BAB I

PENDAHULUAN
I.1 Latar Belakang
Indonesia dikenal sebagai salah satu pusat penyebaran berbagai tumbuhan
tropis di indonesia dan dapat diperkirakan di seluruh kepulauan nusantara terdapat
lebih dari 30.000 spesies tumbuhan tinggi dari lebih 250.000 spesies yang terdapat
di dunia. Penelitian terhadap kandungan kimia tumbuhan tinggi menghasilkan
penemuan-penemuan baru. Tumbuhan memengang peran penting dalam
kelangsungan hidup mahluk diatas bumi. Disamping tumbuhan sesungguhnya
merupakan potensi kimia dari sebagai besar sumber daya hayati yang ada diatas
bumi, yang setiap saat dapat memproduksi senyawa kimia secara teratur dan
seimbang baik berupa produk metabolit primer dan metabolit sekunder. Senyawa
kimia tersebut berfungsi untuk mendukung sebagai alat interaksi terhadap aspek
osistem (Cunha, 1998 dan sukandar,2000).
Sebanyak 250.000 spesies tumbuhan tinggi yang terdapat di permukaan
bumi ini lebih dari 50% diantaranya berada di hutan tropis dan hanya 0,4% saja
yang telah diselidiki kandungan kimia bioaktif yang berasal dari tumbuhan tinggi
(Farnsworth, 1990, Dalan ahmad, 1995).
Penggunaan bahan alam sebagai obat tradisional di Indonesia telah
dilakukan oleh nenek moyang kita sejak berabad-abad yang lalu sebagai salah satu
upaya dalam penanggulangan masalah kesehatan. Indonesia dengan jumlah
penduduk lebih dari 200 juta jiwa, memiliki lebih kurang 30.000 spesies
tumbuhan dan 940 spesies diantaranya termasuk tumbuhan berkhasiat. Tumbuhan
tersebut menghasilkan metabolit sekunder dengan struktur molekul dan aktifitas
biologi yang beraneka ragam serta memiliki potensi yang sangat baik untuk
dikembangkan menjadi obat berbagai macam penyakit (Titis et all, 2013).
Tanaman yang dapat dimanfaatkan sebagai tanaman obat diantaranya
meranti sabut, daun andong, bakau merah, tanaman mindi, kayu bitti, daun terap,
dan biji kemangi. Tanaman-tanaman tersebut sudah banyak digunakan secara
turun temurun.
 Daun meranti sabut dimanfaatkan masyarakat kalimantan dan sumatera
untuk mengobati diare, luka bakar, obat sariawan dan dapat memperlancar
peredaran darah. Daun andong banyak sekali digunakan sebagai obat sakit kepala,
diare, disentri, TBC paru, asma, sakit kulit, inflamasi mata, sakit punggung,
rematik dan encok (Achmad 2004). Kulit batang bakau merah digunakan untuk
mengobati penyakit diabetes, dan sebagai astringent untuk diare. Tanaman mindi
digunakan secara tradisional untuk obat malaria, diabetes, batuk, penyakit kulit,
dan lain-lain (Azam, 2013). Kayu bitti di Sulawesi Selatan digunakan sebagai
bahan kayu bangunan dan merupakan jenis kayu unggulan (Gusmiaty dkk., 2012),
dan daun kemangi secara tradisional telah digunakan sebagai obat untuk
menyembuhkan sakit kepala, batuk, diare, sembelit, penyakit kulit, penyakit
cacingan dan gagal ginjal.
Berdasarkan urain di atas, maka perlu dilakukannya penelitian lebih lanjut
mengenai kandungan senyawa aktif yang terkandung dalam beberapa tanaman
tersebut.
I.2 Rumusan Masalah
I.2.1 Bagaimana cara isolasi, karakterisasi dan uji aktivitas senyawa kumarin
dari ekstrak aktif etil asetat kulit batang Loa (Ficus racemosa L.) ?
I.2.2 Bagaimana toksisitas dari larva (Artemia salina Mill.) terhadap ekstrak etil
asetat daun meranti sabut (Shore Ovalis (Korth.) ?
I.2.3 Bagaimana karakteristik senyawa terpenoid dari hasil isolasi fraksi aktif
ekstrak daun andong (Cordyline fruticosa [L.] A. Cheval) terhadap
aktifitas antioksidan ?
I.2.4 Bagaimana cara mengisolasi dan mengkarakterisasi senyawawa fenolik
yang terdapat pada ekstrak kloroform batang tumbuhan bakau merah ?
I.2.5 Bagaimana cara mengetahui aktivitas isolat batang tumbuhan bakau merah
sebagai biolarvasida ?
I.2.6 Apakah tanaman mindi memiliki sifat sitotoksik ?
I.2.7 Berapa dosis ekstrak tanaman mindi yang memiliki sifat sitotoksik ?
I.2.8 Apakah kayu bitti mempunyai senyawa antikanker dan bersifat toksik ?
I.2.9 Bagaimana cara mengidentifikasi dan karakterisasi senyawa bioaktif
antikanker yang terdapat dalam ekstrak n-heksana kulit batang kayu bitti
(V. cofassus) ?
I.2.10 Bagaimana hasil isolasi, identifikasi dan uji toksisitas senyawa flavonoid
fraksi kloroform dari daun terap (Artocarpus odoratissimus Blanco) ?
I.2.11 Apakah Ekstrak Etanol Biji Kemangi (Ocimumbasilicum L.) memiliki
aktivitas antioksidan ?
I.2.12 Bagaimana tahapan isolasi dan karakteristik isolasi biji kemangi
(Ocimumbasilicum L.) ?
I.3 Tujuan
I.3.1 Untuk mengetahui proses isolasi dari ekstrak etil asetat daun meranti sabut
(Shore Ovalis (Korth.))
I.3.2 Untuk mengetahui tingkat toksisitas dari larva (Artemia salina Mill.)
terhadap ekstrak etil asetat daun meranti sabut (Shore Ovalis (Korth.)
I.3.3 Untuk menentukan karakteristik senyawa terpenoid dari isolat ekstrak
daun andong (Cordyline fruticosa [L.] A. Cheval).
I.3.4 Untuk mengetahui cara mengisolasi dan mengkarakterisasi senyawa
fenolik yang terdapat pada ekstrak kloroform batang tumbuhan bakau
merah.
I.3.5 Untuk mengetahui golongan alkaloid yang terkandung dalam daun mindi
serta sifat toksik daun mindi dan dosis yang memiliki efek sitotoksik.
I.3.6 Untuk mengidentifikasi dan mengkarakterisasi senyawa bioaktif
antikanker yang terdapat dalam ekstrak n-heksana kulit batang kayu bitti
(V. cofassus).
I.3.7 Untuk menentukan nilai bioaktivitas senyawa antikanker dari kulit batang
kayu bitti (V. cofassus) terhadap kematian larva Artemia salina Leach.
I.3.8 Untuk mengetahui hasil isolasi, identifikasi dan uji toksisitas senyawa
flavonoid fraksi kloroform dari daun terap (Artocarpus odoratissimus
Blanco).
I.3.9 Untuk mengetahui aktivitas antioksidan dari ekstrak etanol biji kemangi
(Ocimumbasilicum L.).
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

II.1 Uraian Tanaman

II.1.1Klasifikasi Tanaman + Gambar
II.1.1.1 Klasifikasi Tanaman Meranti Sabut
 Gambar 1. Daun meranti
Tumbuhan Meranti Sabut dapat diklasifikasikan sebagai
berikut.
Kingdom : Plantae
Phylum : Tracheophyta
Class : Magnoliopsida
Ordo : Theales
Famili : Dipterocarpaceae
Genus : Shorea
Spesies : Shorea ovalis (Kort) (Cronquist, 1981)
II.1.1.2 Klasifikasi Tanaman Andong

Gambar 2. Tumbuhan Andong

Tumbuhan Andong dapat diklasifikasikan sebagai
berikut.

Kingdom : Plantae
Sub kingdom : Virildiplantae
Divisi : Tracheophyta
Sub divisi : Spermatophytina
Kelas : Magnoliopsida
Ordo : Asparagales
Famili : Asparagales
Genus : Cordyline
Spesies : Cordyline fruticosa ( L) A. Cheval
II.1.1.3 Klasifikasi Tanaman Bakau Merah

Gambar 3. Tumbuhan Bakau Merah

Tumbuhan Bakau Merah dapat diklasifikasikan sebagai

berikut.
Divisi : Spermatophyta
Sub divisi : Angiospermae
Kelas : Dicotiledonae
Sub kelas : Dialypetalae
Ordo : Myrtales
Famili : Rhizophoraceae
Genus : Rhizophora
Spesie : Rhizophora sp. (Chapman, 1976)
II.1.1.4 Klasifikasi Tanaman Mindi

Gambar 4. Daun Mindi

Tumbuhan Mindi dapat diklasifikasikan sebagai berikut.

Kingdom : Plantae
Sub Kingdom : Tracheobionta
Super Divisi : Spermatophyta
Divisi : Magnoliophyta
Kelas : Magnoliopsida
Sub Kelas : Rodidae
Ordo : Rutales
Famili : Meliaceae
Genus : Melia
Spesies : Melia azedarach L.
II.1.1.5 Klasifikasi Tanaman Bitti

Gambar 5. Pohon Bitti

Tumbuhan Bitti dapat diklasifikasikan sebagai berikut.

Kingdom : Plantae
Divisio : Spermatophyta
Class : Angiospermae
Ordo : Tubiflorae
Famili : Verbenaceae
Genus : Vitex
Spesies : Vitex cofassus
II.1.1.6 Klasifikasi Tanaman Terap

Gambar 6. Daun dan buah Terap

Tanaman Terap dapat di klasifisikan sebagai berikut.

Kingdom : Plantae
Divisi : Magnoliophyta
Kelas : Magnoliopsida
Ordo : Morales
Famili : Morcaceae
Genus : Artocarpus
Spesies : Artocarpus odoratissimus Blanco
 II.1.1.7 Klasifikasi Tanaman Kemangi

Gambar 7. Tanaman Kemangi

Tanaman Kemangi dapat di klasifisikan sebagai berikut.

Kingdom : Plantae
Sub kingdom : Tracheobionta
Divisi : Magnoliophyta
Sub Divisi : Spermatophyta
Kelas : Magnoliopsida
Sub kelas : Asteridae
Ordo : Lamiales
Family : Lamiaceae
Genus : Ocimum
Spesies : Ocimum sanctum L.
II.1.2Deskripsi Tanaman
II.1.2.1 Deskripsi Tanaman Meranti Sabut
Shorea adalah tumbuhan famili Dipterocarpaceae yang
merupakan kelompok tumbuhan tingkat tinggi penghuni hutan
tropis yang tersebar di sebagian wilayah Indonesia terutama hutan
Kalimantan dan Sumatera. Jenis-jenis Dipterocarpaceae tersebar
luas terutama di Asia tenggara hingga ke arah barat Srilanka,
India utara, dan ke arah timur Filipina dan Indonesia. Di
Indonesia sendiri tanaman ini tumbuh alami di daerah
Kalimantan, Sumatera, Jawa, Nusa Tenggara, Bali, Sulawesi dan
Maluku (Ismarti, 2011).
II.1.2.2 Deskripsi Tanaman Andong
Tanaman andong merupakan perdu tegak dengan tinggi
2-4 m, jarang bercabang, batangnya bulat, keras, bekas daun
rontok berbentuk cincin. Daunnya tunggal dengan warna hijau,
ada juga yang berawarna merah kecoklatan. Letak daun tersebar
pada batang, terutama berkumpul di ujung batang. Helaian
berbentuk lanset dengan panjang 20 – 60 cm dan lebar 5-13 cm.
ujung dan pangkalanya runcing, tepinya rata, pertlangannya
menyirip dan tangakai daunnya berbentuk talang (Dalimartha,
2006).
Bunga bermalai besar, muncul dari tengah- tengah kluster
daun. Panjang bunga anatar 30- 38 cm, melengkung dan
bercabang. Bunga berwarna keunguan dan terdiri dari kelopak
bunga yang sempit dengan 6 lobus runcing, 6 benang sari dan
putik putih dengan 3 ovarium. Bunga andong merupakan bunga
majemuk yang bertangakai panjang dengan daun pelindung yang
besar pada pangkal cabang, panjangnya kurang lebih 1,4 cm. anak
daun pelindung pada pangkal bunga berukuran kecil ( Little Jr
dan Skolmen, 1989)
II.1.2.3 Deskripsi Tanaman Bakau Merah
Perawakan: pohon, tinggi dapat mencapai 15 m,
permukaan batang berwarna abu-abu kehitaman, bercelah halus.
Daun: permukaan atas halus, mengkilap, ujung meruncing,
dengan duri, bentuk lonjong dengan lebar bagian tengah, ukuran
panjang 8-12 cm, permukaan bawah tulang daun berwarna
kehijauan, berbintik-bintik hitam tidak merata. Karangan bunga:
terletak di ketiak daun, bercabang 2-3 kali, masing-masing cabang
4-16 bunga tunggal, kelopak 4, berwarna kuning gading, mahkota
4, berwarna keputihan, benang sari 8, tangkai putik jelas (stilus),
panjang 0,4-0,6 cm. Buah: mirip bentuk jambu air, warna coklat,
ukuran 1,5-2 cm, hipokotil berdiameter 2-2,5 cm, permukaan
halus, panjang dapat mencapai 30 cm. Akar: tunjang. Habitat:
tanah basah, sedikit berlumpur, berpasir (Backer dan Bakhuizen
v.d. Brink, 1963; Chapman, 1976; DingHou, 1958; Fernando dan
Pancho, 1980; Kitamura et al., 1997; Noor dkk., 1999; Tomlinson,
1986).
II.1.2.4 Deskripsi Tanaman Mindi
Mindi (Melia azedarach L.) Tanaman mindi termasuk
dalam famili meliaceae, daun mindi memiliki nama daerah di
Jawa dengan gringging, mementin berbentuk pohon yang dapat
mencapai ketinggian 30 m. Daun mindi tersusun sebagai daun
majemuk, anak daun berbentuk elips, panjang 3-9 cm, lebar 15-30
mm, tepi daun bergerigi, ujung dan pangkal daunnya runcing serta
berwarna hijau. Pada umumnya bahan aktif yang terkandung pada
tumbuhan mindi berfungsi sebagai antifedant terhadap serangga
dan menghambat perkembangan serangga. Daun mindi telah
diketahui dapat digunakan sebagai pestisida alami. Ekstrak daun
mindi dapat digunakan pula sebagai bahan untuk mengendalikan
hama (Kartasapoetra, 2009).
II.1.2.5 Deskripsi Tanaman Bitti
Kayu Bitti (Vitex cofassus) merupakan salah satu
pohon endemik Sulawesi yang pada dasarnya adalah pohon
khas provinsi Gorontalo. Kayu yang dihasilkan merupakan
kayu unggulan Sulawesi Selatan. Dibeberapa daerah dikenal
dengan nama gufasa. Di tingkat internasional, kayu Bitti (Vitex
cofassus) banyak di ekspor dari Papua Nugini dan beberapa
negara di kepulauan Pasifik lainnya (Lenny S, 2006).
Kayu Bitti (Vitex cofassus) mempunyai ukuran pohon
yang sedang hingga besar. Batangnya mempunyai diameter
yang dapat mencapai 30-170 sentimeter, kayunya padat dan
berwarna kepucatan. Kayunya sedang hingga berat serta kuat dan
tahan lama. Struktur daun bersilangan dan memiliki susunan
bunga terminal yang merupakan bunga berkelamin ganda.
Mahkota bunga berwarna putih keunguan dan terdapat tangkai
dan kepala sari di dalam rongga mahkota. Bakal buah beradadi
atas dasar bunga dan mempunyai buah yang berdaging yang
berbentuk bulat hingga lonjong. Buahnya berwarna ungu tua
dan terdapat 1 sampai 4 biji dalam setiap buahnya (Lenny S,
2006).
II.1.2.6 Deskripsi Tanaman Terap
Terap atau tarap adalah sejenis pohon buah dari marga
pohon nangka (Artocarpus). Buahnya serupa nangka yang kecil,
dengan bau wangi yang kuat, seperti dicerminkan oleh nama
ilmiahnya: Artocarpus odoratissimus. Buah ini juga dikenal
sebagai marang (Filipina) atau Johey Oak (Ingg.).
Pohon terap tingginya mencapai 25 m, dan batangnya
dapat mempunyai diameter sampai 40 cm, keabu-abuan. Ranting
dengan bulu-bulu panjang kuning sampai kemerahan. Berumah
satu (monoecious).Daun berbentuk jorong sampai bundar telur
terbalik, 11-28 × 16-50 cm, bertepi rata atau menggerigi dangkal,
berujung tumpul atau sedikit meluncip, bertangkai 2-3 cm.Daun
penumpu bundar telur, 1-8 cm, berbulu kuning atau merah, bila
rontok meninggalkan bekas cincin pada ranting.Perbungaan
dalam bongkol soliter, yang muncul pada ketiak daun. Bongkol
bunga jantan berbentuk jorong sampai gada, 2-6 × 4-11 cm. Buah
majemuk (syncarp) agak bulat, sampai 13 × 16 cm, kuning
kehijauan bila masak, dengan tonjolan-tonjolan serupa duri lunak
pendek, bertangkai panjang 5-14 cm, muncul di ujung ranting
seperti pada sukun.
II.1.2.7 Deskripsi Tanaman Kemangi
Ocimum sanctum L.merupakan tanaman semak yang
tumbuh semusim. Tingginya 30 cm sampai 150 cm. Batangnya
bercabang, beralur, berbulu, berkayu, berbentuk segi empat, dan
berwarna hijau. Daunnya tunggal, berbentuk bulat telur dengan
ujung yang runcing dan bagian pangkalnya tumpul dengan tepi
yang bergerigi, pertulangannya menyirip, yang panjangnya 14
mm sampai 16 mm, lebar 3 mm sampai 6 mm, tangkai
panjangnya kurang lebih 1 cm, dan berwarna hijau.
(Syamsuhidayat dan Hutapea, 1991).
Bunga kemangi tersusun pada tangkai bunga berbentuk
menegak. Bunganya jenis hemafrodit, berwarna putih dan berbau
sedikit wangi. Bunga majemuk berkarang dan di ketiak daun
ujung terdapat daun pelindung berbentuk elips atau bulat telur
dengan panjang 0,5-1 cm. Kelopak bunga berbentuk bibir, sisi
luar berambut kelenjar, berwarna ungu atau hijau dan ikut
menyusun buah. Mahkota bunga berwarna putih dengan benang
sari tersisip di dasar mahkota dan kepala putik bercabang dua
namun tidak sama. Buah berbentuk kotak, berwarna cokelat tua,
tegak, dan tertekan dengan ujung berbentuk kait melingkar.
Panjang kelopak buah 6-9 mm. Biji berukuran kecil, bertipe
keras, cokelat, dan waktu diambil segera membengkak. Tipe buah
terdiri dari empat biji. Akar tunggang dan berwarna putih kotor
(Kusuma, 2010)
II.1.3Kandungan Kimia
II.1.4.1 Kandungan Kimia Meranti Sabut
Bagian batang, daun, dan biji tumbuhan Shorea
mengandung metabolit sekunder seperti alfa viniferin suatu trimer
stilbenoid dan Hopeaphenol suatu tetramer stilbenoid yang
berfungsi sebagai antioksidan (Sutopo dan Noviani, 2009). Hasil
penelitian sebelumnya, diketahui berbagai jenis senyawa
metabolit sekunder dengan bioaktivitas yang sangat menarik
diantaranya: senyawa baru turunan oligostilbenoid dari ekstrak
metanol kulit batang Shorea gibbosa yang diberi nama
diptoindonesin F sebagai antibakteri, antiviral terhadap sel P-388
(Sarayobudiyono, et all., 2008).
II.1.4.2 Kandungan Kimia Tanaman Andong
Tanaman andong mengandung saponin, tannin, flavonoid,
polifenol, steroida, polisakarida, kalsium oksalat, dan zat besi.
Sebagian besar berada pada batang, bunga dan akar
II.1.4.3 Kandungan Kimia Bakau Merah
Penelitian tentang kandungan senyawa tumbuhan ini telah
dilakukan. Dong Li.,dkk (2007) telah berhasil mengisolasi
senyawa asetilasi flavanol yang baru yaitu, 3,7-O-diacetil (-)-
epicatechin dan tujuh turunan flavanol yang telah diketahui
seperti, (-)-epicatechin, 3-O-acetyl(-)-epicatechin,3,3′,4′,5,7-
Opentaacetyl (–)-epicatechin, (+)-afzelechin, (+)-catechin,
cinchonain Ib dengan fraksi etil asetat dan proanthocyanidin B2
dengan fraksi n-butanol dari batang bakau merah (Rhizophora
stylosa. Griff). Selain senyawa tersebut, dua senyawa flavan-3-ol
glikosida dengan tujuh senyawa flavan-3-ol juga berhasil di
isolasi dari batang Rhizophora stylosa dengan menggunakan
pelarut metanol, senyawa-senyawa tersebut adalah flavon-3-ol
glikosida, glabraosida A dan glabraosida B. bersama dengan tujuh
turunan flavanol, diantaranya (+)-katekin, (-)-epikatekin,
cinchonain IIa, cinchonain IIb, (+)-katekin 3-O-α-L-rhamnoside,
cinchonainIa dan cinchonain Ib (Takara, Kensaku, dkk., 2008).
II.1.4.4 Kandungan Kimia Tanaman Mindi
Daun, buah, dan biji Melia azedarach mengandung
saponin, flavonoid dan polifenol. Di samping itu daun dan buah
juga mengandung alkaloida (Syamsuhidayat dan Hutapea, 1991).
Flavonoid adalah senyawa polifenol yang mempunyai 15 atom
karbon, terdiri dari 2 cincin benzen yang terdiri dari 3 atom
karbon. Flavonoid larut dalam pelarut polar (etanol, air) atau
lazimnya etanol 70%. Secara umum kelarutan flavonoid berbeda-
beda terhadap pelarut sesuai golongan substitusinya. Pemilihan
pelarut tergantung pada kandungan zat aktif yang diselidiki, tetapi
juga bagaimana substansi tersebut diambil. Bila flavonoid
terdapat dalam vakuola sel, umumnya bersifat hidrofilik maka
penyarian dilakukan dengan menggunakan air maupun pelarut-
pelarut alkohol (Harborne, 1987). Saponin adalah senyawa aktif
permukaan yang kuat dan dapat menimbulkan busa jika dikocok
dalam air dan pada konsentrasi yang rendah, sering menyebabkan
hemolisis sel darah merah. Saponin juga digunakan sebagai
antimikroba, menghambat dehidrogenase jalur prostaglandin
(Robinson, 1995).
II.1.4.5 Kandungan Kimia Tanaman bitti
Menurut penelitian (Asriani I, dkk, 2015) kulit batang
kayu bitti mengandung senyawa golongan steroid, flavonoid, dan
alkaloid (Asriani I, dkk., 2015), ( Nuraini, dkk, 2015).
II.1.4.6 Kandungan Kimia Tanaman Terap
Dari uji fitokimia yang dilakukan diketahui fraksi
kloroform mengandung senyawa flavonoid. Kemudian fraksi
klorofrom dilkukan uji kromatografi Lapis Tipis (KLT) awal
dengan eluen n-heksana dan etil asetat untuk mengetahui
komposisi eluen yang akan digunakan pada kromatografi kolom
vakum (KVC) dengan melihat hasil spot/noda yang ada.
II.1.4.7 Kandungan Kimia Tanaman Kemangi
 Kandungan kimia yang terdapat di dalam Ocimum
sanctum L, yaitu minyak atsiri, karbohidrat, fitosterol, alkaloid,
fenolik, tanin, lignin, pati, saponin, flavonoid, terpenoid,
antrakuinon, minyak volatil termasuk metil sinamat, metil
heptenon, metil nonilketon, kamfor, dan sitral (Dahlan et all.,
2012; Sarma dan Babu 2011).
Kandungan flavonoid dan fenol menjadi senyawa sebagai
bahan antibakteri. Fenol pada kemangi memiliki efek yaitu
merusak membran mikroba dan menstimulasi terganggunya ion-
ion kalium sel yang 15 mengakibatkan rusaknya membran
sitoplasma (Yuhana et al., 2013). Flavonoid bekerja dengan
menghambat sintesis asam nukleat, menghambat fungsi membran
sitoplasma dan menghambat metabolisme energi sel (Cushnie dan
Lamb, 2005).
Biji kemangi mengandung zat kimia yaitu saponin,
flavonoid, dan polifenol (Pitojo, 1996). Daunnya mengandung
minyak atsiri (methylcavicol), saponin, flavonoid, dan tannin
(Mangoting et all., 2008).
II.1.4Khasiat Tanaman
II.1.4.1 Khasiat Tanaman Bakau Merah
Beberapa spesies dari genus Shorea adalah penghasil buah
tengkawang yang merupakan komoditi ekspor dimana kulit
kayunya mengeluarkan getah damar yang dapat digunakan untuk
berbagai keperluan, seperti dalam industri obat-obatan dan
kosmetika. Buah Shorea telah lama dimanfaatkan oleh
masyarakat pedesaan sebagai obat tradisional dalam
menyembuhkan berbagai macam penyakit, seperti: diare, luka
bakar, obat sariawan dan dapat memperlancar peredaran darah.
Minyak hasil perasan dari biji buah tengkawang ini digunakan
sebagai pengawet nasi dan minyak tradisional (Hakim, 2002).
II.1.4.2 Khasiat Tanaman Tanaman Andong
Daun tanaman andong banyak digunakan sebagai obat
sakit kepala, diare, disentri, TBC paru, asma, sakit kulit, inflamasi
mata, sakit punggung, reamtik dan encok ( Fransworth, 1966;
Griffin dan Maunwong yanthi, 1969, Wijaya kusuma, 1966).
Tanaman ini berkhasiat untuk menghentikan pendarahan dan
menghancurkan darah beku pada memar,. Daun andong juga
berkhasiat sebagai obat luka dan wasir ( Fransworth, 1966;
Griffin dan Maunwong yanthi, 1969, Wijaya kusuma, 2006).
II.1.4.3 Khasiat Tanaman Meranti Sabut
Kulit batang dari genus Rhizophora telah dimanfaatkan
oleh masyarakat tradisional sebagai obat-obatan untuk berbagai
penyakit. Di India kulit batang Rhizophora mucronata digunakan
sebagai terapi penyakit diabetes, dan sebagai astringent untuk
diare. Ekstrak beberapa spesies dari genus ini telah dilaporkan
memiliki aktivitas anti bakteri, aktivitas antiinflamasi, dan
melindungi dari disfungsi mitokondria akibat induksi
naphthalene. Menurut penelitian Chalista, (2008) melaporkan
bahwa ekstrak polar dari R. mucronata yang merupakan kerabat
dekat dari R. stylosa berpotensi untuk melawan larva Spodoptera
litura instar II karena dapat membunuh 50 % dari populasi
dengan masa pemaparan 24 jam pada konsentrasi 83,4586 %
(LC50 - 24 jam = 83,4586 %). Beberapa tumbuhan bakau genus
Rhizoporacea telah dilakukan uji terhadap daya toksisitas
terhadap larva suatu serangga diantaranya adalah Brugueira
cylindrica, Ceriops decandra, Rhizophora apiculata, Rhizophora
lamarckii, dan Rhizophora mucronata dari tanaman-tanaman
tersebut, ekstrak petroleum eter dari tanaman Rhizophora
apiculata yang paling efektif terhadap larva nyamuk Culex
quinquefasciatus dengan nilai LC50 sebesar 25,7 mg/L (Thangam
& Kathiresan, 1997 dalam Anonim, 2009)
II.1.4.4 Khasiat Tanaman Tanaman Mindi
Daun berkhasiat sebagai peluruh kencing (diuretik) dan
peluruh cacing. Seluruh tanaman berkhasiat sebagai pembunuh
serangga (Daliamartha, 2003).
II.1.4.5 Khasiat Tanaman Tanaman bitti
 Menurut penelitian Asriani I, dkk, 2015 dan an penelitian
Nuaraini, dkk, 2015 kulit batang kayu bitti berkhasiat sebagai
antikanker.
Seiring semakin berkurangnya Jati (Tectona Grandis) dan
harganaya di pasaran yang semakin meroket, maka masyarakat
mulai mencari alternatif lain yang mudah di jangkau dan
gampang diperoleh. Karena kayu Bitti memiliki sifat yang mirip
dengan Jati yaitu memiliki daya tahan yang kuat, lentur dan tahn
terhadap rayak, sehingga kayu Bitti di peroleh sebagai alternatif
yang tepat. Di kalangan masyarakat luas kayu Bitti dijadikan
sebagai bahan baku untuk konstruksi rumah, baik berupa papan
maupun balok atau kuseng, di gunakan dalam industri pembuatan
kapal dan perahu, karena memiliki daya tahan di dalam air.
Sedangkan untuk industri meubel seperti pembuatan lemari, meja,
kursi dan lain sebagainya, kayu Bitti di pilih karena memiliki
tekstur yang baik dan tahan terhadap rayap. Tidak jarang pula
kayu ini dibuat tangga, jembatan, ukiran, bahkan di Kepulauan
Solomon, Bitti digunakan sebagai bahan baku untuk membuat
gendang yang besar yang mereka namanakan Gundu. Selain itu
Kayu Bitti juga merupakan komuditas expor utama dari Sulawesi,
Papua Nugini dan Kepulauan Solomon dengan tujuan ke Jepang.
II.1.4.6 Khasiat Tanaman Tanaman Terap
Berdasarkan studi literatur, diketahui bahwa sejumlah
spesies Artocarpus banyak menghasilkan senyawa golongan
terpenoid, flavonoid, dan stilbenoid. Keunikan struktur metabolit
sekunder pada Artocarpus menghasilkan efek yang sangat luas,
antara lain sebagai anti bakteri (Khan et al, 2003), anti platelet
(Weng et al, 2006), anti fungal (Jayasinghe et al, 2004),
antimalaria ,sitotoksik (Ko et al, 2005, Hakim et al, 2002, Syah et
al, 2006) dan anti diabetes (Nasution, 2013).
II.1.4.7 Khasiat Tanaman Tanaman Kemangi
Daun dapat digunakan untuk mengobati demam, batuk,
salesma, encok, urat syaraf, air susu kurang lancer, sariawan,
 panu, radang anak telinga, perut kotor, muntah-muntah dan mual,
peluruh kentut (flatulen), peluruh haid, setelah bersalin, borok,
untuk memperbaiki fungsi lambung (Sudarsono, 2002).
Biji digunakan untuk mengatasi jantung mengipas,
sembelit, kencing nanah, penyakit mata, borok, penenang,
pencahar, perangsang, peluruh air kencing, peluruh keringat,
kejang perut (Sudarsono, 2002).
Akar digunakan untuk upaya mengobati penyakit kulit.
Semua bagian tanaman digunakan sebagai pewangi, obat
perangsang, disentri, dan demam (Sudarsono, 2002).
Dengan berkembangnya jaman banyak penelitian yang
menunjukkan bahwa kemangi juga dapat berkhasiat sebagai obat.
Yaitu sebagai analgesik, anti katarak, anti hiperlipidemi, anti
inflamasi, antioksidan, imunomodulator, radioprotektif, aktivitas
hipoglikemik, aktivitas hipotensif, dan anti kanker. Kemangi juga
digunakan untuk pengobatan diabetes (Dattani, 2008)
II.2 Teori Umum
II.2.1 Isolasi Bahan Alam
Isolasi adalah suatu usaha bagaimana caranya memisahkan
senyawa yang bercampur sehingga kita dapat menghasilkan senyawa
tunggal yang murni.Tumbuhan mengandung ribuan senyawa sebagai
metabolit primer dan metabolit sekunder. Biasanya proses isolasi
senyawa dari bahan alami mengisolasi senyawa metabolit sekunder,
karena dapat memberikan manfaat bagi kehidupan manusia.
Kandungan senyawa dari tumbuhan untuk isolasi dapat
diarahkan pada suatu senyawa yang lebih dominan dan salah satu
usaha isolasi senyawa tertentu maka dapat dimanfaatkan pemilihan
pelarut organik yang akan digunakan pada isolasi tersebut, dimana
pelarut polar akan lebih mudah melarutkan senyawa polar dan
sebaliknya senyawaa non polar lebih mudah larut dalam pelarut non
polar (Harborne, 1987).
II.2.1.1 Penyiapan Sampel
Dalam pembuatan simplisia, dilakukan dengan tahapan
sebagai berikut:
a. Pengumpulan bahan baku
Kadar senyawa aktif dalam suatu simplisia berbeda-beda
antara lain tergantung pada :
1. Bagian tanaman yang digunakan
2. Umur tumbuhan atau bagian tumbuhan yang dipanen
3. Waktu panen
4. Lingkungan tempat tumbuh
Waktu panen sangat erat hubungannya dengan pembentukan
senyawa aktif di dalam bagian tanaman yang akan dipanen. Waktu
panen yang tepat pada saat bagian tanaman tersebut mengandung
senyawa aktif dalam jumlah yang terbesar. Senyawa aktif terbentuk
secara maksimal di dalam bagian tanaman atau tanaman pada umur
tertentu.
b. Sortasi basah
Sortasi basah dilakukan untuk memisahkan kotoran-kotoran
atau bahan-bahan asingnya dari bahan simplisia. Misalnya pada
simplisia yang dibuat dari akar suatu tanaman obat. Bahan-bahan
asing seperti tanah, krikil, rumput, batang, daun, akar yang telah
rusak, serta pengotor lainnya harus dibuang. Tanah mengandung
bermacam-macam mikroba dalam jumlah yang tinggi, oleh karena
itu pembersihan simplisia dari tanah yang terikut mengurangi
jumlah mikroba awal.
c. Pencucian
Pencucian dilakukan untuk menghilangkan tanah dan
pengotor lainnya yang melekat pada bahan simplisia. Pencucian
dilakukan dengan air bersih, misalnya air dari mata air, air sumur
atau air PAM. Bahan simplisia yang mengandung zat yang mudah
larut dalam air yang mengalir, pencucian dilakukan dalam waktu
yang sesingkat mungkin. Cara sortasi dan pencucian sangat
mempengaruhi jenis dan jumlah awal simplisia.
d. Perajangan
Beberapa jenis bahan simplisia perlu mengalami proses
perajangan. Perajangan bahan simplisia dengan mempermudah
 proses pengeringan, pengepakan dan penggilingan. Perajangan
dilakukan dengan pisau, dengan alat mesin perajang khusus
sehingga diperoleh irisan tipis atau potongan dengan ukuran yang
dikehendaki.
e. Pengeringan
Pengeringan ialah untuk mendapatkan simplisia yang tidak
mudah rusak, sehingga dapat disimpan dalam waktu yang lebih
lama. Pengeringan simplisia dilakukan dengan menggunakan sinar
matahari atau suatu alat pengering. Kandungan bahan aktif yang
terdapat pada tumbuhan sangat di pengaruhi oleh proses
pengeringan. Setiap jenis tumbuhan mempunyai respon yang
berbeda, ada beberapa tumbuhan yang peka terhadap penyinaran
matahari langsung serta suhu yang terlalu tinggi. Pengeringan yang
tepat akan menghasilkan mutu simplisia yang tahan disimpan lama
dan tidak terjadi perubahan bahan aktif yang dikandungnya. Hal-
hal yang harus diperhatikan selama proses pengeringan adalah suhu
pengeringan, kelembapan udara, aliran udara, waktu pengeringan,
dan luas permukaan bahan.
Menurut Rusli dan Darmawan (1988) bahwa pengeringan
suatu bahan terlalu lama dan suhunya yang terlalu tinggi dapat
menurunkan mutu karena dapat merusak komponen-komponen
yang terdapat di dalamnya.
f. Sortasi kering
Sortasi setelah pengeringan sebenarnya merupakan tahap
akhir pembuatan simplisia. Tujuan sortasi untuk memisahkan
benda-benda asing seperti bagian tanaman yang tidak diinginkan
dan pengotoran lainnya yang masih ada dan tertinggal pada
simplisia kering.
g. Pengepakan dan penyimpanan
h. Pemeriksaan Mutu (DepKes RI, 1985).
II.2.1.2 Ekstraksi
 Ekstraksi merupakan proses pemisahan bahan dari
campurannya dengan menggunakan pelarut. Ekstrak adalah sediaan
yang diperoleh dengan cara ekstraksi tanaman obat dengan ukuran
partikel tertentu dan menggunakan medium pengekstraksi (pelarut)
yang tertentu pula (Agoes, 2009).
Dalam pembuatan ekstrak untuk keperluan farmasi, hal
berikut harus jelas dan diperhatikan:

