menandakan
produk dari fermentasinya hanya berupa asam. Hal ini menunjukkan kemampuan
bakteri A untuk melakukan fermentasi. Namun kemampuan tersebut hanya bisa
memecah monomer atau monosakaridanya saja, tidak sampai dapat memfermentasi
polimer.Dari pengamatan juga dapat disimpulkan bakteri A adalah Bakteri asam laktat
(BAL) homofermentatif yang hanya mampu menghasilkan asam laktat, dengan hasil
 uji berupa warna media berubah menjadi warna kuning atau lebih kuning dari warna
tabung kontrol dan tidak terbentuk gas pada tabung Durham dan diduga sebagai bakteri
Lactobacillus.
Pada pengamatan Pseudomonas aerugiosa dan bakteri B didapatkan hasil yang
negatif untuk keempat tabung. Hal itu ditunjukkan dengan samanya kondisi media
kontrol dan kondisi setelah hasil yaitu berwarna ungu dan tidak ada gelembung udara.

b. reduksi nitrat

Pada pengamatan Escherichia coli dan Pseudomonas aerugiosa, di media nitrat

menunjukkan hasil yang positif dimana warna kaldu kontrol adalah kuning dan setelah
direaksikan dengan Escherichia coli dan Pseudomonas aerugiosa berubah warna
menjadi merah begitu diteteskan reagen A dan reagen B. Hal ini menunjukkan
kemampuan Escherichia coli dan Pseudomonas aerugiosa untuk mereduksi nitrat
menjadi nitrit.

Hasil positif juga ditunjukkan dari hasil pngamatan bakteri A dan B. Namun,
berbeda dengan Escherichia coli, Yang menunjukkan hasil positif dengan penambahan
reagen A dan B, bakteri A dinyatakan positif karena pada saat bubuk zinc ditaburkan
warna tidak menjadi merah dan cenderung sama dengan kontrol. Sehingga didapatkan
bahwa bakteri A dapat mereduksi nitrat dan pada saat diamati nitrat sudah menjadi
amoniak atau gas nitrogen.

c. reaksi katalase

Pada pengamatan reaksi katalase yang dapat menghasilkan gelembung yaitu

bakteri A, Bacillus sp., dan Staphylococcus aureus. Sedangkan pada bakteri B dan
Sarcina tidak didapatkan gelembung yang merupakan gelembung O2. Dari pengamatan
tersebut menunjukkan yang dapat merubah hidrogen peroksida adalah bakteri A, Bacillus
sp., dan Staphylococcus aureus.

7.3 Analisis Kesalahan

Kesalahan yang umum terjadi adalah kesalaan pada inokulasi dan pembuatan agar di
cawan petri. Inokulasi yang tidak benar dapat membuat koloni mati karena terlalu panas. Begitu
juga dengan pembuatan agar di cawan petri, selain menghasilkan streak yang tidak sempurna,
juga bisa didapatkan mikroba mati saat baru mencapai agar yang terlalu panas. Selain itu untuk
penggunaan tabug durham juga bisa terjadi kesalahan karena tabung yang terkocok sehingga
menyebabkan adanya gelembung udara dalam tabung dan hal itu akan membingungkan
pengamatan. Pada reaksi katalase, jika terdapat gelembung di bagian yang tidak ditumbuhi
koloni mikroba, maka bisa jadi itu adala udara dari lingkungan, dan bukan merupakan hasi reaksi
katalase. Namun hal itu akan menyebabkan ambiguitas pada gelembung yang berada di area
yang ditumbuhi koloni. Sehingga pengamatan menjadi diragukan.

VIII. KESIMPULAN

1. Mikroorganisme yang dapat mendegradasi dan memfermentasi karbohidrat adalah

Escherichia coli dengan produk asam dan gas, dan bakteri A dengan produk
berupa asam.
2. Mikroorganisme yang mampu menghasilkan enzim untuk reaksi biooksidasi
adalah untuk reduksi nitrat; Escherichia coli, Pseudomonas aerugiosa, bakteri A,
bakteri B, dan untuk reaksi katalase; bakteri A, Bacillus sp., dan Staphylococcus
aureus.

IX. DAFTAR PUSTAKA

Better, O.S., Rubinstein, I., Winaver, J.M., Knochel, J.P. 1997. Mannitol therapy

revisited (1940–1997). Kidney International. 51 : 886–894.

Debbi. 2006. Kajian Pengaruh Konsentrasi Sukrosa dan Asam Sitrat terhadap Mutu Sabun

Transparan. https://core.ac.uk/download/pdf/32339873.pdf. Diakses tanggal 9

november 2016

Lay,W.B.1994.Analisa Mikroba di Laboratorium.Edisi I.Jakarta : PT.Raja Grafindo

Persada

Linko, P., Linko, Y.Y., and Olkku, J. 1982. Extrusion Cooking and Bioconversions.
 In : Ronald Jowitt (edt.). Extrusion Cooking Technology. Elsevier Applied

Science Publishers. London. Page 68.

Murray, R. K., Granner, D. K., & Rodwell, V. W. Biokimia harper (27 ed.).Jakarta:

Buku Kedokteran EGC; 2009

Pelczar. M.J. 1988. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta : UI Press

Silanikove, N., G. Leitner., U. Merin., and C. G. Prosser. 2010. Recent advances in

exploiting goat’s milk: quality, safety and production aspects. Small Rum.

Res. 30: 30

Zakhari Samir. 2006. Overview: How Is Alkohol Metabolized By The Body?

National Institute On Alcohol Abuse And Alcoholism (NIAAA) 5635,

Fisher Lane.MSC 9304 Bethesda.

 MODUL 08 - PERCOBAAN 20

I. JUDUL : Aktivitas Enzim Intraseluler : Uji IMViC dan TSI

II. TUJUAN
1. Menentukan hasil uji IMViC dari beberapa bakteri pada percobaan.
2. Menentukan hasil uji TSI dari beberapa bakteri pada percobaan.

