3.

METODE PENELITIAN

3.1. Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Bioproses IV Pusat Penelitian
Bioteknologi-LIPI Cibinong. Analisis kadar diazinon dan isolasi bakteri dilakukan
di Laboratorium Bioproses IV Pusat Penelitian Bioteknologi LIPI Cibinong,
identifikasi bakteri dilakukan di Laboratorium Taksonomi Bidang Mikrobiologi
Pusat Penelitian Biologi-LIPI Bogor, analisis kompos dilakukan di Laboratorium
Balai Penelitian Tanah Pusat Penelitian dan Pengembangan Tanah dan
Agroklimat Bogor. Penelitian ini dilaksanakan pada bulan April-Oktober 2005.

3.2. Alat dan Bahan

3.2.1. Alat
Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini adalah cawan petri, labu
erlenmeyer, gelas piala, gelas ukur, labu ukur, botol Schott, corong, jarum ose,
kertas saring, neraca analitik, pH meter, filter ukuran 0.45 μm (millipore),
thermometer, autoklaf, sentrifugase, lampu spirtus, obyek glass, mikroskop,
mikropipet Eppendorf 100 dan 1000 μl, shaker, bak fermentor/inkubator, plat
silika gel 60 F254 dan spektrofometer UV-VIS.

3.2.2. Bahan
Bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah tanah yang tidak
tercemar diazinon, kompos limbah media jamur tiram (Pleuorotus ostreatus),
plastik untuk penutup bak fermentor/inkubator, dan pestisida organofosfat merek
diazinon 60EC yang mengandung 600.000 ppm diazinon (teknis), metanol p.a, etil
asetat teknis, aseton, aquadest, alkohol, spirtus, K2HPO4, KH2PO4, MgSO4.7H2O,
NaCl, CaCl2.2H2O, FeSO4.7H2O, Na2MoO4, MnSO4, NaWo2, Bakto Peptone, dan
Yeast Extract, FDA, Aquabidest dan air destilata. Bahan-bahan lain yang
dibutuhkan yaitu media Potato Dekstrose Agar (PDA). Nutrien Agar (NA),
nistatyn, khloramphenikol, larutan pewarna Hucker’s violet (Gram A), larutan
Mordan Lugol’s iodin (Gram B), larutan pencuci (Gram C), larutan pewarna
sapranin (Gram D), Media khusus Gram Mac Conkey Agar, NNNN tetramethyl-p-
phenylene diamine dihydrochloride (C6H4[N(CH3)2]22HCl, H2O2, methyl red,
bromtymol biru, phenol red, media nutrien cair/broth.

3.3. Pengambilan Sampel untuk Perlakuan

Pengambilan sampel dipilih daerah yang relatif bebas pestisida. Oleh karena
itu dipilih sekitar lokasi laboratorium bioteknologi-LIPI cibinong karena daerah
ini masih relatif bebas pestisida terutama pestisida jenis diazinon. Kompos yang
digunakan adalah kompos limbah media jamur tiram (Pleurotus ostreatus) yang
diperoleh dari petani jamur di Desa Galuga Kecamatan Cibungbulang, Bogor.
Sebelum digunakan, terlebih dahulu dilakukan pengujian terhadap residu pestisida
dalam tanah dan kompos. Hasil analisis menunjukkan bahwa tanah dan kompos
tersebut tidak mengandung residu pestisida diazinon maupun jenis pestisida
lainnya.

3.4. Desain Penelitian

3.4.1. Penelitian Tahap I

Penelitian tahap I melakukan proses bioremediasi dengan menggunakan
kompos limbah media jamur (SMC) dan menentukan kondisi terbaik untuk proses
degradasi diazinon.

3.4.2. Penelitian Tahap II

Penelitian tahap II melakukan isolasi bakteri dan kapang serta
mengidentifikasi bakteri dari kompos limbah media jamur tiram (Pleurotus
ostreatus) untuk mengetahui jenis bakteri yang terdapat dalam SMC tersebut yang
dapat mendegradasi diazinon. Kemudian dilakukan uji kemampuan degradasi
diazinon.
Bagan alir tahapan penelitian seperti ditunjukkan pada Gambar 3.
Penelitian tahap I dilakukan seperti berikut:
1. Sterilisasi tanah yang bebas diazinon pada suhu 121 oC selama 15 menit,
kemudian dicemari dengan diazinon masing-masing konsentrasi 0 ppm, 293
 ppm, 500 ppm, 1000 ppm, 1500 ppm, dan 1707 ppm dengan jumlah kompos
dalam tanah 6%, 10%, 20%, 30% dan 35%.
2. Analisis kompos (SMC) yang meliputi: TPC, C/N, KTK, unsur hara, kadar air,
kadar abu, pH, aktivitas mikroba, dan kadar pestisida.
3. Pencampuran kompos dengan tanah yang telah dicemari diazinon.
4. Fermentasi/inkubasi pada suhu ruang dengan kadar air bahan 30-60% selama
28 hari.
5. Analisis hasil fermentasi/inkubasi (kadar diazinon, TPC, C/N, KTK, unsur hara,
kadar air, kadar abu, pH, dan aktivitas mikroba).

