Anda di halaman 1dari 12

LAPORAN PRAKTIKUM

GENETIKA

PERCOBAAN IX
ISOLASI DNA

NAMA : MASYKUR

NIM : H041171318

HARI/TGL : SABTU/14 APRIL 2018

KELOMPOK : II (DUA)

ASISTEN : RESKI RAHMAWATI ANWAR

LABORATORIUM GENETIKA
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS HASANUDDIN
MAKASSAR
2018
BAB I
PENDAHULUAN

I.1 Latar Belakang

DNA memiliki struktur pilinan utas ganda yang antiparalel dengan

komponen-komponennya, yaitu gula pentosa (deoksiribosa), gugus fosfat, dan

pasangan basa. Pasangan basa pada DNA terdiri atas dua macam, yaitu basa purin

dan pirimidin. Basa purin terdiri atas adenin (A) dan guanin (G) yang memiliki

struktur cincin ganda, sedangkan basa pirimidin terdiri atas sitosin (C) dan timin

(T) yang memiliki struktur cincin-tunggal (Faatih, 2009).

Sebuah sel memiliki DNA yang merupakan materi genetik dan bersifat

herediter pada seluruh sistem kehidupan. Genom adalah set lengkap materi

genetik (DNA) yang dimiliki suatu organisme dan terorganisasi menjadi

kromosom. DNA dapat diisolasi, baik dari sel hewan, manusia, maupun pada

tumbuhan. DNA manusia dapat diisolasi melalui darah. Darah manusia terdiri atas

plasma darah, globulus lemak, substansi kimia (karbohidrat, protein dan hormon),

dan gas (oksigen, nitrogen dan karbon dioksida). Plasma darah terdiri atas eritrosit

(sel darah merah), leukosit (sel darah putih) dan trombosit (platelet). Komponen

darah yang diisolasi yaitu sel darah putih. Sel darah putih dijadikan pilihan karena

memiliki nukleus, dimana terdapat DNA di dalamnya. DNA pada tumbuhan juga

dapat diisolasi, contohnya pada tumbuhan bawang merah (Allium cepa) dan pada

pisang (Musa sp.) (Faatih, 2009).

Berdasarkan uraian diatas, maka dilakukanlah praktikum Isolasi DNA ini

untuk mengetahui cara atau metode yang benar secara konvensional untuk

memisahkan atau mengisolasi DNA dari buah-buahan.


I.2. Tujuan Percobaan

Tujuan dari praktikum ini yaitu:

1. Untuk mengetahui cara atau metode yang benar untuk memisahkan atau

mengisolasi DNA dari buah-buahan.

2. Mengetahui keefektifan deterjen dan buah yang dipakai untuk melakukan

percobaan isolasi DNA

I.3. Waktu dan Tempat Percobaan

Percobaan ini dilaksanakan pada hari Sabtu, 14 April 2018, pukul 14.00-

17.00 WITA, bertempat di Laboratorium Genetika, Jurusan Biologi, Fakultas

Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Hasanuddin, Makassar.


BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

II.1 Tinjauan Umum

Pada sel eukariotik termasuk tanaman dan hewan bagian terbesar dari

DNA berada pada nukleus yaitu organel yang dipisahkan dari sitoplasma dengan

membran. Nukleus terdiri dari 90 % keseluruhan DNA seluler. Sisa DNA adalah

organel lain seperti mitokondria dan kloroplas. Karena DNA terdapat pada

nukleus, maka perlu adanya metode pelisisan sel sampai pemanenan sel. Dimana

metode tersebut merupakan bagian dari metode isolasi DNA (Elrod, 2007).

DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan

berfungsi untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan

secara seluler. Dilihat dari organismenya, struktur DNA prokariot berbeda dengan

struktur DNA eukariot. DNA prokariot tidak memiliki protein histon dan

berbentuk sirkular, sedangkan DNA eukariot berbentuk linear dan memiliki

protein histon. Pada isolasi DNA, pengerjaannya harus sangat hati-hati karena

DNA sangat mudah rusak oleh enzim DNAse yang terdapat pada kulit, saliva

maupun air mata pemeriksa. Oleh karena itu selama pengerjaan harus

mengenakan sarung tangan dan berbicara sesedikit mungkin (Faatih, 2009).

DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan

berfungsi untuk mengatur perkembangan biologi seluruh bentuk kehidupan secara

seluler. Isolasi DNA dianggap penting sebagai langkah awal dalam mengenali

profil pita DNA. Namun, yang menjadi kendala adalah terkadang dalam

melakukan isolasi DNA, ditemukan DNA yang memiliki kualitas dan kuantitas

yang rendah. Hal tersebut dapat diketahui dari konsentrasi DNA-nya. Memang
dalam per-kembangannya yang semakin pesat, banyak alternaif metode untuk

isolasi DNA (Mawardi, 2016).

Isolasi DNA merupakan salah satu tahap penting dalam kegiatan berbasis

molekuler. Dibutuhkan DNA dengan kualitas yang baik untuk berbagai kegiatan

seperti pemanfaatan marka molekuler, pembuatan pustaka genom, hingga

sekuensing. Permasalahan utama yang sering muncul dalam proses isolasi DNA

tanaman adalah kehadiran senyawa kontaminan pada sampel yang diisolasi seperti

senyawa polisakarida, polifenol, protein, RNA, dan senyawa metabolit sekunder

yang terdapat pada tumbuhan obat. Menurut Ranjan, kehadiran senyawa

kontaminan tersebut dapat menghambat berbagai proses mulai dari pemotongan

DNA, amplifikasi, hingga kloning (Nugroho, 2015).

Isolasi DNA/RNA merupakan langkah awal yang harus dikerjakan dalam

rekayasa genetika sebelum melangkah ke proses selanjutnya. Prinsip dasar isolasi

total DNA/RNA dari jaringan adalah dengan memecah dan mengekstraksi

jaringan tersebut sehingga akan terbentuk ekstrak sel yang terdiri atas sel-sel

jaringan, DNA, dan RNA. Kemudian ekstrak sel dipuri-fikasi sehingga dihasilkan

pelet sel yang mengandung DNA/RNA total. Prinsip-prinsip isolasi DNA plasmid

hampir sama dengan isolasi total DNA/RNA dari jaringan (Faatih, 2009).

Langkah pertama untuk mendapatkan DNA plasmid adalah dengan

menumbuhkan sel-sel bakteri yang mengandung plasmid rekombinan. Setelah itu

sel dipanen, dinding serta membran sel dipecah sehingga isi sel (ekstrak sel)

keluar. Ekstrak sel ini kemudian dipurifikasi dengan serangkaian perlakuan

sehingga diperoleh DNA plasmid yang murni. Isolasi DNA yang dilakukan dalam

penelitian ini menurut standar prosedur yang sudah biasa dilaksanakan.


Homogenisasi sel dengan prosedur ini akan menghasilkan DNA utuh karena

proses ini menyebabkan disrupsi sel dan tercucinya komponen-komponen sel lain

selain DNA. Penambahan kloroform setelah sentrifugasi memisahkan larutan

menjadi fase cair dan padat dimana fase cair merupakan DNA dan fase padat

adalah campuran protein dan DNA (Faatih, 2009).

Modifikasi metode standar ekstraksi DNA diperlukan pada ekstraksi DNA

dari daun tanaman yang mengandung banyak polisakarida atau metabolit

sekunder. Ekstraksi DNA daun tanaman Grevillea (Proteaceae) dengan

memodifikasi metode Doyle dan Doyle, telah berhasil diperoleh DNA dengan

kualitas yang baik. Berdasarkan penelitian memperlihatkan hasil ekstraksi DNA

yang kurang optimal baik kualitas maupun kuantitas DNA yang dihasilkan

sehingga mempengaruhi intensitas pita DNA hasil amplifikasi yang tidak jelas.

