Un enfoque proteómico para la obesidad y la diabetes tipo 2

RESUMEN: La incidencia de obesidad y diabetes tipo 2 se ha incrementado dramáticamente, lo que resulta en un

mayor interés en su relevancia biomédica. Sin embargo, los mecanismos que desencadenan el desarrollo de la
diabetes tipo 2 en pacientes obesos siguen siendo en gran medida desconocidos. Las comunidades científicas,
clínicas y farmacéuticas están dedicando amplios recursos para resolver este problema mediante la aplicación de
diferentes herramientas ómicas. Durante la última década, los avances en los enfoques proteómicos y la
Organización del Proteoma Humano se han abierto y están abriendo una nueva puerta que puede ser útil en la
identificación de pacientes en riesgo y para mejorar las terapias actuales. Aquí, revisamos brevemente algunos de los
avances en nuestra comprensión de la diabetes tipo 2 que se han producido mediante la aplicación de proteómica.
También revisamos, en detalle, las mejoras actuales en las metodologías proteómicas y las nuevas estrategias que
podrían emplearse para avanzar en nuestra comprensión de esta patología. Mediante la aplicación de estos nuevos
avances proteómicos, se descubrirán nuevas dianas terapéuticas y / o proteínas de diagnóstico en el área de la
obesidad / diabetes tipo 2.

INTRODUCCION: La incidencia de la diabetes mellitus tipo 2 (DM2) está aumentando a un ritmo alarmante en todo el
mundo. Esto se debe, en parte, al aumento dramático de la epidemia de obesidad ya que la DM2 es una comorbilidad
que se observa con frecuencia en pacientes obesos. Debido a que no todos los pacientes obesos desarrollan DM2 y
no todos los pacientes con DM2 son obesos o tienen sobrepeso [2], es interesante comprender los mecanismos
subyacentes a la asociación entre estas dos entidades para predecir qué pacientes tienen mayor riesgo de desarrollar
esta enfermedad, y posiblemente para el desarrollo de terapias preventivas. DM2 aparece como resultado de la
resistencia a la insulina. Durante la ontogenia de esta enfermedad, el páncreas comienza a producir mayores
cantidades de insulina para mantener la euglucemia que supera colectivamente esta resistencia. Pero a medida que
pasa el tiempo, no se pueden mantener niveles suficientes de insulina para controlar los niveles normales de
glucemia. Las características clínicas de la DM2 aparecen varios años después del inicio de este proceso, tiempo
durante el cual la persona está asintomática. Una vez que aparece claramente la DM2, debe atenderse de inmediato
ya que es muy difícil y prácticamente imposible revertir la progresión de la enfermedad. En cualquier caso, factores
como el ejercicio y la dieta pueden 'ayudar', ya que es de suma importancia controlar adecuadamente la DM2 a través
del estilo de vida, y la intervención temprana de los factores mencionados anteriormente puede dar como resultado
niveles normales de glucosa. Por lo tanto, la detección temprana, o incluso más importante, la posibilidad de evitar el
inicio de DM2 sería de gran beneficio.

La alteración de la estructura, la función, la producción y las interacciones de las proteínas, en parte si no del todo,
contribuye al mecanismo subyacente de muchas enfermedades, incluida la diabetes [3]. La comprensión de los
mecanismos patológicos por los cuales las alteraciones moleculares y ambientales conducen al desarrollo y progreso
de la diabetes es importante para la prevención y el tratamiento de esta enfermedad. En tal empeño, se están
aplicando enfoques tales como genómica, metabolómica y proteómica para identificar biomarcadores más específicos
para la DM2 para la detección y el tratamiento selectivos, y para idear nuevas terapias. En este sentido, nos
centraremos en el uso de proteómica para la identificación de biomarcadores novedosos, y tal vez, objetivos
terapéuticos para la identificación y el tratamiento posterior de DM2. Como en cualquier estudio de investigación, se
deben establecer métodos eficientes y actualizados que se utilicen para la selección y el manejo adecuado de las
muestras clínicas y los datos.

Simplemente definida, la proteómica es el estudio a gran escala de proteínas, particularmente de sus estructuras y
funciones. Las proteínas son partes vitales de los organismos vivos, ya que son los principales componentes de todos
los procesos celulares. El término proteómica se acuñó por primera vez en 1997 como una analogía con la genómica,
el estudio del genoma de un organismo. La palabra proteoma es una mezcla de proteínas y genoma y fue acuñada
por Marc Wilkins en 1994 mientras trabajaba en el concepto de estudiante de doctorado. El proteoma es el conjunto
completo de proteínas producidas o modificadas por un organismo o sistema. Esto variará con el tiempo como
resultado de distintos requisitos o tensiones que encuentra una célula u organismo. La proteómica permite el estudio
de todo el conjunto de proteínas, producidas o modificadas por un organismo o sistema, y varía con el tiempo y una
variedad de factores ambientales. De hecho, se forma sobre la base de la investigación y el desarrollo del Proyecto
Genoma Humano [9, 10]. Por lo tanto, aunque el genoma es estático, el proteoma es dinámico. También es un
componente fundamental de la genómica funcional. Mientras que la proteómica generalmente se refiere al análisis
experimental a gran escala de proteínas en una célula / tejido / organismo dado, las técnicas utilizadas en los
estudios también pueden aplicarse a la identificación y purificación de proteínas. Una de las metodologías clave
utilizadas en esta área es la espectrometría de masas [11]. Discutiremos en detalle el paso de preparación de la
muestra como un tema clave para la investigación proteómica clínica en la siguiente sección.

PREPARACIÓN DE LA MUESTRA: La preparación de muestras de fluidos corporales (sangre, suero, orina y saliva) o
tejidos (por ejemplo, adiposos) es un requisito previo extremadamente importante para lograr datos robustos y
reproducibles a través de la proteómica. Una vez que se han obtenido los fluidos corporales y / o tejidos para análisis
proteómicos futuros, deben congelarse rápidamente (es decir, a 80 ° C en un sistema de biobancariado)
generalmente en alícuotas distribuidas en varios viales para evitar el deterioro de la muestra por congelación y
descongelación repetida ciclos. Cuando se trabaja con muestras de tejido adiposo, la selección de las áreas
representativas del cuerpo humano es extremadamente importante de acuerdo con el objetivo de la investigación
clínica. El manejo de los tejidos también es de suma importancia ya que los diferentes tejidos requerirán diferentes
protocolos de homogeneización y procesamiento. Varios ejemplos se explican en las siguientes secciones y en la
Tabla 1. Para fines proteómicos clínicos, pueden tener lugar cambios en los ensayos de proteoma que pueden
modificar fácilmente los resultados experimentales. Por ejemplo, la contaminación de muestras de proteínas puede
provocar sesgos, ya que los artefactos y / o contaminantes pueden enmascarar proteínas de baja expresión durante
el análisis de espectrometría de masas (MS), y también pueden dar lugar a una mala separación de proteínas durante
la electroforesis y la cromatografía. y, además, los artefactos pueden interactuar con la proteína dada, cambiando así
la estructura 3D.

Hay muchos pasos que se pueden tomar en los procesos de manejo y almacenamiento de proteínas, que pueden
ayudar a minimizar cualquier daño y, a su vez, maximizar la precisión de los resultados. Los pasos cruciales en el
proceso son usar anti-proteasas y anti-fosfatasas, y congelar la muestra de proteína rápidamente después de la
cosecha en varios viales. Una premisa muy común es que "no hay protocolos de preparación de muestra de rutina"
para un experimento proteómico dado; siempre es necesario optimizarlos de acuerdo con los objetivos clínicos y de
acuerdo con las estrategias proteómicas diseñadas para ser utilizadas. En cualquier caso, los protocolos optimizados
para una muestra dada o muestras de los mismos ensayos clínicos pueden usarse de forma rutinaria. Además, varios
laboratorios internacionales [de Human Proteome Organization (HUPO), EUPA y SeProt] están estandarizando
protocolos específicos para el almacenamiento de muestras clínicas aparte de aquellas para el análisis a través de
proteómica y MS utilizando protocolos reproducibles de diferentes laboratorios. Esto es importante cuando llevamos a
cabo análisis y los datos provienen de diferentes experimentos de diferentes laboratorios.