a. Jumlah simplisia yang akan diekstraksi. Jumlah ini akan

digunakan untuk perhitungan dosis obat.
b. Derajat kehalusan simplisia. Hal ini penting untuk mengupayakan
agar penarikan dapat berlangsung semaksimal mungkin.
Kehalusan menyangkut luas permukaan yang akan berkontak
dengan pelarut untuk ekstraksi.
c. Jenis pelarut yang akan digunakan. Hal ini menyangkut keamanan
karena pelarut yang digunakan untuk keperluan farmasi sangat
terbatas jumlahnya. Pelarut juga akan menentukan efisiensi proses
penarikan zat berkhasiat dari tanaman obat.
d. Suhu. Suhu penyari akan menentukan jumlah dan kecepatan
penyaringan.
e. Lama waktu penyaringan. Hal ini penting sekali untuk
menentukan jumlah bahan yang tersari.
f. Proses ekstraksi. Ada kalanya proses ekstraksi harus terlindung
dari cahaya karena kemungkinan akan ada komponen ekstrak
yang peka terhadap cahaya (Agoes, 2009).
Metode ekstraksi terbagi atas :
a. Ekstraksi cara dingin
Metoda ini artinya tidak ada proses pemanasan selama proses
ekstraksi berlangsung, tujuannya untuk menghindari rusaknya
senyawa yang dimaksud rusak karena pemanasanan. Jenis ekstraksi
dingin adalah maserasi dan perkolasi.
1. Maserasi
 Maserasi adalah proses ekstraksi simplisia menggunakan
pelarut dengan beberapa kali pengadukan pada suhu ruangan.
Prosedurnya dilakukan dengan merendam simplisia dalam pelarut
yang sesuai dalam wadah tertutup. Pengadukan dilakukan dapat
meningkatkan kecepatan ekstraksi. Kelemahan dari maserasi
adalah prosesnya membutuhkan waktu yang cukup lama.
Ekstraksi secara menyeluruh juga dapat menghabiskan sejumlah
besar volume pelarut yang dapat berpotensi hilangnya metabolit.
Beberapa senyawa juga tidak terekstraksi secara efisien jika
kurang terlarut pada suhu kamar (27oC). Ekstraksi secara
maserasi dilakukan pada suhu kamar (27oC), sehingga tidak
menyebabkan degradasi metabolit yang tidak tahan panas
(Departemen Kesehatan RI, 2006).
2. Perkolasi
Perkolasi merupakan proses mengekstraksi senyawa
terlarut dari jaringan selular simplisia dengan pelarut yang selalu
baru sampai sempurna yang umumnya dilakukan pada suhu
ruangan. Perkolasi cukup sesuai, baik untuk ekstraksi
pendahuluan maupun dalam jumlah besar (Departemen Kesehatan
RI, 2006).
b. Ekstraksi cara panas
Metoda ini pastinya melibatkan panas dalam prosesnya.
Dengan adanya panas secara otomatis akan mempercepat proses
penyarian dibandingkan cara dingin. Metodanya adalah refluks,
ekstraksi dengan alat soxhlet dan infusa.
1. Refluks
Ekstraksi dengan cara ini pada dasarnya adalah ekstraksi
berkesinambungan. Bahan yang akan diekstraksi direndam
dengan cairan penyari dalam labu alas bulat yang dilengkapi
dengan alat pendingin tegak, lalu dipanaskan sampai mendidih.
Cairan penyari akan menguap, uap tersebut akan diembunkan
dengan pendingin tegak dan akan kembali menyari zat aktif
dalam simplisia tersebut. Ekstraksi ini biasanya dilakukan 3 kali
dan setiap kali diekstraksi selama 4 jam (Departemen Kesehatan
RI, 2006).
 2. Soklet
Metode ekstraksi soxhlet adalah metode ekstraksi dengan
prinsip pemanasan dan perendaman sampel. Hal itu menyebabkan
terjadinya pemecahan dinding dan membran sel akibat perbedaan
tekanan antara di dalam dan di luar sel. Dengan demikian,
metabolit sekunder yang ada di dalam sitoplasma akan terlarut ke
dalam pelarut organik. Larutan itu kemudian menguap ke atas dan
melewati pendingin udara yang akan mengembunkan uap tersebut
menjadi tetesan yang akan terkumpul kembali. Bila larutan
melewati batas lubang pipa samping soxhlet maka akan terjadi
sirkulasi. Sirkulasi yang berulang itulah yang menghasilkan
ekstrak yang baik (Departemen Kesehatan RI, 2006).
3. Digesti
Digesti adalah maserasi kinetik (dengan pengadukan
kontinu) pada suhu yang lebih tinggi dari suhu ruangan, yaitu
secara umum dilakukan pada suhu 40-50oC (Departemen
Kesehatan RI, 2006).
4. Infusa
Infusa adalah ekstraksi dengan pelarut air pada suhu
penangas air (bejana infus tercelup dalam penangas air mendidih),
suhu terukur (96- 98oC) selama waktu tertentu (15-20 menit)
(Departemen Kesehatan RI, 2006).
5. Dekok
Dekok adalah infus pada waktu yang lebih lama dan suhu
sampai titik didih air, yaitu pada suhu 90-100oC selama 30 menit
(Departemen Kesehatan RI, 2006).
II.2.1.3 Partisi
Partisi merupakan proses pemisahan dimana suatu zat terbagi
dalam dua pelarut yang tidak bercampur. Jika suatu cairan
ditambahkan dalam ekstrak cairan yang lain yang tidak dapat
bercampur dengan yang pertama, akan terbentuk dua lapisan. Satu
komponen dari campuran akan memiliki kelarutan ke dalam dua
lapiran tersebut dan setelah beberapa waktu dicapai kesetimbangan
konsentrasi dalam kedua lapisan. Waktu diperlukan untuk
tercapainya keseimbangan biasanya dipersingkat oleh pencampuran
kedua fase tersebut dalam corong pisah.
Kerap kali sebagai pelarut pertama adalah air, sedangkan
sebagi pelarut kedua adalah pelarut organik yang tidak bercampur
dengan air. Dengan demikian ion anorganik atau senyawa organik
polar sebagian besar akan terdapat dalam fase air. Sedangkan
senyawa organik non polar sebagian besar akan terdapat dalam fase
organik. Hal ini yang dikatakan like dissolves like yang berarti
bahwa senyawa polar akan mudah larut dalam pelarut polar dan
sebaliknya demikian.
Pada ekstraksi tidak terjadi pemisahan segera dari bahan-
bahan yang akan diperoleh (ekstrak), melainkan mula-mula hanya
terjadi pengumpulan ekstrak dalam pelarut. Ekstraksi akan lebih
menguntungkan jika dilaksanakan dalam jumlah tahap yang banyak.
Setiap tahap menggunakan pelarut yang sedikit. Kerugiannya adalah
konsentrasilarutan ekstrak makin lama makin rendah, dan jumlah
total pelarut yang dibutuhkan menjadi besar, sehingga untuk
mendapatkan pelarut kembali biayanya menjadi mahal.
Semakin kecil partikel dari bahan ekstraksi, semakin pendek
jalan yang harus ditempuh pada perpindahan massa dengan cara
difusi, sehingga semakin rendah tahanannya. Pada ekstraksi bahan
padat, tahanan semakin besar jika kapiler-kapiler bahan padat
semakin halus dan jika ekstrak semakin terbungkus di dalam sel
(misalnya pada bahan-bahan alami). Ekstraksi dibagi menjadi dua,
yaitu:
a. Ekstraksi padat-cair
Pada ekstraksi padat-cair, satu atau beberapa komponen yang
dapat larut dipisahkan dari bahan padat dengan bantuan pelarut. Pada
ekstraksi, yaitu ketika bahan ekstraksi dicampur dengan pelarut,
maka pelarut menembus kapiler-kapiler dalam bahan padat dan
melarutkan ekstrak. Larutan ekstrak dengan konsentrasi yang tinggi
terbentuk di bagian dalam bahan ekstraksi. Dengan cara difusi akan
terjadi kesetimbangan konsentrasi antara larutan tersebut dengan
larutan di luar bahan padat. Metode ekstraksi padat-cair
menggunakan alat sentrifuge untuk mempercepat pemisahan
campuran ekstrak dengan pelarutnya.
b. Ekstraksi cair-cair
Ekstraksi cair-cair adalah proses pemisahan zat terlarut di
dalam dua macam pelarut yang tidak saling bercampur atau dengan
kata lain perbandingan konsentrasi zat terlarut dalam pelarut organik
dan pelarut air.
Ekstraksi cair-cair biasa juga disebut sebagai metode corong
pisah. Jika suatu cairan ditambahkan ke dalam ekstrak yang telah
dilarutkan dalam cairan lain yang tidak dapat bercampur dengan
yang pertama, akan terbentuk dua lapisan. Satu komponen dari
campuran akan emmiliki kelarutan dalam kedua lapisan tersebut
(biasanya disebut fase) dan setelah beberapa waktu dicapai
kesetimbangan konsentrasi dalam kedua lapisan.
Pada ekstraksi cair-cair, satu komponen bahan atau lebih dari
suatu campuran dipisahkan dengan bantuan pelarut. Ekstraksi cair-
cair terutama digunakan, bila pemisahan campuran dengan cara
destilasi tidak mungkin dilakukan (misalnya karena pembentukan
azeotrop atau karena kepekaannya terhadap panas) atau tidak
ekonomis. Seperti ekstraksi padat-cair, ekstraksi cair-cair selalu
terdiri dari sedikitnya dua tahap, yaitu pencampuran secara intensif
bahan ekstraksi dengan pelarut dan pemisahan kedua fase cair itu
sesempurna mungkin.

II.2.1.4 Kromagrafi kolom

Salah satu metode pemisahan senyawa dalam jumlah besar

adalah menggunakan kromotografi kolom.Pada kromatografi kolom
fase diam yang digunakan dapat berupa silica gel, selulosa, atau
poliamida. Sedangkkan fase geraknya dapat dimulai dari pelarut
nonpolar kemudian ditingkatkan kepolarannya secara bertahap, baik
dengan pelarut tunggal, ataupun kombinasi dua pelarut yang berbeda
kepolarannya dengan perbandingan tertentu sesuai tingkat kepolaran
yang dibutuhkan ( Stahl, 1969)
Fraksi yang diperoleh dari kolom kromatografi ditampung
dan dimonitor dengan kromotografi lapis tipis. Fraksi – fraksi yang
memiliki pola kromatografi yyang sama digabung kemudian
pelarutnya diuapkan sehingga akan diperoleh beberapa fraksi. Noda

pada plat KLT dideteksi dengan lampu ultraviolet 254/365 untuk

senyawa – senyawa yang mempunyai gugus kromofor, dengan

penampakan noda seperti larutan Iod. FeCl3 dan H2SO4 dalam
methanol 10% (Stahl, 1969)
A. Kromatografi cair vakum
Kromatografi cair vakum (KCV) pertama kali diperkenalkan
oleh parailmuwan dari Australia untuk mengatasi lamanya waktu
yang dibutuhkan untuk separasi menggunakan kolom kromatografi
klasik.Pada dasarnya metode iniadalah kromatografi lapis tipis
preparatif yang berbentuk kolom.Aliran fase gerak dalam metode ini
diaktifkan dengan bantuan kondisi vakum (Coll and Bowden, 1986).
Kromatografi cair vakum pada awalnya digunakan untukseparasi
senyawaan steroid dan produk-produk natural dari laut (Targett et
al.,1979).
Kromatografi cair vakum terdiri dari suatu corong Buchner
yang memiliki kaca masir. Corong Buchner ini diiisi dengan fase
diam yang tingkat kehalusannya seperti yang umumnya dipakai
dalam kromatografi lapis tipis (70-230 mesh). Corong Buchner yang
berisi fase diam ini digunakan dalam kondisi vakum/bertekanan,
yang berakibat pada kemampuan yang dihasilkan oleh kromatografi
cair vakum akan sama dengan kromatografi gravitasi namun
diperlukan waktu yang lebih singkat (Targett et al., 1979). Cara asli
yang diperkenalkan oleh Coll menggunakan corong Buchner kaca
masir atau kolom pendek, sedangkan Target menggunakan kolom
yang lebih panjang untuk meningkatkan daya pisah (Hostettman et
al., 1986).
Kromatografi Suction Column atau vacuum liquid
chromatography (VLC) atau kromatografi cair vakum (KCV) adalah
bentuk kromatografi kolom khususnya berguna untuk fraksinasi
kasar yang cepat terhadap suatu ekstrak. Kondisi vakum adalah
alternatif untuk mempercepat aliran fase gerak dari atas ke bawah.
Metode ini sering digunakan untuk fraksinasi awal dari suatu ekstrak
non polar atau ekstrak semipolar (Raymond, 2005).
Kromatografi kolom cair dapat dilakukan pada tekanan
atmosfer atau pada tekanan lebih besar dari atmosfer dengan
menggunakan bantuan tekanan luar misalnya gas nitrogen. Untuk
keberhasilan praktikan di dalam bekerja dengan menggunakan
kromatografi kolom vakum cair, oleh karena itu syarat utama adalah
mengetahui gambaran pemisahan cuplikan pada kromatografi lapis
tipis (Harris, 1982). Kromatografi vakum cair dilakukan untuk
memisahkan golongan senyawa metabolit sekunder secara kasar
dengan menggunakan silika gel sebagai absorben dan berbagai
perbandingan pelarut n-heksana : etil asetat : metanol (elusi gradien)
dan menggunakan pompa vakum untuk memudahkan penarikan
eluen (Helfman, 1983).
Prinsipnya yaitu adsorpsi dan partisi yang
dipercepatbantuan pompa vakum. Keuntungan dari metode ini
adalah prosesnya cepat dan senyawa tertarik secara sempurna.
Kerugiannya adalah pemisahanya tidak sempurna karena senyawa
yang ditampungbercampur dalam suatu penampungan tidak seperti
pada kolom konvensional yang dipisahkan berdasarkan warna,
sehingga pemisahannya lebih maksimal. (Helfman, 1983).
Alat yang digunakan terdiri dari corong G-3, sumbat karet,
pengisap yang dihubungkan dengan pompa vakum serta wadah
penampung fraksi. Walaupun KCV memerlukan jumlah sampel yang
lebih banyak dari pada kromatografi lapis tipis (KLT), KCV tetap
ekonomis dalam sisi biaya. (Stahl,E.1985)
Adapun cara kerja kromatografi cair vakum yaitu kolom
kromatografi dikemas kering (biasanya dengan penjerap mutu KLT
10- 40 μm) dalam keadaan vakum agar diperoleh kerapatan kemasan
maksimum. Vakum dihentikan, pelarut yang kepolarannya rendah
dituangkan ke permukaan penjerap lalu divakumkan lagi. Kolom
dipisah sampai kering dan sekarang siap dipakai (Hostettman, 1986).
Kromatografi vakum cair merupakan salah satu jenis dari
kromatografi kolom. Kromatografi kolom merupakan suatu metode
pemisahan campuran larutan dengan perbandingan pelarut dan
kerapatan dengan menggunakan bahan kolom. Kromatografi kolom
lazim digunakan untuk pemisahan dan pemurnian senyawa (Schill,
1978). Fasa diam yang digunakan dikemas dalam kolom yang
digunakan dalam KCV. Proses penyiapan fasa diam dalam kolom
terbagi menjadi dua macam, yaitu:
1. Cara Basah
Preparasi fasa diam dengan cara basah dilakukan dengan
melarutkan fasa diam dalam fase gerak yang akan digunakan.
Campuran kemudian dimasukkan ke dalam kolom dan dibuat merata.
Fase gerak dibiarkan mengalir hingga terbentuk lapisan fase diam
yang tetap dan rata, kemudian aliran dihentikan (Sarker et al., 2006).
2. Cara kering
Preparasi fasa diam dengan cara kering dilakukan dengan cara
memasukkan fase diam yang digunakan ke dalam kolom
kromatografi. Fase diam tersebut selanjutnya dibasahi dengan pelarut
yang akan digunakan (Sarker et al., 2006). Preparasi sampel saat akan
dielusi dengan KCV juga memiliki berbagai metode seperti preparasi
fasa diam. Metode tersebut yaitu cara basah dan cara kering (Canell,
1998). Preparasi sampel cara basah dilakukan dengan melarutkan
sampel dalam pelarut yang akan digunakan sebagai fasa gerak dalam
KCV. Larutan dimasukkan dalam kolom kromatografi yang telah
terisi fasa diam. Bagian atas dari sampel ditutupi kembali dengan fasa
diam yang sama. Sedangkan cara kering dilakukan dengan
mencampurkan sampel dengan sebagian kecil fase diam yang akan
digunakan hingga terbentuk serbuk. Campuran tersebut diletakkan
dalam kolom yang telah terisi dengan fasa diam dan ditutup kembali
dengan fase diam yang sama (Canell, 1998; Sarker et al., 2006).
Keutungan dan kerugian KCV
Keuntungan pada KCV yang utama dibandingkan kolom
konvensional yaitu :
1. Konsumsi fase gerak KCV hanya 80% atau lebih kecil di banding
dengan kolom konvensional karena pada kolom mikrobor
kecepatan alir fase gerak lebih lambat (10- 100μl/menit)
2. Adanya aliran fase gerak lebih lambat membuat kolom mikrobor
lebih ideal jika digabung dengan spectrometer massa3.
Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat
karenanya jenis kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah
sampelterbatas missal sampel klinis
Kerugian KCV (Kromatogravi Vakum Cair) yaitu :
1. Membutuhkan waktu yang cukup lama2. Sampel yang dapat
digunakan terbatas. (Sarker et al., 2006)