III. PRINSIP DASAR

Enterobacteriaceae merupakan kelompok bakteri yang dapat ditemukan pada jalur

intestinal manusia dan mamalia. Untuk mengidentifikasi kelompok bakteri tersebut dilakukan
Uji IMViC dan Uji TSI. Uji IMViC terdiri dari uji indol, metil merah, Voges-Proskaver dan
penggunaan sitrat. Uji Indol dilakukan untuk mengidentifikasi suatu bakteri dapat memproduksi
indol atau tidak. Indol adalah senyawa yang menjadi ciri khas dari bakteri intestinal. Uji reaksi
metil merah dilakukan untuk membedakan bakteri Eschericia coli dengan bakteri Enterobacter
aerogenes. Uji Vogus-Proskauer dilakukan untuk mendeteksi kemampuan mikroorganisme untuk
menghasilkan senyawa bukan asam. Uji sitrat dilakukan untuk mendeteksi kemampuan
organisme dalam menggunakan sitrat sebagai sumber karbon untuk menghasilkan energi. Uji
TSI digunakan untuk

III. TEORI DASAR

Mikroba yang dapat digunakan sebagai indikator keamanan pangan atau sanitasi harus
dapat dideteksi dengan mudah dan cepat serta dapat dibedakan dari mikroba lainnya. Selain
itu keberadaannya pada bahan pangan harus berkorelasi dengan keberadaan patogen, sehingga
mikroba ini dapat digunakan sebagai indikator keamanan pangan. Persyaratan lain yang harus
dipenuhi oleh mikroba yang akan digunakan sebagai indikator keamanan pangan adalah
memiliki kebutuhan nutrisi atau kecepatan pertumbuhan atau laju kematian yang hampir sama
dengan patogen (Dwidjoseputro, 1994)

Bakteri dapat diidentifikasi dengan mengetahui reaksi biokimia dari bakteri tersebut.
Dengan menanamkan bakteri pada medium, maka akan diketahui sifat-sifat suatu koloni
bakteri. Sifat-sifat suatu koloni tersebut ialah sifat-sifat yang ada sangkut pautnya dengan
bentuk, susunan, permukaan, pengkilatan, dan sebagainya. Identifikasi bakteri dapat diketahui
dengan menanamkan sampel bakteri dalam media seperti media gula-gula dan penanaman
 dalam IMVIC. Uji IMVIC ini merupakan singkatan dari uji Indol, Metil Red, Voges
Proskauer, dan Citrate (BPOM RI, 2008).

A1. Uji Indol

Beberapa bakteri dapat menghasilkan indole dari asam amino triptofan menggunakan
typtophanase enzim. Produksi indole yang terdeteksi menggunakan reagen Ehrlich atau
reagen Kovac ini. bereaksi indole dengan aldehida dalam reagen untuk memberikan warna
merah. Lapisan alkohol berkonsentrasi merah warna sebagai cincin di bagian atas. (Rao,
2006)
Prosedur: Bakteri yang diuji diinokulasi dalam air pepton, yang mengandung amino
tryptophan asam dan diinkubasi semalam di 37oC. Setelah inkubasi beberapa tetes reagen
Kovac ini ditambahkan. reagen Kovac terdiri dari para-dimetil aminobenzaldehyde, alkohol
isoamil dan con. HCl. reagen Ehrlich lebih sensitif di mendeteksi produksi indol di anerobes
dan non-fermentor. Pembentukan merah atau pink cincin berwarna di atas diambil sebagai
positif. (Rao, 2006)
Contoh: Escherichia coli: Positif; Klebsiella pneumoniae: Negatif

Gambar 1 Reaksi Pada Uji Indol

(Sumber : http://microbeonline.com/indole-test-principle-procedure-results/)

A2. Metil merah

Metil Merah adalah indikator asam-basa yang berubah menjadi merah dalam medium yang
sedikit asam. Jadi, jika metil merah ditambahkan pada medium biakan yang mengandung
glukosa yang di dalamnya organisme telah tumbuh selama 18 sampai 24 jam, warna merah
menunjukkan bahwa asam organik telah terbentuk sebagai akibat fermentasi
glukosa. Escherichia coli membentuk banyak asam dan adalah positif terhadap metil merah.
Metil merah adalah suatu indicator yang akan menunjukan warna merah bila pH ada di bawah 4.
Hasil test positif ditandai dengan terbentuknya warna merah, sedangkan warna kuning
menunjukan hasil negative. Pada uji ini sebelumnya ditambahkan reagen MR (0,4% dalam
alcohol 96%) kedalamnya untuk dapat mengetahui reaksi warna (Sahdan, 2010).

A3. Vogus-Proskaver

Tes ini digunakan untuk mengetahui kemampuan suatu organisme untuk menghasilkan dan
mempertahankan asam stabil dan produk dari fermentasi glukosa, untuk mengatasi dinetralkan
oleh sistem dan untuk menentukan kemampuan beberapa organisme untuk menghasilkan produk
akhir netral dari fermentasi glukosa. VP mendeteksi kemampuan organisme untuk mengubah
produk asam untuk asetoin dan 2,3-butanadiol. organisme yang mampu useing jalur VP
menghasilkan jumlah yang lebih kecil dari asam selama fermentasi glukosa dan karena itu tidak
menghasilkan perubahan warna ketika metil indicator merah ditambahkan., reagen sekunder
ditambahkan, alpha -naphthol, diikuti oleh pottasium hidroksida (KOH) hasil tes positif
ditunjukkan oleh kompleks warna merah. (Tille,2014)

Gambar 3 Reaksi Pada reaksi Vogus-Proskaver

(Sumber : http://vlab.amrita.edu/?sub=3&brch=76&sim=215&cnt=1)