Aunque la cantidad de proteína obtenida de las muestras de pacientes puede ser muy baja, las muestras clínicas
permiten obtener datos de gran valor incluso con una cantidad limitada de muestras. Una vez que se ha seleccionado
el tipo de muestra que se va a utilizar, es necesario optimizar el protocolo para la disrupción tisular / lisis celular o
para el aislamiento de las proteínas de los fluidos corporales usando reactivos comerciales que incluyen inhibidores
de proteasa y fosfatasa. Al analizar el suero / plasma, puede ser necesario utilizar un kit de depleción de albúmina /
IgG para identificar proteínas cuya concentración es baja.

Hemos encontrado que muchas proteínas no existen como una sola forma, sino como isoformas generadas
probablemente por modificaciones postraduccionales (PTM) de una proteína determinada. Por lo tanto, para cualquier
protocolo proteómico utilizado, uno debe estar bien informado sobre las isoformas de proteínas. En ciertos casos,
también se recomienda que la mezcla compleja purificada de proteínas esté dilapidada. Además, a menudo se
analiza un tejido dado junto con suero u orina. Este tipo de datos complementarios puede o no ser fácilmente
interpretable, pero muchos estudios de investigación clínica muestran que el análisis de ambos tipos de muestras
ofrece la posibilidad de explicar los procesos biológicos vinculados. Además, la selección de una plataforma
proteómica dada debe hacerse de acuerdo con el objetivo del experimento. Por ejemplo, las estrategias proteómicas
de alto rendimiento pueden ser útiles para el descubrimiento de biomarcadores específicamente relacionados con
diversas etapas de la obesidad y la DM2, y pueden ayudar a mejorar los tratamientos actuales y las terapias
innovadoras. Por otro lado, una vez que las proteínas diana se seleccionan por la fase de descubrimiento de la
investigación, el análisis de esas proteínas en la mezcla compleja de muestras biológicas se puede llevar a cabo
mediante un monitoreo de reacción seleccionado (MRR) o múltiples monitoreos de reacción (MRM). La preparación
de muestra de fluidos corporales es un paso tedioso pero crítico para obtener resultados confiables. Por ejemplo, la
orina contiene bajos niveles de proteínas en comparación con la sangre y puede requerirse una gran cantidad de
muestra y / o un procedimiento de concentración para los análisis. El momento de la recolección de la muestra puede
influir en los resultados porque la composición proteica de los fluidos corporales puede ser diferente según las
diferentes etapas del tratamiento para cada paciente. De hecho, planteamos la hipótesis de que el suero de un
paciente que padece DM2 puede contener diferentes patrones de proteínas en los diagnósticos (t0) durante el
tratamiento (t1) y también al final de la terapia (t2). Sin embargo, no hay un mapa de proteínas de referencia para
DM2 ni para la obesidad; por lo tanto, si somos capaces de 'construir' el mapa de referencia del patrón de proteínas
de la obesidad y la DM2 en comparación con los controles sanos, debemos mejorar nuestra comprensión de estas
patologías.

La aplicación clínica de proteómica, aplicada según el espacio (suero, orina, sangre) y el tiempo (diagnósticos,
tratamiento y / o estados curados), puede utilizarse para estudiar la evolución de los pacientes que padecen obesidad
y DM2, para desentrañar los mecanismos implicados en la enfermedad progresión. Al final, esperamos que los
pacientes se beneficien.

En las siguientes secciones, discutimos detalles específicos útiles para llevar a cabo la obesidad y la investigación
proteómica de DM2.

PROBLEMAS ESPECIALES RELACIONADOS CON EL MUESTREO DE TEJIDO / SANGRE: Como se indicó

anteriormente, la integridad y el almacenamiento de la muestra son factores clave para obtener datos eficientes y
reproducibles. En la última década, la cantidad y calidad de las muestras almacenadas son altas debido a la creación
de biobancos, incluidos los procedimientos de recolección de muestras. Esto implica que las muestras se mantienen
intactas, preservando sus características químicas y físicas que en última instancia pueden dar como resultado datos
indicativos de sus funciones y / o roles dentro de la celda. Por lo tanto, diferentes tipos de muestras (sangre, orina,
tejidos) de los pacientes con diferentes patologías están disponibles para el estudio [18, 19] o se pueden recoger y
almacenar adecuadamente en un biobanco de laboratorio individual.

Otro paso importante está relacionado con la estandarización de los protocolos para la adquisición de datos de
diferentes biobancos, de modo que se puedan comparar diferentes estados de enfermedad y / o cambios a lo largo
del tiempo. Si uno de los objetivos principales es establecer un repositorio a largo plazo de muestras biológicas /
clínicas y hacer que estas muestras estén disponibles para múltiples estudios científicos, entonces se deben usar
protocolos específicos. Por ejemplo, si tenemos un interés particular en la diabetes, las muestras de ayuno deben ser
recolectadas y almacenadas. Además, se deben registrar los datos fenotípicos de un paciente, incluida la edad, el
sexo, el peso, el IMC, la glucosa en ayunas y otros parámetros clínicamente importantes. Estos datos deben
obtenerse en diagnósticos y en diferentes estados a lo largo de la enfermedad. Los protocolos para almacenar
muestras clínicas deberían proporcionar información clara sobre cómo y cuándo se recolectaron, procesaron y
organizaron las muestras para garantizar su integridad a largo plazo para el estudio de una enfermedad determinada.

MUESTRAS DE SUERO: Una de las principales dificultades para estudiar el proteoma sérico es que dos grupos
principales de proteínas séricas, albúmina e inmunoglobulinas, comprenden aproximadamente el 95% del total,
mientras que el 5% restante pertenece a una variedad de otros tipos de proteínas, incluidas citoquinas, hormonas y
enzimas. y proteínas citoplásmicas y nucleares. Esas proteínas altamente abundantes pueden generar antecedentes
sustanciales en cualquier análisis proteómico y pueden enmascarar los cambios significativos en las proteínas de
interés. La albúmina y la IgG pueden eliminarse del suero mediante cromatografía de afinidad para refinar la
identificación de biomarcadores (proteínas de baja expresión) para una patología determinada. Sin embargo, dado
que la albúmina interactúa con muchos componentes sanguíneos, es posible que, al eliminar la albúmina, uno pueda
eliminar inadvertidamente proteínas importantes que son importantes para una patología determinada, en este caso
DM2.

Los lípidos contenidos en el suero pueden tener un papel importante en patologías específicas, como hiperlipidemia,
enfermedades cardiovasculares, etc., ya que pueden interactuar con las proteínas séricas. En algunos casos, es
necesario eliminar estos lípidos para identificar las proteínas requeridas. La fraccionación del suero mediante
centrifugación permite separar luego quilomicrones, lipoproteínas de muy baja densidad (como las VLDLP) de la
muestra de proteína total.

Los resultados de los análisis proteómicos que comparan un estado enfermo versus un estado saludable y las
diferentes etapas de la enfermedad pueden finalmente identificar supuestos terapéuticos y / o dianas terapéuticas, así
como biomarcadores diagnósticos. Se ha sugerido que la concentración de proteínas específicas en el suero puede
ser útil para la detección temprana de resistencia a la insulina y que esto incluso puede ser posible antes de la
aparición de los síntomas. Por lo tanto, la identificación de proteínas séricas expresadas diferencialmente podría ser
potencialmente importante para la prevención y el tratamiento de DM2, incluso en niños obesos.

METODOLOGÍAS PROTEÓMICAS: El avance más significativo en proteómica ha sido el uso de MS para la

identificación de proteínas obtenidas directamente de muestras clínicas o de muestras en las que las proteínas se
separaron previamente mediante electroforesis en gel bidimensional (2DE) o cromatografía. La identificación típica
basada en MS de una proteína utiliza digestión tríptica antes del análisis de EM para mejorar la precisión o las
mediciones de masa. La espectrometría de masas ioniza muestras de proteínas o péptidos y mide sus relaciones de
masa a carga. Dos métodos de ionización empleados a menudo son la desorción / ionización láser asistida por matriz
(MALDI) y la ionización por electrospray (ESI). El analizador de tiempo de vuelo (TOF) se usa a menudo con MALDI.
El analizador TOF acelera los iones en un campo eléctrico y mide el tiempo que tardan en llegar al detector. Si la
carga de la muestra es la misma, la velocidad está inversamente relacionada con sus masas. Los filtros de masa
cuadripolo se usan con ESI. Consiste en cuatro barras de metal paralelas. Al controlar el campo eléctrico dentro de
las cuatro barras mediante un voltaje de radiofrecuencia, solo se pueden seleccionar iones con una determinada
relación de masa a carga y llegar al detector. La trampa de iones cuadripolo funciona de forma similar al filtro
cuadripolar, pero en lugar de atravesar una sola especie de iones, atrapa los iones y los libera secuencialmente.