Tanah Sterilisasi tanah

Kompos limbah Pencampuran Diazinon

media jamur EC 60

Analisis Kompos Fermentasi/inkubasi Sampling:

(C/N, KTK, unsur hara,
Kadar air, kadar abu,
pH, kadar pestisida,
TPC, aktivitas mikroba)
satu kali seminggu
T = suhu ruang
untuk analisis penurunan
Kadar air bahan = 30-60%
kadar diazinon, TPC,
Waktu = 28 hari
aktivitas mikroba

Analisis:
Isolasi Mikroba kadar diazinon, TPC, C/N,KTK,
(bakteri & kapang) unsur hara, kadar air, kadar abu, pH,
dan aktivitas mikroba.

Identifikasi bakteri
Uji kemampuan
degradasi diazinon

Gambar 3 Diagram tahapan penelitian

3.5. Proses Biodegradasi Diazinon

Sampel tanah yang belum dicemari dengan diazinon terlebih dahulu
disterilisasi pada suhu 120 oC dalam autoklaf selama 15 menit setelah dingin
tanah dicemari dengan pestisida organofosfat merk diazinon 60EC, kemudian
tanah tersebut dicampur dengan kompos dengan perbandingan tertentu. Sebelum
kompos dicampur dengan tanah, terlebih dahulu dilakukan pengujian mutu
kompos tersebut. Parameter yang diuji adalah C/N, unsur hara, KTK, kadar air,
kadar abu, pH, TPC, aktivitas mikroba, dan kadar pestisida. Campuran tersebut
kemudian diaduk hingga homogen lalu diinkubasi selama 28 hari dengan kadar
air bahan 30-60% pada suhu kamar (28-32 oC) dan pH 7-8. Selama proses
inkubasi berlangsung sampel ditutup dengan plastik untuk mengurangi terjadinya
penguapan dan tidak terkena cahaya.
Sampel diambil satu kali seminggu di lima titik dengan dua kali
pengambilan kemudian digabung menjadi satu dan diaduk hingga homogen
(sistem komposit) kemudian dianalisis penurunan kadar diazinonnya. Pada akhir
proses inkubasi, selain analisis penurunan kadar diazinon juga dilakukan
pengujian C/N, KTK, unsur hara, kadar abu, kadar air, pH, TPC, dan aktivitas
mikroba.

3.6. Analisis Kadar Diazinon

Analisis kadar diazinon menggunakan metode seperti yang dilakukan oleh
Ningsih (2001) yaitu menggunakan kromatografi lapis tipis (KLT) menggunakan
plat silika gel 60 F254 dan spektrofotometer UV/VIS Beckman DU 650 pada
panjang gelombang 241 nm.

3.6.1. Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

Kromatografi Lapis Tipis adalah metode pemisahan fisikokimia yang
lapisan pemisahan terdiri atas bahan berbutir-butir (fase diam) dan ditempatkan
pada penyangga berupa plat gelas logam atau lapisan yang cocok, campuran yang
akan dipisahkan berupa larutan. Larutan ditotolkan berupa bercak, kemudian plat
diletakkan dalam bejana tertutup rapat yang berisi larutan pengembang yang
cocok (fase gerak) yang telah dijenuhkan. Pemisahan terjadi selama perambatan
fase gerak. Derajat retensi pada KLT dinyatakan sebagai “Retention Factor” (Rf)
yang dinyatakan dengan rumus sebagai berikut:

Jarak titik pusat bercak dari titik awal

Rf = …………………….(1)
Jarak garis depan dari titik awal
 Metode ini dilakukan dengan maksud untuk mengetahui adanya atau
tidaknya produk turunan hasil degradasi diazinon dalam sampel. Analisis kadar
diazinon dengan metode KLT ini menggunakan plat silika gel 60 F254, eluen
pengembang heksana:etilasetat dengan perbandingan 10:1 (v/v) dan pewarna
digunakan serium (II) sulfat.
KLT dilakukan dengan cara mentotolkan sampel pada plat kemudian
dimasukkan kedalam bejana yang berisi heksana dan etyl asetat dengan
perbandingan 10:1 (v/v) yang telah dijenuhkan selama 30 menit. Lalu didiamkan
hingga eluen naik sampai batas garis. Spot yang terbentuk dapat dilihat dengan
menggunakan sinar ultraviolet dan pewarnaan dengan menggunakan serium (II)
sulfat.