A.4. Sitrat

Tes ini mendeteksi kemampuan organisme untuk memanfaatkan sitrat sebagai satu-
satunya sumber karbon dan energi. Bakteri diinokulasi pada medium yang mengandung
natrium sitrat dan indikator pH biru bromotimol. Medium juga mengandung garam amonium
anorganik, yang digunakan sebagai satu-satunya sumber nitrogen. Pemanfaatan sitrat
melibatkan citritase enzim, yang memecah sitrat untuk oksaloasetat dan asetat. Oksaloasetat
 lebih lanjut dipecah menjadi piruvat dan CO2. Produksi Na2CO3 serta NH3 dari pemanfaatan
natrium sitrat dan ammonium garam masing-masing menghasilkan pH basa. Hal ini
menyebabkan perubahan warna medium dari hijau ke biru. (Rao, 2006)

Dengan manggunakan medium sitrat menurut Simmon, merupakan medium padat yang
terdiri dari mono ammonium fosfat, Na citrate, NaCl, air , agar-agar, dan indikator Bromtymol
blue. Pada uji ini medium yang tadinya berwarna hijau kebiruan, bila bereaksi positif maka
akan berubah menjadi berwarna biru terang. Bila rekasi negative, maka akan tetap berwarna
hijau kebiruaan (Hartini, 2011).

Gambar 1 Reaksi Pada Sitrat.

(Sumber : http://microbeonline.com/indole-test-principle-procedure-results/)

B. Uji TSI

Uji TSIA (Triple Sugar Iron Agar) digunakan untuk membedakan kelompok atau genus
Enterobacter, perbedaan tersebut didasarkan atas perbedaan dalam fermentasi karbohidrat dan
produksi hidrogen sulfida oleh beberapa kelompok bakteri intestinal. (Cappucino, 2001).

Uji TSIA untuk mengetahui kemampuan baktri dalam memfermentasikan glukosa, laktisa,
dan sukrosa, dan untuk mengetahui kemampuan bakteri untuk mendesulfurasi asam amino
sehingga media berubah warna menjadi hitam, serta melihat adanya gas yang terbentuk. Endapan
ini terbentuk karena bakteri mampu mendesulfurasi asam amino dan methion yang akan
menghasilkan H2S, dan H2S akan bereaksi dengan Fe+ yang terdapat pada media dan
menghasilkan endapan hitam. Hasil positif apabila bakteri mampu memfermentasikan sukrosa
dan laktosa yaitu lereng (slant) pada media akan berwarna kuning dalam suasana asam. Lalu bila
bakteri mampu untuk mendesulfurasi asam amino maka media akan berubah warna menjadi
hitam, dan media akan terangkat atau pecah bila terbentuk gas. Sifat metabolisme bakteri dalam
uji biokimia biasanya dilihat dari interaksi metabolit-metabolit yang dihasilkan dengan reagen
reagen kimia. Selain itu dilihat kemampuannya menggunakan senyawa tertentu sebagai sumber
karbon dan energi.(Waluyo, 2004)

IV. ALAT DAN BAHAN

a. Alat

1.Pembakar Bunsen,

2.Jarum Inokulasi,

3. Pipet Tetes

b. Bahan

1. Kultur bakteri Escherichia coli, Bacillus cereus , bakteri A dan bakteri B,

2. Kaldu tryptophan 1% dalam tabung
3. Kaldu tryptophan 1% + glukosa 1% dalam tabung
4. Larutan Kovac segar
5. Biakan murni Escherichia coli, Proteus vulgaris. , bakteri A dan bakteri B,
6. Medium kaldu MR-VP dalam tabung
7. Reagen Metil Merah
8. Biakan murni Escherichia coli, Proteus vulgaris, bakteri A dan bakteri B,
9. Reagen alfanaftol , larutan KOH dan keratin
10. Agar miring Simmons sitrat dalam tabung reaksi,
11. Agar miring TSI
12. Biakan murni Escherichia coli, Proteus vulgaris, bakteri A dan bakteri B,

V. DATA DAN PENGAMATAN

 A1. Uji Produksi Indol

Kontrol Hasil Pengamatan Keterangan

Tanggal Pengamatan: 1-11-2016

Nama Bakteri : Escherichia coli
Media : tryptophan 1%
Suhu : 37oC
Keterangan : Muncul cincin
merah -> (+)
Sumber : Kelompok 9

Tanggal Pengamatan: 1-11-2016

Nama Bakteri : Escherichia coli
Media : tryptophan 1% +
glukosa 1%
Suhu : 37oC
Keterangan : Muncul cincin
merah -> (+)
Sumber : Kelompok 9

Tanggal Pengamatan: 1-11-2016

Nama Bakteri : Bacillus cereus
Media : tryptophan 1%
Suhu : 37oC
Keterangan : Terbentuk cincin
coklat
Sumber : Kelompok 10
Tanggal Pengamatan: 1-11-2016
Nama Bakteri : Bacillus cereus
Media : tryptophan 1% +
glukosa 1%
Suhu : 37oC
Keterangan : Terbentuk cincin
coklat
Sumber : Kelompok 10

Tanggal Pengamatan: 1-11-2016

Nama Bakteri : Bakteri A
Media : tryptophan 1%
Suhu : 37oC
Keterangan : Terbentuk cincin
coklat
Sumber : Kelompok 3

Tanggal Pengamatan: 1-11-2016

Nama Bakteri : Bakteri A
Media : tryptophan 1% +
glukosa 1%
Suhu : 37oC
Keterangan : Terbentuk cincin
coklat
Sumber : Kelompok 3
 Tanggal Pengamatan: 1-11-2016
Nama Bakteri : Bakteri B
Media : tryptophan 1%
Suhu : 37oC
Keterangan : Terbentuk cincin
coklat
Sumber : Kelompok 4

