MONITOREO DEL TRATAMIENTO BIOLÓGICO DEL SUELO CONTAMINADO CON

ANTRACENO EN UN BIORREACTOR DE TAMBOR GIRATORIO

RESUMEN
Se usó un reactor de tambor giratorio de 2 kg de capacidad para la conversión biológica de
contaminantes orgánicos casi insolubles en el suelo. El movimiento giratorio permitió un
funcionamiento efectivo con un contenido de sólidos de más del 60% en peso. Se usó un
cultivo bacteriano mixto para degradar el antraceno que se había impregnado en un suelo
alto representativo de arcilla. La actividad del cultivo se mantuvo durante un período de
meses en una operación repetida por lotes, en la que se inocularon tierras frescas con un
20% de suspensión de la etapa anterior. Se lograron tasas de degradación máximas de 100-
150 mg de antraceno (kg de suelo) -1 día-1 a lo largo de los experimentos.
La evolución del dióxido de carbono del biorreactor mostró que la degradación y la
mineralización del antraceno ocurrieron simultáneamente, y que el 55% del antraceno se
mineralizó. Cuando el cultivo se cambió del antraceno como única fuente de carbono a una
mezcla de tres hidrocarburos aromáticos polinucleares, el cultivo pudo degradar cada uno
de estos en la secuencia: antraceno, fenantreno y finalmente pireno.
INTRODUCCIÓN
La implementación de un método de tratamiento biológico para la remediación del suelo
requiere el conocimiento de las características del suelo, las propiedades de los
contaminantes y la geología e hidrología del sitio. Los factores a optimizar incluyen el
suministro de oxígeno, la temperatura, el pH, la presencia o adición de una población
microbiana adecuada y nutrientes, contenido de agua y grado de mezcla. Una decisión clave
es si tratar el suelo in situ, o excavar y usar algún tipo de biorreactor, la última opción puede
ser atractiva para suelos superficiales contaminados.
El cultivo de tierras es un método popular de biorremediación que puede considerarse el
enfoque más curioso para la tecnología del biorreactor. Una limitación importante de este
método es la falta de control de las emisiones por evaporación o escorrentía. Por lo tanto,
el suelo contaminado con compuestos peligrosos debe tratarse en condiciones más
controladas. Ryan et al. (1991) describieron varios tipos de biorreactores, incluidos los de
fase sólida y los de fase pastosa. La mezcla y la aireación activas en la fase de lodo pueden
proporcionar un buen rendimiento. Por ejemplo, Mueller et al. (1991) observaron más del
50% de biodegradación de pentaclorofenol
en 3-5 en 3-5 días, y más del 95% de conversión en 30 días fue informado por Jerger (1993)
para la eliminación de hidrocarburos aromáticos polinucleares
(PAH) en un biorreactor de fase pastosa. Los principales inconvenientes de los biorreactores
de fase pastosa son la alta proporción de agua a sólidos (típicamente 4: 1 o más en base al
peso) y el alto requerimiento de potencia para la agitación para mantener los sólidos del
suelo heterogéneos en suspensión. Parthen et al. (1990) informaron sobre la degradación
de HAP en lodos de 60% de suelo limoso en un tambor rotatorio, donde la concentración
total de HAP disminuyó de 210 mg / kg a 10 mg / kg en 200 h. Cualquier tipo de biorreactor
estará sujeto a limitaciones de rendimiento debido a la difusión y sorción en el suelo (Chung
et al., 1993) y a la lenta disolución de sólidos orgánicos tales como HAP (Weissenfels et al.,
1992).
Los biorreactores de tambor giratorio ofrecen una atractiva combinación de mezcla efectiva
con alto contenido de sólidos (Masliyah y otros, 1992) y altas tasas de aireación (Gray et al.,
1993). En un artículo anterior (Gray et al., 1994), describimos los estudios iniciales de
cribado sobre la biodegradación del antraceno en el suelo utilizando botellas de rodillo de
vidrio a escala de laboratorio (2-1). En el presente documento informamos sobre la
biodegradación del antraceno en un biorreactor de tambor rotativo 14-1 a escala de banco.