Hal tersebut menunjukkan bahwa metode isolasi DNA yang telah dilakukan pada

tanaman padi tidak dapat diaplikasikan secara maksimal pada tanaman lain

khususnya jenis tanaman kehutanan (Restu, 2012).

II.2 Prinsip Isolasi DNA

Prinsip utama dalam isolasi DNA ada tiga yakni penghancuran (lisis),

ekstraksi atau pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan protein, serta

pemurnian DNA. Ada beberapa hal yang perlu diperhatikan dalam proses isolasi

DNA antara lain harus menghasilkan DNA tanpa adanya kontaminan seperti

protein dan RNA, metodenya harus efektif dan bisa dilakukan untuk semua

spesies. Metode yang dilakukan dilakukan tidak boleh mengubah struktur dan

fungsi molekul DNA, dan metodenya harus sederhana dan cepat (Nugroho, 2017).
Ada 5 tahap untuk melakukan isolasi DNA, yaitu: isolasi sel, pelisisan

dinding dan membran sel, pengekstraksian dalam larutan, purifikasi, dan

presipitasi. Tahap pertama yang dilakukan yaitu mengisolasi sel yang ingin

digunakan, yaitu sel bakteri. Tahap selanjutnya yaitu melisiskan dinding dan

membran sel dengan larutan pelisis sel. Setelah dilakukan inkubasi, sitoplasma sel

yang telah bercampur dengan pelisis sel tersebut lalu disentrifugasi selama 15

menit dengan kecepatan 3000 rpm. Selanjutnya supernatan yang terbentuk

dibuang dan kemudian dilakukan ekstraksi di dalam larutan. Hal tersebut

bertujuan agar didapat ekstrak nukleus sel. Tahap berikutnya adalah purifikasi.

Tahap ini bertujuan untuk mem-bersihkan nukleus sel dari zatzat lainnya, dan

tahap terakhir, yaitu presipitasi bertujuan untuk mengendapkan protein, se-hingga

untai-untai DNA tidak lagi menggulung (coiling), yang menyebabkan DNA

menjadi terlihat (Faatih, 2009).

Ada banyak faktor yang mempengaruhi proses isolasi DNA antara lain

bagaimana memilih jenis jaringan yang akan digunakan dan umur jaringan

tersebut, bagaimana menangani dan menyimpan jaringan tersebut sebelum

diisolasi DNAnya, dan bagaimana melakukan homogenasi jaringan tersebut,

terutama pada jaringan tumbuhan yang dinding selnya banyak mengandung

senyawa polisakarida. Menurut Syafaruddin dan Santoso terdapat tiga faktor

penentu dalam proses ekstraksi dan purifikasi DNA secara optimal antara lain

proses penghomogenan jaringan tanaman, komposisi penambahan larutan buffer

pada saat penggerusan daun/jaringan tanaman sampel, dan penghilangan enzim

penghambat polisakarida khususnya untuk tanaman tahunan. Oleh sebab itu

Varma menyatakan bahwa proses isolasi DNA lebih merupakan sebuah seni

dibanding sains (Nugroho, 2015).


Buffer lysis dan Proteinase-K disini dipakai sebagai reagen pelisis supaya

komponen DNA dalam sitoplasma sel bisa keluar dan diisolasi. Phenol digunakan

untuk mengendapkan komponen protein lain yang tidak dikehendaki sedangkan

etanol 70% sebagai pencuci hasil isolasi (Faatih, 2009).