Tanggal Pengamatan: 1-11-2016

Nama Bakteri : Bakteri B
Media : tryptophan 1% +
glukosa 1%
Suhu : 37oC
Keterangan : Terbentuk cincin
coklat
Sumber : Kelompok 4

A2. Reaksi Metil Merah

Kontrol Hasil Pengamatan Keterangan

Tanggal Pengamatan: 1-11-

2016
Nama Bakteri : Escherichia coli
Media : kaldu MR-VP
Suhu : 37oC
Keterangan : Tidak Terbentuk
cincin merah -> (-)
Sumber : Kelompok 9
Tanggal Pengamatan: 1-11-
2016
Nama Bakteri : Proteus
vulgaris.
Media : kaldu MR-VP
Suhu : 37oC
Keterangan : Tidak Terbentuk
cincin merah -> (-)
Sumber : Kelompok 10

Tanggal Pengamatan: 1-11-

2016
Nama Bakteri : Bakteri A
Media : kaldu MR-VP
Suhu : 37oC
Keterangan : Terbentuk layer
orange
Sumber : Kelompok 3

Tanggal Pengamatan: 1-11-

2016
Nama Bakteri : Bakteri B
Media : kaldu MR-VP
Suhu : 37oC
Keterangan : Tidak Terbentuk
cincin merah -> (-)
Sumber : Kelompok 8
A3. Reaksi Vogus Proskaver

Kontrol Hasil Pengamatan Keterangan

Tanggal Pengamatan: 1-11-

2016
Nama Bakteri : Escherichia
coli
Media : kaldu MR-VP
Suhu : 37oC
Keterangan : Tidak Terbentuk
cincin merah
Sumber : Kelompok 9

Tanggal Pengamatan: 1-11-

2016
Nama Bakteri : Proteus
vulgaris
Media : kaldu MR-VP
Suhu : 37oC
Keterangan : Tidak terbentuk
cincin merah -> (-)
Sumber : Kelompok 10

Tanggal Pengamatan: 1-11-

2016
Nama Bakteri : Bakteri A
Media : kaldu MR-VP
Suhu : 37oC
Keterangan : Tidak Terbentuk
cincin merah -> (-)
Sumber : Kelompok 3
 Tanggal Pengamatan: 1-11-
2016
Nama Bakteri : Bakteri B
Media : kaldu MR-VP
Suhu : 37oC
Keterangan : Tidak Terbentuk
cincin merah -> (-)
Sumber : Kelompok 8

A4. Penggunaan Sitrat

Kontrol Hasil Pengamatan Keterangan

Tanggal Pengamatan: 1-11-2016

Nama Bakteri : Escherichia coli
Media : Agar miring Simmons
sitrat
Suhu : 37oC
Keterangan : Warna berubah
menjadi warna biru & Tidak
pecah
Sumber : Kelompok 1
Tanggal Pengamatan: 1-11-2016
Nama Bakteri : Proteus vulgaris
Media : Agar miring Simmons
sitrat
Suhu : 37oC
Keterangan : Warna tetap hijau
& agar tidak pecah
Sumber : Kelompok 6

Tanggal Pengamatan: 3-11-2016

Nama Bakteri : Bakteri A
Media : Agar miring Simmons
sitrat
Suhu : 37oC
Keterangan : Warna berubah
menjadi warna biru & Tidak
pecah
Sumber : Kelompok 3

Tanggal Pengamatan: 1-11-2016

Nama Bakteri : Bakteri B
Media : Agar miring Simmons
sitrat
Suhu : 37oC
Keterangan : Warna tetap hijau
& agar tidak pecah
Sumber : Kelompok 8
B. Uji TSI

Kontrol Hasil Pengamatan Keterangan

Tanggal Pengamatan: 1-11-2016

Nama Bakteri : Pseudomonas
aeruginosa
Media : Agar miring TSI
Suhu : 37oC
Keterangan : tidak ada perubahan
warna
Sumber : Kelompok 1

Tanggal Pengamatan: 1-11-2016

Nama Bakteri : Escherichia coli
Media : Agar miring TSI
Suhu : 37oC
Keterangan : warna berubah
seluruhnya menjadi kuning
Sumber : Kelompok 7

Tanggal Pengamatan: 1-11-2016

Nama Bakteri : Proteus vulgaris
Media : Agar miring TSI
Suhu : 37oC
Keterangan : terdapat sedikit
perubahan warna orange pada
bagian bawah agar miring begitu
pula pada bagian stab
Sumber : Kelompok 3
 Tanggal Pengamatan: 1-11-2016
Nama Bakteri : Bakteri A
Media : Agar miring TSI
Suhu : 37oC
Keterangan : Pada bagian tengah
terdapat perubahan warna menjadi
orange
Sumber : Kelompok 9

Tanggal Pengamatan: 1-11-2016

Nama Bakteri : Bakteri B
Media : Agar miring TSI
Suhu : 37oC
Keterangan : warna menjadi
menggelap
Sumber : Kelompok 10

VI. ANALISIS

Media yang digunakan pada percobaan ini berbeda beda tergantung uji yang dilakukan.
Pada saat percobaan, inokulasi dilakukan secara aseptik dengan tujuan memperkecil
kemungkinan kontaminasi yang terjadi, inkubasi dilakukan selama 24-48 jam pada suhu
37oC dengan tujuan agar bakteri tumbuh optimum, karena pada umumnya bakteri memiliki
temperatur optimum pada suhu tersebut.
A1. Uji indol

Uji Indol menggunakan media Tryptophan 1%, Tryptophan adalah asam amino esensial
yang teroksidasi oleh beberapa bakteri yang mengakibatkan pembentukan indol, asam
piruvat, dan amonia. Pada media ini, E. coli membentuk cincin berwarna merah pada
permukaan medium setelah ditetesi Kovac, hal ini menandakan bahwa ketiga bakteri tersebut
positif menghasilkan indol. Hasil percobaan ini sesuai dengan literatur bahwa E.coli dapat
menghasilkan indol. Pada percobaan yang sama dengan medium yang ditambahkan glukosa
1% dilakukan terhadap E.coli. Glukosa ditambahkan bertujuan untuk mengetahui
pengaruhnya terhadap kerja enzim. Menurut literatur, adanya glukosa akan mengganggu
produksi indol yang dilakukan oleh E.coli dan hal ini tidak sesuai dengan hasil pengamatan
yang diperoleh dari percobaan ini karena pada percobaan media ini terbentuk cincin
berwarna merah.