Tandem MS es una matriz de MS que permite la secuenciación de péptidos. La primera MS aísla un péptido para ser
analizado y la segunda MS fragmenta el péptido por disociación inducida por colisión (CID) por una molécula neutra
tal como nitrógeno. Finalmente, un tercer MS mide la relación masa / carga de los fragmentos resultantes [30]. Se
puede usar una serie de tres cuadrupolos de la misma manera. Como el CID fragmenta un péptido de forma aleatoria
en los enlaces peptídicos, se puede obtener información de la secuencia analizando el espectro de masas resultante.

La espectrometría de masas se puede acoplar a la cromatografía. Para los análisis proteómicos seleccionados, la
cromatografía líquida (LC) se usa a menudo para separar proteínas o péptidos, luego las masas de los péptidos
separados se determinan por MS. Para análisis de LC-MS, solo se necesitan cantidades de microgramos de una
muestra para su caracterización.

La técnica 2DE basada en gel es una herramienta muy útil para la separación de proteínas, donde durante la primera
dimensión las proteínas se separan de acuerdo con su carga neta mediante enfoque isoeléctrico a través de tiras de
gel de gradiente de pH inmovilizado. Posteriormente, durante la segunda dimensión, las proteínas de las tiras de gel
se resuelven de acuerdo con su peso molecular usando SDS-PAGE. 2DE puede ser muy útil ya que las isoformas
proteicas modificadas postraduccionalmente se revelan típicamente. Estas isoformas de proteínas no se resuelven
fácilmente con los otros métodos. Un inconveniente de 2DE está relacionado con las variaciones de gel a gel y la
necesidad de una gran cantidad de muestras (generalmente de 300 lg a 1 mg) para el análisis. Además, el límite de
detección de proteínas en 2DE está en el rango de microgramos. A pesar de esto, interesantes estudios 2DE han
resultado en datos importantes relacionados con la DM.

Además, los geles 2DE se han acoplado a la electroforesis diferencial en gel (DIGE). En 2DE-DIGE, las muestras de
proteínas se marcan con tintes fluorescentes y luego se separan mediante 2D-PAGE. Las diferentes muestras
biológicas se marcan con diferentes colorantes fluorescentes, se mezclan y se separan en el mismo gel. Los geles se
escanean con láser y las imágenes de geles 2D-PAGE para muestras múltiples se obtienen del gel individual. 2D-
DIGE supera las variaciones de gel a gel y permite la comparación de múltiples muestras directamente. Aunque
2DEDIGE es una estrategia más refinada que 2DE, el límite de detección permanece en 0.5 lg.

A diferencia de 2DE, la LC-MS es una herramienta libre de gel en la que las proteínas digeridas o los péptidos
trípticos se pueden separar de acuerdo con sus propiedades físicas y químicas (es decir, hidrofobicidad, cargas y
pH). LC-MS tiene una sensibilidad más alta que los geles 2DE, lo que permite la detección de proteínas presentes en
niveles bajos y, al mismo tiempo, proteínas altamente expresadas. Sin embargo, las proteínas de alta abundancia
como algunas proteínas séricas (albúmina) deben agotarse para refinar los datos resultantes.

La cromatografía de intercambio iónico es una metodología popular que permite la purificación de proteínas y otras
moléculas cargadas. En la cromatografía de intercambio catiónico fuerte (SCX), las moléculas cargadas
positivamente son atraídas por un soporte sólido cargado negativamente. Por el contrario, en la cromatografía de
intercambio aniónico fuerte (SAX), las moléculas cargadas negativamente son atraídas por un soporte sólido con
carga positiva. La cromatografía de intercambio iónico consiste en una metodología para separar moléculas en
función de las diferencias relacionadas con sus cargas superficiales accesibles. Esta técnica se aplica extensamente
en el pre-fraccionamiento y / o purificación de proteína (s) diana de muestras biológicas crudas. Implica la adsorción
reversible de moléculas cargadas a grupos de iones inmovilizados en una matriz de carga opuesta, por lo tanto, las
interacciones entre las moléculas y los sitios activos en el soporte de la membrana se producen de forma convectiva
a través de los poros. Una vez que se carga la muestra y se alcanza el equilibrio, las moléculas alcanzan el paso de
adsorción debido a la carga apropiada y desplazan a los contraiones. Finalmente, se unen reversiblemente a la
matriz. Generalmente, los materiales no enlazados pasarán por la columna con el volumen vacío. En la tercera etapa,
mediante el aumento de la fuerza iónica del tampón de elución, las sustancias se eliminan de la columna. Además,
las altas tasas de recuperación de proteínas con actividad biológica intacta se producen por las condiciones de unión
y elución relativamente suaves de este método de separación. Además, SCX y SAX se pueden acoplar fácilmente a
MS.

ANÁLISIS DE FOSFORILACIÓN DE PROTEÍNAS: Es muy importante analizar las proteínas fosforiladas en la

investigación clínica, ya que pueden implicar nuevos objetivos para las innovaciones de medicamentos / terapia. Lo
detallaremos de manera simple a través de las herramientas más útiles actualmente.

Elución secuencial de (IMAC) seguido de TiO2:

La cromatografía de afinidad de metal inmovilizado (IMAC) y el dióxido de titanio (TiO2) son perlas de metal que se
pueden empaquetar para construir puntas de cromatografía de afinidad metálica manual para aislar principalmente
multifosfopéptidos a través de IMAC y monofosfopéptidos a través de TiO2. Por lo tanto, esta herramienta es útil para
el aislamiento de proteínas / péptidos mono y multiposforilados a partir de un complejo biológico-analito en un único
experimento. El principio básico se basa en el hecho de que los metales contenidos en IMAC y TiO2 llevan cargas
positivas y unen los fosfopéptidos cargados negativamente. TiO2, IMAC y ZrO2 son todos útiles para fosfo-
enriquecimientos, pero Thingholm et al. [37] demostraron un mayor rendimiento de SIMAC al purificar mono y multi-
phosphopeptides en un solo experimento; por lo tanto, recomendamos SIMAC ya que funciona bien para muestras
clínicas. Las técnicas más comunes para el enriquecimiento de la fosforilación individual y / o global son IMAC y TiO2
[38], que se basan en la alta afinidad de los iones metálicos cargados positivamente. Sin embargo, la conversión de
grupos carboxilato en ésteres elimina eficazmente la retención no específica de péptidos no fosforilados, aunque esto
constituye un inconveniente debido a la mayor complejidad en el posterior análisis de MS.

Durante los últimos 10 años, el TiO2 se ha convertido en el más común de los métodos de enriquecimiento de
fosfopéptidos basados en la cromatografía de afinidad de óxido de metal. Esta técnica ofrece una mayor capacidad
en comparación con las resinas IMAC para unir y eluir péptidos mono-fosforilados. TiO2 explota el mismo principio
que IMAC, y es similarmente propenso a la retención no específica de péptidos ácidos no fosforilados. Sin embargo,
cuando se cargan péptidos en ácido 2,5-dihidroxibenzoico [39], ácido gálcico y ácido ftálico, se reduce la unión no
específica a TiO2, mejorando así el enriquecimiento de fosfopéptido sin una modificación química de la muestra. El
TiO2 a menudo se considera intercambiable con IMAC. Funciona en niveles similares de cantidad de muestra (por
ejemplo, microgramos de proteína) para la identificación de fosforilaciones por análisis de MS. Recientemente,
SIMAC [39-41] apareció como una herramienta de enriquecimiento de fosfopéptidos que explota las propiedades de
IMAC acopladas a TiO2, lo que hace posible llevar a cabo estudios más refinados.