B. Kromatografi flash
 Merupakan kromatografi dengan tekanan rendah (pada umunya
kurang dari 20 psi) yang digunakan sebagai kekuatan bagi elusi bahan
pelarut melalui suatu ruangan atau kolom yang lebih cepat kualitas
pemisahan sedang, tetapi dapat berlamgsung cepat (10-15 menit).
Pemisahan ini tidak sesuai untuk pemisahan campuran yang terdiri dari
bermacam-macam zat, tetapi sangat baik untuk memisahkan sedkit
reaktan dari komponen untama dalam siintesa organic. Panjang Kolom
30-45 cm untuk jumlah pelarut 250-3000 ml

Kromatografi ini berbeda denggan kromatografi kolom yang

didasarkan pada gravitasi. Ada dua hal yang membedakan
kromatografi dengan kromatografi kolom yaitu ukuran silica gel yang
digunakan lebih halus dan kecepatan aliran eluen tergantung pada
ukuran slika gel yang digunakan pada kromatografi ini dapat berupa
campuran dari dua atau lebih pelarut. Pemilihan sistem eluen dapat
dilakukan dengan KLT. Sistem eluen yang dipilih adalah sistem eluen
yang memisahkan senyawa pada Rf 0,15-0,20. Banyaknya slika gel
yang digunakan bervariasi antara 30-100 kali berat sampel. Untuk
pemisahan yang mudah dapat menggunakan perbandingan 30:1 dan
untuk pemisahan yang cukup rumit perbandingan itu dapat di
tingkatkan (Still et., al.,1978). Silica gel yang biasa digunakan adalah
slika gel G60 ukuran 63-100µm dan silica G60 ukuran 40-43µm.
pemilihan kolom disesuaikan dengan banyaknya sampel yang akan
dipisahkan. Banyaknya sampel berbanding lurus dengan luas
penumpang kolom ( Kristanti dkk, 2008)

Fraksinasi suatu sampel bahan alam dapat dilakukan dengan

metode kromatografi vakum cair untuk memisahkan fraksii polar
dengan non polarnya. Fraksi yang diperoleh dari kromatografi vakum
cair diisolasi dan dilakukan pemurniaan dengan kromatografio Flash
dan atau sephadek. Besarnya cuplikan berbanding lurus dengan luas
penampang kolom. Adsorben yang paling sering digunakan adalah
silica gel Gypsum flouresence 60 (G60) ukuran 63-200 µm dan silica
gel G60 ukuran 40-43 µm. panjang kolom 30-45 cm untuk jumlah
sampel 250-3000 ml. fase diam yang sering digunakan adalah silica
gel G60 ukuran 63-200 µm dan silica gel G60 ukuran 40-43µm dengan
ukuran 40-63 mess. Besarnya cuplikan berbanding lurus dengan luas
penampang kolom. Adsorben yang paling sering digunakan adalah
silica gel G60 ukuran 63-200 µm dan silica gel G60 ukiuran 40-43 µm
(kristani dkk, 2008)
Pemilihan eluen untuk kromatografi flash disesuaikan dengan
Rf senyawa yang hendak dipisahkan RF senyawa dianjurkan berada
pada rabge 0.15-0.2. jika fraksi-fraksi yang didapatkan tersebut
kemudian diuji dengan KLT. Dari uji KLT, fraksi-fraksi yang
mengandung senyawa yang diinginkan akan teridentifikasi dan harga
Rf nya diketahuai (Still et al,.1978)
C. Kromatografi Lapis Tipis Preparatif
Kromatografi dalam bidang kimia merupakan sebuah tehnik
analisis yang digunakan untuk memisahkan sebuah campuran ataupun
persenyawaan kimia. Tehnik ini ditemukan pada tahum 1906 oleh
Mikhail Tswett seorang ahli botani dari Italia yang lahir di Rusia.
Tehnik pemisahan ini dilakukan terhadap pigmen tumbuhan (klorofil),
dengan cara menuangkan ekstrak petroleum eter dari daun tumbuhan
diatas sebuah kolom kaca yang berisi serbuk kalsium karbonat dalam
arah yang tegak lurus (Najib, 2013).
Dalam perkembangan selanjutnya metode ini tidak hanya
digunakan untuk mengidentifikasi noda, akan tetapi juga untuk
mengisolasi ekstrak. Metode ini kemudian dikenal sebagai KLT
preparatif. Metode ini paling sederhana dan murah untuk mengisolasi
komponen kimia dari suatu bahan alam, dengan menggunakan
lempeng yang besar terbuat dari kaca dengan ukuran 20 x 20 cm
(Najib, 2013).
 Metode kerjanya meliputi penotolen ekstrak bahan alam dalam
bentuk pita pada lempeng. Hal ini memungkinkang sampel dalam
jumlah besar dapat muat pada lempeng KLT, lempeng dikembangkan
dalam pelarut yang telah diketahui mampu memisahkan komponen,
yang paling penting adalah harus digunakan metode deteksi yang tidak
merusak sampel (Najib, 2013).
Pada KLT preparatif, cuplikan yang akan dipisahkan ditotolkan
berupa garis pada salah satu sisi plat lapisan besar dan dikembangkan
secara tegak lurus pada garis cuplikan sehingga campuran akan
terpisah menjadi beberapa pita. Pita ditampakkan dengan cara yang
tidak merusak jika senyawa itu tahan warna, dan penjerap yang
mengandung pita dikerok dari plat kaca. Kemudian cuplikan dielusi
dari penjerap dengan pelarut polar. Cara ini berguna untuk
memisahkan campuran reaksi sehingga diperoleh senyawa murni
untuk telaah pendahuluan, untuk menyiapkan cuplikan analisis, untuk
meneliti bahan alam yang lazimnya berjumlah kecil dan campurannya
rumit, dan untuk memperoleh cuplikan yang murni untuk
mengkalibrasi KLT kuantitatif (Gritter, 1991).
Jika sebuah fraksi dipekatkan dan didinginkan serta pelarutnya
dibiarkan menguap lambat, Kristal dapat membentuk senyawa yang
murni Kristalisasi dapat dilakukan dengan sedikit penggosokan pada
bagian dalam dinding kaca selanjutnya membiarkannya di tempat
dingin,bahkan dalam lemari pendingin.Beberapa deposit mungkin
merupakan kristalin dan harus di cek dengan bantuan lensa tangan
untuk meyakinkan bahwa deposit tersebut bukan bahan yang amorf
yang berasal dari larutan saat pendinginan terjadi (Harborne,1987).
Manfaat dari kromatografi ini yaitu menentukan ciri senyawa
aktif penyebab efek racun atau efek yang bermanfaat, yang
ditunjukkan oleh ekstrak tumbuhan kasar bila diuji dengan sistem
biologi. Dalam hal ini kita harus memantau cara ekstraksi dan
pemisahan pada setiap tahap, yaitu untuk melacak senyawa aktif
tersebut sewaktu dimurnihkan. Kadang-kadang keaktifan hilang
selama proses fraksinasi akibat ketidakmantapan senyawa itu, dan
akhirnya mungkin saja diperoleh senyawa berupa kristal tetapi
keaktifan seperti yang ditunjukkan oleh ekstrak asal (Harborne, 1987).
D. Kromatografi kolom eksklusi
Pemisahan berbagai konstituen dengan meninjau perbedaann
ukuran dan geometri molekul adalah dasar Kromatografi eksklusi.
Peredaan ukuran menyebabkan beberapa partikel bergerak lebih cepat
ddaari yang lainya sehingga menimbulkaan perbedan permukaan
migrasi. Kromatografi eksklusi dapat dikelompokkan menjadi tiga
kategori yaitu :
a) Teknik permeasi gel atau filtrasi gel
Teknik permeasi atau Filtrasi adalah suatu teknik yang
menguraikan campuran zat-zat sesuai dengan ukuran molekulnya.
Teknik ini didasari atas inklusi dan eksklusi suatu zat terlarut melalui
suatu fase diam yang terbuat dari gel polimer yang terikat silang ddan
berpori heterogen. Dalam kromatografi eksklusi cair-padat pemisahan
teradi antara vase cair di dalam partike gel dan cairan di luar
mengelilingi partikel gel.
Sebagai penunjang fase diam dalam pemisahan ini biasanya
digunakan xerogel-xerogel. Xerogel adalah suatu gel organik yang
dapat bersifat hidrofilik (yaitu : agar dan dekstran yang terikat silang
pada poliakrilamida) ataupun hidrofobik (poistirena). Xerogel-xerogel
ini tersedia di pasaran dengan nama dagang biogel p-2
(poliakrilamida), sepadex G-10-200 (dekstran) juga styrogel (gel
polistirena yang dimodifikasi) dan agarose. Kolom yang digunakan
adalah kolom biaya pengelusi (luent) dibiarkan mengalir karena
grafitasinya. Laju aliran akan bertambah dengan bertambahnya ukuran
partikel seperti kromatografi pertukaran ion, laju aliran juga dapat
dipengaruhi oleh variasi porositas gel. Untuk suatu gel yang tidak
padat, volume interstisi dapat diturukan dengan pemberian tekanan,
volume eluent berkisar antara 25 – 100 ml. sepertii juga metode
kromatografi lainnya, konsekwensi efluaennya diukur melalui sifat-
sifat fisik yang sesuai.. seperti indeks refraksi, absorbansi,, intensitaas
pendar flour atau sifat-sifat listriknya.
Parameter-parameter kolom dapat dihubungkan secar matematik
dengan
Vb = Vo + Vi + Vr = Vo Vs
Vi = m Sr/ Ps
Vi =Vo + Kd Vi
Dimana :
Vi = volume bagiana dalam gel,
Vr = volume matriks gel,
Vs = volume total face diam gel,
m = berat gel,
Sr = volume pelarut yang dipakai,
Ps = kerapatan pelarut,
Kd = koefisien distribusi,
Pr = kerapatan gel,
Vb = volume bed,
Vo = volume di luar gel,
Pemisahan suatu tipe gel bergantung pada ukuran molekul dan
sifat kimia dari zat yang akan dipisahkan. Misalkan biogel 0 – 10
digunakan untuk zat-zat dengan berat molekul berkisar antara 500-
17000 satuan. Molekul dengan besar molekul diatas batas ini yaitu
limit eksklusif, akan lewat saja tanpa rintangan dari gel. Di bawah
limit eksklusi, zat tersebut akan terelusi pada volume elusi yang sesuai
dengan volume bed total. Untuk bekerja dalam medium tidak berai, gel
yang tepat digunakan adalah sephadex LH-20.

Pemakaian Kromatografi permeasi gel digunakan untuk analisis

campran molekul dengan berat molkul yang berbeda seperti
pemisahaan rafinosa, maltose, dengan menggunakan sephadex pada
pH 7,0, laju aliran 5 ml/jam ddan H2O sebagai eluent. Pemisahan
molekul- molekul dengan berat molekul sama dapat juga dilakukan
dengan pemilihan yang tepat tipe gel dan tinggi kolomnya.
Pengeluaran garam (desalting) adalah salah satu pemisahan yang
meliputi pembebasan garam dan senyawa berberat dengan molekul
makro.
b) Eksklusi dan reterdasi ion
Eksklusi ion adalah suatu proses untuk memisahkan materi ionic
dari materi nonionic didasari pada perbedaan distribusi pada ke dua
tipe zat pelarut ini di antara vase resin penukar ion dan larutan air. Jika
suatu resin penukar ion diletakkan dalam larutan elektrolit encer atau
dalam air, konsentrasi elektrolit pada kesetimbangan dalam fase resin
akan lebih kecil dari pada larutan sekelilingnya yaitu fase luarnya,
tetapi bila resin diletakkan dalam suatu larutan nondielektrolit (dalam
air), maka nonelektrolit ini akan berubah untuk terdistribbusi secara
merata pada kedua fase. Jadi sebenarnya tidak terjadi penukaran ion
dalam peristiwa absobsi elektrolit dan elektrolit tersebut. Karena ke
dua tipe zat terlarut ini dapat diekstraksi dari resin dengan hanya
mengencerkan larutan laurnya (sekelilingnya). Dengan air. Jiak suatu
latutan yang mengandung baik materi-materi ionic dan nonionic
diletakkan pada bagian atas kolom berisi resin dan dicuci dengan air,
materi ionic akan mengalir mengelilingi partikel resin sedang materi
nonionic berdifusi kedalam pertikel-partikel resin dan masuk kedalam
rongga-rongga kosong antara partikel resin. Laju perpindahan materi
nonionic akiabatnya akan lebih rendah dari pada komponen ionicnya
dan akan teramati komponen ionic muncul terlebih dahulu sebagai
efluen. Jelasbahwa resin penukaran ion digunakan sebagai fase diam,
dank arena tidak terjadi penukaran ion, resindapat dipakai terus-
menerustanpa regenerasi.
1. Mekanisme Eksklusi Ion
 Suatu resin penukaran ion tidaklah sama dengan absobsi biasa.
Dengan mengatur jaringan muatan suatu resin, dapat diperoleh
keadaan dimana hanya satu macam ion elektrolit yang dieksklusikan.
Jumlah total elektrolit yang berdifusi kedalam resin dibatasi eloh
prinsip elektronetralitas. Makin kuat terionisasi suatu resin penukaran
makin efesien untuk eksklusi ion. Banyaknya garam yang erdifusi
kedalam resin berkurang dengan bertamnbahnya kapasitas penukar ion
suatu resin. Sebagian besar ion elektrolit berberat elektrolit rendah
yang mudah larut dalam air, bebas berdifusi kedalam dan keluar resin
tidak peduli besarnya kapasitas resin, sehingga cenderung
berkonsentrasi sama dengan ke dua fase saat kesetimbangan tercapai.
2. Aplikasi Metode Ion Eksklusi
Gula dan garam tidak dapat dipisahkan dengan metode ini karena
ukuran dan ketidakmampuanya relative dari molekul sukrosa dan
glukosa untuk berdifusi secara cepat kedalam fase resin. Pemisahan
elektrolit kuat dan molekul netral paling baik dicapai dengan metode
eksklusi ion, misalnya pemisahan NaCl dan etilen glikol, HCl dan
HC3COOH, CH3COOH; NaCl dan etano. Riechenberg telah
menggunakan teknik ini untuk pemisahan anggota deret Homolog,
misalkan pemisahan asam asetat dan asam n- butirat. Gugusan sulfanat
yang bersiafat asam pada resin penukaran ion, dapat menghasilkan
efek garam pada materi organic dan cenderung untuk menehan efek
absorbsi matriks resin. Oleh karena itu rieman menggunakan larutan
garam sebagai pengganti larutan H2O untuk eluen dalam memisahkan
methanol, etanol dan propanol. Efek yang menguntungkan adanya
garam dalam eluen adalah efek garam selektif terhadap komponen
nonionic dari fase larutannya.
c) Inorganic molecular sieves
Zeolit alam dan sintesis membentuk suatu saringan molekul
untuk pemisahan gas-gas dan molekul organic berukuran organic
berukuran kecil. Volume suatu zeolit terbentuk dari suatu rongga-
romgga yang saling dihungbungkan dengan saluran-saluran (channels).
Penyaringan dan aksi penghambatan dari saluran dikombinasikan
dengan aktifitas adsobsi permukaan matriks Kristal sehingga
memungkinkan digunakannya zeolit untuk memisahkan molekul—
molekul yang lebih kecil dari ukuran saluran ini dari molekul yang
lebih besar ukurannya dari ukuran saluran. Aktifitas permukaan dan
geometris molecular berperanan dalam pemisahan ini.
Secara structural zeolit adalah rangka tetrahedral yang bersatu
membetuk struktur sarang tawon dengan rongga-rongga besar yang
saling berhubungan melalui saluran-saluran kecil. Penampang lintang
dari saluran inilah yang menentukan ukuran molekul yang dapat
masuk ke dalam rongga-rongga. Ukuran dari posisi ion logam (misal
Na, Ca) dalam Kristal zeolit,dan tipe struktur jaringan rangka tetra
hedral alumina silica zeolit menentukan diameter efektif dari saluran-
saluran tersebut.
Beberapa macam tipe zeolit, misalkan tipe molecular sieve 4A adalah
[Na12 (AlO2)12 (SiO2)12]. Molekul berdiameter lebih kecil dari 4A
akan terabsorbsi, misalkan H2O, CO2, H2S, SO2dan hidrokarbon
borongga 1-2 atom karbon. Etana dapat masuk kedalam molecular
sieve 5A, yang dibuat dari molecular sieve 4A dengan menggantikan
Na oleh Ca dan K. paraffin lantai lurus dapat masuk kedalamnya,
demikian juga alcohol sampai dengan C 4, tetapi siklopropana tidak
dapat masuk. Demikian juga asam naftanik dan olekul aromatic
lainya. Tipe 10 x dan 13 x adalah Na8 (AlO2)80 (SiO2)106. Mereka
mengabsobsi molekul berdiameter sampai 10 A.
Molecular sieve mempunyai afinitas lebih besar terhadap
molekul polar dan senyawa yang berpolarisasi karena induksi pada
molekul nonpolar yang berukuran sama. Molekul-molekul polar
tertahan dengan kuat dalam rongga Kristal. Pada pemurnian dan
industry gas, molekul sieve digunakan untuk menghilangkan molekul-
molekul tidak jenuh (polar). Zeolit digunakan juga sebagai medium
berlangsungnya reaksi. Bahan kimia didalamnya sebagai hasil reaksi
dapat dikeluarkan dengan menggunakan teknik vakum atau dengan
pergeseran menggunakan materi yang berabsorbsi kuat, misalkan air.
Molecular sieve ini dapat diaktifkan kemali dengan peanasan 200-
3500 C. mereka juga digunakan dalam kromatografi gas padat sebagai
fase diamnya dalam kolom.

d.) Cara Memasukkan Adsorben ke dalam Kolom

1.) Slurry packing (Wet method)
Adsorbent disuspensikan ke dalam fase gerak dan diaduk
sedemikian rupa sehingga tidak ada gelembung udara. Hasilnya
adalah slurry yang selanjutnya dimasukkan ke dalam kolom. Larutan
ketukan yang cukup untuk memastikan tidak adanya batas antara
kapas dengan slurry. Pada kromatografi gel adsorbent harus
didiamkan terlebih dahulu dengan fase gerak selama satu malam.
2.) Dry packing
Pada metoda ini adsorben kering dimasukkan langsung ke
dalam kolom. Lakukan getaran untuk mengeluarkan gelembung
udara. Fase gerak dilewatkan pada adsorben metoda ini tidak bisa
digunakan pada Kromatografi Gel.

e.) Teknik Membuat Kolom

 Pastikan kolom terbuat dari polyethylene frit.
 Masukan silica gel atau alumina ke dalam kolom sampai ½ - 2/3
kolom.
 Masukan silica gel ke dalam suatu beaker glass 50 mL dan
tambahkan 8 mL heksan.
 Klem kolom dalam suatu posisi tegak.
 Tambahkan 2 mL heksan ke dalam kolom.
 Aduk campuran silica gel – heksan sewaktu mengalir memasuki
kolom.
 Buka klem dan keluarkan pelarut.
 Ulangi langkah-langkah di atas sampai semua silica gel berada
dalam kolom.
 Tutup klem dengan beberapa pelarut berada selapis di atas silica
gel.
f.) Kelemahan Kromatografi Kolom
 Pemisahan berjalan lambat
 Tidak dapat digunakan untuk partikel yang kecil
 Penyerapan tidak dapat bolak balik
g.) Faktor yang Mempengaruhi Gerak Zat
 Daya serap adsorben
 Sifat pelarut
 Suhu sistem kromatografi
 Ukuran partikel
 Tekanan udara dalam kolom
Jika zat terpisah berwarna atau berflouresensi dengan sinar UV,
kolom penyerap dapat dikeluarkan dengan cara memotong melintang
lapisan yang diperlukan atau zat disaring dengan penyaring yang
cocok. Jika zat terpisah tidak berwarna letak lapisan zat dapat
diketahui dengan cara memberi warna atau menyemprot kolom dengan
pereaksi yang dapat membentuk warna.
h.) Zat Padat Penyerap
a. Alumina atau magnesia: memisahkan serat-serat, zat warna, ester
dan alkaloid
b. Silika gel : untuk memisahan sterol asam amino
c. Magnesium klorida
d. Pati : memisahkan enzim
e. Gula : memisahkan klorofil dan xantofil
f. Karbon : memisahkan peptida dan karbohidrat
g. Kalsium karbonat : memisahkan xantofil, karotensia
h. Kalsium fosfat : memisahkan enzim dan protein.
II.2.2 Pemurnian
Pemurnian merupakan salah satu upaya untuk menghilangkan
senyawa-senyawa inert seperti lemak, resin, gula, karbohidrat, serat
dan pati sebagai komposisi utama rimpang lengkuas . Senyawa-
senyawa tersebut bersifat sangat higroskopis, lengket dan akan
memberikan masalah dalam proses formulasi obat. Bila ekstrak telah
dimurnikan, kandungan senyawa aktifnya akan jauh lebih tinggi
dibandingkan bila ekstrak tidak dimurnikan (Hernani, 2007).
II.2.2.1 Kristalisasi
Merupakan suatu metode untuk pemurnian zat dengan
pelarut dan dilanjutkan dengan pengendapan. Dalam kristalisasi
senyawa organik dipengaruhi oleh pelarut. Pelarut kristalisasi
merupakan pelarut dibawa oleh zat terlarut yang membentuk
padatan dan tergantung dalam struktur kristal – kristal zat
terlarut tersebut.