Sedangkan pada bakteri Bacillus sp., bakteri A dan Bakteri B tidak menghasilkan cincin
berwarna merah sehingga kedua bakteri tersebut negatif menghasilkan indol. Bacillus cereus
menunjukan hasil yang negative sesuai dengan literature.

A2. Uji Metil merah

Pada Uji metil merah didapatkan bahwa tidak menghasilkan cicin merah. Hal ini berbeda
dengan literature bahwa bakteri Escherichia coli tersebut memfermentasikan glukosa
sehingga dapat menghasilkan asam, Asam yang dihasilkan bermacam-macam sehingga
seperti campuran asam, diantaranya asam laktat, asam asetat dan asam format. Dikarenakan
reaksi yang dihasilkan asalah asam merah pada pH sekitar 4 indikator metil akan
menunjukkan terbentuknya cincin merah yang mengindikasikan hasil yang positif. Perbedaan
hasil ini dapat diakibatkan beberapa hal, diantaranya adalah reagen yang kurang ditambahkan
pada media, terlalu lamanya masa inkubasi, atau bakteri tidak diinokulasi secara semburna
sehingga biakan tidak tumbuh pada media MR-VP.

Pada percobaan ini bakteri Proteus vulgaris tidak menghasilkan cicin merah. Hal ini
menunjukan perbedaan dengan literature bahwa Proteus vulgaris seharusnya menunjukan
hasil yang positif dikarenakan proteus memfermentasikan glukosa sehingga dapat
menghasilkan asam. Uji MR dengan hasil positif, terjadi perubahan warna menjadi merah
setelah ditambahkan metil merah. Artinya, bakteri ini mengahasilkan asam campuran
(metilen glikon) dari proses fermentasi glukosa yang terkandung dalam medium MR-VP.
Terbentuknya asam campuran pada media akan menurunkan pH sampai 5,0 atau kurang, oleh
karena itu bila indikator metil ditambahkan pada biakan tersebut dengan pH serendah itu
maka indikator tersebut menjadi merah. Hal ini menandakan bahwa bakteri ini peragi asam
campuran. Perbedaan hasil dengan literature dapat diakibatkan oleh konsentrasi dan jumlah
reagen yang kurang banyak atau dapat diakibatkan oleh biakan bakteri yang tidak tumbuh
dengan baik dan terjadi suatu hal saat inkubasi dilakukan.

Pada percobaan ini bakteri A dan bakteri B tidak menghasilkan cicin merah yang
menunjukan bahwa bakteri tersebut tidak memfermentasikan glukosa sehingga dapat
menghasilkan asam.

A3. Uji Vogus-Proskaver

Pada Reaksi Vogus-Proskaver bakteri Escherichia coli , Proteus vulgaris , bakteri A,

bakteri B setelah inkubasi selama 24 jam didapatkan bahwa tidak menghasilkan cicin merah.
Hasil ini sesuai dengan literature bahwa bakteri Escherichia coli dan Proteus vulgaris
tersebut tidak memiliki kemampuan untuk menghasilkan produk senyawa bukan asam
seperti asetimetilkarbinol sebagai hasil akhir dari fermentasi glukosa atau asam organik
lainnya.

A.4. Uji Sitrat

Uji sitrat merupakan salah satu pengujian dari kelompok tes IMViC. Pengujian ini
digunakan untuk melihat kemampuan mikroorganisme. menggunakan sitrat sebagai satu-
satunya sumber karbon dan energi. Untuk uji ini digunakan medium sitrat koser (SCA) yang
merupakan medium sintetik dengan Na sitrat sebagai satu-satunya sumber karbon. NH4 +
sebagai sumber N dan indikator BTB (Brom Timol Blue) yang merupakan indikator pH.

Pada uji penggunaan sitrat dalam medium Simmons bakteri Escherichia coli
memberikan dampak perubahan warna medium dari yang semula berwarna hijau menjadi
berwarna biru. Hal ini menandakan bahwa bakteri Escherichia coli tersebut dapat
mereduksi sitrat dan menghasilkan sodium karbonat. Kemampuan ini didasarkan adanya
enzim sitrat permease yang membantu transport sitrat di dalam sel. Tetapi menurut literature
Escherichia coli tidak mereduksi sitrat. Perbedaan hasil percobaan dengan literatur ini
dapat disebabkan oleh beberapa hal, terkait kontaminasi yang terjadi pada medium atau
beberapa hal yang mempengarusi saat isolasi.

Pada uji penggunaan sitrat dalam medium Simmons bakteri Proteus dan bakteri B tidak
terjadi perubahan warna pada medium setelah dilakukan pengamatan sebanyak 2 kali yaitu
setelah 24 dan 72 jam.. Hal ini menandakan bahwa bakteri tersebut tidak dapat mereduksi
sitrat sesuai dengan literarur.