Dalam pelisisan dinding sel digunakan antibiotik, lalu disentrifugasi untuk

memperoleh sel. Selanjutnya digunakan larutan pelisis sel lysing solution yang

mengandung EDTA (ethylenediamine tetraacetic acid) yang akan membentuk

kompleks (chelate) dengan ion logam, seperti Mg2+ yang merupakan kofaktor

DNAse. Selanjutnya tabung dibolak-balik dengan gerakan memutar yang

membentuk angka 8 agar larutan dapat menyatu dengan sempurna selama 10

menit. Sel yang telah bercampur dengan pelisis sel tersebut lalu disentrifugasi

selama 10 menit dengan kecepatan 12000 rpm. Selanjutnya supernatan yang

terbentuk dimbil dalam filter, sedangkan pellet dibuang. Tahap selanjutnya yaitu

purifikasi. Purifikasi bertujuan untuk membersihkan plasmid dari zat-zat lainnya,

kedalam larutan tadi kemudian diberikan fenol CIAA lalu divortek dan

disentrifugasi, dilakukan berulang. Hal tersebut bertujuan untuk mengoptimalkan

kerja CIAA. Sehingga supernatan yang mengandung plasmid dipisahkan, pellet

dibuang. Tahap berikutnya yaitu presipitasi; dilakukan dengan cara meneteskan

larutan presipitasi protein dan kemudian divortex yang bertujuan untuk

menghomogenkan larutan. Larutan presipitasi protein terdiri atas kalium asetat

atau Na-asetat yang jika berikatan dengan protein mengakibatkan terbentuknya

senyawa baru yang memiliki kelarutan yang lebih rendah, sehingga menyebabkan

plasmid mengendap. Hasil dari sentrifugasi adalah terdapatnya pelet DNA

plasmid pada dasar tabung yang kemudian ditambahkan etanol 70% dan dibolak-

balik kembali. Pemberian etanol bertujuan untuk membersihkan DNA plasmid


dari pengotor-pengotornya. Hasil akhirnya adalah DNA plasmid yang berada pada

tepi dasar tabung. Langkah akhirnya adalah dengan pemberian Tris-EDTA yang

bertujuan untuk melarutkan kembali DNA plasmid untuk dipreservasi

(Murtiyaningsih, 2017).

Penambahan senyawa pereduksi seperti merchaptoetanol dalam proses

isolasi DNA dapat mencegah proses oksidasi senyawa fenolik sehingga

menghambat aktivitas radikal bebas yang dihasilkan oleh oksidasi fenol terhadap

asam nukleat. Penggunaan CTAB dalam buffer ekstraksi berguna untuk

mengeliminasi polisakarida. Selanjutnya Fang dan Tel-zur, menyatakan bahwa

penambahan NaCl dengan konsentrasi di atas 1 M dapat meningkatkan kelarutan

polisakarida sehingga lebih mudah untuk dihilangkan. Dengan demikian, buffer

CTAB cukup memenuhi syarat untuk digunakan dalam ekstraksi DNA dari

tanaman yang mengandung karbohidrat dan fenol tinggi karena tidak merusak

DNA. Buffer CTAB dengan kandungan garam yang tinggi dapat memisahkan

polisakarida dari dinding sel, sedangkan PVP dapat mengurangi browning akibat

kandungan fenol pada daun muda (Restu, 2012).

Larutan NaCI/CTAB (hexadecyltrimethylammonium bromide) yang

dijelaskan oleh Rogstad digunakan untuk mengawetkan material daun. Namun,

ekstraksi DNA yang direkomendasikan oleh Rogstad tidak menghasilkan DNA

berkualitas tinggi dari spesimen kami, mungkin karena daun yang direndam

dengan larutan NaCI/CTAB jenuh tidak cukup dihancurkan dalam nitrogen cair.