II.2.2.2 Rekristalisasi
Rekristalisasi merupakan cara yang paling efektif untuk
memurnikan zat – zat organik dalam bentuk padat. Oleh karena
itu teknik ini secara rutin digunakan untuk pemurnian senyawa
hasil sintesis atau hasil isolasi dari bahan alami, sebelum
dianalisis lebih lanjut, misalnya dengan instrumebn spektoskopi
seperti UV, IR, NMR, dan MS. Sebagai metoda pemurnian
padatan, rekristalisai memiliki sejarah yang panjang seperti
distilasi. Walaupun beberapa metoda yang lebih rumit telah
dikenalkan, rekristalisasi adalah metoda yang paling penting
untuk pemurnian sebabkemudahannya (tidak perlu alat khusus)
dan arena keefektifannya. Ke depannya rekristalisasi akan tetap
metoda standar untuk memurnikan padatan.
Metode ini sederhana, material padayan ini terlarut
dalam pelarut yang cocok pada suhu tinggi (pada atau dekat titik
didih pelarutnya) untuk mendapatkan jumlah larutan jenuh atau
dekat jenuh. Ketika larutan panas perlahan didinginkan, Kristal
akan mengendap karena kelarutan padatan biasanya menurun
bila suhu diturunkan. Diharapkan bahwa pengotor tidak akan
pengkristal karena konsentrasinya dalam larutan tidak terlalu
tinggi untuk mencapai jenuh. Walaupun rekristalisasi adalah
metoda yang sangat sederhana, dalam prakteknya bukan berarti
mudah dilakukan.
Adapun saran – saran yang dibutuhkan untuk melakukan
metoda kristalisai adalah sebagai berikut :

a. Kelarutan material yang akan dimurnikan harus

memiliki ketergantungan yang besar pada suhu.
Misalnya, ketergantungan pada suhu NaCl hampir dapat
diabaikan.Jadi pemurnian NaCl dengan rekristalisasi
tidak dapat dilakukan.
b. Kristal tidak harus mengendap dari larutan jenuh
dengan pendinginan karena mungkin terbentuk super
jenuh. Dalam kasus semacam ini penambahan Kristal
bibt, mungkin akan efektif. Bila tak ada Kristal bibit,
menggaruk dinding mungkin akan berguna.
c. Untuk mencegah reaksi kimia antara pelarut dan zat
terlarut, penggunaan pelarut non polar lebih disarankan.
Namun, pelarut non polar cenderung merupakan pelarut
yang buruk untuk senyawa polar.
Umumnya, pelarut dengan titik didih rendah lebih
diinginkan. Namun sekali lagi pelarut dengan titik didih lebih
rendah biasanya non polar. Jadi, pemilihan pelarut biasanya
bukan masalah sederhana
II.2.2.3 KLTP
Metode KLT preparatif. KLT preparatif dibuat dengan
menggunakan silika gel GF254 sehingga dapat berfluoresensi di
bawah lampu UV. Pada KLT preparatif, fraksi I yang akan
dipisahkan ditotolkan berupa garis pada salah satu sisi plat
lapisan dan dikembangkan secara tegak lurus pada garis
cuplikan, sehingga campuran akan terpisah menjadi beberapa
pita. Sebelum dilakukan KLT preparatif pada fraksi I, terlebih
dahulu dilakukan KLT untuk mendapatkan eluen yang sesuai.
Sistem eluen n-heksana : kloroform (1 : 4).
II.2.2.4 KLT 2D
KLT 2 arah atau 2 dimensi ini bertujuan untuk
meningkatkan resolusi sampel ketika komponen-komponen
solute mempunyai karakterisik kimia yang hampir sama. Selain
itu, 2 sistem fase gerak yang sangat berbeda dapat digunakan
secara berurutan pada suatu campuran tertentu sehingga
memungkinkan untuk melakukan pemisahan analit yang
mempunyai tingkat polaritas yang hampir sama (Rohman,
2009).
KLT dua dimensi dilakukan dengan melakukan
penotolan sampel disalah satu sudut lapisan lempeng tipis dan
mengembangkannya sebagaimana bisa dengan eluen pertamaa.
Lempeng kromatografi selanjutnya, lempeng dimasukkan dalam
chamber yang menggunakan eluen kedua sehingga
pengembangan dapat terjadi pada arah kedua yang tegak lurus
dengan arah pengembangan yang pertama. Suksesnya
pemisahan tergantung pada kemampuan untuk memodifikasi
selektifitas eluen kedua dibandingkan dengan selektifitas eluen
pertama (Rohman, 2009).
II.2.2.5 KLT Multieluen
Multi eluen merupakan penggunaan eluen atau fase
gerak yang berbeda yang memungkinkan pemisahan analit
dengan berdasarkan tingkat polaritas yang berbeda
(Sastrohamidjojo, 2007). Prinsipnya “like dissolve like”, yang
dapat digunakan untuk pemilihan pelarut dalam menentukan
jenis senyawa kimia yang mungkin terekstraksi dari organisme.
Dimana pelarut non polar akan mengestraksi senyawa-senyawa
non polar dan sebaliknya, serta dapat juga digunakan untuk
menganalisis kemurnian suatu isolat / senyawa kimia yang
diperoleh dari hasil isolasi dari bahan alam (Sastrohamidjojo,
2007).
KLT Multi eluen adalah penggunaan eluen atau fase
gerak yang berbeda yang memungkinkan pemisahan analit
 berdasarkan tingkat polaritas yang berbeda. Dalam multi eluen,
setelah pengembang tunggal menaik, kromatogram diangkat dari
chamber dan dikeringkan, biasanya selama 5-10 menit.
Kromatogram tersebut kemudian dielusi lagi dalam eluen segar
dari pelarut yang sama dalam arah yang sama untuk jarak yang
sama. Proses ini dapat diulang berkali-kali untuk meningkatkan
resolusi komponen dengan nilai Rf dibawah 0,5.
Beberapa pengembang dilakukan dengan pelarut yang
berbeda dalam arah yang sama, masing-masing yang
menjalankan jarak yang sama atau berbeda, disebut elusi
bertahap. Sebuah fase kurang polar dapat digunakan pertama,
diikuti oleh fase yang lebih polar, atau sebaliknya. Pemindahan
material nonpolar kebagian atas lapisan, meninggalkan zat
terlarut yang polar, darimana zat terlarut berasal. Setelah kering,
zat terlarut polar dipisahkan oleh pengembang dengan eluen
(Gritter, dkk.,1991). Multi eluen adalah salah satu cara untuk
mendapatkan resolusi yang baik dari hasil KLT. Memfokuskan
zona pemisahan multi eluen, cocok digunakan untuk sampel
yang memiliki noda dengan nilai Rf di bawah 0,5. Sampel
disentrifuge terlebih dahulu dengan menggunakan methanol p.a,
untuk menjamin kemurnian senyawa. Sebab, methanol p.a
merupakan pelarut yang khusus digunakan untuk analisis dan
bebas dari pengotor. Berbeda dengan metanol teknis yang bisa
saja mengandung pengotor seperti plasticizer dari wadah yang
digunakan untuk menampung pelarut. Agar seluruh area
lempeng dapat digunakan sehingga senyawa yang masih
menumpuk dalam satu noda, dapat terelusi kembali melalui sisi
lempeng yang lain (Hostetmann & Marston,1995).
II.2.3 Karakterisasi
II.2.3.1 UV-Vis
Spektrofotometri Sinar Tampak (UV-Vis) adalah
pengukuran energi cahaya oleh suatu sistem kimia pada panjang
gelombang tertentu (Day, 2002). Sinar ultraviolet (UV)
mempunyai panjang gelombang antara 200-400 nm, dan sinar
tampak (visible) mempunyai panjang gelombang 400-750 nm.
Pengukuran spektrofotometri menggunakan alat
spektrofotometer yang melibatkan energi elektronik yang cukup
besar pada molekul yang dianalisis, sehingga spektrofotometer
UV-Vis lebih banyak dipakai untuk analisis kuantitatif
dibandingkan kualitatif. Spektrum UV-Vis sangat berguna untuk
pengukuran secara kuantitatif. Konsentrasi dari analit di dalam
larutan bisa ditentukan dengan mengukur absorban pada panjang
gelombang tertentu dengan menggunakan hukum Lambert-Beer
(Rohman, 2007).
Hukum Lambert-Beer menyatakan hubungan linieritas
antara absorban dengan konsentrasi larutan analit dan
berbanding terbalik dengan transmitan. Dalam hukum Lambert-
Beer tersebut ada beberapa pembatasan, yaitu :

1. Sinar yang digunakan dianggap monokromatis

2. Penyerapan terjadi dalam suatu volume yang
mempunyai penampang yang sama

3. Senyawa yang menyerap dalam larutan tersebut tidak

tergantung terhadap yang lain dalam larutan tersebut

4. Tidak terjadi fluorensensi atau fosforisensi

5. Indeks bias tidak tergantung pada konsentrasi larutan

Prinsip kerja Uv-Vis yaitu cahaya yang berasal dari

lampu deuterium maupun wolfram yang bersifat polikromatis di
teruskan melalui lensa menuju ke monokromator pada
spektrofotometer dan filter cahaya pada fotometer.
Monokromator kemudian akan mengubah cahaya polikromatis
menjadi cahaya monokromatis (tunggal). Berkas-berkas cahaya
dengan panjang tertentu kemudian akan dilewatkan pada sampel
yang mengandung suatu zat dalam konsentrasi tertentu. Oleh
karena itu, terdapat cahaya yang diserap (diabsorbsi) dan ada
pula yang dilewatkan. Cahaya yang dilewatkan ini kemudian di
terima oleh detector. Detector kemudian akan menghitung
cahaya yang diterima dan mengetahui cahaya yang diserap oleh
sampel. Cahaya yang diserap sebanding dengan konsentrasi zat
yang terkandung dalam sampel sehingga akan diketahui
konsentrasi zat dalam sampel secara kuantitatif.
Hal hal yang perlu diperhatikan
1. Larutan yang dianalisis merupakan larutan
berwarna. Apabila larutan yang akan dianalisis
merupakan larutan yang tidak berwarna, maka larutan
tersebut harus diubah terlebih dahulu menjadi larutan
yang berwarna. Kecuali apabila diukur dengan
menggunakan lampu UV.
2. Panjang gelombang maksimum. Panjang gelombang
yang digunakan adalah panjang gelombang yang
mempunyai absorbansi maksimal. Hal ini dikarenakan
pada panajgn gelombang maksimal, kepekaannya juga
maksimal karena pada panjang gelombang tersebut,
perubahan absorbansi untuk tiap satuan konsentrasi
adalah yang paling besar. Selain itu disekitar panjang
gelombang maksimal, akan terbentuk kurva absorbansi
yang datar sehingga hukum Lambert-Beer dapat
terpenuhi. Dan apabila dilakukan pengukuran ulang,
tingkat kesalahannya akan kecil sekali.
3. Kalibrasi Panjang gelombang dan Absorban.
Spektrofotometer digunakan untuk mengukur intensitas
cahaya yang dipancarkan dan cahaya yang diabsorbsi.
Hal ini bergantung pada spektrum elektromagnetik yang
 diabsorb oleh benda. Tiap media akan menyerap cahaya
pada panjang gelombang tertentu tergantung pada
senyawa yang terbentuk. Oleh karena itu perlu dilakukan
kalibrasi panjang gelombang dan absorban pada
spektrofotometer agar pengukuran yang di dapatkan
lebih teliti.
II.2.3.2 FT-IR
Spektroskopi infra merah membantu mengidentifikasi
macam-macam ikatan yang terdapat dalam suatu senyawa.
Dengan diketahuinya macamnya ikatan kovalen yang ada dan
mana yang tidak ada dapat kita perkirakan gugus fungsional
yang ada atau tidak ada dalam suatu struktur misalnya, bila
suatu senyawa mempunyai ikatan O – H, maka senyawa dapat
berupa asam karboksilat (RCOH2), alcohol (ROH) atau suatu
fenol (ArOH). Spektrofotometer IR digunakan dalam penentuan
gugus fungsional dari suatu senyawa seperti gugus : N-H, C-H,
O-H, C-X, C=O, C-C, C=C,C=N dan juga digunakan untuk
analisis kuantitatif, seperti analisis kuantitatif untuk pencemar
udara misalnya karbon monoksida dalam udara dengan tehnik
non-dispersive. Spektrum infra merah memberikan puncak-
puncak maksimal yang jelasnya puncak minimumnya. Pada
dasarnya, instrumentasi yang digunakan dalam radiasi
inframerah menggunakan dasar-dasar optik yang sama seperti
yang terdapat dalam spektrofotometer ultravaliolet dan tampak
(Sastrohamidjojo, !990)
Tabel 1. Frekuensi dan Absorbansi Inframerah (Harmita,
2015)

Gugus Daerah serapan (cm-

Jenis senyawa 1
fungsi )
C-H Alkana 2850-3000
C-H Aldehid 2700-2900
=CH Aromatis 690-900, 3050-3150
O-H H-terikat 3200-3500
O-H Bebas 3600-3650
O-H Asam Karboksilat 3200-3400
C=C Alkena 1600-1680
C=C Aromatis 1475 – 1600
C=O Aldehid 1720-1740
C=O Keton 1705-1725
C=O Asam Karboksilat 1700-1725
C=O Ester 1730-1750
C=O Amida 1640-1670
C=O Anhidrida 1810 dan 1760
C=O Asil Halida 1800
Alkohol, eter, ester,
C-O
asam karboksilat, 1000-1300
anhidrida
Amin primer, amin
3100-3500
N-H sekunder
1550-1640
dan amida
Tabel 2. Serapan Khas Gugus Fungsi pada Inframerah
(Silverstein, 2005)

Gugus
Jenis senyawa Daerah serapan (cm-1)
fungsi
C-H Alkana 2850-2960, 1350-1470
C-H Alkena 3020-3080, 675-870
C-H Aromatis 690-900, 3050-3150
C-H Alkuna 3300
C=C Alkena 1640-1680
C=C Aromatis (cincin) 1500-1600
Alkohol, eter, asam
C-O 1080-1300
karboksilat, ester
Aldehid, keton, asam
C=O 1690 – 1760
karbosilat, ester
Alkohol, fenol,
O-H 3610-3640
(monomer)
Alkohol, fenol, (ikatan
O-H 2000-3600
H)
O-H Asam Karboksilat 3000-3600
N-H Amina 3310-3500
C-N Amina 1180-1360
-NO2 Nitril 1515-1560, 1345-1385
Bagian pokok dari spektrofotometer infra merah adalah
sumber cahaya infra merah, monokrometer dan detektor. Cahaya
dari sumber dilewatkan melalui cuplikan, dipecah menjadi
frekuensi-frekuensi individunya dalam monokromator dan
intesitas relatif dari frekuensi individu diukur oleh detektor
(Williams dan Fleming, 2014).
Bagian-bagian spektrofotometer infra merah (Williams
dan Fleming, 2014).:
1. Sumber cahaya infra merah
Sumber yang umum digunakan adalah merupakan
batang yang dipanaskan oleh listrik yang berupa Nemst
glower dan Globar. Nemst glower biasanya merupakan
tabung hampa dari zirkinium dan tyrium oksid yang
dipanaskan dan mempunyai suhu operasi antara 750º
hingga 1200ºC. Nemst glower lebih tinggi tanpa
mengurangi waktu hidupnya.
2. Monokromator
Monokromator yang mendispresikan energi sinar
awal menjadi banyak frekuensi dan kemudian setelah
melalui serangkaian celah yang menyeleksi frekuensi
tertentu yang akan dideteksi oleh detektor.
Prisma dan grating keduanya dapat digunakan.
Kebanyakan prisma yang digunakan adalah NaCI, hal ini
disebabkan karena NaCI hanya transparan dibawah 625 cm ‫־‬
1
, sedangkan halida logam lainya harus digunakan dalam
pekerjaan dengan frekuensi yang rendah (misal Csl, atau
campuran thBr dan Thl). Grating dan prisma mempunyai
peranan dalam meresolusi spektra dan dapat dibuat dari
bermacam-macam bahan.
3. Detektor
Ada tiga macam detektor yang digunakan pada
spektrofotometer infra merah, yaitu Bolometer,
Termokopel, dan Sel Pneumatic Golay. Ketiga macam
detektor tersebut bekerja berdasarkan pada pengaruh panas
yang dihasilkan bila radiasi infra merah diserap dari bekas
sinar yang mengenai. Pada umumnya detektor harus
mempunyai daerah peka kecil, kapasitas panas yang
rendah, arus gangguan yang rendah, sensitivitas panas yang
tinggi, absorbtivitas tidak selektif terhadap semua frekuensi
radiasi infra merah.
Sinar yang berasal dari celah keluar monokromator
difokuskan pada suatu detektor yang berfungsi mendeteksi
dan mengukur energi cahaya yang ditimbulkan oleh
pengaruh pemanasannya. Variasi suhu kecil yang
diakibatkan oleh variasi energi cahaya yang dideteksi
ditimbulkan bolometer atau termokopel. Pada bolometer
kenaikan suhu menyebabkan perubahan tegangan listrik
yang digunakan untuk mengubah tegangan. Termokopel
menggunakan energi cahaya untuk memanaskan salah satu
dari dua lempeng logam mulia yang dihubungkan dan
menghasilkan gaya elektromotif diantara hubungan
tersebut. Tegangan yang dihasilkan adalah berbanding
langsung dengan jumlah energi cahaya. Proses serapan
infra merah seperti halnya penyerapan energi yang lain,
molekul akan tereksitasi ke tingkatan yang lebih tinggi bila
menyerap radiasi infra merah. Hanya frekuensi tertentu dari
radiasi infra merah yang akan diserap oleh molekul.
Penyerapan radiasi infra merah sesuai dengan perubahan
energi. Radiasi dalam kisaran energi ini sesuai dengan
kisaran frekuensi vibrasi rentangan dan vibrasi bengkokan
dari ikatan kovalen dalam kebanyakan molekul. Namun,
tidak semua ikatan dalam molekul dapat menyerap energi
infra merah, meskipun radiasi tetap sesuai dengan gerakan
ikatan (Wagner dkk, 1999).
II.2.3.3 NMR (C-NMR dan HNM) 1D dan 2D
Spektroskopi Resonansi Magnetik Inti (NMR) adalah
suatu alat yang paling canggih yang tersedia untuk menentukan
struktur senyawa organik. Teknik ini bergantung pada
kemampuan inti atom untuk berperilaku seperti sebuah magnet
kecil dan menyesuaikan diri dengan medan magnet eksternal.
Ketika diradiasi dengan frekuensi gelombang radio, inti dalam
molekul dapat berubah sejajar dengan medan magnet.
Spektrometri NMR pada dasarnya merupakan
spektrometri absorbsi, sebagaimana spektrometri infra merah
maupun ultraviolet. Pada kondisi yang sesuai, suatu sampel
dapat mengabsorpsi radiasi elektromagnetik daerah frekuensi
radio, pada frekuensi yang tergantung dari sifat-sifat sampel.
Suatu plot dari frekuensi puncak-puncak absorbsi versus
intensitas puncak memberikan suatu spektrum NMR.
Spektroskopi NMR (Nuclear Magnetic Resonance) didasarkan
pada medan magnet yang berasal dari spin inti atom yang
bermuatan listrik.
Banyak inti (atau lebih tepat, inti dengan paling tidak
jumlah proton atau neutronnya ganjil) dapat dianggap sebagai
magnet kecil. Inti seperti proton (1H atau H-1) dan inti karbon-
13 (13C atau C-13, kelimpahan alaminya sekitar 1%). Karbon
-12 (12C), yang dijadikan standar penentuan massa, tidak
bersifat magnet.
Bila sampel yang mengandung 1H atau 13C atau bahkan
semua senyawa organik, ditempatkan dalam medan magnet,
akan timbul interaksi antara medan magnet luar dengan magnet
kecil (inti). Karena adanya interaksi ini, magnet kecil akan
terbagi atas dua tingkat energi, yaitu: tingkat yang sedikit agak
lebih stabil (+) dan keadaan yang kurang stabil (-) yang
energinya berbeda. Karena dunia inti adalah dunia mikroskopik,
energi yang berkaitan dengan inti ini terkuantisasi, artinya tidak
kontinyu. Perbedaan energi antara dua keadaan diberikan oleh
persamaan sebagai berikut: ∆E = γhH/2π
Keterangan:
H : Kuat medan magnet luar (yakni magnet spektrometer)
H : Tetapan Planck
γ : Tetapn khas bagi jenis inti tertentu, disebut dengan rasio
giromagnetik dan untuk proton nilainya 2,6752 x 108 kg-1 s A
(A= ampere). Bila sampel disinari dengan gelombang
elektromagnetik ν yang berkaitan dengan perbedaan energi ∆E,
yakni: ∆E = hν Inti dalam keadaan (+) mengabsorbsi energi ini
dan tereksitasi ke tingkat energi (-). Proses mengeksitasi inti
dalam medan magnetik akan mengabsorbsi energi (resonansi)
disebut nuclear magnetic resonance (NMR). Frekuensi
gelombang elektromagnetik yang diabsorbsi diungkapkan
sebagai fungsi H.
ν = γH/2π
Bila kekuatan medan magnet luar, yakni magnet
spektrometer, adalah 2,3490 T (tesla, 1 T = 23490 Gauss), ν
yang diamati sekitar 1 x 108 Hz = 100 MHz. Nilai frekuensi ini
di daerah gelombang mikro.Seacara prinsip, frekuensi
gelombang elektromagnetik yang diserap ditentukan oleh
kekuatan magnet dan jenis inti yang diamati. Namun, perubahan
kecil dalam frekuensi diinduksi oleh perbedaan lingkungan
kimia tempat inti tersebut berada. Perubahan ini disebut
pergeseran kimia.
Inti yang memiliki jumlah proton yang ganjil atau jumlah
netron yang ganjil, tetapi tidak keduanya ganjil, mempunyai
bilangan kuantum spin ½, 3/2, 5/2 dan seterusnya, seperti H1,
B11, F19, P31. Bilangan kuantum spin untuk masing-masing
inti adalah 1/2 .Masing- masing inti mempunyai dua spin yang
bersesuaian yaitu I=+1/2 dan I=-1/2 . Untuk inti yang lebih
besar mempunyai bilangan spin yang terbentang dari nol, yang
menyiratkan mereka tidak mempunyai komponen spin untuk
minimal 9/2. Inti tersebut berkelakuan seperti bola berspin
muatan yang bersirkulasi menghasilkan suatu medan magnet
seperti arus listrik dalam kumparan kawat. Sepanjang sumbu
putarnya terdapat suatu momen magnetik inti yang sesuai.
Hubungan antara spin inti dan momen magnet memberikan
bilangan kuantum magnetik yang diberikan oleh :
m = l, l-1, l-2, . . ., -l
Inti mempunyai dua bilangan kuantum magnetik ,
dimana m = + 1/2 dan m = -1/2.
Untuk inti di mana jumlah proton dan neutron keduanya
ganjil, maka muatan terdistribusi secara nonsimetris. Inti yang
memiliki jumlah proton dan neutron keduanya genap, tidak
mempunyai momentum sudut putar yaitu I=0 dan tidak
menunjukkan sifat magnetik, misalnya C12 bersifat inert secara
magnetik dan tidak terdeteksi dalam NMR. Inti yang bersifat
magnetik (I>0) pada umumnya berinteraksi dengan medan
magnit luar dan menyelaraskan orientasinya dengan tingkat-
tingkat energi yang sesuai. Tingkat-tingkat energinya adalah I, I
– 1, I – 2, – I. Untuk suatu inti tertentu, orientasinya yang
mungkin adalah (2I + 1) untuk suatu proton bila I = 1/2 ; dua
orientasi akan terjadi.

Prinsip Kerja NMR.

Metode spektroskopi jenis ini didasarkan pada
penyerapan energi oleh partikel yang sedang berputar di dalam
medan magnet yang kuat. Pada umumnya metode ini berguna
sekali untuk mengidentifikasi struktur senyawa / rumus bangun
molekul senyawa organik. Jumlah dan tempat proton dalam
molekul senyawa organik menentukan bentuk spektrum yang
dihasilkan.Energi yang dipakai dalam pengukuran dengan
metode ini berada pada daerah gelombang radio 75-0,5 m atau
pada frekuensi 4-600 MHz, yang bergantung pada jenis inti yang
diukurnya, NMR bermacam-macam ragamnya, misalnya
NMR 1H, 13C, 19F.
Inti yang dapat diukur dengan NMR yaitu :
a. Bentuk bulat
b. Berputar
c. Bilangan kuantum spin = ½
d. Jumlah proton dan netron ganjil, contoh : 1H, 19F, 31P, 11B, 13C.
Dalam keadaan normal (inti tidak dikenai/diletakkan
pada medan magnet eksternal), semua orientasi dari suatu inti
berenergi sama (degenerasi). Bila inti dikenai medan magnet,
maka orientasi/tingkat spin tidak lagi berenergi sama. Hal ini
disebabkan karena inti mempunyai momen magnetik (µ) yang
ditimbulkan oleh berpusingnya muatan. Jumlah orientasi yang
mungkin bagi suatu inti bila padanya dikenakan medan magnet
homogen eksternal ditentukan oleh bilangan kuantum spin (I)
dari inti tersebut, sesuai dengan persamaan : Jadi untuk inti 1H
dan 13C, dengan I = ½, masing-masing akan mempunyai dua
macam orientasi (2 x ½ + 1 = 2), yaitu + ½ (searah dengan
medan magnet) dan – ½ (berlawanan arah/melawan medan
magnet). Tingkatan spin + ½ berenergi lebih rendah karena
searah dengan medan magnet karena searah dengan medan
magnet eksternal, sedang tingkatan spin – ½ berenergi lebih
tinggi karena melawan medan magnet eksternal.
Komponen Spektrofotometer
Komponen spektrofotometer NMR terdiri dari, tempat
sampel, celah magnet, ossilator radio frekuensi, detektor radio
frekuensi, audio amplifier, pencatat (recorder). Sampel
dilarutkan dalam pelarut yang tidak mengandung proton
(misalnya CCl 4) dan sejumlah kecil TMS ditambahkan sebagai
standar internal, kemudian dimasukkan kedalam tempat sampel.
Sampel kemudian diputar sekitar sumbunya untuk
mengusahakan agar semua bagian dari larutan terkena medan
magnet yang sama.
Celah magnet
Magnet terdiri dari dua bagian, magnet pokok
mempunyai kekuatan sekitar 14.100 Gauss, dan ia
ditutup oleh potongan - potongan kecil kutub
elektromagnet. Pada celah magnet terdapat kumparan
yang dihubungkan dengan ossilator frekuensi radio (RF)
60 MHz.
Ossilator frekuensi radio
Ossilator frekuensi radio akan memberikan
tenaga elektromagnetik sebesar 60 MHz melalui
kumparan yang dihubungkan pada celah sampel.
 Kumparan selanjutnya memberikan tenaga
elektromagnetik yang digunakan untuk mengubah
orientasi perputaran proton. Kebanyakan
spektrofotometer NMR menggunakan sinyal frekuensi
RF tetap dan mengubah -ubah kekuatan medan magnet
untuk membawa setiap proton mengalami resonansi.
Detektor radio frekuensi
Kumparan detektor berada tegak lurus dengan
kumparan ossilator RF. Bila ada tenaga yang diserap,
kumparan detektor tidak menangkap tenaga yang
diberikan oleh kumparan ossilator RF. Bila sampel
menyerap tenaga, maka putaran inti akan menghasilkan
sinyal frekuensi rasio pada bidang kumparan detektor,
dan alat memberikan respon ke pencatat sebagai sinyal
resonansi atau puncak.
Pencatat
Pencatat berfungsi untuk menangkap sinyal
resonansi atau puncak. Sebelum sinyal sampai ke
pencatat biasanya dilewatkan terlebih dahulu ke audio
amplifier untuk menggandakan sinyal, sehingga
menjadi lebih nampak.
Penerapan spektroskopi NMR
Dalam menginterpretasi spektrum NMR, ada empat langkah
yang perlu diperhatikan, yaitu :
1. Jumlah sinyal, yang menerangkan kepada kita ada berapa macam
perbedaan dari proton-proton yang terdapat dalam molekul.
2. Kedudukan sinyal, yang menerangkan kepada kita sesuatu tentang
lingkungan elektronik dari setiap macam proton.
3. Intensitas sinyal, yang menerangkan kepada kita berapa banyak
proton dari setiap macam proton yang ada.
4. Pemecahan (splitting) dari sebuah sinyal menjadi beberapa puncak,
yang menerangkan kepada kita tenang lingkungan dari sebuah proton
dengan lainnya yaitu proton-proton yang berdekatan.Sebagai contoh
dari uraian tersebut, maka perhatikan spektra NMR dari toluene; p-
exilen, dan mesitelen.
Kegunaan Spektrofotometer NMR
Banyak informasi yang dapat diperoleh dari spektra NMR. Pada
umumnya metode ini berguna sekali untuk mengidentifikasi struktur
senyawa atau rumus bangun molekulsenyawa organik. Meskipun
spektroskopi infra merah juga dapat digunakan untuk tujuan tersebut,
analisis spektra NMR mampu memberikan informasi yang lebih
lengkap.Dampak spektroskopi NMR pada senyawa bahan alam sangat
penting. Ini dapat digunakan untuk mempelajari campuran analisis,
untuk memahami efek dinamis seperti perubahan pada suhu dan
mekanisme reaksi, dan merupakan instrumen tak ternilai untuk
memahami struktur dan fungsi asam nukleat dan protein. Teknik ini
dapat digunakan untuk berbagai variasi sampel, dalam bentuk padat
atau pun larutan.
Aplikasi Spektrofotometer NMR
Bidang Kedokteran, spektroskopi NMR merupakan alat yang
dikembangkan dalam biologi struktural.NMR manjadi sebuah teknik
alternatif selain kristalografi X-Ray, untuk memperolehinformasi
struktur dan resolusi dinamik atomik dan studi interaksi molekuler
darimakromolekul biologi pada kondisi larutan secara fisiologi. Usaha
sangat penting untuk memperluas aplikasi NMR untuk sistem molekul
yang lebih besar, karena jumlah yang lebih besar secara biologi
dibutuhkan kompleks makromolekul dan makromolekuler yang
memiliki massa molekuler melebihi range yang sacara prakis
digunakan untukspektroskopi NMR konvensional dalam larutan.
Peningkatan ukuran ini memberikan batasan, contohnya, penentuan
struktur protein yang tidak dapat dikristalkan,termasuk membran
protein integral, penelitian interaksi molekuler melibatkanmolekul
besar dan penghimpunan makromolekuler, dan penentuan struktur
darioligonukleotida yang lebih besar dan kompleks dengan protein.
Bidang Biologi MolekulerNMR pada biologi melekuler
dilakukan pada sample dalam bentuk larutan yangterlebih dahulu
dilakukan pemurnian atau ekstraksi. Dengan NMR dapat
diketahuistruktur molekulernya dan perubahan yang terjadi ketika
mendapat ganguan dari luar (rangsangan, penyakit atau penambahan
zat lain).
II.2.3.4 GC-MS
Gas Chromatography-Mass Spectroscopy (GC-MS) digunakan
untuk mengidentifikasi komponen flavor dalam minyak nilam.
Spektroskopi massa dapat digunakan untuk mengetahui Rumus
Molekul tanpa melalui analisis unsur. Misalnya C4H10O, biasanya
memakai cara kualitatif atau kuantitatif. Setelah diketahui rumus
empirisnya, yakni (CxHyOz)n, kemudian baru ditentukan BM-nya.
Komputer pada alat GC-MS dapat langsung diketahui rumus
molekulnya.
GC-MS hanya dapat digunakan untuk mendeteksi senyawa-
senyawa yang mudah menguap. Glukosa, sukrosa, sakarosa bersifat
tidak menguap sehingga tidak dapat dideteksi dengan alat GC-MS.