Pada uji penggunaan sitrat dalam medium Simmons bakteri A memberikan dampak
perubahan warna medium dari yang semula berwarna hijau menjadi berwarna biru pada
pengamatan setelah 72 jam. Hal ini menandakan bahwa bakteri A tersebut dapat mereduksi
sitrat dan menghasilkan sodium karbonat. Kemampuan ini didasarkan adanya enzim sitrat
permease yang membantu transport sitrat di dalam sel.Sitrat bereaksi dengan bantuan enzim
sitrase dan menghasilkan asam oksaloasetat dan asetat. Produk ini secara enzimatik
dikonversi menjadi asam piruvat dan karbondioksida. Selama reaksi ini, medium akan
berubah menjadi basa karena karbondioksida yang dihasilkan dengan sodium dan air akan
membentuk sodium karbonat yang basa. Kehadiran sodium karbonat inilah yang akan
membuat indikator bromtimol biru yang merupakan komponen medium mengubah medium
dari warna hijau menjadi biru keunguan. Bakteri tersebut dapat menggunakan sitrat, maka
asam akan dihilangkan dari medium biakan, sehingga menyebabkan peningkatan pH dan
mengubah warna medium dari hijau menjadi biru.

Pada uji penggunaan sitrat dalam medium Simmons bakteri B tidak terjadi perubahan
warna pada medium setelah dilakukan pengamatan sebanyak 2 kali yaitu setelah 24 dan 72
jam.. Hal ini menandakan bahwa bakteri tersebut tidak dapat mereduksi sitrat.

B. Uji TSI

Pada percobaan ini digunakan medium Triple Sugar Iron. Dimana pada medium ini ada
3 jenis karbohidrat, yaitu laktosa dan sukrosa 1% dan glukosa 1%. Indikator yang digunakan
untuk mengetahui bakteri di dalam media bereaksi positif adalah fenol merah. Dalam
percobaan ini dilakukan dengan dua metode inokulasi, yaitu stab dan streak, digunakannya
kedua metode ini bertujuan untuk mendapatkan hasil yang optimal dalam transfer bakteri
 yang dilakukan dan cara stab menunjukan beberapa bakteri yang menghasilkan gas dengan
tanda media yang distab menjadi retak.

Pada bakteri Pseudomonas aeruginosa dan Bakteri B setelah inkubasi selama 24 jam
tidak terdapat perubahan pada warna dan area stab pada media. Hal tersebut menunjukan
bahwa tidak terjadi fermentasi karbohidrat sama sekali.

Dari hasil pengamatan didapatkan bahwa Bakteri Escherichia col terlihat media
mengalami perubahan warna menjadi kuning seluruhnya. Hal tersebut menandakan bahwa
fermentasi laktosa atau sukrosa terjadi. Karena kedua substrat ini tersedia dalam konsentrasi
yang cukup banyak, maka berfungsi sebagai substrat untuk fermentasi lanjutan yang
menghasilkan reaksi asam baik pada permukaan maupun ujung agar.

Pada hasil pengamatan didapatkan bahwa media yang dibiaki bakteri Proteus vulgaris
yang telah diinkubasi selama 24 jam mengalami perubahan warna pada bagian bawah media
sedangkan pada bagian miring atas tidak terdapat perubahan warna. Tetapi hal ini
menunjukan perbedaan dengan literature dikarenakan bakteri ini tidak memfermentasi
karbohidrat tetapi terjadinya perubahan warna menandakan terjadinya fermentasi glukosa.
Hal ini dapat terjadi dikarenakan media yang dipakai tidak steril, jarum inokulasi tidak steril
ataupun hal hal yang diakibatkan saat inkubasi.

Dari hasil pengamatan didapatkan bahwa bakteri A terlihat media mengalami perubahan
warna pada bagian bawah media sedangkan pada bagian miring atas tidak terdapat
perubahan warna yang menandakan hanya terjadi fermentasi glukosa. Bakteri tersebut lebih
memilih untuk mendegradasi glukosa terlebih dahulu. Karena substrat ini hadir dalam
konsentrasi yang minimal, sejumlah kecil asam yang dihasilkan pada permukaan agar miring
segera dioksidasi. Pepton yang ada di medium juga menghasilkan kondisi basa.

VII. KESIMPULAN
Menurut hasil percobaan, pada reaksi indole bakteri yang menunjukan hasil positif
adalah Escherichia coli. Sedangkan untuk bakteri Bacillus sp, bakteri A dan bakteri B
menunjukan hasil yang negative. Pada uji metil merah dan uji Vogus-Proskaver bakteri
Escherichia coli, Proteus vulgaris, Bakteri A dan Bakteri B menunjukan hasil yang
negative. Untuk uji sitrat yang menghasilkan hasil yang positif adalah bakteri A dan
 Escherichia coli, sedangkan yang menghasilkan hasil negative adalah bakteri B dan Proteus
vulgaris.
Hasil yang ditunjukan pada uji TSI bakteri Pseudomonas aeruginosa dan Bakteri B
menunjukan hasil yang negative, untuk bakteri Escherichia col menunjukan hasil positif
dengan perubahan warna pada seluruh bagian agar, sedangkan bakteri dan bakteri A Proteus
vulgaris menunjukan perubahan warna pada ujung agar yang menunjukan hasil yang positif.

IX. DAFTAR PUSTAKA

BPOM RI. 2008. InfoPOM Badan Pengawas Obat dan Makanan. Jakarta: Badan POM RI. Vol.
9, No. 2, Maret 2008. ISSN 1829-933.

Cappucino, J.G. and Sherman, N. 2001. Microbiology: A Laboratory Manual.2nd Edition. New
York : The Benjamin 42 Cummings Publishing Company.

Dwidjoseputro. 1994. Analisis Mikroba di Laboratorium. Jakarta: Raja Grafindo.

Hartini, P. B. 2011.Studi Keamanan Mikrobiologi Makanan jajanan Di Kantin Falesa IPB.

Bogor.