Otro procedimiento de enriquecimiento de fosfopéptidos antes del análisis de MS es ZrO2 y su principio se basa en la
cromatografía de afinidad de metales como IMAC y TiO2. ZrO2 permite el aislamiento de péptidos fosforilados
individuales de una manera más selectiva que TiO2. De hecho, se ha utilizado con éxito en la caracterización a gran
escala de fosfoproteínas [43-46]. Además, las estrategias que consisten en fraccionar y posteriormente enriquecer
fosfopéptidos se basan en una fuerte cromatografía de intercambio catiónico / aniónico (SCX y SAX) y cromatografía
de interacción HILIC. La precipitación de fosfato de calcio también es una etapa de pre-fraccionamiento útil para
simplificar y enriquecer fosfopéptidos a partir de muestras complejas que se pueden acoplar a IMAC.

Etiqueta isobárica para cuantificación relativa y absoluta:

Esta técnica permite la cuantificación relativa y absoluta de 2 a 8 muestras complejas al mismo tiempo. Utiliza un
reactivo de marcado químico isobárico multiplexado. Esta etiqueta permite la multiplexación de 2 a 8 muestras de
proteínas complejas y produce iones de secuenciación MS / MS idénticos para las 8 versiones del mismo péptido
tríptico derivado. La cuantificación y los análisis se realizan comparando las áreas de los picos y las relaciones de los
picos en el modo MS / MS. Los iones indicadores utilizados son de 114 a 117 Da y de 113 a 119 y 121 Da. Para llevar
a cabo estudios de nivel de expresión de proteínas, puede ser una buena opción aplicar etiquetas isobáricas para la
cuantificación relativa y absoluta (iTRAQ), aunque el etiquetado de isótopos estables por aminoácidos en cultivo
celular (SILAC, cuando se usan líneas celulares) y / o MRM o SRM también se puede emplear con éxito (ver a
continuación).

SILAC es otro enfoque para la incorporación in vivo de un marcador en proteínas para el posterior análisis cuantitativo
de MS. El paso de identificación se lleva a cabo actualmente en modo MS / MS. Su principio se basa en la
incorporación metabólica de una determinada forma "ligera" o "pesada" del aminoácido en las proteínas. Los
aminoácidos se incorporan a través de formas isotópicas estables sustituidas tales como deuterio, 13C y 15N.
Básicamente, durante los experimentos SILAC, se cultivan dos poblaciones celulares en un medio de cultivo que es
idéntico, excepto que uno contiene la etiqueta "ligera" y la segunda etiqueta "pesada". Estas etiquetas permiten la
comparación de dos condiciones fisiológicas (por ejemplo, sana versus enferma). Se distinguen dos condiciones a
través del aminoácido análogo marcado que se añadió a los medios de cultivo. Las proteínas recién sintetizadas
dentro de las células tienen las mismas propiedades físicas y químicas a excepción de las diferencias de masa como
resultado del isótopo.

Monitoreo de reacción seleccionado o monitoreo de reacción múltiple:

Esta es una herramienta cuantitativa proteómica basada en MS / MS. Cuando se usa ESI, primero, se selecciona y se
aísla un precursor peptídico para obtener una población de iones que represente "el precursor". A continuación, la
población de iones se fragmenta para producir iones de producto o "iones secundarios". La intensidad de señal de los
iones fragmentados representa la abundancia de péptidos y / o proteínas para una muestra dada. De hecho, este
método permite datos cuantitativos absolutos. El monitoreo de reacción seleccionado o MRM se lleva a cabo en
espectrómetros de masas específicos llamados 'cuadrupolo de tripa' y 'trampas de iones'. La sensibilidad y
especificidad de tal estrategia es extremadamente alta. En los ensayos de SRM, se usan dos analizadores de masas
como filtros de masa estáticos para controlar un ion de fragmento particular de un ion precursor seleccionado. La
selectividad resultante de las dos etapas de filtrado acopladas a los datos del ciclo de alto rendimiento en los ensayos
cuantitativos permite una sensibilidad extremadamente alta [51-60] (la Fig. 1 muestra un esquema simple de SRM /
MRM útil para la investigación metabólica).

Cuantificación sin etiquetas:

Este es un método basado en MS que permite la determinación de la cantidad relativa de proteína de 2 o más
muestras complejas [61]. La cuantificación de Labelfree no usa un compuesto que contiene isótopos estables para
unirse químicamente a las proteínas. En un análisis proteómico cuantitativo libre de etiquetas, las mezclas de
proteínas se analizan directamente y las muestras se comparan entre sí después de análisis independientes. Como
resultado, no hay mezcla de muestras, por lo que se puede lograr una mayor cobertura del proteoma y no hay límite
para la cantidad de experimentos que se pueden comparar [62]. Además, los enfoques sin marca pueden dividirse en
dos grupos principales por la forma en que se mide la abundancia de un péptido. El primer grupo comprende métodos
que se basan en el recuento de iones y comparan la abundancia máxima o el volumen de recuento de iones para
picos de péptido a tiempos de retención específicos entre diferentes muestras. Dado que los péptidos ionizados
eluyen de una columna de fase inversa en el espectrómetro de masas, sus intensidades de iones pueden medirse
dentro de los límites de detección dados de la configuración experimental (la Figura 2 muestra de manera simple el
esquema de Libre de Etiqueta útil para investigación metabólica) .

Ionización por electropulverización y espectrometría de masas en tándem MS-n (Nano-ESI-MSn):

Tandem MS [69], ESI junto con CID y MS / MS representa potencialmente uno de los métodos más sensibles,
discriminantes y directos para el análisis cualitativo y cuantitativo de alto rendimiento de cantidades de proteína
subpicomole. Nano-ESI-MS / MS permite la identificación de proteínas / péptidos (y fosfo-proteínas / péptidos)
previamente etiquetados y aislados provenientes de muestras complejas (es decir, sangre y / o CSF) y,
posteriormente, análisis de datos cuantificados (de la etiqueta iTRAQ ) y los residuos modificados (del SIMAC de
aislamiento) deben realizarse a través de, por ejemplo, la búsqueda de Matrix-Science Mascot
(http://www.matrixscience.com/cgi/search_form.pl?FORMVER=2&SEARCH=MIS).

A través de las herramientas mencionadas anteriormente, podemos lograr: (i) identificación (ID) de biomarcadores
candidatos a proteínas, (ii) analizar cómo las redes de señalización intracelular se activan / desactivan a través de la
fosforilación durante la progresión de la enfermedad y (iii) determinar qué proteínas y fosfoproteínas u otras PTM
están reguladas hacia arriba o hacia abajo en varios estados clínicos (saludables o enfermos). Los datos resultantes
son específicos para un tiempo y / o estado de enfermedad (es decir, después del diagnóstico, durante el tratamiento)
de un paciente específico y de acuerdo con cada tipo diferente de muestra (sangre, suero, orina) ya que el proteoma
es dinámico (espacio y tiempo). Finalmente, los biomarcadores de proteínas identificados resultantes se pueden
validar mediante ELISA y / o Western Blot y a través de SRM / MRM suponiendo que hay un anticuerpo disponible
para una proteína determinada [70-72]. En resumen, para obtener datos de biomarcadores confiables y reproducibles,
siempre es necesario estandarizar los protocolos para la recolección, manejo, almacenamiento y procesamiento de
muestras para análisis proteómicos posteriores utilizando cualquiera de los procedimientos descritos anteriormente.
Estas herramientas permiten el análisis de cientos de proteínas en un momento dado en un tamaño de muestra muy
pequeño con alta sensibilidad. La principal diferencia entre estas técnicas actuales está relacionada con la
sensibilidad, el nivel de detección del método seleccionado.

IDENTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS: Mascot Server (http://www.matrixscience.com/) se usa comúnmente para la

identificación, caracterización y cuantificación de las proteínas resultantes después de que se han recogido los
resultados de MS. Permite búsquedas gratuitas y contiene bases de datos de secuencias de proteínas en línea de
todos los organismos analizados hasta la fecha. A través de Mascot también es posible validar los biomarcadores de
proteína identificados del estudio clínico de investigación proteómica a través de la inspección manual de todos los
espectros. Los mejores diarios proteómicos requieren la validación manual de los espectros para garantizar la alta
calidad de los datos. El nuevo y eficiente software bioinformático aparece de forma rutinaria en el mercado para llevar
a cabo estadísticas y validación, especialmente para análisis de alto rendimiento; por lo tanto, el paso de validación
se puede desarrollar de manera más eficiente. Las herramientas bioinformáticas interesantes y útiles para la
investigación proteómica están bien establecidas en otras revisiones.