Gambar 9. Alat GC-MS

Secara umum, GC-MS memiliki tiga konfigurasi utama, yitu
GC, konektor, dan MS. Prinsip kerja GC-MS didasarkan pada
perbedaan kepolaran dan massa molekul sampel yang dapat diuapkan.
Sampel yang berupa cairan atu gas langsung diinjeksikan ke dalam
injektor, jika sampel berbentuk padatan maka harus dilarutkan pada
pelarut yang dapat diuapkan. Aliran gas yang mengalir akan membawa
sampel yang teruapkan untuk masuk ke dalam kolom.
Komponen-komponen yang ada pada sampel akan dipisahkan
berdasarkann partisi diantara fase gerak (gas pembawa) dan fase diam
(kolom). Hasilnya adalah berupa molekul gas yang kemudian akan
diionisasikan pada spektrofotometer massa sehingga molekul gas itu
akan mengalami fragmentasi yang berupa ion-ion positif. Ion akan
memiliki rasio yang spesifik antara massa dan muatannya. (Karliawan
2009)

Gambar 10. Skema konfigurasi GC-MS

GC-MS semakin meluas penggunaannya sejak tahun 1960 dan

banyak diaplikasikan dalam kimia organik. Sejak saat itu terjadi
kenaikan penggunaann yang sangat besar pada metode ini. Hal tersebut
dikarenakan GC-MS dapat menguapkan hampir semua senyawa
organik dan mengionkannya. Selain itu, fragmen yang dihasilkan dari
ion molekul dapat dihubungkan dengan struktur molekulnya.
Instrumen GC-MS merupakan gabungan dari alat GC dan MS, yang
berarti sampel yang akan dianalisis diidentifikasi dahulu dengan alat
GC kemudian diidentifikasi kembali dengan alat MS. GC dan MS
merupakan kombinasi kekuatan yang simultan untuk memisahkan dan
mengidentifikasi komponen-komponen campuran (Harvey, 2000).
Defenisi Gas Cromatografy Mass Spectrometry (GCMS)
GCMS merupakan metode pemisahan senyawa organik yang
menggunakan dua metode analisis senyawa yaitu kromatografi gas
(GC) untuk menganalisis jumlah senyawa secara kuantitatif dan
spektrometri massa (MS) untuk menganalisis struktur molekul
senyawa analit.
Kromatografi gas-spektrometer massa (GC-MS) adalah metode
yang mengkombinasikan kromatografi gas dan spektrometri massa
untuk mengidentifikasi senyawa yang berbeda dalam analisis sampel.
Kromatografi gas dan spketometer masa memilki keunikan masing-
masing dimana keduanya memiliki kelebihan dan kekurangan. Dengan
menggambungkan kedua teknik tersebut diharapkan mampu
meningkatkan kemamapuan dalam menganalisis sampel dengan
mengambil kelebihan masing-masing teknik dan meminimalisir
kekurangannya.
Kromatografi gas dan spketometer masa dalam banyak hal
memiliki banyak kesamaan dalam tekniknya. Untuk kedua teknik
tersebut, sampel yang dibutuhkan dalam bentuk fase uap, dan
keduanya juga sama-sama membutuhkan jumlah sampel yang sedikit
( umumnya kurang dari 1 ng). Disisi lain, kedua teknik tersebut
memiliki perbedaan yang cukup besar yakni pada kondisi operasinya.
Senyawa yang terdapat pada kromatografi gas adalah senyawa yang
digunakan untuk sebagai gas pembawa dalam alat GC dengan tekanan
kurang lebih 760 torr, sedangkan spketometer massa beroperasi pada
kondisi vakum dengan kondisi tekanan 10-6 – 10-5 torr.
Gas kromatografi merupakan salah satu teknik spektroskopi
yang menggunakan prinsip pemisahan campuran berdasarkan
perbedaan kecepatan migrasi komponen-komponen penyusunnya. Gas
kromatografi biasa digunakan untuk mengidentifikasi suatu senyawa
yang terdapat pada campuran gas dan juga menentukan konsentrasi
suatu senyawa dalam fase gas.
Spektroskopi massa adalah suatu metode untuk mendapatkan
berat molekul dengan cara mencari perbandingan massa terhadap
muatan dari ion yang muatannya diketahui dengan mengukur jari-jari
orbit melingkarnya dalam medan magnetik seragam.
Penggunaan kromatografi gas dapat dipadukan dengan
spektroskopi massa.
Paduan keduanya dapat menghasilkan data yang lebih akurat
dalam pengidentifikasian senyawa yang dilengakapi dengan struktur
molekulnya.
Kromatografi gas ini juga mirip dengan distilasi fraksional,
karena kedua proses memisahkan komponen dari campuran terutama
berdasarkan pada perbedaan titik didih (atau tekanan uap). Namun,
distilasi fraksional biasanya digunakan untuk memisahkan komponen-
komponen dari campuran pada skala besar, sedangkan GC dapat
digunakan padaskala yang lebih kecil (yaitu mikro) (Pavia:2006).
Instrumentasi Cromatografy Mass Spectrometry (GCMS)
Rangkaian instrumentasi untuk gas kromatografi dan
spekstroskopi massa bergabung menjadi satu kesatuan rangkaian yang
sering disebut dengan GCMS. Secara umum rangkaian GCMS :

Gambar 1. Diagram Alir Kromatografi Gas-Cair

Berikut adalah penjelasan mengenai masing-masing instrument pada
rangkaian GCMS.
Instrumentasi Gas Kromatografi
a. Carrier Gas Supply
Gas pembawa (carrier gas) pada kromatografi gas sangatlah penting.
Gas yang dapat digunakan pada dasarnya haruslah inert, kering, dan
bebas oksigen. Kondisi seperti ini dibutuhkan karena gas pembawa ini
dapat saja bereaksi dan dapat mempengaruhi gas yang akan dipelajari
atau diidentifikasi.
b. Control System
Berfungsi mengontrol tekanan dan laju fase gerak yang masuk ke
kolom dan mengontrol suhu oven.
c. Injeksi Sampel (Injection Port)
Sejumlah kecil sampel yang akan dianalisis diinjeksikan pada mesin
menggunakan semprit kecil. Jarum semprit menembus lempengan
karet tebal (Lempengan karet ini disebut septum) yang mana akan
mengubah bentuknya kembali secara otomatis ketika semprit ditarik
keluar dari lempengan karet tersebut. Dalam pemisahan dengan GLC
cuplikan harus dalam bentuk fase uap. Tetapi kebanyakan senyawa
organik berbentuk cairan dan padatan. Oleh karena itu, senyawa yang
berbentuk cairan dan padatan pertama-tama harus diuapkan. Ini
mem¬butuhkan pemanasan sebelum masuk dalam kolom. Panas itu
terdapat pada tempat injeksi. Namun demikian suhu tempat injeksi
tidak boleh terlalu tinggi, sebab kemungkinan akan terjadi perubahan
karena panas atau penguraian dari senyawa yang akan dianalisa. Kita
juga tidak boleh menginjeksikan cuplikan terlalu banyak, karena GC
sangat sensitif. Biasanya jumlah cuplikan yang diinjeksikan pada
waktu kita mengadakan analisa 0,5 -50 ml gas dan 0,2 - 20 ml untuk
cairan seperti pada gambar di bawah.
d. Oven
Oven digunakan untuk memanaskan column pada temperature tertentu
sehingga mempermudah proses pemisahan komponen sample.
Biasanya oven memiliki jangkauan suhu 30oC – 320oC.
e. Kolom
 Kolom merupakan jantung dari kromatografi gas. Ada beberapa bentuk
kolom, diantaranya lurus, bengkok, misal berbentuk V atau W, dan
kumparan/spiral. Kolom selalu merupakan bentuk tabung. Berisi fasa
diam, sedangkan fasa bergerak akan lewat didalamnya sambil
membawa sample. Secara umum terdapat 2 jenis kolom, yaitu:
1) Packed column, umumnya terbuat dari glass atau stainless steel coil
dengan panjang 1 – 5 m dan diameter kira-kira 5 mm.
2) Capillary column, umumnya terbuat dari purified silicate glass
dengan panjang 10-100 m dan diameter kira-kira 250 mm. Beberapa
jenis stationary phase yang sering digunakan:
• Polysiloxanes untuk nonpolar analytes/sample.
• Polyethylene glycol untuk polar analytes/sample.
• Inorganic atau polymer packing untuk sample bersifat small gaseous
species.
Ada dua tipe utama kolom dalam kromatografi gas-cair. Tipe pertama,
tube panjang dan tipis berisi material padatan; Tipe kedua, lebih tipis
dan memiliki fase diam yang berikatan dengan pada bagian terdalam
permukaannya. Ada tiga hal yang dapat berlangsung pada molekul
tertentu dalam campuran yang diinjeksikan pada kolom:
• Molekul dapat berkondensasi pada fase diam.
• Molekul dapat larut dalam cairan pada permukaan fase diam
• Molekul dapat tetap pada fase gas
2. Instrumentasi Spekstroskopi massa
a. Sumber Ion
Setelah analit melalui kolom kapiler, ia akan diionisasi. Ionisasi pada
spektroskopi massa yang terintegrasi dengan GC ada dua, yakni
Electron Impact ionization (EI) atau Chemical Ionization (CI), yang
lebih jauh lagi terbagi menjadi negatif (NCI) dan positif (PCI).
Berikutnya akan dijelaskan ionisasi EI. Ketika analit keluar dari kolom
kapiler, ia akan diionisasi oleh elektron dari filamen tungsten yang
diberi tegangan listrik. Ionisasi terjadi bukan karena tumbukan elektron
dan molekul, tapi karena interaksi medan elektron dan molekul, ketika
berdekatan. Hal tersebut menyebabkan satu elektron lepas, sehingga
terbetuk ion molekular M+, yang memiliki massa sama dengan molekul
netral, tetapi bermuatan lebih positif. Adapun perbandingan massa
fragmen tersebut dengan muatannya disebut mass to charge ratio yang
disimbolkan M/Z. Ion yang terbentuk akan didorong ke quadrupoles
atau mass filter. Quadrupoles berupa empat elektromagnet.
Setelah melewati rangkaian gas kromatografi, sampel gas yang akan
diuji dilanjutkan melalui rangkaian spekstroskopi massa. Molekul-
molekul yang melewati sumber ion ini diserang oleh elektron, dan
dipecah menjadi ionion positifnya. Tahap ini sangatlah penting karena
untuk melewati filter, partikel-partikel sampel haruslah bermuatan.
b. Filter
Selama ion melui rangkaian spekstroskopi massa, ion-ion ini melalui
rangkaian elektromagnetik yang menyaring ion berdasarkan perbedaan
masa. Para ilmuwan memisahkan komponen-komponen massa untuk
kemudian dipilih yang mana yang boleh melanjutkan yang mana yang
tidak (prinsip penyaringan). Filter ini terus menyaring ion-ion yang
berasal dari sumber ion untuk kemudian diteruskan ke detektor.
Pada quadrupoles, ion-ion dikelompokkan menurut M/Z dengan
kombinasi frekuensi radio yang bergantian dan tegangan DC. Hanya ion
dengan M/Z tertentu yang dilewatkan oleh quadrupoles menuju ke
detektor.
c. Detektor
Ada beberapa tipe detektor yang biasa digunakan. Detektor ionisasi
nyala dijelaskan pada bagian bawah penjelasan ini, merupakan detektor
yang umum dan lebih mudah untuk dijelaskan daripada detektor
alternatif lainnya.
Dalam mekanisme reaksi, pembakaran senyawa organik merupakan hal
yang sangat kompleks. Selama proses, sejumlah ion-ion dan elektron-
elektron dihasilkan dalam nyala. Kehadiran ion dan elektron dapat
dideteksi. Seluruh detektor ditutup dalam oven yang lebih panas
dibanding dengan temperatur kolom. Hal itu menghentikan kondensasi
dalam detektor.
Detektor terdiri atas High Energy Dynodes (HED) dan Electron
Multiplier (EM) detector. Ion positif menuju HED, menyebabkan
elektron terlepas. Elektron kemudian menuju kutub yang lebih positif,
yakni ujung tanduk EM. Ketika elektron menyinggung sisi EM, maka
akan lebih banyak lagi elektron yang terlepas, menyebabkan sebuah
arus/aliran. Kemudian sinyal arus dibuat oleh detektor proporsional
terhadap jumlah ion yang menuju detektor.
d. Recorder
Berfungsi merekam hasil dan mencetaknya pada sebuah grafik. Hasil
detektor akan direkam sebagai urutan puncak-puncak; setiap puncak
mewakili satu senyawa dalam campuran yang melalui detektor.
Sepanjang anda mengontrol secara hati-hati kondisi dalam kolom, anda
dapat menggunakan waktu retensi untuk membantu mengidentifikasi
senyawa yang tampak-tentu saja anda atau seseorang lain telah
menganalisa senyawa murni dari berbagai senyawa pada kondisi yang
sama.
4. Komputer
Data dari spekrometri masa dikirim ke computer dan diplot dalam
sebuah grafik yang disebut spectrum masa.
Prinsip Kerja Cromatografy Mass Spectrometry (GCMS)
GC-MS adalah terdiri dari dua blok bangunan utama: kromatografi
gas dan spektrometer massa. Kromatografi gas menggunakan kolom
kapiler yang tergantung pada dimensi kolom itu (panjang, diameter,
ketebalan film) serta sifat fase (misalnya 5% fenil polisiloksan).
Perbedaan sifat kimia antara molekul-molekul yang berbeda dalam suatu
campuran dipisahkan dari molekul dengan melewatkan sampel
sepanjang kolom. Molekul-molekul memerlukan jumlah waktu yang
berbeda (disebut waktu retensi) untuk keluar dari kromatografi gas, dan
ini memungkinkan spektrometer massa untuk menangkap, ionisasi,
mempercepat, membelokkan, dan mendeteksi molekul terionisasi secara
terpisah. Spektrometer massa melakukan hal ini dengan memecah
masing-masing molekul menjadi terionisasi mendeteksi fragmen
menggunakan massa untuk mengisi rasio.
1. Kromatografi Gas (Gas Chromatography)
Kromatografi gas (GC) merupakan jenis kromatografi yang
digunakan dalam kimia organik untuk pemisahan dan analisis. GC dapat
digunakan untuk menguji kemurnian dari bahan tertentu, atau
memisahkan berbagai komponen dari campuran. Dalam beberapa situasi,
GC dapat membantu dalam mengidentifikasi sebuah senyawa kompleks.
Dalam kromatografi gas, fase yang bergerak (atau "mobile phase")
adalah sebuah operator gas, yang biasanya gas murni seperti helium atau
yang tidak reactive seperti gas nitrogen. Stationary atau fasa diam
merupakan tahap mikroskopis lapisan cair atau polimer yang
mendukung gas murni, di dalam bagian dari sistem pipa-pipa kaca atau
logam yang disebut kolom. Instrumen yang digunakan untuk melakukan
kromatografi gas disebut gas chromatograph (atau "aerograph", "gas
pemisah").
2. Spektroskopi Massa (Mass Spectrometry)
Umumnya spektrum massa diperoleh dengan mengubah senyawa
suatu sample menjadi ion-ion yang bergerak cepat yang dipisahkan
berdasarkan perbandingan massa terhadap muatan. Spektroskopi massa
mampu menghasilkan berkas ion dari suatu zat uji, memilah ion tersebut
menjadi spektum yang sesuai dengan perbandingan massa terhadap
muatan dan merekam kelimpahan relatif tiap jenis ion yang ada.
Umumnya hanya ion positif yang dipelajari karena ion negative yang
dihasilkan dari sumber tumbukan umumnya sedikit.
3. Kombinasi GCMS
Saat GC dikombinasikan dengan MS, akan didapatkan sebuah
metode analisis yang sangat bagus. Peneliti dapat menganalisis larutan
organik, memasukkannya ke dalam instrumen, memisahkannya menjadi
komponen tinggal dan langsung mengidentifikasi larutan tersebut.
Selanjutnya, peneliti dapat menghitung analisa kuantitatif dari masing-
masing komponen. Pada Gambar 4, sumbu z menyatakan kelimpahan
senyawa, sumbu x menyatakan spektrum kromatografi, dan sumbu y
menyatakan spektrum spektroskopi massa. Untuk menghitung masing-
masing metode dapat divisualisasikan ke dalam grafik dua dimensi.
4. Metode Analisis Cromatografy Mass Spectrometry (GCMS)
Pada metode analisis GCMS (Gas Cromatografy Mass
Spektroscopy) adalah dengan membaca spektra yang terdapat pada
kedua metode yang digabung tersebut. Pada spektra GC jika terdapat
bahwa dari sampel mengandung banyak senyawa, yaitu terlihat dari
banyaknya puncak (peak) dalam spektra GC tersebut. Berdasarkan data
waktu retensi yang sudah diketahui dari literatur, bisa diketahui senyawa
apa saja yang ada dalam sampel. Selanjutnya adalah dengan
memasukkan senyawa yang diduga tersebut ke dalam instrumen
spektroskopi massa. Hal ini dapat dilakukan karena salah satu kegunaan
dari kromatografi gas adalah untuk memisahkan senyawa-senyawa dari
suatu sampel. Setelah itu, didapat hasil dari spektra spektroskopi massa
pada grafik yang berbeda.
Informasi yang diperoleh dari kedua teknik ini yang digabung
dalam instrumen GC/MS adalah tak lain hasil dari masing-masing
spektra. Untuk spektra GC, informasi terpenting yang didapat adalah
waktu retensi untuk tiap-tiap senyawa dalam sampel. Sedangkan untuk
spektra MS, bisa diperoleh informasi mengenai massa molekul relatif
dari senyawa sampel tersbut.
Tahap-tahap suatu rancangan penelitian GC/MS:
1. Sample preparation
2. Derivatisation
3. Injeksi
Menginjeksikan campuran larutan ke kolom GC lewat heated injection
port. GC/MS kurang cocok untuk analisa senyawa labil pada suhu tinggi
karena akan terdekomposisi pada awal pemisahan.
5. GC separation
Campuran dibawa gas pembawa (biasanya Helium) dengan laju alir
tertentu melewati kolom GC yang dipanaskan dalam pemanas. Kolom
GC memiliki cairan pelapis (fasa diam) yang inert.
6. MS detector
Aspek kualitatif : lebih dari 275.000 spektra massa dari senyawa yang
tidak diketahui dapat teridentifikasi dengan referensi komputerisasi.
Aspek kuantitatif : dengan membandingkan kurva standar dari senyawa
yang diketahui dapat diketahui kuantitas dari senyawa yang tidak
diketahui.
7. Scanning
Spektra massa dicatat secara reguler dalam interval 0,5-1 detik selama
pemisahan GC dan disimpan dalam sistem instrumen data untuk
digunakan dalam analisis. Spektra massa berupa fingerprint ini dapat
dibandingkan dengan acuan.
Karakteristik Analisis
1. Limitasi/Batasan
Secara umum, penggunaan metode GC-MS hanya terbatas untuk
senyawa dengan tekanan uap berkisar10-10 torr. Kebanyakan senyawa
dengan tekanan lebih rendah hanya dapat dianalisis jika senyawa
tersebut merupakan senyawa turunan (contoh , trimetilsili eter).
Penentuan penentuan gugus fungsional pada cincin aromatic masih sulit.
Untuk senyawa isomer tidak dapat dibedakan oleh spketometer (sebagai
contoh : naftalena vs azulena), tapi dapat dipisahkan dengan
kromatograpi.
2. Sensivitas dan Batas Deteksi
 Bergantung pada faktor pelarutan dan metode ionisasi, sebuah
ekstrak dengan 0,1 – 100 ng dari setiap komponen mungkin dibutuhkan
agar sesuai jumlah yang diinjeksikan.
3. Perbandingan dengan Teknik lainnya
• IR spketometer dapat menyediakan informasi posisi aromatic isomer
dimana GC-MS tidak bisa; namun IR biasanya lebih rendah
sensitivitasnya sebesar 2 – 4.
• NMR (nuclear magnetic resonance) spektrometri dapat memberikan
informasi rinci pada konformasi molekuler ekstrak; namun biasanya
NMR lebih rendah sensivitasnya sebesar 2-4.
4. Sampel
Keadaan sampel harus dalam keadaan larutan untuk diijeksikan ke
dalam kromatografi. Pelarut harus bersifat volatile dan organic (sebagai
contoh heksana atau dikllorometana). Jumlah sampel bergantung pada
metode ionisasi yang dilakukan, biasanya yang sering digunakan untuk
analisis sensivitas adalah sebesar 1 – 100 pg per komponen.
5. Informasi analitikal
GC-MS digunakan untuk identifikasi kualitatif dan pengukuran
kuantitatif dari komponen individual dalam senyawa campuran
kompleks. Terdapat perbedaan strategi analisis data untuk aplikasi
keduanya.
6. Keunggulan dari metode ini adalah sebagai berikut :
a. Efisien, resolusi tinggi sehingga dapat digunakan untuk menganalisa
partikel berukuran sangat kecil seperti polutan dalam udara
b. Aliran fasa bergerak (gas) sangat terkontrol dan kecepatannya tetap.
c. Pemisahan fisik terjadi didalam kolom yang jenisnya banyak sekali,
panjang dan temperaturnya dapat diatur.
d. Banyak sekali macam detektor yang dapat dipakai pada kromatografi
gas (saat ini dikenal 13 macam detektor) dan respons detektor adalah
proporsional dengan jumlah tiap komponen yang keluar dari kolom.
e. Sangat mudah terjadi pencampuran uap sampel kedalam fasa
bergerak.
f. Kromatograf sangat mudah digabung dengan instrumen fisika-kimia
yang lainnya, contohnya GC/FT-IR/MS.
g. Analisis cepat, biasanya hanya dalam hitungan menit.
h.Tidak merusak sampel.
i. Sensitivitas tinggi sehingga dapat memisahkan berbagai senyawa
yangsaling bercampur dan mampu menganalisa berbagai senyawa
meskipun dalam kadar/konsentrasi rendah. Seperti dalam udara,
terdapat berbagai macam senyawa yang saling bercampur dan
dengan ukuran partikel/molekul yang sangat kecil.
7. Kekurangan dari metode ini adalah sebagai berikut :
a. Teknik Kromatografi gas terbatas untuk zat yang mudah menguap
b. Kromatografi gas tidak mudah dipakai untuk memisahkan campuran
dalam jumlah besar. Pemisahan pada tingkat mg mudah dilakukan,
pemisahan pada tingkat gram mungkin dilakukan, tetapi pemisahan
dalam tingkat pon atau ton sukar dilakukan kecuali jika ada metode
lain.
c. Fase gas dibandingkan sebagian besar fase cair tidak bersifat reaktif
terhadap fase diam dan zat terlarut.
II.2.4 Bioassay
Bioassay berasal dari dua kata yaitu biologos dan assay.
Penggabungan dua kata ini memberikan makna bahwa bioassay
adalah suatu test atau uji yang menggunakan organisme hidup untuk
mengetahui efektifitas suatu bahan hidup ataupun bahan organik dan
anorganik terhadap suatu organisme hidup. Pada umumnya dalam
dunia medis bioassay dilakukan untuk mengetahui efektifitas
antibakteri atau anti jamur dan juga antivirus, yang dilakukan secara
in vivo maupun in vitro. Saat ini sudah beredar dipasaran lebih dari 50
jenis anti antimikroba yang berupa anti bakteri atau anti jamur. Namun
dalam pemakaiannya selama ini dilakukan secara berlebihan sehingga
menyebabkan mikroba yang semula sensitif terhadap antibakteri/
antijamur menjadi resisten. Oleh karena permasalahan ini, maka
diperlukan penemuan senyawa antimikroba baru sebagai pengganti
senyawa yang sudah tidak efektif lagi.
II.2.4.1 Antioksidan

Antioksidan didefenisikan sebagai inhibitor yang

bekerja menghambat oksidasi dengan cara bereaksi dengan
radikal bebas reaktif yang membentuk radikal bebas tidak
reaktif yang tidak stabil. Antioksidan merupakan semua bahan
yang dapat menunda atau mencegah kerusakan akibat oksidasi
pada molekul sasaran. Dalam pengeritan kimia antioksidan
adalah senyawa-senyawa pemberi elektron, tetapi dalam
pengertian biologis lebih luas lagi, yaitu semua senyawa yang
dapat meredam dampak negatif oksidan, termasuk enzim-
enzim dan protein-protein pengikat logam. Antioksidan
merupakan senyawa yang dapat menghambat spesies oksigen
reaktif dan juga radikal bebas sehingga antioksidan dapat
mencegah penyakitpenyakit yang dihubungkan dengan radikal
bebas seperti karsinogenesis, kardiovaskuler, dan penuaan
(Siagian, 2002 ).