3.6.2. Spektrofotometer UV-VIS

Spektrofotometri adalah suatu metode pengukuran serapan radiasi
elektromegnetik pada panjang gelombang tertentu yang sempit dan mendekati
monokromatik dan diserap oleh zat. Pelarut yang sering digunakan adalah air,
metanol, n-heksana, etanol, minyak bumi, dan eter.
Analisis diazinon dengan metode spektrofometri ini merupakan modifikasi
yang dilakukan oleh Bavcon et al. (2003) dengan metode yang dilakukan oleh
Ningsih (2001), yaitu dilakukan dengan cara mengekstraksi sebanyak 10 gram
sampel dengan etil asetat sebanyak 20 ml. Larutan yang diperoleh diuapkan
kemudian dilarutkan kembali dengan 2 ml metanol p.a, sampel disonifikasi agar
larutan tersebut tercampur dengan baik (homogen). Kemudian dilakukan
pembacaan pada spektrofotometer UV-VIS (Beckman DU 650) dengan sinar UV
pada panjang gelombang 241 nm. Absorbansi yang diperoleh kemudian diplot
pada kurva standar untuk menghitung konsentrasi diazinon dalam sampel.

3.7. Isolasi Mikroba dan Identifikasi bakteri

3.7.1. Pembuatan Media

3.7.1.1. Potato Dekstrose Agar (PDA).
Media ini digunakan untuk menginokulasi kapang dari SMC.
Cara pembuatan:
1. Ditimbang PDA sebanyak 3.9 g dan agar powder 0.5 g.
2. Kedua bahan tersebut dicampur dan ditambahkan dengan aquadest
sebanyak 100 ml, kemudian dipanaskan sambil diaduk.
3. Setelah mendidih dan homogen media disterilisasi dalam autoklaf pada
suhu 121 oC selama 15 menit.
4. Media didinginkan (hangat kuku) lalu ditambahkan khloramphenikol 50
ppm sebanyak 1 ml yang telah disterilkan dengan millipore 0.45 μm.
5. Media dituang ke dalam petri steril ± 1-2 ml, dan didinginkan
6. Setelah padat petri ditutup dan dibalik agar uap air tidak jatuh ke atas
permukaan agar.

3.7.1.2. Nutrien Agar (NA)

Media ini digunakan untuk menginokulasi bakteri dari SMC.
Cara pembuatan:
1. Ditimbang NA sebanyak 2.3 g dan agar powder 0.5 g.
2. Kedua bahan tersebut dicampur dan ditambahkan dengan aquadest sebanyak
100 ml, kemudian dipanaskan sambil diaduk.
3. Setelah mendidih dan homogen media disterilisasi dalam autoklaf pada suhu
121 oC selama 15 menit.
4. Media didinginkan (hangat kuku) lalu ditambahkan nistatyn 50 ppm
sebanyak 1 ml yang telah disterilkan dengan millipore 0.45 μm.
5. Media dituang ke dalam petri steril ± 1-2 ml, dan didinginkan
6. Setelah padat petri ditutup dan dibalik agar uap air tidak jatuh ke atas
permukaan agar.

3.7.2. Isolasi Mikroba (Bakteri dan Kapang)

Mikroba yang terdapat dalam SMC masih merupakan koloni campuran
sehingga perlu dilakukan isolasi untuk mendapatkan isolat/biakan murni (koloni
tunggal). Isolasi mikroba dapat dilakukan dengan dua cara yaitu:
1. Metode Cawan Tuang/Taburan (Puor Plate Method)
Metode ini dilakukan dengan cara menggoreskan suspensi bahan yang
mengandung bakteri pada permukaan medium agar yang sesuai dalam cawan
petri. Setelah diinkubasi pada bekas goresan akan tumbuh koloni-koloni yang
terpisah yang mungkin berasal dari satu sel bakteri, sehingga dapat diisolasi lebih
lanjut. Metode goresan ini dapat dilakukan dengan metode goresan lurus, kuadran,
atau radian.

2. Metode Cawan Gores (Streak Plate Method)

Metode dilakukan dengan cara menginokulasi medium agar yang sedang
mencair pada temperatur 50oC dengan suspensi bahan yang mengandung bakteri
dan menuangkannya ke dalam cawan petri, setelah diinkubasi akan terlihat koloni-
koloni yang tersebar di permukaan agar.
Dalam penelitian ini isolasi mikroba dilakukan dengan metode cawan
tuang/gores yaitu dengan menginokulasi SMC pada media padat Nutrient Agar
(NA) dan Potato Dekstrose Agar (PDA). Pada media padat NA ditambahkan zat
antibiotik nistatyn yang berfungsi untuk menghambat pertumbuhan
mikroorganisme kapang dan khamir sedangkan pada media padat PDA
ditambahkan dengan khloramphenikol untuk menghambat pertumbuhan bakteri.
Inokulasi mikroba ini dilakukan dengan dua metode yaitu cair dan padat:
1. Menimbang SMC sebanyak 1gram lalu di larutkan dengan air steril sebanyak
10 ml kemudian di goyang (shaker) selama 30 menit, supernatan yang
diperoleh dipipet sebanyak 100 μl lalu dituang kedalam cawan petri yang
berisi media PDA dan NA
2. Ditimbang kompos sebanyak 5 gram lalu ditabur kedalam cawan petri yang
yang berisi media PDA dan NA.