Por lo tanto, es obvio que la metodología disponible para realizar estudios de proteómica y fosfoproteómicos ha
avanzado dramáticamente en los últimos años, para mejorar nuestra comprensión de las redes de señalización
intracelular. Estos avances metodológicos ahora están empezando a aplicarse a los estudios de DM2 y la
identificación de nuevos biomarcadores. La Figura 3 muestra, de una manera simple, el flujo de trabajo básico útil
para la investigación metabólica (Fig. 3). A continuación, repasaremos brevemente algunos de los estudios más
relevantes en diabetes utilizando enfoques proteómicos.

ESTUDIOS ACTUALES Y RELEVANTES DE DM Y OBESIDAD USANDO ENFOQUES PROTEÓMICOS: Yang et al.

Llevaron a cabo 2DE de muestras dializadas peritoneales. Pudieron visualizar más de 300 puntos de proteína, de los
cuales se seleccionaron 13 puntos de proteína para ser extirpados y las proteínas correspondientes fueron digeridas
y analizadas por nano-ultra performance de fase inversa LC-ESI-MS / MS. Los datos resultantes confirmaron 10
manchas / proteínas con expresión diferencial significativa entre las muestras de DI y glomerulonefritis crónica en
diálisis peritoneal. Estos autores afirman que las proteínas expresadas diferencialmente identificadas en su estudio
pueden no ser nuevos biomarcadores. Sin embargo, también indican posibles objetivos para el tratamiento
farmacológico y los perfiles de proteínas que podrían ser predictores de peritonitis, lo que indica la necesidad de
estudios de validación en el futuro. Una posible manera de validar los resultantes de proteína-biomarcadores
identificados a partir de la obesidad y las muestras DM2 durante los estudios de investigación proteómica clínicos es
a través de: (i) ELISA y / o transferencia de western (utilizando anticuerpos específicos (ABS) para el biomarkers-
potencial identificado) y (ii ) a través de SRM / MRM [4]. La monitorización de reacción seleccionada o MRM es un
método de MS / MS que permite monitorizar péptidos diana dentro de una mezcla compleja de péptidos trípticos. Por
ejemplo, las proteínas A1 y B2 se descubren como biomarcadores de DM2 en el momento del diagnóstico en
pacientes obesos, mientras que las proteínas C3 y D4 son biomarcadores de DM2 durante el tratamiento con
complicaciones y las proteínas E5, E6 y E7 son indicadores de buen pronóstico. Estos biomarcadores candidatos se
pueden controlar de forma rutinaria en cada paciente para obtener más información sobre cómo mejorar el
tratamiento, el régimen y su pronóstico.
En 2009 Kim et al. [83] llevaron a cabo el análisis proteómico en ratones ob / ob, que carecen de leptina, antes y
después de los tratamientos con polisacáridos hipoglucemiantes. Su objetivo era identificar biomarcadores de
pronóstico de DM2 usando electroforesis en gel de 2DE (2-DE). Específicamente, estos autores estudiaron la
influencia de los polisacáridos extracelulares hipoglucémicos (EPS) procedentes del macrofungus Tremella fuciformis
en los niveles diferenciales de proteínas plasmáticas en ratones ob / ob a través de 2-DE. Pudieron visualizar 900
puntos de los cuales 92 fueron regulados diferencialmente en ratones ob / ob. De estos 92 puntos, 40 fueron
identificados como proteínas relevantes asociadas a la diabetes. Además, pudieron corroborar que el alto nivel sérico
de ferritina, que actúa como antioxidante al unirse al exceso de hierro, es un factor de riesgo para la futura DM2, y
que la adiponectina juega un papel importante en el síndrome metabólico y la inflamación, como los bajos niveles
séricos de adiponectina son un elemento de riesgo para DM2. También demostraron que Apo A-I, IV, C-III, E,
proteína de unión a retinol 4 y proteínas de transferrina se modificaron significativamente en ratones ob / ob, y sus
niveles se normalizaron después del tratamiento con EPS. A través de Western Blot, observaron que mientras la
resistina está regulada positivamente, la adiponectina se regula por disminución en la diabetes y la obesidad y esto se
normalizó con EPS. Además, para complementar los datos proteómicos resultantes, Kim et al. [83] investigaron los
patrones de expresión genética diferencial en diferentes tejidos, como el hígado, el tejido adiposo y el músculo de
ratones ob / ob en respuesta al tratamiento con EPS, mediante el uso de matrices de PCR. Los datos resultantes
demostraron que el nivel de expresión de muchos genes relacionados con el inicio, el desarrollo y la progresión de la
diabetes estaba significativamente regulado por EPS, lo que sugiere que EPS podría actuar como un potente
regulador de la expresión génica para una amplia variedad de genes en ob / ratones ob, particularmente en obesidad,
resistencia a la insulina y complicaciones de la diabetes mellitus [83]. Por lo tanto, Kim et al. [83] unió exitosamente
diferentes herramientas de OMIC para mejorar y corroborar los datos resultantes.

Es bien sabido que la obesidad y el envejecimiento afectan el metabolismo de los adipocitos y la distribución de la
grasa en los depósitos subcutáneos y viscerales. Además, el aumento de peso y el envejecimiento pueden conducir a
resultados clínicos similares, como, por ejemplo, resistencia a la insulina, enfermedad cardiovascular y aterosclerosis.
Alfadda et al. [84] estudiaron el nivel de expresión de las proteínas en pacientes obesos en relación con sus tejidos
adiposos subcutáneos y la edad. A través de 2DE-DIGE acoplado a MALDI-TOF estos autores fueron capaces de
identificar 9 proteínas altamente expresadas y 4 proteínas de menor expresión en adipocitos de pacientes ancianos
en comparación con pacientes obesos jóvenes. Algunas de las proteínas más altamente expresadas incluyen: (A1)
prohibitina 1, (A2) proteína disulfuro isomerasa A3, (A3) beta actina, (A4) profilina, (A5) aldo-cetoreductasa 1 C2, (A6)
alfacristalina B y (A7) las annexins A1, A5 y A6. Las 4 proteínas menos abundantes son: (B1) queratina tipo 2
citoesquelético 1, (B2) queratina tipo 2 citoesquelético 10 y (B3) hemoglobinas A y B. Estas están implicadas en la
regulación de la apoptosis, senescencia celular y respuestas inflamatorias, todas las cuales son eventos patológicos
comunes en la obesidad y el envejecimiento. Además, el transductor de señal y el activador de transcripción (STAT) 3
se identificó como la molécula central en el mapa de conectividad y la vía apoptótica como la ruta con el puntaje de
mascota más alto: (Mascot es un motor de búsqueda que utiliza datos de MS para identificar proteínas de bases de
datos de secuencias primarias, ya que la mezcla de péptidos de digestión resultante se analiza mediante la secuencia
de MS como se describió anteriormente) (http://www.matrixscience.com/search_form_select.html). Las diferencias en
las abundancias de prohibitina 1, disulfuro de proteína isomerise A3, beta actina, profilina y proteínas STAT3 se
validaron mediante inmunotransferencia. Los datos resultantes de los estudios de Alfadda et al. demostraron que las
proteínas identificadas como expresadas diferencialmente en pacientes obesos de edad versus pacientes obesos
jóvenes sugieren un aumento en la resistencia a la apoptosis como un mecanismo de defensa contra un estado de
inflamación crónica de bajo grado. También afirman que sus datos proporcionan pistas para desentrañar los
mecanismos bioquímicos que sustentan la obesidad y el envejecimiento relacionado con la obesidad [84].