El antraceno se seleccionó como un compuesto modelo para representar la contaminación
del suelo por HAP resistente y de baja solubilidad. El objetivo del estudio fue monitorear
tanto la biodegradación del antraceno como la producción de dióxido de carbono, y
demostrar el funcionamiento por lotes repetido de un biorreactor de tambor giratorio a
escala de laboratorio utilizando un cultivo bacteriano mixto.
MATERIALES Y MÉTODOS
Medio y cultura
Se preparó una solución tampón de pH 7.0 mezclando 1.33 g de KH2PO4y 2.67 g de K2HPO4
en 1 litro de agua destilada. Las siguientes sales se añadieron luego a la solución tampón
(todas en g / l):1 NH4Cl, 2Na2SO4, 2KNO3, 0.05FeSO4 * 7H20 y 1 ml de solución de metal traza
(Fedorak y Grbic-Galic 1991).
Una población microbiana mixta se enriqueció a partir de una muestra de suelo
contaminada con creosota de un sitio en Edmonton, Alberta, y se mantuvo con antraceno
como única fuente de carbono (Gray et al., 1994). Inicialmente, se mezclaron 7 g de suelo
contaminado con 200 ml de medio de sales a 27 ° C con 0.1 g de antraceno como fuente de
carbono. Los cultivos se mantuvieron mediante transferencias mensuales (10% en volumen)
y el crecimiento se controló mediante dilución, recubrimiento y recuento de colonias. Una
vez estabilizada la población bacteriana mixta, elegida arbitrariamente como la novena
transferencia mensual, el cultivo se decantó, dejando atrás el antraceno insoluble y las
células, cosechadas por centrifugación. El sedimento bacteriano se lavó con 8 litros de
medio de sales, se resuspendió en 35 ml, 20% de glicerol a una densidad de 108 cfu /ml y se
congeló a -75ºC.
Este material congelado se usó para preparar cultivos de semillas para experimentos de
rutina.
Preparación del suelo
El suelo era franco-arcilloso arenoso con labranza moderadamente calcárea (Cooking Lake
Loam, Edmonton, Alberta). Este subsuelo se muestreó desde una profundidad superior a 1
m, y estaba compuesto por 50.6% de arena, 25.5% de limo y 23.9% de arcilla con un área
superficial de 348 m2/g (según el método del etilenglicol). El contenido orgánico fue 0,62%
en peso. El pH en agua destilada fue 8.3.
Aproximadamente 100 kg de tierra se cribaron a través de un tamiz de 5 mm-mesh para
eliminar rocas, hojas y raíces. Luego, el suelo se secó al aire extendiéndolo en una capa
delgada sobre una lámina de plástico durante 3-4 días a temperatura ambiente,
ocasionalmente mezclando El suelo seco se almacenó en cubos cerrados como muestra de
stock.
El suelo impregnado con antraceno se preparó en lotes de 500 g. Se disolvió un peso medido
de antraceno en cloruro de metileno a una concentración de 2-3 g/l y se mezcló con tierra
en una relación de 250 ml de solución/kg de tierra. El suelo luego se mezcló a fondo en un
agitador durante aproximadamente 3 h a temperatura ambiente y el disolvente se eliminó
al vacío a 50ºC usando un evaporador rotatorio. La exposición del suelo a la luz se minimizó
para evitar la fotoxidación de antraceno a antraquinona, y el suelo preparado se mantuvo
en un congelador a -10 °C antes de su uso. Cada lote de suelo se analizó para determinar la
cantidad exacta de antraceno cargado. El suelo y todos los materiales utilizados en estos
experimentos fueron no estériles.