Berdasarkan sumbernya, antioksidan dapat dibedakan

menjadi 2 macam yaitu antioksidan alami dan antioksidan
sintetik. Antioksidan alami dapat ditemukan pada tanaman
seperti biji-bijian, buah dan sayur-sayuran yang diantaranya
mengandung senyawa turunan fenol yaitu koumarin,
hidroksinamat, tokoferol, difenol, flavonoid, dihidroflavon,
kathekin dan asam askorbat (Suranto, 2011). Sedangkan
antioksidan sintetik berupa butil hidroksilanisol, butil
hidrositoluen, propil gallat dan etoksiquin (Rahmawati et al.,
cit Cahyadi, 2006).
1. Uji Aktivitas Antioksidan dengan Metode DPPH
Radikal bebas (free radical) adalah suatu senyawa atau
molekul yang mengandung satu atau lebih elektron tidak
berpasangan pada orbital luarnya. Adanya elektron yang tidak
berpasangan menyebabkan senyawa tersebut sangat reaktif
mencari pasangan dengan cara menyerang dan mengikat
elektron molekul yang berada disekitarnya. Akibatnya yaitu
gangguan fungsi sel, kerusakan struktur sel, molekul
termodifikasi yang tidak dapat dikenali oleh sistem imun, dan
bahkan mutasi. Semua bentuk gangguan tersebut dapat
memicu munculnya berbagai penyakit seperti penyakit
degeneratif hingga kanker. Oleh sebab itu, tubuh kita
memerlukan suatu substansi penting, yakni antioksidan yang
dapat melindungi tubuh dari serangan radikal bebas dan
meredam dampak negatifnya (Winarsi, 2007).
Antioksidan merupakan senyawa yang dapat
menghambat reaksi oksidasi, dengan mengikat radikal bebas
dan molekul yang sangat reaktif. Akibatnya, kerusakan sel
dapat dihambat (Winarsi,2007). Berdasarkan sumbernya,
antioksidan dapat digolongkan menjadi 2 jenis yaitu
antioksidan alami dan antioksidan sintesis. Namun adanya
kekhawatiran terhadap efek samping antioksidan sintetik
menjadikan antioksidan alami sebagai alternatif yang terpilih
(Trilaksani, 2003).
Berdasarkan penelitian Atta-Ur-Rahman (2001),
senyawa-senyawa yang mempunyai potensi sebagai
antioksidan umumnya merupakan senyawa flavonoid, fenolat
dan alkaloid. Senyawa flavonoid dan polifenolat bersifat
antioksidan (karena sifat reduksinya, beraksi dengan
menangkap radikal bebas melalui pemberian atom hidrogen
pada radikal tersebut), antidiabetes, antikanker, antiseptik dan
antiinflamasi, sedangkan alkaloid mempunyai sifat
antineoplastik yang juga ampuh menghambat pertumbuhan sel-
sel kanker.
Metode DPPH merupakan suatu metode untuk
menentukan aktivitas antioksidan dalam sampel dengan
melihat kemampuannya dalam menangkal radikal bebas
senyawa 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl dan untuk pembanding
digunakan Vitamin C murni. Adanya aktivitas antioksidan dari
sampel mengakibatkan terjadinya perubahan warna pada
larutan DPPH dalam metanol yang semula berwarna ungu
pekat menjadi kuning pucat.
2. Metode Oxygen Radical Absorbance Capacity (ORAC)
Pengukuran kapasitas antioksidan dengan metode
ORAC memberikan kemudahan untuk memperoleh jumlah
total seluruh komponen dalam sampel yang memberikan
kontribusi terhadap pengukuran kapasitas antioksidan.
Kebanyakan metode uji terhadap inhibitor melibatkan pro-
oksidan atau spesies reaktif dan substrat yang dapat dioksidasi.
Pro-oksidan atau spesies reaktif mengakibatkan kerusakan
oksidatif terhadap substrat. Kerusakan ini dapat dihambat
dengan memasukkan antioksidan ke dalam sistem reaksi.
Penghambatan oleh antioksidan ini diukur dan dinyatakan
sebagai kapasitas antioksidan (Niki, 2002). Metode ORAC
mengukur penghambatan oleh antioksidan terhadap propagasi
radikal peroksil sebagai pro-oksidan, yang dihasilkan dari
AAPH (2,2’-azobis (2-amidino-propan) dihidroklorida), yang
merupakan indikasi dari transfer atom hydrogen (Ghiselli et al,
1995).
3. Metode Trolax Equivalent Antioxidant Capacity (TEAC)
Sama halnya dengan metode ORAC, metode TEAC
didasarkan pada nilai penghambatan radikal bebas. Secara
ringkas proses pengukuran kapasitas antioksidan dilakukan
dengan menambahkan sampel pada sistem yang memiliki
radikal bebas, kemudian nilai penghambatan proses reaksi
radikal bebas diukur sebagai nilai kapasitas antioksidan.
Metode TEAC dikembangkan berdasarkan adanya penekanan
absorbansi dari kation radikal 2,2’-azinobis (3-
etilbenzotiazolin 6-sulfonat) (ABTS) oleh antioksidan dalam
sampel uji. Penekanan absorbansi ini terjadi apabila ABTS
diinkubasi dengan peroksidase dan H2O2. Jika waktu inkubasi
tercapai maka antioksidan yang ditambahkan pada sistem
dapat menghambat radikal ABTS (Cao and Prior, 1998).
4. Metode TRAP (Total Radical-Trapping Antioxidant
Parameter).
Metode ini menggunakan spektrofotometri luminescene
untuk mengukur kerusakan fluorosensi dari R-phycoerythin
selama reaksi peroksidasi di kontrol. Nilai TRAP dihitung dari
panjang fase-lag yang disebabkan oleh antioksidan
dibandingkan dengan Trolox.
5. Uji FRAP (Ferric Reducing Antioxidant Power)
Benzie dan Strain (1996) mengemukakan bahwa
metode FRAP adalah metode yang digunakan untuk menguji
antioksidan dalam tumbuh-tumbuhan. Kelebihan metode
FRAP in yaitu metodenya murah, reagennya mudah disiapkan
dan cukup sederhana dan cepat. Metode ini dapat menemukan
kandungan antioksidan total dari suatu bahan berdasarkan
kemampuan senyawa antioksidan untuk mereduksi ion Fe 3+
menjadi ion Fe2+ sehingga kekuatan antioksidan suatu senyawa
dianalogikan dengan kemampuan mereduksi dari senyawa
tersebut (Halvorsen, et al., 2002).
6. Metode TOSC (Total Oxyradical Scavening Capacity).
 Metode ini berdasarkan pada reaksi antara radikal
peroxyl dan ɑ-keto-y-methiolbutyric acid (KMBA), yang
dioksidasi menjadi ethylen. Antiokisdan yang ditambahkan
bersaing dengan KMBA untuk radikal peroxyl, oenurunan
produksi ethylen, yang umunya dukur dengan kromatografi
gas.
7. Metode PSC (Peroxyl Radical Scavening Capacity
Metode ini, juga sama dengan metode ORAC,
didasarkan pada tingkat penghambatan oksidasi dicloro-
fluorecin oleh antioksidan yang menangkap radikal peroxyl
yang dihasilkan dari degradasi termal 2,2-
azobis(amidinopropane).
8. Uji Folin-Ciocalteau Total Phenolic
Uji ini menggunkan perubahan warna ketika logam
oksida direduksi oleh antiokisdan polifenol seperti asam galat
dan katekin, menghasilkan suatu larutan biru dengan absorbsi
maksimum pada 765mn. Kurva standar dibuat dengan
menggunakan asam galat, dan hasil dilaporkan sebagai
ekuivalen asam galat.
Parameter yang dipakais untuk menunjukkan aktivitas
antioksidan adalah harga konsentrasi efisen atau effecient
concentraion (EC50) atau Inhibition Concentraion (IC50)
yaitu konsentrasi suatu zat antioksidan yang dapat
menyebabkan 50% DPPH kehilangan karakter radikal atau
konsentrasi suatu zat antioksidan tinggi, akan mempunyai
harag EC50 atau IC50 yang rendah.
II.2.4.2 Antimikroba

Potensi dari suatu antimikroba diperkirakan dengan

membandingkan penghambatan pertumbuhan terhadap mikro-
organisme yang sensitif dari hasil penghambatan suatu
 konsentrasi antibiotik uji dibandingkan dengan antibiotik
referensi. Bahan referensi yang digunakan dalam pengujian
adalah zat yang aktivitasnya telah diketahui dengan mengacu
pada Standar Internasional yang sesuai (Anonim, 2001).
Penentuan aktivitas antimikroba dapat dilakukan dengan
dua metode, yaitu metode difusi dan metode dilusi. Pada
metode difusi termasuk didalamnya metode disk diffusion (tes
Kirby & Baur), E-test, ditch-plate technique, cup-plate
technique. Sedangkan pada metode dilusi termasuk
didalamnya metode dilusi cair dan dilusi padat (Pratiwi, 2008).

a. Metode difusi diantaranya:

1) Metode disk diffusion (tes Kirby & Baur) menggunakan
piringan yang berisi agen antimikroba, kemudian diletakan
pada media agar yang sebelumnya telah ditanami
mikroorganisme sehingga agen antimikroba dapat
berdifusi pada media agar tersebut. Area jernih
mengindikasikan adanya hambatan pertumbuhan
mikroorganisme oleh agen antimikroba pada permukaan
media agar.
2) Metode E-test digunakan untuk mengestimasi Kadar
Hambat Minimum (KHM), yaitu konsentrasi minimal
suatu agen antimikroba untuk dapat menghambat
pertumbuhan mikroorganisme. Pada metode ini digunakan
strip plastik yang mengandung agen antimikroba dari
kadar terrendah sampai tertinggi dan diletakkan pada
permukaan media agar yang telah ditanami
mikroorganisme sebelumnya. Pengamatan dilakukan pada
area jernih yang ditimbulkannya yang menunjukan kadar
agen antimikroba yang menghambat pertumbuhan
mikroorganisme pada media agar.
3) Ditch-plate technique. Pada metode ini sampel uji berupa
 agen antimikroba yang diletakkan pada parit yang dibuat
dengan cara memotong media agar dalam cawan petri
pada bagian tengah secara membujur dan mikroba uji
(maksimum 6 macam) digoreskan ke arah parit yang berisi
agen antimikroba tersebut. Cup-plate technique. Metode
ini serupa dengan disk diffusion, dimana dibuat sumur
pada media agar yang telah ditanami dengan
mikroorganisme dan pada sumur tersebut diberi agen
antimikroba yang akan diuji.
b. Metode dilusi diantaranya:
1) Metode dilusi cair/broth dilution test (serial dilution).
Metode ini digunakan untuk mengukur Konsentrasi
Hambat Minimum (KHM) dan Kadar Bunuh Minimum
(KBM). Cara yang dilakukan adalah dengan membuat seri
pengenceran agen antimikroba pada medium cair yang
ditambahkan dengan mikroba uji. Larutan uji agen
antimikroba pada kadar terkecil yang terlihat jernih tanpa
adanya pertumbuhan mikroba uji ditetapkan sebagai
KHM. Larutan yang ditetapkan sebagai KHM tersebut
selanjutnya dikultur ulang pada media cair tanpa
penambahan mikroba uji ataupun agen antimikroba, dan
diinkubasi selama 18-24 jam. Media cair yang tetap
terlihat jernih setelah diinkubasi ditetapkan sebagai KBM.
2) Metode dilusi padat (solid dilution test). Metode ini serupa
dengan metode dilusi cair namun menggunakan media
padat (solid). Keuntungan metode ini adalah satu
konsentrasi agen antimikroba yang diuji dapat digunakan
untuk menguji beberapa mikroba uji.

II.2.4.3 Toksisitas (BSLT)

 Toksisitas adalah suatu keadaan yang menandakan adanya
efek toksik/racun yang terdapat pada bahan sebagai sediaan
single dose atau campuran. Toksisitas akut ini diteliti pada
hewan percobaan yang menunjukkan evaluasi keamanan dari
kandungan kimia untuk penggunaan produk rumah tangga,
bahan tambahan makanan, kosmetik, obat-obatan (Donatus,
2005).

Uji toksisitas dilakukan untuk mendapatkan informasi atau

data tentang toksisitas suatu bahan (kimia) pada hewan uji.
Secara umum uji toksisitas dapat dikelompokkan menjadi uji
toksisitas jangka pendek/akut, dan uji toksisitas jangka panjang.
Uji toksisitas akut dimaksudkan untuk mendapatkan informasi
tentang gejala keracunan, penyebab kematian, urutan proses
kematian dan rentang dosis yang mematikan hewan uji (Lethal
dose atau disingkat LD50) suatu bahan. Uji toksisitas akut
merupakan efek yang merugikan yang timbul segera sesudah
pemberian suatu bahan sebagai dosis tunggal, atau berulang
yang diberikan dalam 24 jam (Donatus, 2005).

II.2.4.3.1 Tingkatan Uji Toksisitas

Toksisitas adalah suatu keadaan yang menandakan adanya
efek toksik/racun yang terdapat pada bahan sebagai sediaan
single dose atau campuran. Toksisitas akut ini diteliti pada
hewan percobaan yang menunjukkan evaluasi keamanan dari
kandungan kimia untuk penggunaan produk rumah tangga,
bahan tambahan makanan, kosmetik, obat-obatan (Donatus,
2005).

Uji toksisitas dilakukan untuk mendapatkan informasi atau

data tentang toksisitas suatu bahan (kimia) pada hewan uji.
Secara umum uji toksisitas dapat dikelompokkan menjadi uji
toksisitas jangka pendek/akut, dan uji toksisitas jangka panjang.
Uji toksisitas akut dimaksudkan untuk mendapatkan informasi
tentang gejala keracunan, penyebab kematian, urutan proses
kematian dan rentang dosis yang mematikan hewan uji (Lethal
dose atau disingkat LD50) suatu bahan. Uji toksisitas akut
merupakan efek yang merugikan yang timbul segera sesudah
pemberian suatu bahan sebagai dosis tunggal, atau berulang
yang diberikan dalam 24 jam (Donatus, 2005).

II.2.4.3.2 Uji Toksisitas Akut

Uji toksisitas akut dirancang untuk menentukan atau

menunjukkan secara kasar median lethal dose (LD50) dari
toksikan. LD50 ditetapkan sebagai tanda statistik pada
pemberian suatu bahan sebagai dosis tunggal yang dapat
menyebabkan kematian 50% hewan uji (Priyanto, 2010). Jumlah
kematian hewan uji dipakai sebagai ukuran untuk efek toksik
suatu bahan (kimia) pada sekelompok hewan uji. Jika dalam hal
ini hewan uji dipandang sebagai subjek, respon berupa kematian
tersebut merupakan suatu respon diskretik. Ini berarti hanya ada
dua macam respon yaitu ada atau tidak ada kematian (Donatus,
2005). Menurut Weil, penelitian uji toksisitas akut ini paling
tidak menggunakan empat peringkat dosis yang masing masing
peringkat dosis menggunakan paling sedikit empat hewan uji.
Dosis dibuat sebagai suatu peringkat dengan kelipatan
logaritmik yang tetap. Dosis terendah merupakan dosis yang
tidak menyebabkan timbulnya efek atau gejala keracunan, dan
dosis tertinggi merupakan dosis yang menyebabkan kematian
semua (100%) hewan uji. Cara pemberian obat atau bahan yang
diteliti harus disesuaikan pada pemberiannya pada manusia,
sehingga dapat mempermudah dalam melakukan ekstrapolasi
dari hewan kemanusia.(Priyanto, 2010). Dalam uji toksisitas
akut, penentuan LD50 dilakukan dengan cara menghitung
jumlah kematian hewan uji yang terjadi dalam 24 jam pertama
sesudah pemberian dosis tunggal bahan yang diteliti menurut
cara yang ditunjukkan oleh para ahli. Namun demikian,
kematian dapat terjadi sesudah 24 jam pertama karena proses
keracunan dapat berjalan lambat.(Priyanto, 2010). Data yang
dikumpulkan pada uji toksisitas akut adalah data kuantitatif
yang berupa kisaran dosis letal atau toksik, dan data kualitatif
yang berupa gejala klinis. Kerja suatu obat dapat dipengaruhi
oleh konsentrasi obat, spesies hewan, faktor endogen (usia, berat
badan, jenis kelamin, kesehatan hewan), diet terkait dengan
komposisi pakan, cara pemberian, temperatur serta musim.
(Priyanto, 2010).

II.2.4.3.3 Uji Toksisitas Subkronik

Uji toksisitas subkronik adalah uji untuk mengetahui

pengaruh merugikan yang timbul akibat pemberian takaran
harian berulang dari obat, bahan kimia, atau pemaparan dengan
bahan-bahan tersebut yang berlangsung sekitar 10% dari rentang
hidupnya. Meskipun demikian, beberapa peneliti menggunakan
jangka waktu yang lebih pendek, misalnya pemberian zat selama
14 dan 28 hari (Djojosumarto, 2008).

Toksisitas subkronik menyediakan informasi tentang

bahaya kesehatan yang dapat muncul dari sebuah paparan terus
menerus dalam jangka waktu tertentu. Studi ini dapat
memberikan informasi mengenai organ target, kemungkinan
terjadinya akumulasi, dan estimasi dari level yang tidak
menimbulkan efek dari suatu paparan yang dapat digunakan
untuk menentukan level dosis untuk studi kronik dan
mendirikan kriteria keselamatan untuk paparan manusia (Barille,
2005).

Pada uji toksisitas subkronik disarankan untuk memilih

tiga dosis. Satu dosis yang cukup tinggi untuk menimbulkan
tanda toksisitas yang pasti tetapi tidak cukup tinggi untuk
membunuh sebagian besar hewam itu, dosis rendah yang
diharapkan tidak membunuh atau tidak akan membunuh sama
sekali, dan dosis menengah (Lu, 1995).

II.2.4.3.4 Uji Toksisitas Kronik

Uji toksisitas kronik atau jangka panjang dilakukan

dengan memberikan bahan uji berulang-ulang selama masa
hidup hewan coba atau sekurang-kurangnya sebagian besar dari
masa hidupnya, misalnya 18 bulan untuk mencit, 24 bulan untuk
tikus, dan 7-10 tahun untuk anjing dan monyet (Lu, 1995).

Tujuan uji toksisitas kronik adalah untuk memperoleh

informasi adanya efek toksik zat yang tidak terdeteksi pada uji
toksisitas subkronik, karakterisasi toksisitas dari suatu sediaan
uji yang dipaparkan dalam waktu lama dan berulang, dan
menentukan dosis yang tidak menimbulkan efek toksik (BPOM,
2014).

II.2.4.3.5 Metode Perhitungan LD50

Banyak metode yang digunakan dalam perhitungan LD50.

Setiap metode yang digunakan memiliki kelebihan dan
kekurangan. Beberapa metode yang digunakan dalam
perhitungan nilai LD50 menggunakan cara grafik atau aljabar.
Beberapa metode yang umum dipakai untuk menentukan LD50
adalah seperti berikut:
a. Metode Trevan Metode ini merupakan cara yang
sederhana, tetapi memerlukan jumlah hewan yang besar
untuk memperoleh hasil yang lebih teliti. Beberapa tingkat
dosis harus ditentukan terlebih dahulu. Pengamatan
dilakukan 24 jam setelah perlakuan dan ditentukan persen
kematian setiap kelompok. Antara log dosis dan persen
kematian dihubungkan sehingga didapatkan grafik yang
berbentuk sigmoid. Nilai LD50 didapatkan dengan cara
menarik garis dari angka 50% pada sumbu Y dan
diplotkan pada sumbu X. Titik potong pada absis
merupakan LD50 yang ditentukan.
b. Metode Perhitungan dengan Cara Grafik Miller dan
Tainter Metode Miller dan Tainter merupakan metode
yang paling umum dipakai dalam perhitungan efektif
dosis. Perhitungan LD50 berdasarkan metode ini
memerlukan kertas probit logaritma. Skala yang
digunakan adalah skala logaritma dan skala probit. Skala
logaritma digunakan pada absis sebelah kanan sedangkan
skala probit digunakan pada ordinat sebelah kiri. Skala
dibuat dalam skala persen yang setara dengan skala probit
atau nilai persen dapat dilihat di dalam tabel probit.
c. Metode Aritmatik Reed dan Muench Metode ini
menggunakan nilai-nilai kumulatif. Asum si yang dipakai
bahwa kematian seekor hewan akibat dosis tertentu akan
mengalami kematian juga oleh dosis 12 yang lebih besar
dan hewan bertahan hidup pada dosis tertentu juga akan
tetap bertahan hidup pada dosis yang lebih rendah.
Kematian kumulatif diperoleh dengan menambahkan
secara suksesif ke bawah dan hidup kumulatif diperoleh
dengan menambahkan secara suksesif ke atas. Persen
hidup dari dosis-dosis yang berdekatan dengan LD50
 dihitung. Penetuan LD50 didapatkan berdasarkan
persamaan berikut:
P.D =
Sehingga LD50 didapatkan
Log 10 LD50 = -7 + (P. Dx-10)
(Priyanto, 2010).
d. Metode Thomson dan Weil Metode ini merupakan metode
yang banyak dipergunakan karena tidak memerlukan
hewan percobaan yang terlalu banyak dan mempunyai
tingkat kepercayaan atau “confidenc elevel” yang cukup
tinggi. Perhitungan nilai LD50 menggunakan metode
Thomson dan Weil. Tabel perhitungan Thomson dan Weil
digunakan untuk menentukan nilai LD50. Nilai LD50
dihitung dengan persamaan sebagai berikut:
Log LD50 = Log D + d (f + 1)
Keterangan:
m = nilai LD50.
D = dosis terkecil yang digunakan.
d = log dari kelipatan dosis.
f = suatu nilai dalam tabel Weil, karena angka kematian
tertentu (r).
Kisaran nilai LD50 dihitung dengan rumus
Log kisaran = Log LD50 ± 2 d δf
Keterangan:
δf = suatu nilai pada tabel yang tergantung pada nilai n
dan k.
n = jumlah hewan percobaan per kelompok. k =adalah
jumlah hewan percobaan -1
(Priyanto, 2010).

BSLT merupakan suatu bioassay yang pertama untuk

penelitian bahan alam dan salah satu metode menguji bahan-
bahan yang bersifat toksik. Keunggulan dari uji BSLT ini tidak
menghabiskan banyak waktu, prosedurnya sederhana, cepat,
tidak membutuhkan banyak biaya, tidak membutuhkan teknik
aseptik, tidak memerlukan peralatan khusus dan hanya
membutuhkan sedikit sampel uji. Bioassay adalah uji yang
menggunakan organisme hidup untuk mengetahui efektifitas
suatu bahan hidup ataupun bahan organik dan anorganik.
Metode BSLT menurut Meyer et al, McLaughlin & Rogers et al
menggunakan larba udang Artemia salina Leach sebagai hewan
coba dan merupakan uji toksisitas akut karena efek toksik dari
suatu senyawa ditentukan dalam waktu singkat (selama 24 jam)
setelah pemberian dosis uji tunggal (Hanif, 2012).
Senyawa yang aktif akan menghasilkan mortalitas yang tinggi
dan sesuai acuan literatur tersebut dapat dilakukan berikutnya,
seperti uji toksisitas subakut, subkronis, atau toksisitas jangka
panjang untuk dikembangkan sebagai bahan baku obat,
contohnya mancari zat-zat potensial sebagai antikanker.
Beberapa senyawa bioaktif yang telah berhasil diisolasi dan
dimonitor aktivitasnya dengan BSLT menunjukkan adanya
korelasi terhadap suatu uji spesifik antikanker, yaitu pada harga
LC50. Tetapi bila tidak bersifat toksik, dapat diteliti kembali
khasiat lainnya dengan menggunakan hewan coba lain yang
lebih besar dari larva Artemia salina Leach, contohnya mencit
atau tikus secara in vivo dan dapat dikembangkan untuk tujuan
yang luas, seperti bahan baku kosmetika atau suplemen
makanan (Cahyadi, 2009).
Metode BSLT ini merupakan uji penapisan farmakologi
awal yang memiliki beberapa keunggulan, yaitu :
a. Relatif tidak mahal dan tidak membutuhkan keahlian
tertentu
b. Metode ini juga telah teruji kepercayaannya, sebesar 95%
untuk mengamati aktivitas toksik dalam suatu senyawa
c. Merupakan uji tahap awal isolasi senyawa-senyawa toksik
yang terkandung dalam ekstrak suatu tanaman
d. Metode ini juga dapat dikaitkan dengan metode penapisan
untuk penyaringan senyawa antikanker dari tanaman
(Cahyadi, 2009).
 BAB III
METODE PENELITIAN
III.1. Alat dan Bahan
A. Alat
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah alat destilasi, rotary
evaporator, neraca analitik, kolom kromatografi, plat KLT GF254, chamber,
lampu UV penampak noda, vial, pipa kapiler, alat penentu titik leleh melting point
apparatus, spektrofotometer UV-VIS, spektrofotometer IR, NMR dan peralatan
gelas yang umum digunakan.
B. Bahan
Sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun meranti sabut
(Shorea ovalis. (Korth)). Bahan yang digunakan adalah n-heksana, etil asetat,
metanol, aquadest, asam asetat anhidrat, kloroform, kloroform amoniak, logam
magnesium, larutan FeCl3, HCl 1%, H2SO 2N, pereaksi Liebermann Burchard,
pereaksi Meyer, dan silika gel 60.
III.1.1 Cara Kerja
A. Penyiapan sampel
Pengambilan dan Pengolahan Sampel Sampel yang akan digunakan adalah
daun dari tumbuhan meranti sabut (Shorea ovalis. (Korth) yang diambil di Bukit
Suligi Kecamatan Tandun, Kabupaten Rokan Hulu. Daun dari tumbuhan meranti
sabut terlebih dahulu dibersihkan dari kotoran yang melekat. Kemudian dikering
anginkan dan dirajang.
B. Uji Fitokimia (Harborne, 1987)
Uji pendahuluan kandungan metabolit sekunder dilakukan terhadap daun
meranti sabut Sebanyak 5 g sampel dipotong sampai halus, lalu diekstraksi
dengan etanol, pada ekstrak ini ditambahkan masing-masing 5 ml air suling dan
kloroform lalu dikocok kuat dan dibiarkan beberapa saat sampai terbentuk dua
lapisan. Lapisan air digunakan untuk uji senyawa flavonoid, fenolik, dan saponin.
Lapisan kloroform digunakan untuk uji senyawa terpenoid, dan steroid.

a. Uji Flavonoid
 Beberapa tetes lapisan air pada plat tetes ditambah 1-2 butir logam
magnesium dan beberapa tetes asam klorida pekat hingga terbentuk warna jingga,
merah muda sampai merah menandakan adanya senyawa flavonoid.
b. Uji Fenolik
Beberapa tetes lapisan air pada plat tetes ditambah 1–2 tetes larutan besi
(III) klorida 1%. Bila terbentuk warna biru/ungu, berarti terdapat senyawa fenolik.
c. Uji Saponin
Lapisan air dalam tabung reaksi dikocok. Apabila terbentuk busa yang
bertahan selama 5 menit, berarti positif adanya saponin.
d. Uji Terpenoid dan Steroid
Lapisan kloroform disaring melalui pipet yang berisi norit. Hasil saringan di
pipet 2–3 tetes dan dibiarkan mengering pada plat tetes. Setelah kering
ditambahkan pereaksi Liebermann-Burchard (2 tetes asam asetat anhidrat dan 1
tetes asam sulfat pekat). Terbentuknya warna merah berarti positif adanya
terpenoid dan warna hijau-biru berarti positif adanya steroid.
e. Uji Alkaloid
Sampel daun meranti sabut Shorea ovalis (Korth)sebanyak 5 g dalam bentuk
serbuk, ditambahkan 10 ml kloroform, kemudian ditambahkan 10 ml larutan
kloroform beramoniak 0,05 M, diaduk kemudian disaring. Kedalam tabung reaksi
tambahkan 10 tets asam sulfat 2 N, kocok selama 2 menit, biarkan hingga
terbentuk dua lapisan dan terjadi pemisahan. Ambil lapisan asam (atas) dan
tambahkan 1-2 tetes pereaksi Meyer jika terbentuk endapan putih menunjukkan
hasil yang positif untuk alkaloid (Farnsworth, 1966).
C. Ekstraksi Sampel
Sampel dimaserasi secara bertingkat yang dimulai dri n-Heksana, setelah itu
dimaserasi dengan pelarut etil asetat dengan 3 kali pengulangan, kemudian di
saring sehingga diperoleh maserat. Maserat dipekatkan dengan rotary evaporator
hingga diperoleh ektrak kental etil asetat (Anonim, 2000).