Rao, Sridhar.2006.IMViC Reactions. Davangere: Departement of microbiology JJMMC.

Sahdan, Nona .2010. Analisis Bakteri Coliform Pada Jajanan Anak Sekolah SD
Inpres Bontomanai Makassar . Makassar: Tidak diterbitkan,.

Tille, Patricia.2014.Bailey & Scott's Diagnostic Microbiology.Missouri:ELSEVIER.

Waluyo, L. 2004. Mikrobiologi Umum. Universitas Muhamadiyah Malang: Malang

 MODUL 08 - PERCOBAAN 21

I. JUDUL : Aktivitas Biokimia Lain

II. TUJUAN
a. Menentukan bakteri yang dapat menghidrolisis urea
b. Menentukan bakteri yang menghasilkan gas H2S

III. PRINSIP DASAR

Urease adalah enzim yang biasa digunakan untuk mengidentifikasi bakteri Proteus
vulgaris. Reaksi kehadiran urease diketahui pada medium kaldu urea yang berisi indikator pH
fenol merah. Gas H2S adalah hasil dari aktivitas bakteri terhadap asam amino. H2S dari asam
amino disintesis dengan enzim sistein desulfurase. Produksi gas H2S adalah langkah awal proses
deaminasi. H2S hanya dihasilkan oleh bakteri tertentu seperti Proteus vulgaris.

IV. TEORI DASAR

Biokimia merupakan ilmu yang mempelajari tentang senyawa-senyawa yang ada di

dalam sistem hidup, penyusunan senyawa-senyawa tersebut ke dalam sel-sel dan interaksi kimia
yang terjadi. Sel-sel pada makhluk hidup tersusun dari biomolekul. Untuk dapat
mempertahankan hidup, sel-sel mengalami metabolisme (reaksi pada sel). Dalam metabolisme,
sel menyerap energi dari makanan atau nutrisinya, energi ini digunakan untuk membentuk
biomolekul penyusun sel(Lehninger, 1995).

Beberapa bakteru mampu memproduksi enzim yang disebut dengan urease yang akan
“menyerang” ikatan nitrogen dan karbon pada senyawa amida seperti urea dan pada akhirnya
akan menghasilkan ammonia, CO 2, dan air. Aktivitas urea dideteksi pada bakteri yang tumbuh
dan berkembang pada medium yang mengandung urea dan digunakan indikator pH dan fenol
merah. Ketika urea terhidrolisis, ammonia akan terkumpul pada medium dan membentuk alkalin.
pH akan naik dan menyebabkan indikator fenol merah yang ditambahkan pada medium akan
berubah dari kuning menjadi merah kejinggan sampai pink tua ataupun merah cherry jika kultur
bakteri positif dapat melakukan hidrolisis urea. Jika tidak terbentuk warna-warna tersebut berarti
hasil negatif dan menunjukkan bahwa kultur tidak dapat menghidrolisis urea. (Harley and
Prescott, 2002:185) Banyak protein yang memiliki asam amino yang mengandung sulfur seperti
sistein. Ketika protein tersebut dihirolisis oleh bakteri, asam amino akan terlepas dan digunakan
sebagai nutrisi. Sistein dengan kehadiran enzim sistein desulfurase akan kehilangan atom
sulfurnya dari adanya penambahan hidrogen dari air untuk membentuk gas H 2 S. Gas H 2 S
juga akan diproduksi dari reduksi dari senyawa sulfur inoranik seperti thiosulfat (S 2 O 3 ),
sulfat, dan sulfit. (Harley and Prescott, 2002:147) Digunakan medium SIM yang mengandung
pepton dan sodium thiosulfat sebagai substrat dan Fe(NH 4 )SO 4 sebagai indikator H 2 S. Ketika
H 2 S bergabung dengan besi ammonium sulfat akan terbentuk besi sulfida berwarna hitam dan
tidak larut. Jika kultur bakteri yang memiliki enzim sistein desulfurase dapat bergerak, maka
keseluruhan tabung reaksi akan berubah menjadi hitam. Garis hitam yang terbentuk pada tabung
reaksi menunjukkan hasil positif H 2 S. Bila tidak terdapat garis hitam maka hasil negatif dan
tidak terbentuk H 2 S. (Harley and Prescott, 2002:149)

V. ALAT DAN BAHAN

a. Alat

1.Pembakar Bunsen,

2.Jarum Inokulasi,

3. Pipet Tetes

b. Bahan

1. Kultur bakteri Escherichia coli, Pseudomonas aerugiosa, bakteri A dan bakteri B,

2. Kaldu urea dalam tabung,
3. Kaldu Nitrat
4. Kultur bakteri Escherichia coli, Proteus vulgaris, bakteri A dan bakteri B,
5. Agar tegak medium H2S

VI. DATA DAN PENGAMATAN

A. Uji Urease
Kontrol Hasil Pengamatan Keterangan

Tanggal Pengamatan: 1-
11-2016
Nama Bakteri :
Escherichia coli
Media : Kaldu urea
Suhu : 37oC
Keterangan :
Sumber : Kelompok 4

Tanggal Pengamatan: 1-
11-2016
Nama Bakteri :
Pseudomonas aeruginosa
Media : Kaldu urea
Suhu : 37oC
Keterangan : Tidak terjadi
perubahan warna
Sumber : Kelompok 3

Tanggal Pengamatan: 1-
11-2016
Nama Bakteri : Bakteri A
Media : Kaldu urea
Suhu : 37oC
Keterangan :
Sumber : Kelompok 10
 Tanggal Pengamatan: 1-
11-2016
Nama Bakteri : Bakteri B
Media : Kaldu urea
Suhu : 37oC
Keterangan : Terdapat
perubahan warna menjadi
ungu
Sumber : Kelompok 1

