Práctica de Genómica Funcional

GENOTIPIFICACIÓN DEL POLIMORFISMO 1236 C>T DEL GEN ABCB1

INTRODUCCIÓN

TRANSPORTADORES DE LA SUPERFAMILIA ABC: En 1976, Juliano y Ling publicaron que la sobreexpresión de

una proteína de membrana en células de ovario de hámster chino resistente a la colchicina también provocaba
resistencia adquirida a varios fármacos distintos desde el punto de vista estructural (esto es, multirresistencia).
La primera proteína descubierta fue la glicoproteína P/ MDR1/ ABCB1, luego la superfamilia ABC ha seguido
creciendo y en la actualidad consta de 49 genes y cada uno posee una o dos regiones ABC. La región ABC es un
dominio catalítico central de hidrólisis de ATP que contiene secuencias Walker A - B y una secuencia C. Las
regiones ABC de estas proteínas fijan e hidrolizan el ATP, y las proteínas utilizan la energía para el transporte de
sus sustratos a través de la membrana. A pesar de que algunos transportadores de la superfamilia ABC
contienen un solo motivo ABC, forman homodímeros (BCRP/ABCG2) o heterodímeros (ABCG5 y ABCG8) que
exhiben una función de transporte.

Los transportadores ABC se dividen en siete grupos según la homología de su secuencia: ABCA (12 miembros),
ABCB (11 miembros), ABCC (13 miembros), ABCD (cuatro miembros), ABCE (un miembro), ABCF (tres miembros)
y ABCG (cinco miembros).

GLICOPROTEINA P:
Los transportadores son proteínas de membrana que regulan la entrada de nutrientes esenciales y
iones, así como la salida de los productos del metabolismo celular, las toxinas ambientales y otros
productos xenobióticos. En lo referente al transporte de los fármacos, los transportadores mas
representantes son los miembros de dos superfamilias:
ABC ([ATP binding cassette] casete enlazador de trifosfato de adenosina (ATP) .
SLC ([solute carrier] acarreador de solutos).
La mayor parte de las proteínas ABC corresponden a transportadores activos primarios, que
dependen de la hidrólisis del ATP para bombear en forma activa sus sustratos a través de la

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membrana. Existen 49 genes conocidos para las proteínas ABC, que se pueden agrupar en siete
subclases o familias de ABCA a ABCG. Uno de los transportadores mejor conocido en la
superfamilia ABC es la glucoproteína P, codificada por ABCB1, también llamada MDR.
En los últimos años, se han descrito más de 15 polimorfismos del gen MDR1, el más relevante de
ellos, por su proyección clínica, es el polimorfismo C3435T del exón 26 del gen, el único que se
correlaciona con un fenotipo de menor expresión de la proteína en la membrana de los enterocitos
y una mayor absorción intestinal de drogas, sustratos de la P-gp2. De hecho, se ha determinado
en individuos caucásicos, que la concentración de P-gp en células epiteliales del intestino es
sustancialmente más baja en personas con el genotipo T/T que en aquellos con genotipo C/C para
la mutación C3435T2.
Sin embargo, este polimorfismo no confiere un cambio aminoacídico, por lo que se piensa que
podría estar cosegregando con otros polimorfismos, como el G2677T/A del exón 21 que sí lo
determina, y con el polimorfismo C1236T del exón 12. Estos tres polimorfismos asociados
permiten definir distintos haplotipos de relevancia clínica para el gen MDR1, como han sido
descritos en poblaciones euroamericana, afroamericana y asiática.

En la presente práctica determinaremos el polimorfismo C1236T del exón 12 mediante PCR-

RPLP:

METODOLOGÍA DE TRABAJO

I. OBJETIVO
 Entrenar al alumno en el manejo de la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para
la detección polimorfismos mediante RFLP.

II. MATERIALES Y REACTIVOS

Material

 Puntas de 10 y 200 µL
 Guantes estériles
 Tubos para PCR

Reactivos

 Mix de PCR
 Buffer TBE 1 X
 Buffer de carga
 Agarosa
 Bromuro de etidio 10 mg/mL
 Marcador de peso molecular
 Enzima de restricción

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Equipos

 Termociclador
 Cámara de electroforesis
 Transiluminador
 Horno microondas
 Micropipetas de 10, 100 y 1000 µL

III. PROCEDIMIENTO

1. Extracción de ADN

La muestra de ADN debe tener las condiciones de integridad y de concentración adecuadas.

Aproximadamente a 100 ng/ul.

2. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

Para la amplificación coger 2 L de la extracción de ácidos nucleicos anteriormente preparado; se

utilizarán como cebadores los oligonucleótidos que flanquean el gen de interés.

Mezcla de reactivos para la amplificación del DNA de interés.

Tabla 2. Reactivos para la preparación de la PCR

Reactivos Volumen Para 4 reacciones

uL
H20 PCR 9.5 38
Mix PCR Buffer 1X, dNTPs 200 12.5 50
μM, MgCl2 1.5 mM
Foward 50 ρmoles 0.5 2
Reverse 50 ρmoles 0.5 2
Taq ADN – polimerasa 1.5 U/μL 0.5 2

Colocar 23 µL del Mix preparado en microtubos y adicionar 2 µL de cada muestra de ADN.

En el termociclador Perkin Elmer 2400, programar las siguientes condiciones de reacción:

Desnaturalización: 94 ºC durante 30 seg,

Hibridación: 58 ºC 30 seg
Polimerización: 72 ºC durante 30 seg.

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Estas condiciones se repiten durante 35 ciclos y se programa una incubación final a 72 ºC durante 7 min.

Realizar una electroforesis en gel de agarosa al 2 % con buffer TBE 1 X, utilizar como marcador de peso
molecular el DNA Ladder 100 bp.

Verificar el tamaño del amplicón en el caso de la práctica 435 bp.

3. Polimorfismos de longitud de los fragmentos de restricción (RFLP)

La mezcla para la reacción se hará de la siguiente forma en un microtubo de 1.5 mL.

H2O: 7.0 μL
Producto de PCR 10.0 μL
Buffer 10 X: 2 μL
Enzima 10 U/ μL: 1 μL
Total: 20 μL

Mezclar bien e Incubar por 12 horas a 37 °C

Preparación del gel de agarosa 3 %

TBE 1 X 50 mL

Agarosa 1.5 g

 Calentar al microondas por 20 segundos

 Dejar enfriar hasta 45 °C
 Dejar polimerizar 20 minutos en la cámara de electroforesis
 A las muestras de ADN se adiciona 5 μL de buffer de carga y se cargan en los pocillos
teniendo cuidado de no mezclar las muestras. Se deja correr durante 3 h a 80 V.
 Transcurrido el tiempo retirar con sumo cuidado el gel de agarosa, colorear con bromuro de
etidio y visualizar el ADN genómico digerido en el transiluminador UV.

Tabla 3. Tamaños del producto de PCR cortado por la enzima de restricción

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