D. Pemisahan Dengan Kromatografi

 Kolom Pemisahan senyawa-senyawa yang ada di dalam ekstrak dilakukan
dengan kromatografi kolom dengan diameter ukuran kolom 3 cm, panjang kolom
40 cm dengan sistem gradien mulai dari n-heksanan 100 %, n-heksanan : etil
asetat 1 berbanding10 hingga metanol 100 % dengan memakai silika gel 60.
Pengisian kolom dilakukan dengan membuat bubur silika terlebih dahulu, lalu
dimasukkan ke dalam kolom dengan menggunakan corong, kemudian dielusi
sampai kerapatan silika di dalam kolom maksimum. Ekstrak yang akan
dipisahkan dilakukan preadsorpsi dan Isolasi dan Uji BSLT Ekstrak Etil Asetat
Daun dimasukkan dalam kolom. Kemudian dielusi secara bergradien
menggunakan pelarut n-heksan, etil asetat, kemudian dengan metanol. Hasil
pemisahan ditampung dalam vial 15 ml dan diberi nomor 1 sampai 279. Hasil
kolom dibagi dalam beberapa fraksi dan berdasarkan hasil KLT di peroleh 15
fraksi, hasil fraksi I digabung vial 30 sampai 39. Selanjutnya direksristalisasi, dan
diperoleh 17, 8 mg.
E. Pengujian Hasil Kromatografi Kolom Dengan KLT
Hasil pemisahan kromatografi kolom dilakukan uji KLT. Vial-vial yang
akan diuji ini diambil secara acak setiap 5 vial, selanjutnya plat KLT dielusi
dengan eluen yang sesuai sampai batas atas plat KLT, lalu plat di keluarkan dan
dikeringkan. Untuk melihat bercak yang dihasilkan dapat dilakukan memakai plat
KLT GF 255 dengan penyinaran lampu UV. Selanjutnya ditentukan Rf dari
masing-masing bercak. Vial yang mempunyai harga Rf yang sama dapat
digabungkan menjadi satu fraksi.
F. Rekristalisasi
Senyawa hasil kolom direkristalisasi dengan menggunakan dua macam
pelarut yang berbeda kelarutannya. Pelarut yang pertama ditambahkan dengan
pelarut yang dapat melarutkan hasil isolasi yang jumlahnya sedikit dan
selanjutnya ditambahkan pelarut yang tidak melarutkan hasil isolasi, sehingga
terjadi rekristalisasi dan pelarut diuapkan (Iskandar dan Bantacut, 1990).

G. Karakterisasi
 Kemurnian senyawa yangdiperoleh sebanyak 12 mg ditentukan dengan KLT
dan pengujian titik leleh menggunakan alat melting point apparatus, selanjutnya
dilakukan elusidasi struktur menggunakan spektrofotometer Ultraviolet dan
Visibel (UV-Vis), IR, dan spektroskopi resonansi magnetik inti (NMR).
H. Uji Sitotoksik Ekstrak Etil Asetat Daun Meranti sabut (Shorea ovalis
(Kort.)) dengan Metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT)
Uji Sitotoksik Ekstrak Etil Asetat Daun Meranti sabut (Shorea ovalis
(Kort.)) dengan Metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) Kista udang Artemia
salina ditetaskan dalam wadah pembiakan yang berisi air laut dan telah dilengkapi
dengan aerasi oksigen dan lampu, digunakan 48 jam setelah pembentukan larva.
Vial uji dikalibrasi sebanyak 5 mL. Pengujian dilakukan dengan konsentrasi 100,
10,dan 1µg/mL. Sebanyak 40 mg sampel uji dilarutkan dalam 4 mL etanol dan
didapatkan larutan induk sampel uji dengan konsentrasi 10.000 μg/mL. Dari
larutan induk tersebut dipipet sebanyak 0,5 mL dan ditambahkan pelarut etanol
sampai 5 mL hingga diperoleh larutan dengan konsentrasi 1000 µg/mL. Dari
larutan konsentrasi 1000 µg/mL, kemudian diencerkan hingga diperoleh
konsentrasi 100 µg/mL, 10 μg/mL, 1 μg/mL. Dari masing-masing konsentrasi
dipipet 0,5 mL, dibiarkan pelarut menguap, dilarutkan kembali dengan 50 µl
DMSO, selanjutnya ditambahkan dengan air laut sampai mencapai batas kalibrasi.
Dimasukkan larva Artemia salina ke masing-masing vial sebanyak 10 ekor.
Kemudian masing- masing dibuat dalam 3 vial. Kematian larva udang diamati
setelah 24 jam. Dari data yang dihasilkan dihitung LC50 dengan metode kurva dan
menggunakan tabel probit (meyer: dkk 1982) (Harefa,1987 ). Untuk kontrol, 50 μl
DMSO dipipet kedalam vial uji, ditambahkan air laut sampai mencapai batas
kalibrasi, dimasukkan larva Artemia salina 10 ekor. Ditambahkan lagi air laut
beberapa tetes hingga mencapai kalibrasi (Priyanto, 2009).

III.2 Alat dan Bahan

III.2.1 Cara Kerja
A. Uji profil fitokimia
Sampel uji yang digunakan yaitu daunsegar Cordyline fruticosa [L.] A.
Cheval.Pengujian yang dilakukan diantaranya ujikandungan fenolik dengan
reagen besi (III)klorida, uji flavonoid dengan Sianidin test,uji saponin, uji
triterpenoid dan steroiddengan reagen Liebermann-Burchard, ujialkaloid dengan
pereaksi Meyer, dan ujikumarin dengan natrium hidroksida.
B. Ekstraksi
Sebanyak 1050 gram sampel kering yang telah dihaluskan, diekstrak
menggunakan metoda maserasi dengan pelarut n-heksan. Proses maserasi
dilakukan selama 3 hari pada suhu ruang. Setelah itu hasil maserasi disaring dan
filtrat dipekatkan dengan rotary evaporator. Maserasi dilakukan beberapa kali
hingga pelarut tidak berwarna lagi. Kemudian dilanjutkan dengan pelarut etil
asetat dan methanol secara berurutan dengan perlakuan yang sama. Hasil ekstraksi
didapatkan ekstrak pekat n-heksan, etil asetat dan metanol.
C. Kromatografi kolom
Sebanyak 10 g ekstrak etil asetat dikromatografi kolom menggunakan eluen
n-heksan: etil asetat : metanol dengan menggunakan sistem step gradien polarity
(SGP). Eluat yang keluar dari kolom ditampung dengan vial, kemudian dianalisis
pola pemisahan nodanya dengan plat kromatografi lapis tipis (KLT). Fraksi yang
memiliki pola noda dengan Rf yang sama digabung sehingga didapatkan fraksi
yang lebih sederhana.
D. Karakterisasi senyawa hasil isolasi
Senyawa hasil isolasi dikarakterisasi secara kimia dan spektroskopi.
Karakterisasi secara kimia dilakukan dengan menggunakan pereaksi Liebermen-
Burchard dan beberapa pereaksi laiinnya serta uji kemurnian senyawa
menggunakan beberapa jenis eluen. Karakterisasi secara spektroskopi dengan
menggunakan spektoskopi UV dan IR

E. Pengujian aktifitas antioksidan

 Pengujian antioksidan menggunakanmetoda DPPH dikembangkan
berdasarkan literatur yang telah dimodifikasi. 5 Larutan DPPH 0,1 mM dibuat
dengan cara melarutkan DPPH 2 mg dengan methanol hingga volume 50 mL
dalam labu ukur.Sebanyak 10 mg masing-masing ekstrak dilarutkan dengan
metanol dalam labu ukur 10 mL, sehingga diperoleh konsentrasi 1000 mg/L.
Kemudian dibuat larutan uji dari larutan induk dengan berbagai konsentrasi
sehingga diperoleh larutan ekstrak dengan konsentrasi 20 ; 50 ;80 ; 110 dan 140
mg/L untuk ekstrak nheksan,etil asetat, dan methanol. Konsentrasi 3 ; 6 ; 12 ; 24
dan 48 mg/L untuk senyawa hasil isolasi. Sebagai larutan kontrol pada pengujian
ini adalah 1mL metanol ditambah 1 mL DPPH. Untukmasing-masing larutan uji
diambil sebanyak 1 mL kemudian ditambahkan 1mL DPPH dan didiamkan
selama 30 menit,campuran dihindarkan dari cahaya. Setelah itu diukur absorbansi
larutan campuran.Pengukuran absorbansi dilakukan padapanjang gelombang 517
nm.6 Dari nilai absorbansi kemudian ditentukan perseninhibisi dan IC50.
III.3 Alat dan Bahan
A. Alat
Seperangkat alat kromatografi cair vakum (KCV), dan kromatografi lapis
tipis (KLT), timbangan analitik (PRECISA), blender, corong, aluminium foil,
kapas, wadah maserasi (botol gelap), rotary evaporator (IKA RV 10), silica gel,
dan alat-alat gelas.
B. Bahan
Sedangkan bahan yang digunakan adalah batang bakau merah (R. stylosa),
larva nyamuk Aedes aegypti, Etanol 95%, Kloroform p.a, Metanol, Aquabidest
pro injeksi, n-heksan, etil asetat, Feri Klorida (FeCl3) , Shinoda test.
C. Pengadaan Sampel
Sampel batang bakau merah (R. stylosa) diperoleh dari Margomulyo,
Surabaya, Jawa Timur.

III.3.1 Penyiapan Sampel

A. Pengumpulan Bakau Merah
 10 kg batang bakau merah (R. stylosa) diperoleh dari Margomulyo,
Surabaya, Jawa Timur. Sebelum diteliti lebih dahulu diidentifikasi ke LIPI UPT
Balai Konservasi Tumbuhan Kebun Raya Purwodadi, Pasuruan, Jawa Timur.
Batang tumbuhan tersebut selanjutnya dikeringkan dengan cara diangin-anginkan
untuk mengurangi penguapan yang mengikutkan senyawa yang terkandung di
dalamnya, sehingga diperoleh sampel batang bakau merah (R. stylosa), kemudian
digiling hingga berbentuk serbuk.
B. Tahap Isolasi Senyawa Fenolik Ekstrak Kloroform
Serbuk halus batang bakau merah (R. stylosa. Griff) sebanyak 3 kg
dimaserasi menggunakan pelarut kloroform dengan ketinggian pelarut pada waktu
merendam ±1 cm di atas sampel. Maserasi dilakukan sebanyak 3 kali masing-
masing selama 5 hari pada suhu kamar. Hasil maserasi disaring secara vakum
menggunakan penyaring Buchner dan filtrat yang diperoleh diuapkan secara
vakum menggunakan penguap putar vacuum rotary evaporator untuk memperoleh
ekstrak kental. Ekstrak kental yang diperoleh, dipisahkan senyawanya dengan
metode KCV menggunakan pelarut n-heksan 100% sebanyak 2 kali, n-heksan: etil
asetat (9:1), (8:2), (7:3) dan (6:4) kemudian dilanjutkan dengan etil asetat 100%
dan metanol 100% sehingga menghasilkan beberapa fraksi senyawa. Fraksifraksi
senyawa tersebut kemudian dimonitor dengan kromatografi lapis tipis dengan
menggunakan eluen n-heksan : etil asetat (9:1). Tiap-tiap fraksi yang memiliki Rf
sama, digabung selanjutnya dilakukan pemisahan lebih lanjut dengan
kromatografi cair vakum (KCV) bertingkat dengan eluen n-heksan 100%
sebanyak 4 kali, n-heksan : etil asetat = 9:1 sebanyak 4 kali dan metanol 100%
sebanyak 2 kali. Tiap-tiap fraksi dari kromatografi kolom gravitasi dimonitor
dengan kromatografi lapis tipis (KLT) menggunakan eluen n-heksan: etil asetat
(9:1), dan fraksi yang mempunyai Rf yang sama digabung selanjutnya dipisahkan
kembali dengan metode kromatografi kolom gravitasi menggunakan fasa diam
silica gel dengan eluen campuran yang terdiri dari campuran n-heksan: etil asetat
(9:1). Hasil pemisahan dimonitor dengan kromatografi lapis tipis (KLT)
menggunakan pelat KLT dengan berbagai eluen, dan selanjutnya tiap fraksi di uji
dengan FeCl3 dan Shinoda test untuk mengetahui keberadaan senyawa flavonoid.
Fraksi-fraksi yang dihasilkan selanjutnya dimurnikan dengan cara rekristalisasi
berulang-ulang dengan menggunakan pelarut kloroform dan metanol dengan
perbandingan kloroform: n-heksan = 1:5 hingga diperoleh isolat murni. Uji
kemurnian isolat dilakukan dengan penentuan titik leleh dan kromatografi lapis
tipis dengan 3 sistem eluen.
C. Tahap Karakterisasi Senyawa Hasil Isolasi
Karakterisasi senyawa hasill isolasi dilakukan dengan beberapa pengujian
yaitu uji sifat fisika, kimia dan spektrofotometer. Uji sifat fisika yang meliputi uji
kelarutan dan uji titik leleh , pengujian sifat kimia yang meliputi uji dengan
reagen (FeCl3 dan Shinoda test), dan pengujian spektofometer meliputi IR, UV-
Vis dan GC-MS.
D. Tahap Pengujian Aktivitas Biolarvasida Terhadap Larva Aedes aegypti
Tahap uji aktivitas biolarvasida senyawa ekstrak kloroform batang bakau
merah (R. stylosa) adalah sebagai berikut : melarutkan isolat bakau merah dengan
larutan tween 80 agar isolat dapat larut kedalam air, mengencerkan larutan uji
dengan air pada variasi konsentrasi 0, 40, 60, 80 dan 100 ppm, Memasukkan
larutan uji (stok, isolat dan larvasida sintetik) sebanyak 5 mL pada botol vial kecil,
memasukkan larva nyamuk Aedes aegypti instar 3 sebanyak 20 ekor ke dalam
larutan uji dengan menggunakan pipet, Pengamatan dilakukan setelah 24 jam
terhadap kematian larva nyamuk, melakukan pengulangan sebanyak 4 kali dan
menghitung tingkat mortalitas larva nyamuk Aedes aegypti : Persentase mortalitas
dapat dihitung dengan menggunakan rumus :
p X 100%

Keterangan : P : persentase mortalitas X : jumlah larva yang mati Y : jumlah larva

yang diamati. Apabila mortalitas pada perlakuan kontrol lebih besar 0% dan lebih
kecil 20%, maka mortalitas larva pada perlakuan dikoreksi dengan formula Abbot
(dalam Negara, 2003) dengan rumus sebagai berikut :
P= x100%

Keterangan : P : persentase mortalitas P 1 : mortalitas larva pada saat pengamatan

C : kematian kontrol Pendugaan nilai toksisitas larvasida terhadap larva uji
nyamuk Aedes aegypti diukur dengan nilai LC50, yaitu suatu konsentrasi atau dosis
yang dapat menyebabkan kematian 50% serangga yang diuji (Moekasan, 1993
dalam Negara, 2003). Penentuan LC50 dihitung dengan analisis Probit
menggunakan program minitab 13. Analisis probit digunakan dalam pengujian
biologis untuk mengetahui respon subyek yang diteliti oleh adanya stimuli dalam
hal ini larvasida untuk mengetahui respon berupa mortalitas (Umniyati, 1990
dalam Negara, 2003). Hasil analisis ini akan diperoleh nilai LC50 untuk masing-
masing bahan bioaktif larvasida yang paling efektif atau kuat pengaruhnya
terhadap serangga uji larva nyamuk Aedes aegypti. Bahan-bahan alami yang
digunakan sebagai biolarvasida, dapat dikatakan memiliki aktivitas biolarvasida
yang tinggi apabila nilai LC50 setelah 48 jam adalah kurang dari 100 µg/mL dan
berkisar antara 13.9-56.2 µg/mL. Sedangkan dikatakan pertengahan apabila harga
LC50 setelah 48 jam adalah kurang dari 200 µg/mL yang berkisar antara 82,6-
130,3 µg/mL. (Suwannee, dkk., 2006)
III.4 Alat dan Bahan
A. Alat
Alat yang digunakan dalam penelitian ini terdiri dari rotary evaporator,
blender, neraca analitik, kertas saring,erlenmeyer, pipet tetes,gelas beker, corong
gelas, corong pisah, botol vial, pipa kapiler, tabung reaksi, pengaduk kaca,
penangas air, cawan penguap, wadah pengembang, lampu UV, spektrofotometer
UV–Vis, FT-IR (Perkin Elmer Spectrum Version 10.4.00, dan LC-MS.
B. Bahan
Bahan yang diperlukan dalam penelitian ini yaitu daun Mindi (Melia
azedarach L.) dari daerah Purworejo, Jawa Tengah, aquades, etanol 96% teknis,
n-heksana teknis, kloroform teknis, etil asetat teknis, plat KLT silika gel GF254
(Merck), plat KLT Preparatif silika gel GF254 (Merck), n-heksana p.a. (Merck),
etil asetat p.a. (Merck), asam asetat p.a. (Merck), kloroform p.a. (Merck), metanol
p.a. (Merck), asam klorida (Merck), natrium hidroksida (Merck), pereaksi
dragendorf, pereaksi Mayer
III.4.1 Cara Kerja
A. Ekstraksi senyawa alkaloid
 Serbuk daun Mindi sebanyak 1000 g dimaserasi dengan pelarut etanol 96%
selama 8 x 24 jam. Ekstrak etanol diuapkan pada kondisi vakum sampai ekstrak
kental, selanjutnya dilarutkan dalam metanol dan ditambahkan aquades dengan
rasio 1:1, didiamkan selama semalam untuk memisahkan antara klorofil dengan
filtrat. Simplisa dan ekstrak yang didapatkan dilakukan analisis penapisan
fitokimia yang meliputi alkaloid, flavonoid, tanin, kuinon, saponin, dan steroid/
triterpenoid
B. Isolasi alkaloid
Fraksi yang berupa metanol–air dilakukan partisi menggunakan n-heksan
dan kloroform. Fraksi metanol-air yang didapatkan dilakukan penggaraman
menggunakan HCl 2 M hingga pH 3 lalu diekstraksi dengan pelarut etil asetat
sehingga didapatkan lapisan asam. Pada lapisan asam dilakukan penambahan
NH4OH hingga pH 9 kemudian dilakukan ekstraksi kembali dengan pelarut etil
asetat. Setelah itu diuapkan hingga didapatkan ekstrak alkaloid, dan dilakukan
pemisahan menggunakan KLT sebagai fase diam berupa silika gel GF254 dan
eluen berupa etil asetat : kloroform (6:4). Noda yang terbentuk dilakukan uji
alkaloid dengan pereaksi Dragendorf. Noda positif alkaloid dilakukan pemisahan
menggunakan KLT preparatif dengan fase diam silika gel GF254, ketebalan 2 mm
dan eluen berupa etil asetat : kloroform (6:4).
C. Uji Kemurnian
Uji kemurnian isolat alkaloid dilakukan dengan KLT berbagai pelarut
tunggal (etil asetat, etanol, n-heksana), campuran (etil asetat:etanol (7:3), etil
asetat:etanol (8:2), etil asetat:n-heksana (7:3), etil asetat:n-heksana (8:2), juga
KLT dua dimensi (etil asetat: etanol (9:1) dan etil asetat: n-heksana (9:1)) hingga
diperoleh satu noda.
D. Karakterisasi isolat alkaloid
Untuk mengetahui struktur isolat alkaloid yang didapatkan, dilakukan
analisis menggunakan spektrofotometer UV-Vis, FT-IR, dan LC-MS.

E. Uji aktivitas
Telur Artemia salina dimasukkan di dalam air garam selama 2 x 24 jam.
Suhu penetasan adalah ± 25-300C dan pH ± 6-7. Telur akan menetas setelah 18–
24 jam dan larvanya siap untuk uji BSLT. Sampel dari ekstrak alkaloid diambil
62,5 mg, dilakukan pengenceran dengan konsentrasi 1000, 100, dan 10 ppm.
Pengujian dilakukan dengan memasukkan 10 ekor larva Artemiasalina berumur
48 jam ke dalam botol vial yang telah berisi larutan ekstrak alkaloid. Setelah 24
jam, jumlah larva yang mati dihitung dan dilakukan analisis probit untuk
menentukan aktivitas LC50.
III.5 Alat dan Bahan
A. Alat
Alat-alat gelas, rotary evaporator, chamber, corong sintered glass, lampu
UV 254-366 nm, lampu pijar, kolom kromatografi gravitasi, neraca analitik, oven,
alat penyemprot, pompa vakum, pipa kapiler, kaca pembesar, mikropipet, botol
vial, cutter, dan alat spektrofotometer FTIR Prestige 21 merek Shimadz
B. Bahan
Kulit batang kayu bitti (Vitex cofassus), akuades, akuabides, pelarut etanol,
metanol, n-heksana, etil asetat, kloroform, aseton, dimetilsulfoksida (DMSO)
pereaksi Mayer, pereaksi Liebermann-Buchard, besi (III) klorida (FeCl3) 5%,
pereaksi Wagner, pereaksi Dragendroff, natrium hidroksida (NaOH) 10%, natrium
klorida (NaCl) murni, asam sulfat (H2SO4) pekat, silika G60 (230-400 mesh)
Merck nomor katalog 7730, 7733 dan 7734, silika gel G60 PF 254, aluminium
foil, kertas saring, dan telur Artemia salina Leach.
III.5.1 Prosedur Kerja
A. Ekstraksi
Kulit batang kayu bitti dibersihkan kemudian ditumbuk kasar dan
dikeringkan dengan cara di angin-anginkan selama kurang lebih satu bulan sampai
diperoleh berat konstan selanjutnya hasilnya digunakan sebagai sampel penelitian.
Ekstraksi komponen aktif dilakukan dengan cara ekstraksi maserasi atau
perendaman. Serbuk kulit batang kayu bitti ditimbang sebanyak 1,5 kg dan
diekstraksi secara maserasi menggunakan pelarut n-heksana selama 24 jam
sebanyak 3x. Kemudian filtrat yang dihasilkan ditampung dan dipekatkan dengan
menggunakan rotary evaporator. Selanjutnya hasil pemekatan digunakan untuk
uji toksisitas, uji fitokimia dan identifikasi dengan menggunakan spektrofotometer
IR.
B. Identifikasi
Identifikasi dilakukan dengan uji fitokimia kandungan senyawa aktif dengan
uji reagen dari ekstrak pekat n-heksana kulit kayu bitti dilarutkan dengan sedikit
masing-masing dengan pelarutnya. Kemudian dilakukan uji alkaloid, uji sterol
dan triterpen, uji saponin, dan uji flavonoid.
C. Fraksinasi dengan KLT, KKCV dan kromatografi gravitasi
Ekstrak kental yang diperoleh di KLT kemudian diteruskan dengan
kromatografi kolom cair vakum (KKCV). Fraksi yang menunjukkan adanya
butiran kristal dilanjutkan pada kromatografi gravitasi, sehingga diperoleh fraksi
yang lebih sederhana.
D. Pemurnian
Pemurnian dilakukan dengan cara kristalisasi dan rekristalisasi dengan
pelarut yang cocok, hingga diperoleh kristal murni yang ditandai dengan hasil
KLT yang menunjukkan satu noda pada tiga sistem eluen.
E. Identifikasi ekstrak kayu Bitti dengan menggunakan spektrofotometer
Infra Red (IR)
Isolat hasil pemurnian disiapkan lalu ditumbuk hingga memenuhi ukuran
partikel kurang dari 2 μm, kemudian dimasukkan ke dalam pellet press secara
merata. Pellet press dihubungkan ke pompa vakum selama 15 menit diusahakan
pellet yang terbentuk mempunyai ketebalan 0,3 mm (transparan), selanjutnya
dibuka pellet secara hati-hati dan dipindahkan ke dalam sel holder menggunakan
spatula. Setelah itu diatur alat spektrometer Infra Merah (IR) dengan kecepatan
kertas pada posisi “normal” dan ekspansi transmisi “100x”. Skala kertas diuji
melalui pembuatan spektrum dari film polystiren. Apabila skala kertas sudah
tepat, maka dengan cara yang sama dibuat sepktrum Infra Merah dari sampel yang
sudah disiapkan, kemudian ditentukan gugus-gugus fungsi.