Masing-masing cawan petri diinkubasi dengan posisi terbalik pada suhu

kamar selama 24-48 jam. Bakteri dan kapang yang tumbuh dipindahkan pada
media padat lain untuk memperoleh biakan murni. Setelah 2-3 hari isolat yang
tumbuh pada media awal dipindahkan dan dipisahkan berdasarkan perbedaan
bentuk dan morfologinya ke media padat NA dan PDA lainnya yang tidak
mengandung nistatyn dan khloramphenikol. Isolat-isolat tersebut dipindahkan
dengan menggunakan jarum ose kemudian menggoreskannya pada media padat
untuk memisahkan isolat-isolat tersebut agar diperoleh koloni tunggal (single
coloni). Koloni tersebut diinkubasi selama 3 hari pada suhu ruang. Hal ini
dilakukan berulang-ulang hingga diperoleh isolat yang murni. Isolat yang telah
murni dipindahkan ke dalam media agar miring (NA dan PDA) dengan cara
membuat garis zig zag. Kemudian diinkubasi selama 3 hari pada suhu ruang lalu
disimpan dalam lemari pendingin.

3.7.3. Pewarnaan bakteri

Pewarnaan bakteri dimaksudkan untuk melihat struktur sel bakteri dengan
seksama. Fungsi pewarnaan bakteri terutama memberi warna pada sel dan
bagian-bagiannya agar lebih kontras dan tampak lebih jelas, sehingga dapat
diamati berbagai bentuk (morfologi), jenis (gram positif atau gram negatif),
susunan bakteri, serta sel-sel bakteri (spora, kapsel, atau flagela). Sel-sel bakteri
yang tidak diwarnai pada umumnya sukar diamati dengan mikroskop cahaya
biasa, karena sitoplasma sel mempunyai indeks bias yang hampir sama dengan
indeks bias lingkungannya (Lay 1992). Hasil pewarnaan sangat dipengaruhi oleh
beberapa faktor yaitu:
a. Fiksasi, sebelum bakteri diwarnai terlebih dahulu dilakukan fiksasi dengan
menggunakan cara fisik (pemanasan atau dengan freeze drying) ataupun
menggunakan agen kimia (asam pikrat, alkohol, aseton, asam kromat-asam
osmiat). Fiksasi berfungsi untuk (1) Mencegah mengkerutnya globula-globula
protein sel; (2) Mempertinggi sifat reaktif gugusan-gugusan karboksilat,
amino primer, sulfihidril; (3) Merubah afinitas pewarna bakteri; (4) Mencegah
terjadinya otolisis sel; (5) Dapat membunuh bakteri secara cepat dengan tidak
menyebabkan perubahan-perubahan bentuk atau strukturnya; (6) Melekatkan
bakteri di atas gelas benda; (7) Membuat sel lebih kuat (keras).
b. Substrat, tiap pewarna asam maupun basa dapat bereaksi dengan konstituen
sel. Oleh karena itu substrat organik (lipid, protein, asam nukleat, dan
karbohidrat) akan mempengaruhi pewarnaan bakteri. Sehingga dapat
dibedakan sel-sel yang (1) basofil, yaitu sel-sel yang dapat mengikat pewarna
 bakteri basa; (2) asidofil atau oksifil, yaitu sel-sel yang dapat mengikat
pewarna bakteri asam; (3) sudanolfil, yaitu sel-sel yang dapat mengikat
pewarna bakteri yang dapat larut dalam minyak.
c. Intensifikasi Pewarnaan, dilakukan dengan mempertinggi kadar pewarna,
temperatur pewarnaan (60-90 oC) atau menambah suatu mordan.
d. Pelunturan pewarna bakteri (Decolorizer), digunakan untuk mendapatkan
kontras yang baik pada bayangan mikroskop.