Recientemente, muchos investigadores han comenzado a utilizar herramientas cuantitativas basadas en MS (es
decir, iTRAQ) en lugar de 2DE o 2DE-DIGE. La principal ventaja es que la cuantificación basada en MS permite
mediciones mediante la adición de etiquetas de isótopos; por lo tanto, se pueden cuantificar más proteínas, incluidas
las proteínas de baja expresión. La espectrometría de masas-los estudios cuantitativos que usan iTRAQ en DM2
representan una buena posibilidad para enfrentar el reto de mejorar los datos recopilados hasta la fecha, ya que
pertenece a una estrategia proteómica muy refinada.

Un ejemplo relevante es el estudio de Cai et al. [85] quien analizó cardiomiopatía y DM2 con el enfoque proteómico
iTRAQ. La miocardiopatía diabética que acompaña a la DMT2 es un trastorno complicado causado por una patología
multifactorial que incluye un metabolismo alterado de la energía cardíaca y un aumento del estrés oxidativo. La
obesidad se asocia con altos niveles de ácidos grasos circulantes, lo que puede dar como resultado un aumento de la
absorción de ácidos grasos y la acumulación de TG en el miocardio. Además, el aumento del daño por oxígeno y la
generación de especies reactivas de oxígeno (ROS) aumentan el daño cardíaco. Por lo tanto, la normalización del
metabolismo de la energía cardíaca y la reducción del estrés oxidativo pueden ser factores importantes en el
tratamiento de la miocardiopatía diabética. Se ha informado que Phlorizin tiene un efecto antidiabético debido a sus
propiedades antioxidantes. Aunque la florizina es un antioxidante utilizado en el tratamiento de la DM, sus efectos
cardioprotectores en la miocardiopatía diabética no están bien establecidos. A través de la proteómica de alto
rendimiento de iTRAQ Cai et al. estudiaron la función de la florizina en la prevención de la miocardiopatía diabética en
ratones db / db, que son obesos y diabéticos debido a un defecto en el receptor de la leptina. Acoplaron LC-MS / MS
a iTRAQ para identificar y caracterizar los perfiles de proteínas de ratones db / db tratados y tratados con florizina. Se
preparó tejido cardíaco de ratones tratados y no tratados para el análisis de iTRAQ para obtener el patrón de perfil de
proteína del efecto de la florizina sobre las proteínas del miocardio. Un total de 1627 proteínas fueron identificadas.
De las 113 proteínas expresadas diferencialmente, 29 se elevaron en el grupo db / db en comparación con el grupo
control, pero disminuyeron con el tratamiento con florizina. Se redujeron 84 proteínas adicionales en los ratones db /
db en comparación con el grupo control. Los autores seleccionaron 2 proteínas (calnexina y proteína quinasa unida a
integrina) para el análisis de Western Blot para validar los datos de iTRAQ. Calnexin se encontró que disminuyó,
mientras que la proteína quinasa unida a integrina se incrementó en el grupo de DM tratado con florizina en
comparación con el grupo de DM. La cuantificación de la intensidad de la banda mostró que los resultados eran
consistentes con los datos de iTRAQ.

Cai et al. [85] fueron capaces de identificar miles de proteínas de las cuales el 12-15% se expresaron
diferencialmente. Estas proteínas están involucradas en el metabolismo lipídico cardíaco, la función mitocondrial y la
miocardiopatía. Los datos resultantes sugieren que la florizina puede prevenir el desarrollo de la miocardiopatía
diabética mediante la regulación de la expresión de proteínas clave en estos procesos. También demostraron que la
flororina reduce significativamente la ganancia de peso corporal y los niveles circulantes de glucosa, triglicéridos,
colesterol total y productos finales glicosilados. Sus hallazgos sugieren que la estructura normal del miocardio se
conserva mejor después del tratamiento con florizina y que este fármaco puede ser un protocolo terapéutico
novedoso para el tratamiento de la miocardiopatía diabética, con los datos proteómicos que ayudan a identificar el
posible mecanismo.

Los adipocitos desempeñan un papel central en el metabolismo energético y en la epidemia de obesidad. Por lo tanto,
determinar la composición proteica de los adipocitos debería ayudar a desentrañar importantes cuestiones biológicas.
En tal esfuerzo, Mann et al. [86] estudiaron el adipocito-proteoma mediante proteómica más espectrometría de masas
y herramientas bioinformáticas. Primero llevaron a cabo el fraccionamiento subcelular de la línea celular de
preadipocitos de ratón 3T3-L1 con y sin tratamiento de insulina, en citosol, membrana, mitocondrias y fracciones
nucleares. Utilizaron geles de SDS-PAGE a partir de los cuales se digirieron las bandas de proteína y los péptidos
resultantes se identificaron mediante LC-MS / MS / MS (LTQ-FT). Pudieron identificar 3287 proteínas que forman
parte del proteoma de los adipocitos. Además, cada fracción se analizó mediante transferencia Western y utilizando
anticuerpos específicos para cada fracción. Además, validaron todos los datos resultantes mediante bioinformática,
obteniendo uno de los proteomas de mayor confianza reportados. El adipocito-proteoma está disponible en la base de
datos del Proteoma Unificado Max-Planck [86]. Este artículo contiene información muy útil para desentrañar la
complejidad de los adipocitos en la obesidad y otras patologías [86].

Otro ejemplo del grupo de Mann et al. [87] se relaciona con desentrañar la vía de señalización intracelular inducida
por insulina a través de la fosfoproteómica. Es bien sabido que la vía de señalización de la insulina es muy importante
en las enfermedades metabólicas y los procesos celulares del envejecimiento. El receptor de insulina y sus sustratos
son fundamentales en la red de señalización de insulina, con la unión de insulina a su receptor para desencadenar
cascadas de fosforilación de tirosina que posteriormente activan otras redes en cascada conectadas. Comprender la
activación de las redes de señalización conectadas es la clave para desentrañar diversos procesos biológicos
relacionados con la DM y la obesidad. Para comenzar a entender la red de la cascada de fosforilación de tirosina,
Mann et al. identificaron el tirosina-fosfoproteoma de la vía de señalización de insulina aplicando MS acoplada a la
inmunoprecipitación de fosfotirosina y SILAC en adipocitos marrones diferenciados. También cuantificaron la
dinámica temporal de los eventos de fosforilación de la tirosina sobre la estimulación de la insulina en adipocitos
marrones diferenciados. Los autores aplicaron herramientas proteómicas cuantitativas basadas en MS de alta
resolución (SILAC e inmunoprecipitación anti-pY) para identificar y cuantificar 40 efectores proteicos de la vía de la
insulina en adipocitos marrones diferenciados. Para conocer la dinámica temporal de la fosforilación de proteínas en
la tirosina, los autores aplicaron una etiqueta triple de SILAC con tres poblaciones de células marcadas
diferencialmente que se estimularon para diferentes tiempos. Los datos fueron corroborados por Western Blot. De los
40 efectores de insulina identificados, 7 (SDR, proteína de unión PKC, LRP-6 y PISP / PDZK11, una posible proteína
de unión a ATPasa de calcio) se describieron por primera vez para participar en la señalización de la insulina.
Además, Mann et al. indican que este enfoque es capaz de detectar el pY específico que contiene proteínas /
péptidos y cuantifican el nivel de su fosforilación según diferentes condiciones de estrés y estímulos sobre la red de
insulina [87].

Walker et al. [88] sugirieron recientemente que en la obesidad, las "redes" de vías de señalización metabólica están
relacionadas con el estado de la vitamina D y que la regulación de la adiponectina con vitamina D implica eventos
postraduccionales. Acoplaron 2DE-gels más MS para identificar moléculas relevantes en niños obesos dicotomizados
según los niveles de 25OH vitamina D (25OHD). Se analizó el plasma libre de plaquetas de 42 niños obesos (M / F =
18/24) clasificados según sus niveles de 25OHD3 (<15 ng / ml = deficiente y> 30 ng / ml = no deficiente). El análisis
de la imagen (ChemiDoc Imager y PD Quest -software para analizar los datos proteómicos resultantes-) fue capaz de
identificar las manchas proteicas de 2DE-Sypro-geles que se expresaron diferencialmente de acuerdo con cada
"volumen" puntual individual a través de la densidad / área que integra Sypro -Teñido de rubíes según el modelo
gaussiano. Sus datos mostraron 53 manchas de proteína expresadas diferencialmente, de las cuales el 51% se
regularon negativamente (comparando la deficiencia de VD y ninguna deficiencia de VD). Un biomarcador identificado
interesante es la forma HMW de adiponectina, que se observó que estaba regulada negativamente en pacientes
pediátricos obesos con deficiencia de vitamina D. Además, los biomarcadores identificados pueden modularse in vivo
con suplementos de vitamina D. Este enfoque proteómico representa una estrategia muy interesante para diferenciar
fenotipos de enfermedades y también para estudiar objetivos de terapia específicos.