Ketika mencari metode lain dari ekstraksi DNA yang cocok untuk bahan tanaman

yang diawetkan oleh NaCI/CTAB, kami menemukan bahwa protokol ekstraksi

DNA Lassner yang dimodifikasi oleh Terauchi memberikan hasil yang baik

(Storchova, 2000).
Menurut Anuradha CTAB merupakan detejen kationik yang bersifat

melarutkan membran plasma dan membentuk kompleks ikatan dengan fruktan

serta senyawa polisakarida lainnya yang nantinya dapat dihilangkan selama

penambahan senyawa kloroform. Proses eliminasi senyawa polisakarida

merupakan tahapan yang penting karena menurut Varma polisakarida seringkali

mengendap bersama dengan DNA, menyebabkan tekstur larutan DNA menjadi

kental dan lengket. Menurut Fang kehadiran senyawa polisakarida dapat

menghambat aktivitas enzim restriksi dan Taq Polymerase. Penambahan senyawa

PVP pada metode ini berfungsi untuk mengurangi oksidasi senyawa fenolik. PVP

akan membentuk senyawa kompleks melalui ikatan hidrogen dengan senyawa

fenolik dan terendap bersama debris sel sehingga mencegah terjadinya interaksi

antara polifenol dengan DNA (Nugroho, 2015).

Pada beberapa metode isolasi digunakan senyawa seperti PVP, natrium

disulfit, dan β merkaptoetanol untuk mengurangi aktivitas senyawa polifenol.

Namun senyawa seperti β merkaptoetanol cukup berbahaya bila digunakan pada

laboratorium yang tidak memiliki lemari asam. Baunya yang menyengat dapat

mengganggu sistem pernafasan. Selain β-merkaptoetanol, asam askorbat

merupakan senyawa antioksidan yang dapat digunakan dalam proses isolasi DNA

untuk mengurangi aktivitas senyawa polifenol. Dibanding β-merkaptoetanol,

asam askorbat merupakan senyawa tidak berbahaya dan tidak menimbulkan bau

yang menyengat. Beberapa penelitian menunjukkan efektivitas penggunaan asam

askorbat dalam proses isolasi DNA seperti pada penelitian Ginwal dan Maurya

pada isolasi DNA tanaman Dalbergia sissoo, Borse pada isolasi DNA 12 tanaman

obat, dan Anuradha pada isolasi DNA tanaman murbei (Murtiyaningsih, 2017).
DAFTAR PUSTAKA

Elrod, S., dan Stansfield, W., 2007. Genetika Edisi Keempat. Erlangga, Jakarta.

Faatih, Mukhlissul. 2009. Isolasi dan Digesti DNA Kromosom. Jurnal Penelitian
Sains dan Teknologi. 10(1): 61-67.

Mawardi, A., dan Simonapendi, M. I., 2016. Uji Efektivitas Metode Isolasi DNA
Genom Kopi Arabika (Coffea arabica L.) Asal Kabupaten Jayawijaya.
Jurnal Biologi Papua. 8(1): 7-12.

Murtiyaningsih, Hidayah. 2017. Isolasi DNA Genom dan Identifikasi


Kekerabatan Genetik Nanas Menggunakan Rapid (Random Amplified
Polimorfic DNA). Jurnal Agritrop. 15(1): 84-90.

Nugroho, E. D., dan Rahayu, D. A., 2017. Pengantar Bioteknologi (Teori dan
Aplikasi). Deepublish, Yogyakarta.

Nugroho, K., Terryana, R. T., dan Lestari, P., 2015. Optimasi Metode Isolasi
DNA pada Jatropha spp. Jurnal Agroteknologi. 5(2): 15-22.

Restu, M., Mukrimin., dan Gusmiaty., 2012. Optimalisasi Teknik Ekstraksi dan
Isolasi DNA Tanaman Suren (Toona Sureni Merr.) untuk Analisis
Keragaman Genetik berdasarkan Random Amplified Polymorphic DNA
(RAPD). Jurnal Natur Indonesia. 14(2): 138-142.

Storchova, H., Hrdlikova, R., Chrtek, J., Tetera, M., Fitze, D., dan Fehrer, J.,
2000. An Improved Method of DNA Isolation from Plants Collected in
the Field and Conserved in Saturated NaCl/CTAB Solution. Taxon
Journal. 49(1): 79-84.