Beberapa cara pewarnaan bakteri yang biasa dilakukan ialah pewarnaan

sederhana, pewarnaan deferensial, pewarnaan Gram, pewarnaan Ziehl Neelsen
(acid fast), dan pewarnaan negatif (Lay 1992). Pada penelitian ini dilakukan
pewarnaan bakteri dengan menggunakan metode pewarnaan Gram. Pewarnaan
gram meliputi 4 tingkatan yaitu:
1. Pemberian pewarna utama (larutan pewarna kristal violet, warna ungu)
2. Pengintensifan pewarna utama dengan menambahkan larutan mordan (JKJ)
3. Pencucian (dekolorisasi) dengan alkohol 70%
4. Pemberian pewarna penutup (pewarna lawan, counterstain) larutan pewarna
safranin yang berwarna merah.
Dengan pewarnaan Gram maka dapat dibedakan bakteri yang bersifat
positif dan bersifat negatif: (1) Bakteri Gram positif ialah bakteri yang mengikat
pewarna utama dengan kuat sehingga tidak dapat dilunturkan dan diwarnai oleh
pewarna lawan. Dengan menggunakan mikroskop sel-sel bakteri ini tampak
berwarna violet; (2) Bakteri Gram negatif ialah bakteri yang daya ikat terhadap
pewarna utama tidak kuat, sehingga dapat dilunturkan dan diwarnai oleh pewarna
lawan. Dengan pengamatan mikroskopik sel bakteri ini tampak berwarna merah.
Sifat Gram terutama ditentukan oleh sifat-sifat fisik dan kimia dinding sel
dan membran sitoplasma. Dinding sel dan membran sitoplasma bakteri Gram
positif mempunyai afinitas yang besar terhadap kompleks pewarna kristal violet
dan iodium, sedang pada Gram negatif tidak. Pada waktu pewarnaan, larutan
kristal violet dan iodium menembus sel bakteri. Pada sel bakteri Gram positif zat-
zat ini membentuk senyawa yang sukar larut, tidak larut dalam peluntur, dan tidak
diwarnai oleh pewarna penutup sedang bakteri Gram negatif tidak demikian.
Pewarnaan Gram dilakukan dengan cara :
1. Gelas objek dibersihkan dengan alkohol 70%, lalu dipanggang di atas nyala api
dan dinginkan
2. Biakan diambil dengan ose secara aseptik ke atas gelas objek, diratakan dan
dikering-anginkan
3. Preparat yang telah kering difiksasi dengan cara melewatkan di atas api
4. Pada preparat diteteskan pewarna utama (Gram A) 1-2 tetes, dibiarka 1 menit
lalu dicuci dan dikeringkan
5. Lalu ditetesi dengan larutan mordan Lugol (Gram B) dibiarkan 1 menit, dicuci
dan dikeringkan
6. Kemudian dicuci dengan larutan peluntur (Gram C) selama 30 detik, dicuci dan
dikeringkan
7. Lalu diberi larutan pewarna penutup (Gram D) dibiarkan 2 menit lalu dicuci
dan dikeringkan
8. pengamatan dengan mikroskop dengan pembesaran 100 kali. Bakteri Gram
positif berwarna violet dan Gram negatif berwarna merah.

3.7.4. Determinasi dan Identifikasi Bakteri

Untuk identifikasi dan determinasi suatu biakan murni dari hasil isolasi,
perlu diamati morfologi koloni serta morfologi individual, sifat-sifat pewarnaan,
sifat fisiologis (biokimia), patonogenesitas dan serologinya. Pada identifikasi
bakteri yang pertama-tama harus dilakukan adalah pengamatan terhadap
morfologi individual dan pertumbuhannya pada bermacam-macam media. Karena
bakteri tidak dapat dideterminasi hanya berdasarkan sifat-sifat morfologinya saja
tapi perlu pula diteliti sifat-sifat biokimia dan faktor-faktor yang mempengaruhi
pertumbuhannya (media, pH, dan temperatur). Pada pengujian untuk identifikasi
bakteri digunakan pedoman Bergey’s Manual of Determinative Bakteriology (Holt
et al. 1994 ).

Sifat Morfologi Bakteri:

1. Morfologi sel individual meliputi:
♦ Ukuran, bentuk, dan rangkaian sel
 ♦ Ada tidaknya spora, dan kedudukan spora
♦ Ada tidaknya flagela, kedudukan, dan jumlah flagela
♦ Ada tidaknya kapsula
♦ Reaksi-reaksi pengecatan (pewarnaan)
2. Morfologi koloni meliputi bentuk, ukuran, tekstur, warna koloni, tipe medium.

Sifat Biokimia Bakteri:

Pengujian sifat biokimia bakteri meliputi:
1. Perubahan karbohidrat (daya fermentasi terhadap zat-zat gula dan hidrolisis
terhadap pati)
2. Hidrolisis lemak (bakteri dapat menghidrolisis lemak menjadi gliserol dan
asam lemak)
3. Penguraian protein (tiap-tiap spesies bakteri mempunyai daya hidrolisis dan
penguraian protein yang berbeda-beda)
4. Reduksi bermacam-macam unsur (bakteri anaerob dapat mereduksi garam
nitrat menjadi nitrit atau amonia, metilen blue atau indikator direduksi menjadi
tidak berwarna. Bakteri bersifat aerob obligat dapat mereduksi H2O2 menjadi
H2O dan O2)
5. Pembentukan figmen (pigmen akan tampak bila ada O2 bebas/aerob, dan dalam
keadaan anaerob pigmen akan hilang)
6. Pengujian biokimia khusus lainnya.