Un factor importante que contribuye a la obesidad y sus comorbilidades asociadas es un estilo de vida sedentario,
además de la ingesta excesiva de alimentos. Abu-Farha et al. [89] publicó recientemente un interesante estudio que
aplica análisis proteómicos de alto rendimiento de células mononucleares de sangre periférica (PBMC). Las muestras
de PBMC se purificaron de machos humanos delgados y obesos para identificar y cuantificar proteínas expresadas
diferencialmente entre ambos grupos. En este estudio se analizaron los mecanismos subyacentes a la progresión de
la obesidad y la posibilidad de controlar esta progresión con ejercicios físicos. Usando SCX más MS / MS, se
identificaron 47 proteínas expresadas diferencialmente entre pacientes delgados y obesos [89]. La trombospondina 1
(TSP1) se regulaba positivamente mientras que la histona desacetilasa 4 (HDAC4) se regulaba negativamente y
después de 3 meses de ejercicios físicos, TSP1 y HDAC4 volvían a los niveles de control.

Se informa que los ácidos grasos poliinsaturados Omega-3 (AGPI n-3) disminuyen los síntomas de la diabetes, la
obesidad y la resistencia a la insulina relacionada con los trastornos metabólicos. Las proteínas y las vías implicadas
en la regulación de PUFA n-3 son desconocidas, especialmente aquellas que producen efectos beneficiosos para la
salud. Ahmed et al. [90] estudiaron el efecto de las dietas con niveles altos o bajos de PUFA n-3 en el perfil
proteómico hepático en ratones. Aplicaron geles 2DE acoplados a análisis LC-MS / MS más software específico
(ImageScanner III, Progenesis Samespots, versión 3.1). Es importante señalar que se necesitaron 800 g de proteína
total para cargarse en geles 2DE (ahora es posible utilizar otras herramientas proteómicas, mencionadas
anteriormente, para evitar la necesidad de utilizar una cantidad tan grande de muestra). Los puntos de proteína
resultantes visualizados a través de 2DE se digirieron con tripsina y se analizaron mediante MALDI-TOF (MS).
También llevaron a cabo análisis por espectrometría de masas en tándem a través de LC-MS / MS para identificar
puntos de proteína de los geles 2DE. MALDITOF MS es útil para estudiar un número específico o reducido de puntos
de proteína, mientras que cuando se usa LC-MS / MS, se puede identificar más rápidamente un número mayor de
proteínas. Descubrieron que una dieta rica en PUFA n-3 disminuye la expresión de regucalcina, adenosina quinasa y
aldehído deshidrogenasa. Además, las dietas ricas en PUFA n-3 aumentan la expresión de la apolipoproteína AI, S-
adenosilmetionina sintasa, fructosa-1, 6-bisfosfatasa, cetohexinoquinasa, malato deshidrogenasa, succinil CoA
sintasa específica de GTP, ornitina aminotransferasa y proteína disulfuro isomerasa-A3 . Por lo tanto, estos autores
demostraron que los PUFA n-3 producen modificaciones en muchas proteínas relacionadas con la regulación de
lípidos, carbohidratos, el ciclo del ácido cítrico y el metabolismo proteico y promueven la hipótesis de que existe una
red de vías metabólicas afectadas por PUFA n-3 [90 ] (La Tabla 1 muestra ejemplos de estudios de diabetes y
obesidad utilizando herramientas proteómicas: se detallan el tipo de muestra y los objetivos clínicos y proteómicos,
además se mencionan las proteínas / biomarcadores identificados, incluido el enfoque proteómico [91-102]). Martos-
Moreno et al. [103] evaluaron la capacidad del análisis proteómico del suero para detectar las alteraciones
metabólicas en comparación con los ensayos clínicos estándar, y también para identificar posibles nuevos
biomarcadores candidatos de deterioro metabólico en niños muy pequeños obesos. Descubrieron que las isoformas
de la apolipoproteína A1, apo-J / clusterina, proteína de unión a vitamina D y transtirretina se regulaban por
disminución a través de 2DE acoplado a MALDI-TOF (MS, MS / MS) en pacientes obesos jóvenes con algunos
cambios en estas proteínas mejorado por resistencia a la insulina y parcialmente revertido después de la pérdida de
peso.

Curiosamente, observaron que las isoformas de haptoglobina de bajo peso molecular se incrementaron en pacientes
obesos, mejoraron en niños obesos resistentes a la insulina y nuevamente disminuyeron después de la pérdida de
peso, y se correlacionaron positivamente con los niveles séricos de interleuquina-6 y NAMPT / visfatina. La
significación para un posible biomarcador candidato se confirmó estadísticamente para la isoforma de bajo peso
molecular haptoglobina (obeso versus control y resistente a la insulina frente a no resistente a la insulina) y Apo A1
(IR frente a no IR). De hecho, la apolipoproteína A1 y la haptoglobina se validaron a través de ELISA para confirmar
la importancia clínica de los biomarcadores potenciales relacionados con complicaciones metabólicas en niños
obesos jóvenes.

Este estudio de investigación establece la base o subestructura de las utilidades proteómicas para las mejoras
clínicas de la obesidad, para identificar, en un futuro cercano, verdaderos biomarcadores candidatos que puedan
ayudar a mejorar las terapias en el inicio temprano de la obesidad y la resistencia a la insulina en la infancia [104].

List et al. [105] llevaron a cabo un análisis proteómico en la piel de ratones C57BL / 6J con diabetes tipo 2 usando
ratones no diabéticos como controles. Para inducir la obesidad y la diabetes, los autores aplicaron una dieta alta en
grasas a los ratones durante 16 semanas. Aplicaron el software 2DE y PDQuest para el análisis obteniendo alrededor
de 1000 puntos de proteína distintos. De esos 1000 puntos, 6 mostraron una disminución significativa, mientras que
22 se sobreexpresaron en el estado diabético en comparación con los controles. Estos análisis se llevaron a cabo en
un MALDI-TOF en modo MS y MS / MS. List et al., Observaron que alrededor del 60% de las proteínas que estaban
reguladas hacia arriba y hacia abajo, pertenecen al metabolismo energético. La muestra analizada en este estudio fue
la piel diabética, y proporciona la identificación de proteínas de muestras de piel de ratón relacionadas con los
cambios en la obesidad y la diabetes posterior. Además, los autores destacan la relevancia de las biopsias cutáneas
asociadas a ensayos proteómicos como una herramienta muy útil no invasiva para el diagnóstico de hiperinsulinemia
y diabetes.

Kopchick et al. [104] comentó a principios de 2009 sobre el uso de la proteómica en general para análisis de sangre,
orina y tejidos para el descubrimiento de nuevos biomarcadores séricos inducidos por la hormona del crecimiento
(GH). Descubrieron que las isoformas de tranthyretin, clusterin, ApoE y ApoA1 se expresan diferencialmente a través
de MS y MS / MS acopladas a geles 2DE, por lo que estas isoformas pueden ser biomarcadores potenciales para
iniciar estudios usando hormona de crecimiento humana recombinante (rhGH). Además, sugieren que con más
biomarcadores, es posible desarrollar un sistema de prueba robusto, sensible y específico para rhGH usando una
combinación de múltiples marcadores, logrando así nuevos objetivos y mejoras en la terapia.