C. Produksi H2S

Kontrol Hasil Pengamatan Keterangan

Tanggal Pengamatan: 1-
11-2016
Nama Bakteri :
Escherichia coli
Media : Agar Tegak H2S
Suhu : 37oC
Keterangan : terbentuk
warna hitam pada bagian
stab
Sumber : Kelompok 3

Tanggal Pengamatan: 1-
11-2016
Nama Bakteri : Proteus
vulgaris
Media : Agar Tegak H2S
Suhu : 37oC
Keterangan : Tidak
terdapat perubahan
Sumber : Kelompok 10
 Tanggal Pengamatan: 1-
11-2016
Nama Bakteri : Bakteri A
Media : Agar Tegak H2S
Suhu : 37oC
Keterangan : Tidak
terdapat warna hitam
Sumber : Kelompok 1

Tanggal Pengamatan: 1-
11-2016
Nama Bakteri : Bakteri B
Media : Agar Tegak H2S
Suhu : 37oC
Keterangan :tidak
terdapat perubahan
Sumber : Kelompok 8

VII. ANALISIS

A.Uji Urease

Pada percobaan untuk mengetahui bakteri memiliki enzim urease atau tidak digunakan
medium urea sebagai sumber urea yang nantinya akan dihidrolisis oleh bakteri yang
diinokulasikan pada bakteri tersebut. Reagen fenol merah digunakan untuk mengetahui pH yang
terbentuk akibat dari hidrolisis urea yang menghasilkan ammonia yang mengubah pH
lingkungan menjadi basa.
 Dari hasil pengamatan bakteri Escherichia coli dan bakteri B di inkubasi selama 24 jam
terjadi perubahan warna pada media urea dari warna kuning menjadi warna pink. Perubahan
warna terjadi karena adanya perubahan pH menjadi basa. Hal tersebut terjadi karena ammonia yg
dihasilkan oleh hidrolisis urea. Peran utama enzim urease adalah memecah urea agar nitrogen
yang ada pada urea dapat digunakan sebagai penyedia energi internal dan eksternal bagi
organisme. Sehingga bakteri yang dapat menghidrolisis urea dapat menggunakan nirogen sebagi
salah satu sumber energinya. Sedangkan bakteri yang tidak dapat menghidrolisis urea berarti
menggunakan sumber lain sebagai pemenuh kebutuhan nitrongennya.

Dari hasil pengamatan bakteri Pseudomonas aeruginosa dan bakteri A di inkubasi selama
24 jam tidak terjadi perubahan warna pada media urea. Tidak terjadi warna karena ammonia
tidak dihasilkan pada hidrolisis urea.

B. Uji H2S

Pada percobaan ini, bakteri diinokulasi dengan cara stab pada media agar H2S. Apabila
hasil positif maka akan terbentuk warna hitam di sekitar daerah yang sudah ditusuk oleh kultur
bakteri dan berhasil negatif bila tidak terdapat warna hitam sama sekali. Warna hitam tersebut
merupakan hasil dari ikatan antara H2S dengan besi ammonium sulfat (terkandung pada medium)
yang membentuk besi sulfida.

Dari hasil pengamatan bakteri Escherichia coli yang telah di inkubasi selama 24 jam
pada media SIM terlihat perubahan warna menjadi hitam. Hal tersebut menandakan bahwa
bakteri Escherichia coli menghasilkan gas H2S yang kemudian berikatan dengan Fe membentuk
FeS sehingga medium berwarna hitam. Gas H2S akan diproduksi dari reduksi dari senyawa
sulfur inoranik seperti thiosulfat (S2O3 ), sulfat, dan sulfit. Sistein dengan kehadiran enzim sistein
desulfurase akan kehilangan atom sulfurnya dari adanya penambahan hidrogen dari air untuk
membentuk gas H2S.

Setelah inkubasi selama 24 jam bakteri Proteus vulgaris, bakteri A, dan bakteri B tidak
menunjukan perubahan pada media SIM. Bakteri tersebut tidak menghasilkan H2S maka tidak
terjadi reaksi yang berikatan dengan ammonium sulfat pada media.
 C. Analisis Bakteri A dan Bakteri B

Tabel 3 Hasil Percobaan 19,20 dan 21 dengan Bakteri A dan Bakteri B

Aktivitas
Fermentasi Karbohidrat Uji IMViC
Biokimia Lain
Bakteri Reaksi Reaksi
Uji Penggunaan
Glukosa Sukrosa Laktosa Mannitol Metil Vogus- H2S Urea
Indol Sitrat
Merah Proskaver

A (+) (+) (-) (-) (-) (-) (-) (+) (-) (-)

B (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (+)

Bakteri A berdasarkan hasil percobaan 19, 20 dan 21 dan literature

http://microrao.com/entero_ident.htm menunjukan hasil 98,61% adalah Serratia marcescens.
Sedangkan Bakteri B berdasarkan literature yang sama menunjukan hasil 87,78% Morganella
morganii.

VIII. KESIMPULAN

Bakteri yang mampu menghidrolisis urea adalah Escherichia coli dan bakteri B. Hal
tersebut ditunjukan dengan adanya perubahan warna pada media urea dari warna kuning menjadi
warna pink. Perubahan warna terjadi karena adanya perubahan pH menjadi basa, karena bakteri
tersebut menghasilkan ammonia yang dihasilkan pada saat hidrolisis urea.

Bakteri yang menghasilkan gas H2S adalah Escherichia coli. Hal tersebut menandakan
bahwa bakteri Escherichia coli menghasilkan gas H2S yang kemudian berikatan dengan Fe
membentuk FeS sehingga medium berwarna hitam

IX. DAFTAR PUSTAKA

Lehninger, A.L. 1997. Dasar-Dasar Biokimia. Jilid I.Jakarta: Erlangga

Harley and Prescott.2002.Laboratory Exercises in Microbiology . New York: Mc Graw Hill.