Tahapan identifikasi bakteri adalah sebagai berikut:

1. Isolat bakteri yang akan diuji dibiakkan pada media cair dan dilanjutkan dengan
media agar padat, setelah pertumbuhan lengkap sesuai lamanya inkubasi
biakan pada suhu ruang (30-37 oC) bahkan pada suhu thermofilik hingga 50 oC,
selanjutnya diamati morfologi koloninya. Pada tahap ini dilakukan dengan
mengamati kultur biakan dan koloni yang tumbuh pada permukaan agar (kasar,
halus) serta besarnya koloni (mm). kemudian dilakukan pengamatan morfologi
pada Media Khusus Gram Negatif (Mac Conkey Agar). Selain menggunakan
media tersebut diatas juga dapat menggunakan media selektive artinya bakteri
 yang akan diamati akan tumbuh pada media khusus (SS agar, XLD agar,
BRC).
1. Tes Katalase (Catalase Test)
Menggunakan H2O2 3% dengan cara meneteskan larutan tersebut pada
permukaan objek glass, biakan murni diambil dengan ose lalu disentuhkan pada
tetesan tersebut, bila dalam hitungan detik terdapat gelembung udara
menandakan catalase positive.
2. Tes Oksidase (Oxidase Test)
Menggunakan NNNN-tetramethyl-p-phenylene diamine dihydrocloride
(C6H4[N(CH3)2]22HCl) dicamper dengan asam askorbat (ascorbic acid),
larutan tersebut diteteskan pada kertas saring. Biakan murni diambil dengan
ose lalu digoreskan pada kertas saring tersebut. Bila dalam beberapa detik
terjadi perubahan warna biru/violet menandakan Oxidase positive
3. Motility-Slide
a. Biakan yang tumbuh pada media cair/broth diambil dengan ose dan
diletakkan pada cover glass, object glass. Pergerakan positif terlihat bergerak
dan berlarian dengan cepat sedang yang negatif hanya bergerak dan diam
ditempat.
b. Metode kedua yaitu menggunakan agar setengah padat yang ditempatkan
pada tabung. Kultur diambil lalu ditusukkan pada media dari atas ke bawah.
Setelah diinkubasi selama 24 jam terlihat penyebaran ke arah menyamping
seperti warna keruh berarti menandakan positif.
4. Indole
Indol merupakan zat yang berbau busuk yang dihasilkan oleh bakteri yang
ditumbuhkan dalam medium yang mengandung asam amino triptofan. Uji
indol dengan menggunakan pepton cair pada tabung dengan bantuan pereaksi
reagent kovac’s akan terlihat warna merah.
5. Methyl Red-Voger Proskaur (MRVP)
Pengujian ini dapat dilihat pada media methyl red pada tabung berwarna bening
teh, kultur terlebih dahulu dibiakkan semalam setelah terjadi kekeruhan
ditambahkan reagen methyl red 50-100 μL. Reaksi positif bila berwarna merah
dan negatif bila berwarna kuning. Sedang untuk pengujian Vorges Proskaur
 (VP) ke dalam media yang sama ditambahkan α-naphtol sebanyak 500-600 μL
lalu dikocok dan ditambahkan KOH 40% sebanyak 200 μL. Reaksi dapat
dilihat setelah 20-30 menit berwarna merah jika positif VP.
6. Citrate
Menggunakan media agar miring pada tabung yang berwarna hijau
ditambahkan bromthymol blue. Biakan digereskan pada permukaan agar lalu
diinkubasi 24-72 jam, perubahan warna menjadi biru jika positif. Untuk yang
negatif di reinkubasi beberapa hari hingga terjadi perubahan.
7. Nitrate Reaction
Menggunakan nutrien broth yang ditambahkan KNO3. Biakan murni
ditumbuhkan selama semalam setelah keruh menandakan cukup pertumbuhan
dengan menambahkan reagen Nitrate soln A dan soln B terjadi perubahan
warna menjadi merah terang.

Setelah pengujian di atas, dilakukan pengujian secara biokimia dengan

menggunakan berbagai macam uji gula-gula dengan menggunakan medium
Pepton water sebagai dasar medium digunakan Pepton 10 g, NaCl 5g, dan
aquadest 1000 ml lalu ditambahkan indikator phenol red (pH 7.2-7.4) kemudian
o
disterilisasi pada 115 C selama 20 menit. Penambahan gula-gula seperti
Aesculine, Arabinoce, Dulcitol, Fructose, Galactose, Inisitol, Lactose, Maltose,
Rafinose, Rhamnose, Salicin, Sorbitol, Sucrose, Trehalose, Xylose dengan
masing-masing konsentrasi antara 0.5-1%. Setelah penambahan gula-gula
dilakukan sterilisasi dengan steam selama 10 menit. Perubahan warna menjadi
kuning bila positif. Secara keseluruhan tahapan proses isolasi mikroba dan
determinasi/identifikasi bakteri seperti ditunjukkan pada Gambar 4.
 Persiapan Sampel