Biorreactor
En la figura 1 se muestra un diagrama esquemático del aparato de biorreactor. El
biorreactor consistía en un tambor giratorio construido de aluminio, de 31 cm de longitud
y 24 cm de diámetro interno con un volumen de 14 litros. Ambos extremos estaban
provistos de pestañas de 27 cm internas diámetro con una abertura de 8 cm de diámetro
en el centro. Se colocó un sello mecánico giratorio en el centro de cada pestaña. Se
conectaron tubos de acero inoxidable de 0,6 cm de diámetro al centro de cada pestaña para
la entrada y salida de la corriente de aire. El sello giratorio permitió que el tambor gire
mientras mantiene un sello hermético. Una brida tenía ocho levantadores de 2.4 cm de alto
(10% del diámetro interno del tambor) y 31 cm de largo, colocados a distancias iguales
alrededor de la circunferencia del reactor. La lechada se mezcló girando el tambor a la
velocidad deseada mediante dos rodillos de fricción cubiertos de goma, que eran
accionados por un motor de velocidad variable.
Se realizaron experimentos en blanco para determinar el volumen óptimo de la suspensión,
la composición de la suspensión y la velocidad de rotación. Se usó un tambor de plástico
transparente de dimensiones similares al biorreactor para estos experimentos. El flujo de
la suspensión dentro del tambor se observó a varios volúmenes totales de la suspensión
(desde 10% a 25% del volumen del reactor), cantidades de tierra en la suspensión (40% a
70%) y velocidades de rotación del tambor (1- 6 rpm). Las condiciones de operación elegidas
fueron del 60% en peso de contenido sólido con la suspensión que ocupa el 18% del
volumen del reactor y una velocidad de rotación de 3 rpm.

Fig. 1. Diagrama esquemático del biorreactor de tambor giratorio experimental para la remediación de suelo
contaminado.

Se suministró oxígeno al cultivo haciendo pasar aire a través del tambor a un caudal de 50
ml/min. El aire de entrada se filtró y saturó con humedad, antes de ingresar al reactor,
pasándolo a través de dos burbujeadores de agua, que se sumergieron en un baño a
temperatura constante a 27ºC. El suministro de oxígeno al lodo superó ampliamente la
demanda total de oxígeno degradar la HAP a CO2 y H2O, sobre la base de experimentos
previos de transferencia de oxígeno (Gray et al., 1993). La línea de salida del reactor se
conectó a un espectrómetro de masas para controlar continuamente la concentración de
CO2 en la corriente de gas de salida.
En la mayoría de los experimentos, 1.5 kg de suelo se mezclaron dentro del reactor con 1.0
kg de medio de sales para dar una relación de sólido a líquido de 3:2. El volumen total de
suspensión fue del 18% del volumen total del reactor. La operación discontinua repetida se
llevó a cabo reemplazando el 80% de la suspensión del reactor con una cantidad conocida
de suspensión fresca con la misma relación 3:2 de tierra a medio.
El inóculo para el biorreactor 14-1 se preparó usando una botella de rodillo de vidrio 2-1.
Se lavaron las células (1 ml) del caldo congelado y se resuspendieron en el medio de sales
para eliminar el glicerol de almacenamiento, luego se añadieron a una mezcla de 200 g de
tierra, que había sido impregnada con 120 mg de antraceno, y 133 ml de medio de sal.
La suspensión se incubó luego en el frasco rotatorio durante 4 días a 27ºC. Se tomaron
muestras del frasco rotatorio a tiempo cero y después de 4 días de incubación para
determinar la concentración de antraceno y el número de bacterias. El contenido de la
botella giratoria se transfirió luego al biorreactor y se mezcló con suspensión fresca.
El reactor se hizo funcionar a temperatura ambiente, entre 21 ° C y 23 ° C.
Repetición de lotes
El experimento del biorreactor comenzó (día 0) con una mezcla de 220 g (10%) de lechada
inoculada de la botella con rodillo y 2000 g (90%) de suspensión fresca. Se preparó una
suspensión espesa fresca dentro del reactor mezclando 1200 g de suelo cargado con
antraceno con 800 g de medio de sales durante aproximadamente 2 h. A continuación, la
suspensión de inoculación se añadió al biorreactor, que se mezcló durante 2 h antes del
muestreo para la concentración inicial de antraceno.
