INSTITUTO POLITÉCNICO

NACIONAL
ESCUELA NACIONAL DE
CIENCIAS BIOLÓGICAS

LABORATORIO DE MÉTODOS DE
ANÁLISIS
GRUPO : 5QM2 SECCIÓN: 3

PROFESOR : Francisco Carmelo Fernández López

Práctica
“Separación de una mezcla de dos aminoácidos
por Cromatografía de Intercambio iónico”

10/04/18

OBJETIVOS
 Emplear la técnica de intercambio iónico para la separación de dos aminoácidos.
 Comprobar la separación mediante una reacción colorida y el perfil de elución.

FUNDAMENTO
La cromatografía por intercambio iónico es logísticamente similar a la cromatografía por afinidad. En
ambos casos se usa una columna con resina que se une a la proteína de interés. Sin embargo, en la
cromatografía por intercambio iónico la interacción es menos específica y se basa en la carga
neta .Una resina de intercambio iónico tiene un ligando con carga positiva o negativa. Si tiene carga
negativa es un intercambiador de cationes.
La columna se equilibra al inicio con una amortiguador de pH y fuerza iónica apropiados. La resina
de intercambio se une a contraiones.Las proteínas cuya carga neta sea opuesta a la del
intercambiador se quedarán en la columna , intercambiándose por los contraiones unidos" Las
proteínas que no tengan carga neta o que posean la misma carga que el intercambiador saldrá con
el eluyente.
RESULTADOS
TABLA1.Separación de prolina e histidina.
No. Volumen de A400 A570 No. tubo Volumen A570
tubo elución (ml) de elución
(ml)
1 3 0,018 - 24 72 0,223
2 6 0 - 25 74 0,247
3 9 0 - 26 77 0,353
4 12 0 - 27 80 0,498
5 15 0 - 28 83 0,546
6 18 0,09 - 29 86 0,606
7 21 0,218 - 30 89 0,672
8 24 0,365 - 31 92 0,654
9 27 0,453 - 32 95 0,627
10 30 0,366 - 33 98 0,599
11 33 0,262 - 34 101 0,87
12 36 0,314 - 35 104 0,821
13 39 0,237 - 36 107 0,63
14 42 0,219 - 37 110 0,644
15 45 0,133 - 38 113 0,577
16 48 0,136 0,057 39 116 0,513
17 51 0,166 0,071 40 119 0,423
18 54 - 0,094 41 122 0,017
19 57 - 0,082 42 125 0,138
20 60 - 0,118 43 128 0,037
21 63 - 0,054 44 131 0,089
22 66 - 0,083 45 134 0,047
23 69 - 0,063
Gráfico 1. Perfil de elución de la separación por cromatografía por intercambio
iónico de una mezcla de prolina e histidina.

0.9

0.8

0.7

0.6
Absorbancia

0.5

0.4 Prol i na A400

Hi stidi na A570
0.3

0.2

0.1

0
0 20 40 60 80 100 120 140 160

Volumen de elucion (ml)

a) ¿Cuál de los aminoácidos eluyo primero? Explique porqué

El primero en eluir fue la prolina ya que este solo tendrá un grupo cargado positivamente y la
histidina contara con dos por lo cual será más afín a ser intercambiado por el ion móvil del
intercambiador permitiendo que la prolina eluya primero .
b)¿Cuál es la importancia de regular la velocidad de elución , que pasa a altas y bajas
velocidades?
Es importante para que la velocidad en que se eluya no sea demasiado alta para así permitir que el
iòn pueda ser sustituido en su totalidad y no solo un parte de este, quedando retenido en el
intercambiador y a una velocidad baja el tiempo de la separación sería demasiado. Así que al regular
la velocidad lo que se permite es obtener una mejor separación.
c) Empleando las fórmulas de los aminoácidos y del grupo funcional del intercambiador,haga
un esquema de cómo se produjo la separación .Considere el cambio de pH en el medio .
Histidina
 Prolina

DISCUSIÓN
Se realizó el empaquetamiento de la columna con el intercambiador y se aplicó la muestra que
contenía la mezcla de los aminoácidos y se eluyó primero con regulador de citratos pH 5.25 , a este
pH ambos aminoácidos tienen carga positiva con la diferencia de que la histidina tendrá 2 grupos
cargados positivamente uno es el grupo amino y otro es el de su cadena lateral imidazol ya que el
pKa de la histidina para el grupo amino es de 6 y para el grupo imidazol es de 9.17 estos valores nos
indican que a pH por debajo de 9.17 tendrá el grupo imidazol con carga positiva y a pH por debajo
de 6 tendrá al grupo imidazol y al amino cargado positivamente , mientras que la prolina solo tiene
uno que es el grupo amino del esqueleto del aminoácido cuyo pKa es de aproximadamente 10.60,
esta diferencia hace que la histidina sea más positiva por lo que quedara unida al ion fijo del
intercambiador.

Para hacer el análisis y tomar las lecturas de absorbancia en el espectrofotómetro fue necesario
hacer una dilución con 2 mL de agua destilada para cada uno de los tubos , después de que se
incubaron 20 minutos, esto se hizo con la finalidad de disminuir la intensidad de la coloración de
algunos tubos para que esto no provocara interferencias a la hora de leer en el espectrofotómetro y
no se obtuvieran lecturas mayores a 1, en la tabla 1 se muestran que se obtuvieron absorbancias
menores a 1 , por lo cual la dilución que se hizo con el volumen fue adecuada para hacer las
lecturas. Algunos de los errores que se cometieron en la separación de la mezcla de la prolina y la
histidina fue que en la columna se formaron algunas burbujas, esto se observó cuando se desecho
la resina, provocando que la resina en algunas partes no interactuara con las moléculas histidina, por
lo tanto , tardaran en separarse y causando que se formaran con muchas crestas y valles en el perfil
de elución obteniendo así el grafico 1 donde se visualizan las crestas y valles .

La gran diferencia que se presenta en el perfil de elución entre la prolina e histidina fue debido a que
los errores antes mencionados, se presentaron en mayor cantidad al cambiar el regulador a pH= 2.0
y obtener los volúmenes de histidina.
 CONCLUSIONES
 Se empleo la cromatografía por intercambio iónico para la separación de los aminoácidos
prolina e histidina.
 Se realizó la reacción colorida con Ninhidrina y se comprobó la separación de los aminoácidos
observándose tubos con tonalidad violeta y amarillo claro, se realizó el perfil de elución para la
observación de estos aminoácidos
 Se separó correctamente la mezcla de dos aminoácidos prolina e histidina.
 Se comprobó la presencia y separación de los dos aminoácidos gracias a sus diferencias en
sus grupos funcionales y características electroquímicas que presentan.

REFERENCIAS
 Mary K.Campell ,Shawn O.Farrell.Bioquimica (2003)editorial Thomson,4ta edición.
México.pag.118-123
 Donald Voet,Judith G. Voet .Bioquímica(2004) Editorial medica Panamericana , 3ra
edicion.Montevideo ,Uruguay .Pag-142-143
 BOHINSKI. 1991 Bioquímica. 5ed., Pearson. México.