Pembuatan Media
(PDA & NA)

Pembiakan (inokulasi) mikroba

Pembiakan Pembiakan
Bakteri dalam Kapang/Khamir dalam
media NA media PDA

Isolasi Bakteri Isolasi

Kapang/Khamir

Koloni tunggal
Koloni tunggal

Pewarnaan Determinasi/identifikasi
bakteri bakteri

Uji sifat Biokimia

Genus/Spesies

Gambar 4 Tahapan isolasi dan identifikasi bakteri

3.7.5. Uji Kemampuan Degradasi Diazinon

Mikroorganisme dapat mendegradasi pestisida apabila mikroorganisme
tersebut diadaptasikan terlebih dahulu dengan lingkungan yang mengandung
pestisida. Karena dalam proses adaptasi tersebut terjadi sintesis enzim yang
dibutuhkan unuk mendegradasi senyawa-senyawa rekalsitran (Gumbira-Said dan
Fauzi 1995).
 Bakteri yang diperoleh dari hasil identifikasi lalu diujikan pertumbuhannya.
Media pertumbuhan dan adaptasi yang digunakan adalah Nutrient Agar (NA)
padat yang mengandung 100 dan 500 ppm diazinon.
Bakteri yang tumbuh kemudian dilakukan uji pembentukan zona jernih
untuk menguji kemampuannya dalam mendegradasi diazinon. Media yang
digunakan adalah media MSPY (Mineral Salt Pepton Yeast) yang mengandung
diazinon 1000 ppm, 1500 ppm, dan 1700 ppm. Bakteri tersebut diinokulasi selama
empat hari untuk melihat aktivitasnya dalam mendegradasi diazinon.

3.7.5.1. Pembuatan Media NA adaptasi.

Cara pembuatan media ini yakni dengan menimbang NA sebanyak 2.3 g
dan agar powder 0.5 g ke dalam 100 ml air destilata kemudian dipanaskan sambil
diaduk. Setelah mendidih dan homogen media disterilisasi dalam autoklaf pada
suhu 121 oC selama 15 menit. Kemudian media didinginkan (hangat kuku) lalu
ditambahkan diazinon 100 dan 500 ppm lalu dituang ke dalam petri steril. Setelah
padat petri ditutup dan dibalik agar uap air tidak jatuh ke atas permukaan agar.
Kemudian bakteri diinokulasikan dan diinkubasi pada suhu 30 oC selama 3 hari.

3.7.5.2. Pembuatan Media MSPY.

Pembuatan media MSPY dilakukan dengan cara melarutkan KH2PO4 0.2 g,
K2HPO4 0.5 g, MgSO4.7H2O 0.2 g, NaCl 0.2 g, CaCl2.2H2O 0.05 g, FeSO4.7H2O
0.025 g, Na2MoO4, 0.005 g, MnSO4 0.0005 g, NaWo2 0.0005 g, Bakto peptone 1.0
g, dan Yeast extract 2.0 g, ke dalam gelas piala yang berisi 1 liter air destilata
kemudian diaduk sambil mengatur pH pada kisaran 7.0 (pH netral). Lalu larutan
media dipindahkan ke dalam erlenmeyer yang berukuran 1 liter dan diisi bacto
agar sebanyak 15 g, kemudian disterilkan dalam autoklaf (Oshiro 1996). Media
steril tersebut kemudian ditambahkan diazinon dengan konsentrasi masing-
masing, 1000 ppm, 1500 ppm, dan 1700 pm.
Menurut Margot dan Stammbach (1964), bahwa diazinon menguap pada
suhu 83-84 oC, sensitif terhadap oksidasi pada suhu di atas 100 o
C dan
terdegradasi pada di atas 120 oC sehingga diazinon tidak dapat disterilkan dengan
autoklaf. Oleh karena itu diazinon harus disterilkan melalui proses sterilisasi
penyaringan yakni dengan menggunakan filter ukuran 0.45 μm (millipore).