La detección de rhGH es difícil ya que tiene una vida media corta, por lo tanto, Kopchick et al. [106] indican que se
necesitan biomarcadores nuevos y robustos para detectar el abuso de rhGH. A través de 2DE y MS, se observó que
aumentaban isoformas específicas de alfa-1 antitripsina y transtirretina; mientras que el inhibidor de la alfa-tripsina, la
cadena pesada H4, la apolipoproteína A-1 y la cadena beta de la hemoglobina se observaron disminuidas. Los datos
resultantes muestran que la administración de rhGH a dosis altas redujo significativamente las concentraciones
totales de proteína sérica y las isoformas específicas reguladas hacia arriba o hacia abajo de cinco proteínas séricas.
Estas isoformas de proteínas pueden servir como biomarcadores potenciales del tratamiento con rhGH, incluso
cuando se usa y maltrata la rhGH. Para este estudio, se analizaron muestras de suero derivadas de los pacientes
tratados con rhGH en un diseño aleatorizado, doble ciego, controlado con placebo. Además, el significado biológico
resultante de los datos de EM se validó mediante ensayos de transferencia Western. La Tabla 1 resume ejemplos
útiles de investigación metabólica llevados a cabo a través de diferentes estrategias proteómicas (Tabla 1).

Es obvio que el actual programa internacional de secuenciación del proteoma humano (http://www.thehpp.org/human
proteome project HUPO) tendrá un impacto importante en el diagnóstico de enfermedades y la innovación de las
terapias [107-109]. Se ha predicho que el proteoma humano completo se secuenciará completamente en menos de 2-
3 años; por lo tanto, varias enfermedades crónicas, como la diabetes, la obesidad y / o el envejecimiento, se
beneficiarán de la investigación de la proteómica [110]. Por lo tanto, estará disponible el mapa de referencia del
proteoma humano útil para muchas patologías, facilitando el uso de controles adecuados para cada estudio clínico,
ya que es muy importante elegir pacientes adecuados y buenos controles para la verificación independiente,
especialmente cuando se busca proteína real biomarcadores para mejoras en diagnósticos y terapias.

Observaciones finales

Los mecanismos moleculares subyacentes a la obesidad y su progresión a DM2 no son completamente conocidos.
La proteómica y otras herramientas OMIC están ayudando a avanzar en nuestra comprensión del origen, inicio,
desarrollo, prevención y tratamiento de enfermedades complejas, incluida la obesidad y la DM2. Además, dado que
las tecnologías proteómicas basadas en MS son cada vez más sensibles y específicas, el empleo de estas
herramientas es una oportunidad importante para aumentar nuestro conocimiento de la DM2 y la obesidad e
identificar nuevos objetivos para el diagnóstico y el tratamiento.

La cromatografía líquida-espectrometría de masas da como resultado una mayor precisión en comparación con geles
2DE, especialmente debido al hecho de que LC-MS permite la identificación de proteínas de baja expresión (buenos
biomarcadores candidatos a proteínas). Por lo tanto, aunque se ha logrado información importante a través de 2DE
(especialmente con respecto a estudios de isoformas),

Se pueden alcanzar conceptos al analizar muestras clínicas a través de enfoques proteómicos que aplican
directamente LC-MS evitando 2DE.

Las nuevas posibilidades de estrategias proteómicas, que incluyen SIMAC, iTRAQ, sin etiquetas y nano-ESI-LC-MSn,
podrían resultar en la identificación de nuevos biomarcadores fosforilados en las redes de señalización intracelular
involucradas en la DM y la obesidad. Se debe enfatizar una vez más que la preparación correcta de muestras clínicas
es un requisito previo esencial y esto debe estandarizarse en biobancos.

Para finalizar, los avances en los enfoques proteómicos y la secuencia completa del proteoma humano, nos
permitirán desentrañar los cambios en el perfil proteómico de muestras clínicas de pacientes obesos con y sin
diabetes, así como de DM2 con y sin obesidad (Fig. 4). resume los pros y los contras (consejos) de varias
metodologías proteómicas útiles para la investigación metabólica). Por lo tanto, beneficiará a los pacientes y ayudará
a avanzar terapias específicas. Como delegado de HUPO (http://www.hupo.org/; Fomento de iniciativas proteómicas
internacionales para comprender mejor las enfermedades humanas), para el proteoma humano en ensayos y
estudios de niños en el Hospital Universitario Ni ~ no Jesus (Madrid, España), están buscando apoyar el proteoma
humano en este contexto. Creemos que esto beneficiará aún más la comprensión de la patología de las
enfermedades y, en última instancia, mejorará los diagnósticos y tratamientos personalizados en el futuro cercano;
por lo tanto, los pacientes sin duda se verán beneficiados.
Tabla 1. Los ensayos representativos que detallan en cada columna los objetivos, las tecnologías, el tipo de muestra
que se analizará y los datos resultantes se ubican esquemáticamente en esta tabla. 2DE-electroforesis es una de las
herramientas más comunes utilizadas en estudios de investigación de la diabetes y la obesidad cuando se utiliza
proteómica. Sin embargo, actualmente, están apareciendo más artículos científicos que muestran las ventajas de
aplicar HPLC o nano HPLC acoplados directamente a espectrometría de masas (LC-MS) para evitar la pérdida de
proteínas de baja expresión o biomarcadores putativos. Los biomarcadores, los proteópodos de los adipocitos y la
insulina han sido los objetivos más comunes seguidos por los científicos para desentrañar las patologías de la
diabetes y la obesidad. Todos ellos, y muchos otros, nos permitieron avanzar y establecer las plataformas correctas y
la tecnología actual: las innovaciones permitirán mejorar los diagnósticos y perfeccionar las terapias mediante la
identificación de nuevos biomarcadores mediante proteómica.

Fig. 1 Esquema de SRM / MRM

útil para la investigación
metabólica. SRM o MRM para
ensayos cuantitativos consiste
en: (A) siguiendo, por ejemplo,
ionización tipo ESI, (B) un
péptido precursor se aísla
primero para obtener una
población de iones sustancial de
la mayoría de las especies
previstas. Esta población se
fragmenta para producir iones
de producto (C) cuyas
abundancias de señal son
indicativas de la abundancia del
péptido en la muestra. El SRM
puede llevarse a cabo en un
cuadrupolo triple, donde el Q1
que resuelve la masa aísla el
precursor, el Q2 actúa como una
célula de colisión y el Q3 que se
resuelve en masa se cicla a
través de los iones producto que
se detectan al salir del último cuadrupolo. Un par precursor / producto a menudo se denomina transición.

Fig. 2 Sugerimos realizar

este esquema de
cuantificación sin etiquetas
útil para la investigación
metabólica. (A) Las señales
peptídicas se detectan a
nivel de MS1 y se distinguen
del ruido / fondo químico por
su patrón isotópico
característico. (B) A
continuación, estos patrones
se siguen a través de la
dimensión del tiempo de
retención y se usan para
reconstruir un perfil de
elución cromatográfico de la
masa del péptido
monoisotópico. (C-E) La
corriente iónica total de la
señal peptídica se integra
luego y se usa como una
medida cuantitativa de la
concentración de péptido
original. Para cada péptido
detectado, se encuentran
primero todos los picos isotópicos y luego se asigna el estado de carga. Sin etiquetas se puede llevar a cabo a través
de Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance (FTICR) u Orbitrap.
 Fig. 3 Esquema general de la
corriente de flujo proteómico
actual, para la investigación
metabólica clínica. Los fluidos
corporales humanos (es decir,
sueros, orina y sangre) deben
almacenarse y prepararse
adecuadamente con protocolos
optimizados. Posteriormente, las
proteínas deberían purificarse y /
o aislarse para obtener péptidos
digeridos (es decir, usando
tripsina). Se aplica la estrategia
adecuada basada en MS
proteómica, y una vez que
obtenemos los datos
(biomarcadores potenciales), se
pueden llevar a cabo ensayos de
validación (es decir, ELISA y / o
transferencia western) eligiendo
anticuerpos específicos para
identificar biomarcadores de
proteínas reales. Actualmente, la
investigación de proteómica clínica implica cromatografía de alto rendimiento acoplada a espectrometría de masas,
evitando geles 2DE para identificar proteínas abundantes altas y bajas en una muestra clínica dada.

Fig. 4 Pros y
contras de
varias
herramientas
proteómicas
útiles en la
investigación
metabólica. En
esta figura, se
ha detallado un
resumen de los
pros y los
contras
(consejos) de
varias
metodologías
proteómicas,
desde la
preparación de
muestras hasta
la obtención de
datos de MS.
Nuestro
objetivo es
colocar
herramientas
útiles para la
investigación
metabólica
proteómica.