El plan inicial era dejar 10% de la lechada en el biorreactor como inóculo para la próxima
ejecución del lote. Sin embargo, en el primer intento de hacer esto en el lote 2 (día 14), no
fue posible eliminar el 90% del lodo (2000 g de 2220 g) del reactor, porque el lodo estaba
cubierto como una capa delgada en su gran área de superficie interna. Con el fin de
mantener las mismas condiciones para los lotes futuros, se dejaron 500 g de lechada dentro
del reactor y se añadieron 2000 g (1200 g de suelo y 800 g de medio de sales) de lechada
fresca. A partir de entonces, cada nuevo lote se inició reemplazando 2000 g, o el 80%, de la
antigua suspensión descontaminada con una suspensión recién preparada. El inóculo fue el
20% restante (500 g) de la vieja lechada que contenía microorganismos activos y cualquier
antraceno residual.
Aunque la biodegradación se completó en 6-8 días, las transferencias se hicieron
generalmente después de 4-6 días adicionales debido al tiempo requerido para preparar el
suelo impregnado de antraceno. Se preparó un lote nuevo de suelo cargado de antraceno
para cada transferencia para evitar la fotoxidación del antraceno.
Técnicas analíticas
Conteo de placas
Se extrajeron muestras de 2-3 g de lechada del reactor en un tubo de ensayo y luego se
diluyeron con el doble de la cantidad de solución de peptona al 0,1%. Se realizaron
diluciones decimales sucesivas con solución de peptona para obtener diluciones en el
intervalo de 10-5 a 10-8. Las placas extendidas de cada dilución se prepararon por triplicado
en agar con conteo de placa (Difco, Detroit, Michigan), luego se incubaron a 27ºC durante
2 días. Se contaron las unidades de formación de colonias (ufc), y estos números se
expresaron sobre la base de suelo seco.
Contenido de humedad
El contenido de humedad de la suspensión se determinó mediante el método EPA 3540-7.
Se secó un peso conocido de la suspensión (5-10 g) a 105 ° C durante 12 h, luego se dejó
enfriar en un desecador y se volvió a pesar.
Análisis de dióxido de carbono
La evolución de CO2 a partir de la mineralización de antraceno se controló continuamente
utilizando un analizador de gases cuádruplo Dycor. El analizador se conectó a una
computadora IBM, que registró composiciones de gas promediadas en el tiempo cada 5
minutos. El analizador se calibró con una mezcla conocida de 5% de CO2, 10% de O2, 2% de
Ar y el resto de N2. Se determinó el factor de respuesta para el CO2 con respecto a Ar en la
mezcla de calibración, luego se calculó el porcentaje de CO2 en la corriente de gas efluente
del reactor usando la concentración de Ar en la corriente como patrón interno.
Análisis de antraceno en el lodo
El antraceno se recuperó cuantitativamente del suelo mediante extracción con Soxhlet
usando cloruro de metileno como disolvente siguiendo el método EPA 3540. Las muestras
en suspensión (5-10 g) se secaron mezclando a fondo con un peso igual de sulfato de
magnesio anhidro antes de la extracción. Después de la extracción, el disolvente se evaporó
en un evaporador rotatorio, y el residuo se re-disolvió en 5 ml de cloruro de metileno en un
matraz volumétrico. El antraceno se analizó mediante cromatografía de gases según el
método 8000 de la EPA utilizando el método de calibración externo. Se añadió una cantidad
exactamente ponderada de fenantreno (1.0-2.0 mg) como patrón interno a la solución de
antraceno en cloruro de metileno. Para experimentos en los que se añadieron fenantreno
y pireno al biorreactor con antraceno, se usó fluoreno como patrón interno.
Se usó un cromatógrafo de gases Hewlett-packard 5890, equipado con una columna capilar
DB-1 y un detector de ionización de llama. El análisis de hidrocarburos fue reproducible en
+ 3% y el límite mínimo detectable fue de aproximadamente 5 mg/kg. Los niveles más bajos
de antraceno se determinaron re-disolviendo el residuo extraído en un volumen menor de
cloruro de metileno. Todos los resultados se informan en suelo seco.