3.8. Analisis Aktivitas Mikroba dengan Fluorescein Diacetate (FDA) Assay

Analisis aktivitas mikroba dilakukan dengan menggunakan metode seperti
yang dilakukan oleh Eggen (1999), yaitu menggunakan Fluorescein Diacetate
(FDA) Assay. FDA tidak digunakan untuk menghitung biomassa mikrobial tetapi
untuk membandingkan aktivitas mikroba hydrolitik dalam satu ekosistem yang
sama. Penentuan FDA dilakukan dengan cara menginkubasi sampel dalam larutan
buffer, yang bertindak sebagai penerima elektron yang menurunkan warna
fluorescein. Intensitas warna ditentukan dengan menggunakan spektofotometri.
Larutan standar FDA dibuat dengan melarutkan 0.0399 gram FDA ke
dalam 100 mL aseton. Kemudian ditimbang 10 gram kompos ke dalam
erlenmeyer yang telah diisi dengan larutan standar FDA masing-masing 0, 0.1;
0.2, 0.3, 0.5, 1.0 dan 1.5 mL, masing-masing erlenmeyer ditambah 50 mL buffer
fosfat. Larutan standar diinkubasi dengan penggoyangan (rotary shaker) pada
kecepatan 120 rpm selama satu jam kemudian ditambahkan 50 mL aseton untuk
menghentikan reaksi hidrolisis. Larutan disentrifugasi dengan kecepatan 6000
rpm selama 10 menit, lalu disaring. Absorban filtrat diukur dengan
spektrofotometri UV-VIS (Beckman DU 650) pada panjang gelombang (λ) 490
nm.
Perlakuan pada sampel dilakukan dengan cara menimbang FDA 0.200 gram
lalu dilarutkan dengan aseton kemudian ditambah dangan “deionized water”
(aquabidest) hingga 100 mL sebagai larutan stok. Sampel di timbang masing-
masing 10 gram ke dalam erlenmeyer lalu ditambah 50 ml buffer fosfat (pH 7.6)
dan larutan FDA 0.5 mL kemudian diinkubasi dengan rotary shaker pada
kecepatan 120 rpm selama satu jam kemudian ditambahkan 50 mL aseton.
Larutan didekantasi (pindahkan) ke dalam tabung sentrifugasi dan disetrifugasi
dengan kecepatan 6000 rpm selama 10 menit, lalu disaring dengan millipore (0.45
μm). Absorban diukur dengan spektrofotometri pada panjang gelombang (λ) 490
nm.
3.9. Rancangan Percobaan
Rancangan percobaan ini dilakukan dengan menggunakan dua faktor yaitu
konsentrasi diazinon (x1) dan perbandingan tanah dengan kompos (x2). Pada
penelitian ini dilakukan dengan menggunakan metode permukaan respon
(Respons Surface Method/RSM) mengikuti Rancangan Komposit Fraksional,
masing-masing peubah uji terdiri dari tiga taraf dengan rincian seperti ditunjukkan
pada Tabel 4.

Tabel 4 Kisaran dan taraf peubah uji pada optimasi bioremediasi

Nilai Nilai Nilai
Jenis Perlakuan faktor faktor faktor
terendah tengah tertinggi
(-1) 0 (+1)
Konsentrasi diazinon (ppm) 500 1000 1500

Rasio kompos dalam tanah (%) 10 20 30

Dalam penelitian ini digunakan Central Composite Design (CCD)

(Montgomery,1991) dengan 3 ulangan pada titik pusat sehingga memenuhi
model kuadratik, nilai pusat perlakuan digunakan konsentrasi diazinon 1000 ppm
dan rasio kompos dalam tanah 20%. Matriks satuan-satuan percobaan pada proses
bioremediasi dalam unit dan nilai asli seperti disajikan pada Tabel 5. Dimana nilai
asli diperoleh dengan rumus

Nilai asli =[(nilai tertinggi/rendah–nilai tengah) x nilai kode + nilai tengah] ......(2)
Tabel 5 Matriks satuan percobaan pada optimasi proses bioremediasi rancangan
komposit fraksional
Kode Nilai asli
No Diazinon Kompos Diazinon Kompos(%) Keterangan
(ppm)
1 1 1 1500 30 P1
2 -1 1 500 30 P2
3 1 -1 1500 10 P3.
4 -1 -1 500 10 P4
5 0 0 1000 20 P51
6 0 0 1000 20 P52
7 0 0 1000 20 P53
8 1.414 0 1707 20 P6
9 -1.41 0 293 20 P7
10 0 1.414 1000 35 P8
11 0 -1.414 1000 6 P9
12 - - 1000 0 K1
13 - - 1000 0 K2

Dengan dua peubah uji tersebut maka model kuadratiknya seperti bentuk
persamaan berikut:

Yi = bo + b1x1i + b2x2i + b11x1i2 +b22x2i2 +b12x1i + ri ……….……………….. (3)

Keterangan:
Y = Respon dari masing-masing perlakuan
X = (x1: konsentrasi diazinon; x2: rasio kompos dalam tanah)
b = Koefisien parameter
r = error

Parameter respon utama yang digunakan adalah penurunan konsentrasi

diazinon. Sebagai kontrol digunakan tanah tidak disterilisasi dan tanpa
penambahan kompos (K1), dan tanah disterilisasi tanpa kompos (K2) dengan
masing-masing konsentrasi diazinon 1000 ppm.