F. Uji Toksisitas
1. Menyemai Benur (menetaskan telur Udang)
a. Volume air laut diukur sebanyak 300 mL.
 b. Air laut dituang dalam wadah penetasan, kemudian telur Artemia
salina diletakkan pada sisi wadah yang tertutup sebagian (wadah
dijauhkan dari sinar matahari langsung).
c. Dibiarkan selama 2x24 jam sampai menetas menjadi benur (Naupli)
yang siap digunakan.
2. Penyiapan sampel
a. Sampel (ekstrak pekat n-heksana, fraksi dan senyawa murni) masing-
masing ditimbang 1,0 mg dalam botol vial, dilarutkan dalam 100 μL
DMSO.
b. Larutan sampel diencerkan dengan 150 μL aquabides sehingga
volume total menjadi 250 μL, diambil 200 μL diencerkan dengan 600
μL aquabides sehingga volume total menjadi 800 μL.
c. Pengenceran dalam microplate. Pengukuran dilakukan triplo (tiga
kali). Dalam microplate baris A dan B diisi sampel masing-masing
100 μL
d. Baris B sampai G ditambahkan 100 μL aquabides
e. Dari baris B dipipet 100 μL, dimasukkan ke baris C, dan dari baris C
dipipet 100 μL dimasukkan ke D dan seterusnya.
f. Terakhir dari G dipipet 100 μL dan dimasukkan ke H.
Catatan: Kolom H tidak digunakan dalam pengukuran.
3. Memasukkan Benur Larva
Media udang yag sudah menetas (berisi sekitar 7-15 ekor) dipipet 100 μL,
dimasukkan masing-masing ke dalam lubang baris A sampai G pada mikropipet
yang telah diisi sampel melalui pengenceran pada B, kemudian diinkubasi selama
24 Jam. Setelah 24 jam, dihitung jumlah udang yang mati dan hidup pada tiap
lubang dalam microplate. Data yang diperoleh dicatat pada lembar pengamatan.

III.6 Alat dan Bahan

A. Alat dan Bahan
 Daun Terap (A. odoratissimus Blanco), Etanol 70%, Aquades, Kloroform,
Kertas Saring, Asam Asetat Anhidrat, H2SO4 Pekat, Metanol, Reagen Wagner,
Serbuk Mg, Hcl, Amonia, Amil Alkohol, Garam Kasar, Fermipan, Larva Udang
Artemia salina L. Neraca Anlitik, Seperangkat Alat Destilasi, Rotary Evaporator,
Penjepit, Bunsen, Gelas Beaker, Kaca Arloji, Corong Kaca, Gelas Ukur,
Erlenmeyer, Pengaduk Kaca, Pipet Tetes, Tabung Reaksi, Lup.
B. Sampel Penelitian
Sampel daun Terap (A. odoratissimus Blanco) di ambil Di Kalimantan
Timur
III.6.1 Cara Kerja
A. Pembuatan Ekstrak Daun Terap
Ekstraksi sampel Metode ekstraksi yang digunakan dalam penelitian ini
adalah maserasi, yaitu serbuk kering daun Terap (A. odoratissimus Blanco)
dimaserasi dengan menggunakan pelarut metanol dan disimpan di tempat
terlindung dari cahaya matahari sambil sesekali dikocok. Maserasi dilakukan
berkali–kali hingga diperoleh filtrat jernih. Hasil maserasi disaring dan dipekatkan
dengan rotary evaporator. Ekstrak yang diperoleh disebut sebagai ekstrak kasar
metanol
Selanjutnya dilakukan proses fraksinasi terhadap ekstrak kasar metanol
tersebut berdasarkan pada perbedaan kepolaran pelarut-pelarut organik. Fraksinasi
untuk masing–masing fraksi dilakukan berulang kali hingga warna pelarut pada
fraksi yang diinginkan bening. Fraksinasi dilakukan dengan corong pisah,
dilakukan menggunakan pelarut n–Heksana terlebih dahulu, kemudian kloroform
(Lopes et al, 2004). Hasil fraksinasi dari fraksi Kloroform yang diperoleh
dipekatkan dengan rotary evaporator, kemudian dilakukan uji fitokimia pada
fraksi untuk mengetahui jenis senyawa metabolit sekunder yang terdapat pada
fraksi kloroform.

B. Uji fitokimia
 Uji fitokimia dilakukan untuk mengetahui jenis metabolit sekunder yang
terkandung pada ekstrak kasar metanol Terap (A. odoratissimus Blanco) serta
fraksi kloroform dan hasil dari uji kromatografi kolom Vakum cair dan
kromatografi kolom flash. Masing – masing dilarutkan sesuai dengan pelarutnya.
1. Uji alkaloid (Uji Meyer dan Uji Dragendorff)
Ekstrak kasar metanol daun Terap (A. odoratissimus Blanco) dan
fraksi kloroform ditambahkan 2 tetes pereaksi Dragendroff (campuran
Bi(NO3)2.5H2O dalam asam nitrat dan larutan KI). Adanya alkaloid
ditunjukkan dengan terbentuknya endapan jingga sampai merah coklat
dengan pereaksi Dragendorff (Robinson, 1995).
2. Uji terpenoid dan steroid (Uji Lieberman Buchard)
Ekstrak kasar metanol Terap (A. odoratissimus Blanco) dan fraksi
kloroform ditambahkan 3 tetes pereaksi Lieberman-Burchard (asam asetat
glasial + H2SO4 pekat). Uji positif triterpenoid memberikan warna merah
atau ungu dan uji positif steroid memberikan warna hijau atau biru
(Harborne, 1987).
3. Uji fenolik
Ekstrak kasar metanol daun Terap (A. odoratissimus Blanco) dan
fraksi kloroform ditambahkan larutan besi(III) klorida (FeCl3) 10%
beberapa tetes, ekstrak positif mengandung fenolik apabila menghasilkan
warna hijau, merah, ungu, biru atau hitam (Harborne, 1987).
4. Uji flavonoid
Ekstrak kasar metanol daun Terap (A. odoratissimus Blanco) dan
fraksi kloroform ditambahkan 2 mg serbuk Mg dan 3 tetes HCl pekat. Uji
positif ditunjukkan dengan terbentuknya warna merah, kuning atau jingga
(Harborne, 1987).
5. Uji saponin
Ekstrak kasar metanol daun Terap (A. odoratissimus Blanco) dan
fraksi kloroform, dikocok kuat, jika timbul busa ditambahkan 1 tetes HCl
pekat. Ekstrak positif mengandung saponin jika timbul busa dengan
ketinggian 1-3 cm yang bertahan selama 15 menit (Harborne, 1987).
C. Pemisahan dan Pemurnian Senyawa Metabolit Sekunder
Dari uji fitokimia yang dilakukan diketahui fraksi kloroform mengandung
senyawa flavonoid. Kemudian fraksi klorofrom dilkukan uji kromatografi Lapis
Tipis (KLT) awal dengan eluen n-heksana dan etil asetat untuk mengetahui
komposisi eluen yang akan digunakan pada kromatografi kolom vakum (KVC)
dengan melihat hasil spot/noda yang ada.
D. Kromatografi Vakum Cair
Proses pemisahan dan pemurnian dilakukan dengan metode kromatografi
vakum cair (KVC) dengan menggunakan silika gel 60 GF254 sebagai fase diam.
Senyawa-senyawa yang ada dalam fraksi kloroform dilakukan pemisahan dengan
menggunakan Kromatografi vakum cair (KVC) yang bertujuan untuk
memisahkan golongan senyawa metabolit sekunder secara kasar dengan
menggunakan silika gel sebagai adsorben dan berbagai perbandingan pelarut n-
heksana dan eti asetat (elusi gradien) dan menggunakan pompa vakum untuk
memudahkan penarikan eluen (Hostettmann et al .1995). Corong yang diletakkan
diatas kolom KVC yang berdiameter 13 cm dan tinggi 24 cm diisi dengan fase
diam silika gel 60 GF254 dengan ketinggian silika mencapai lebih kurang 4 cm.
Sebagai kolom digunakan corong Bucheer kaca masir, ke dalam corong Bucheer
kaca masir dimasukkan silika gel 60 GF254 yang dikemas dalam keadaan kering.
Lalu di bagian atas ditutup dengan kertas saring. Alat vakum dihidupkan untuk
memperoleh kerapatan yang maksimum. Sebelum dilakukan proses pemisahan
dengan kolom kromatografi vakum, sampel diimpergnasi terlebih dahulu
menggunakan silika gel dengan ukuran 50-100 mesh. Sebanyak 8.02 gram ekstrak
kloroform diimfragnasi dengan silika gel sebanyak 81.12 gr kemudian digerus
hingga homogen dan kering, sampel kemudian dimasukkan pada bagian atas
kolom yang disebar secara merata, lalu diatasnya diletakkan kertas saring. Alat
vakum dihidupkan kembali. Kemudian sampel dielusi mulai dari kepolaran
rendah lalu kepolaran ditingkatkan perlahan-lahan dan kolom dihisap sampai
kering pada setiap pengumpulan fraksi (Hostettmann et al. 1995).
 Hasil dari kromatografi vakum cair yang diperoleh sebanyak 25 botol,
selanjutnya dimonitoring dengan KLT menggunakan eluen n- heksana:etil asetat
(3:7), kemudian dilakukan fraksi gabungan terhadap Rf yang sama. Fraksi
gabungan diperoleh 3 fraksi yaitu A.B, dan C. Fraksi B dilanjutkan ke
kromatografi kolom flash.
E. Kromatografi Kolom Flash
Pemisahan senyawa-senyawa yang terdapat dalam fraksi B dilakukan
kromatografi kolom flash dengan menggunakan silika gel G 60 (70-230 mesh)
sebagai fase diam. Silika gel disuspensikan terlebih dahulu dengan n- heksana
dimasukkan ke dalam kolom yang dasarnya telah diberi kapas. Pengisian kolom
dilakukan dengan sistem pengisapan dari puncak kolom oleh pompa dengan
tekanan yang kecil (< 2 psi), agar diperoleh kerapatan kemasan maksimum.
Kemudian dibiarkan satu malam. Sebelum dilakukan proses pemisahan dengan
kromatografi kolom flash, sampel diimpregnasi terlebih dahulu menggunakan
silika gel dengan ukuran 50-100 mesh dengan perbandingan sampel : silika = 1:2.
Sebanyak 0.4 gr ekstrak etil asetat dimpregnasi dengan silika gel sebanyak 0.8 gr
kemudian digerus hingga homogen dan kering. Sampel dimasukkan ke dalam
kolom lalu dielusi menggunakan pelarut dengan kepolaran meningkat
menggunakan sistem pengisapan (suction) untuk mempercepat proses elusi.
Begitu sampel masuk ke dalam fase diam, fase gerak ditambahkan secara
kontinyu sampai terjadi pemisahan. Eluat ditampung pada botol penampung fraksi
setiap 5-10 mL, kemudian keseluruhan fraksi yang dihasilkan dilakukan KLT
penggabungan (Istiyanti,2013).
 Fraksi hasil KLT penggabungan yang mempunyai pola pemisahan sama
(harga Rf sama) digabungkan, kemudian diuapkan selama seminggu agar pekat
dan masing-masing kelompok fraksi yang diperoleh diuji secara fitokimia (Asih,
2009).
F. Uji Kemurnian
Uji kemurnian dilakukan menggunakan berbagai campuran fase gerak, yaitu
n -heksana, kloroform, etil asetat dan metanol. Jika isolat tetap menunjukkan noda
tunggal pada plat kromatogram dengan fase gerak yang berbeda, menunjukkan
isolat relatif murni secara KLT, bahwa isolat tersebut hanya mengandung satu
jenis senyawa ( Asih, 2009).
G. Identifikasi Senyawa Metabolit Sekunder
Senyawa metabolit sekunder hasil isolasi (isolat murni) dikarakterisasi yang
meliputi spektrum UV-Vis dengan spektroskopi UV-Vis untuk mengetahui
panjang gelombang maksimum dan menunjukkan gugus kromofor senyawa isolat
murni serta spektrum FTIR dengan spektroskopi FTIR untuk mengetahui bilangan
gelombang yang dapat menunjukkan gugus fungsi yang dimiliki senyawa isolat
murni.

H. Uji Toksisitas Brine Shrimp Lethality Test (BSLT)

Dalam persiapan larutan sampel 1 mg isolat dilarutkan dalam 100 µL air
laut sambil diaduk sehingga konsentrasi menjadi larutan menjadi 1000 ppm.
Larutan kontrol dibuat sama dengan prosedur diatas tanpa penggunaan sampel.
 Penyemaian larva udang disemaikan dalam 100 mL air laut. Selanjutnya
diberi pencahayaan TL agar menetas sempurna. Setelah 24 jam telur udang
menetas dan siap untuk diujicobakan. Pengujian toksisitas, disiapkan 2 plat mikro
standar masing- masing untuk plat uji dan plat kontrol. Pada baris 1 dan 2 masing-
masing tiga kolom dimasukkan 100 µL larutan sampel pada plat uji dan 100
µL larutan kontrol pada plat kontrol. Larutan baris 2 diencerkan dengan 100 µL
akuades dan diaduk.
Kemudian dipipet kembali 100 µL dimasukkan kedalam baris 3 diencerkan
kembali 100 µL akuades sambil diaduk dan seterusnya dengan cara yang sama
sampai baris terakhir. Sehingga konsentrasi larutan untuk masing-masing baris
sebagai berikut, baris 1 = 1000 ppm, baris 2 = 500 ppm, baris 3 = 250 ppm, baris
4 = 125 ppm, baris 5 = 62,5 ppm, baris 6 = 32,25 ppm, baris 7 = 15,6 ppm, baris
8 = 7,8 ppm . Selanjutnya ke dalam larutan sampel pada plat uji dan larutan
kontrol pada plat kontrol ditambahkan 100 µL air laut yang mengandung 10 larva
udang, kemudian dibiarkan selama 24 jam. Sampel yang sukar larut dapat
ditambahkan DMSO 1% sebanyak 1-3 tetes. Dihitung jumlah rata-rata larva
udang yang mati dan hidup untuk setiap baris dari plat uji.
I. Teknik Analisa Data
Nilai LC50 (Lethal Concentration 50%) yaitu nilai yang menunjukkan zat
toksik yang dapat mengakibatkan kematian larva udang sampai 50%, selama 24
jam (LC50 dalam unit waktu) ditentukan dengan menggunakan program Analisis
Probit SAS. 100 µL akuades dan diaduk. Kemudian dipipet kembali 100 µL
dimasukkan kedalam baris 3 diencerkan kembali 100 µL akuades sambil diaduk
dan seterusnya dengan cara yang sama sampai baris terakhir. Sehingga konsentrasi
larutan untuk masing-masing baris sebagai berikut, baris 1 = 1000 ppm, baris 2 =
500 ppm, baris 3 = 250 ppm, baris 4 = 125 ppm, baris 5 = 62,5 ppm, baris 6 =
32,25 ppm, baris 7 = 15,6 ppm, baris 8 = 7,8 ppm . Selanjutnya ke dalam larutan
sampel pada plat uji dan larutan kontrol pada plat kontrol ditambahkan 100 µL air
laut yang mengandung 10 larva udang, kemudian dibiarkan selama 24 jam.
Sampel yang sukar larut dapat ditambahkan DMSO 1% sebanyak 1-3 tetes.
Dihitung jumlah rata-rata larva udang yang mati dan hidup untuk setiap baris dari
plat uji. 2.12. Teknik Analisa Data Nilai LC 50 (Lethal Concentration 50%) yaitu
nilai yang menunjukkan zat toksik yang dapat mengakibatkan kematian larva
udang sampai 50%, selama 24 jam (LC50 dalam unit waktu) ditentukan dengan
menggunakan program Analisis Probit SAS.
III.7 Alat dan Bahan
A. Alat
Alat yang digunakan meliputi rotary evaporator, corong pisah, KLT, KKG,
UV 254 nm, UV 366 nm, dan GCMS (Shimadzu®),
B. Bahan
Bahan yang digunakan meliputi ekstrak etanol biji O. Basilicum, etanol,
aquades, heksana, etil asetat, butanol, DPPH 0,05%, metanol (pa), reagen Folin-
Cioceltaeu (1:1), NaCO3 20%, dan asam galat
III.7.1 Cara Kerja
A. Ekstraksi
Serbuk kering biji O. Basilicum sebanyak 1 kg dimaserasi menggunkan
pelarut etanol selama 3x24 jam. Ekstrak etanol yang diperoleh selanjutnya
diuapkan menggunakan rotary evaporator vakum, sehingga diperoleh ekstrak
kental coklat kehijauan sebanyak 30,8 g. Hasil ekstrak kental selanjutnya
dilakukan pengujian fitokimia.
B. Partisi
Ekstrak etanol biji O. Basilicum dilarutkan terlebih dahulu dengan
etanol:H2O (1:1) dan dipartisi secara berturut-turut dengan heksana, etil asetat dan
butanolyang memiliki tingkat kepolaran yang berbeda lapisan dan dipisahkan
fase-fase yang terbentuk. Sisa fase etanol:H 2O ditambahkan kembali dengan
larutan penyari dan digojok hingga terjadi pemisahan kembali. Dilakukan cara
yang sama hingga fase dari larutan penyari yang ditabahkan jernih (tidak ada zat
yang tersari).
C. Uji Autografi Antioksidan
Hasil fraksi-fraksi selanjutnya ditotolkan pada plat KLT, dibiarkan sebentar
sampai mengering. Kemudian disemprotkan dengan larutan DPPH 0,05%,
dikeringkan anginkan dan diamati terbentuknya warna jingga atau kuning dengan
latar berwarna ungu yang menunjukkan aktivitas penghambatan radikal DPPH
(Sukandar dkk., 2010).
D. Uji Aktivitas Antioksidan
 Sampel sebenyak 2 mg dilarutkan dalam 10 mL metanol (pa) sehingga
diperoleh konsentrasi sampel sebesar 200 ppm dan dibuat larutan baku dengan
variasi konsentrasi 200 ppm, 100 ppm, 50 ppm, 25 ppm dan 12,5 ppm. Masing-
masing sampel dipipet sebanyak 2 mL dan ditambahkan dengan 2 mL DPPH
0,002% dan diinkubasi selama 30 menit lalu diukur pada (lamda) 517 nm.
Kemudian dihitung persen inhibisinya dan diekstrapolasi ke dalam persamaan
regresi linier hingga didapat IC50-nya.
E. Penentuan Total Fenolik
Sampel sebanyak 2,5 mg ditambahkan dengan 2,5 mL aquades, kemudian
ditambahkan 0,5 mL reagen Fplin-Cioceltaeu (1:1) dan diinkubasi selama 3menit.
Lalu dotambahkan 2 mL larutan NaCO3 20% dan dibiarkan pada water bath yang
mendidih selama 1 menit. Setelah didinginkan pada ice bath, diukur nilai
absorbansinya pada (lamda) 750 nm. Larutan standar yang digunakan adalah
larutan asam galat 0-500 ppm. Jumlah kandungan fenolik sebanding dengan
jumlah mg ekuivalen asam galat dalam 1 gram berat sampel kering.
F. Analisis dengan Kromatografi Lapis Tipis
Kromatografi lapis tipis (KLT) silica gel 60 F254 untuk mendapatkan
perbandingan eluen yang sesuai antara n-heksan dan etil asetat. Diperoleh eluen
yang sesuai atara n-heksan dan etil asetat (1:9) Setelah didapat eluen yang sesuai
dilanjutkan dengan kromatografi kolom
G. Pemisahan dengan Kromatografi Kolom Gravitasi
Pemisahan menggunakan kromatografi kolom dengan eluen yang diproleh
dari analisis terbaik dari KLT menggunakan heksana:etil asetat (1:9). Fraksi-fraksi
yang didapat pada pemisahan ditampung dalam tabung dan diperoleh sub-fraksi
selanjutnya dianalisis dengan spektrofotometer UV pada λ 254 nm dan λ 366 nm.
H. Identifikasi dengan Kromatografi Lapis Tipis
Hasil sub-fraksi yang diperoleh selanjutnya diidentifikasi dengan
menggunakan KLT untuk memperoleh fraksi dengan pola noda warna dan Rf
yang sama, selanjutnya pola noda dan Rf yang sama digabungkan.
I. Uji Autografi Antioksidan
Setelah diperoleh hasil sub-fraksi dilakukan pengujian antioksidan
menggunakan KLT dengan larutan DPPH 0,05% dikering anginkan dan diamati
terbentuknya warna jingga atau kuning dengan latar berwarna ungu yang
menunujukkan aktivitas penghambatan radikal DPPH (Sukandar dkk, 2010).

J. Uji Aktivitas Antioksidan

Sampel sebenyak 2 mg dilarutkan dalam 10 mL metanol (pa) sehingga
diperoleh konsentrasi sampel sebesar 200 ppm dan dibuat larutan baku dengan
variasi konsentrasi 200 ppm, 100 ppm, 50 ppm, 25 ppm dan 12,5 ppm. Masing-
masing sampel dipipet sebanyak 2 mL dan ditambahkan dengan 2 mL DPPH
0,002% dan diinkubasi selama 30 menit lalu diukur pada (lamda) 517 nm.
Kemudian dihitung persen inhibisinya dan diekstrapolasi ke dalam persamaan
regresi linier hingga didapat IC50-nya.
K. Penentuan Total Fenolik
Sampel sebanyak 2,5 mg ditambahkan dengan 2,5 mL aquades, kemudian
ditambahkan 0,5 mL reagen Fplin-Cioceltaeu (1:1) dan diinkubasi selama 3menit.
Lalu dotambahkan 2 mL larutan NaCO3 20% dan dibiarkan pada water bath yang
mendidih selama 1 menit. Setelah didinginkan pada ice bath, diukur nilai
absorbansinya pada (lamda) 750 nm. Larutan standar yang digunakan adalah
larutan asam galat 0-500 ppm. Jumlah kandungan fenolik sebanding dengan
jumlah mg ekuivalen asam galat dalam 1 gram berat sampel kering.
L. Analisis dengan GCMG
Analisis dengan GCMG.Isolat hasil kolom dilarutkan dengan etanol
kemudian instrumen GCMS diatur kondisi yang sesuai. Sampel diinjeksikan
keinstrumen yang telah mencapai kondisi yang opimum dan direkam
kromatogram nya yang kemudiaan di bandingkan dengan Wiley7 Library GCMS
Merck Shimadzu QP2010. Kondisi GCMS yang digunakan sebagai berikut: jenis
kolom RTx1-MS Restech Polymethyl xiloxan, diameter kolom, 6.25 mm, suhu
kolom 50 °C, tekanan 53,6 kPa, aliran kolom 1.00 ml/menit, kecepatan linear 36,3
cm/detik dan fase gerak gas helium.
 BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
IV.1. Hasil
IV.1. 1 Ekstraksi sampel daun meranti sabut
Ekstraksi sampel daun Meranti sabut sebanyak 5 g direndam dengan etanol, dan
diperoleh hasil ekstrak etanol kemudian dicampurkan dengan 5 ml air suling dan 5 ml
kloroform dan dikocok lalu dibiarkan beberapa menit sampai terlihat adanya 2 lapisan
yang terpisah yaitu air dan kloroform, lalu diambil lapisan air untuk dilakukan uji
senyawa flavonoid, fenolik, dan saponin, sedangkan lapisan kloroform digunakan
untuk uji senyawa terpenoid, dan steroid. Metode ini disebut dengan Partisi Ekstrak
Cair-Cair (ECC) yaitu proses pemisahan zat terlarut didalam 2 macam zat pelarut
yang tidal saling bercampur atau dengan kata lain perbandingan konsentrasi zat
terlarut dalam pelarut organik, dan pelarut air (Khamidinal, 2009).
Hasil ekstraksi dengan metode maserasi bertingkat yang kemudian dipekatkan
dengan rotary evaporator diperoleh ekstrak kental etil asetat sebanyak 78 gram
dengan rendemen 3 % berwarna hijau pekat dan berbau khas. Ekstraksi ini dilakukan
untuk mengambil komponen non polar dari sampel daun Meranti sabut. Selanjutnya
dipisahkan komponen kimia yang terkandung dalam ekstrak tersebut dengan
menggunakan Kromatografi Lapis Tipis (KLT).
IV.1. 2. Analisis skiring fitokimia
Hasil Uji Flavonoid dengan penambahan asam klorida pekat akan terbentuk
warna jingga, merah muda sampai merah menandakan adanya senyawa flavonoid.
Tujuan penabahan HCL adalah karena flavonoid bersifat basa sehingga biasanya
diekstrak dengan pelarut yang mengandung asam (harbone, 1996).
Hasil uji Fenolik dengan1–2 tetes larutan besi (III) klorida 1%. Bila terbentuk
warna biru/ungu, berarti terdapat senyawa fenolik. Hasil uji Saponin Lapisan air
dalam tabung reaksi dikocok. Apabila terbentuk busa yang bertahan selama 5 menit,
berarti positif adanya saponin. Hasil uji Terpenoid dan Steroid, lapisan kloroform
disaring melalui pipet yang berisi norit. Hasil saringan di pipet 2–3 tetes dan
dibiarkan mengering pada plat tetes. Setelah kering ditambahkan pereaksi
Liebermann-Burchard (2 tetes asam asetat anhidrat dan 1 tetes asam sulfat pekat).
Terbentuknya warna merah berarti positif adanya terpenoid dan warna hijau-biru
berarti positif adanya steroid. Hasil Uji Alkaloid, Sampel daun meranti sabut Shorea
ovalis (Korth)sebanyak 5 g dalam bentuk serbuk, ditambahkan 10 ml kloroform,
kemudian ditambahkan 10 ml larutan kloroform beramoniak 0,05 M, diaduk
kemudian disaring. Kedalam tabung reaksi tambahkan 10 tets asam sulfat 2 N, kocok
selama 2 menit, biarkan hingga terbentuk dua lapisan dan terjadi pemisahan. Ambil
lapisan asam (atas) dan tambahkan 1-2 tetes pereaksi Meyer jika terbentuk endapan
putih menunjukkan hasil yang positif untuk alkaloid.
IV.1. 3. Analisis senyawa hasil isolasi
Dari hasil kromatografi kolom ditampung dalam vial dan dibiarkan menguap.
Diperoleh sebanyak 279 vial, kemudian dimonitor dengan KLT yang dilakukan
penotolan dari setiap vial dengan jarak 3-5. Pola nodanya diamati dibawah lampu UV.
Fraksi yang memilki Rf atau pola noda yang sama digabung sehingga didapatkan 15
fraksi gabungan yang hasilnya ini dimonitoring kembali dengan KLT, 15 fraksi
gabungan tersebut diberi label F A hingga F O.
Fraksi I (vial 30-39) memperlihatkan pola noda yang terpisah sempurna pada
KLT, dimana terdapat noktah utama yang bulat, yang terpisah baik, dan memiliki Rf
yang ideal, dan juga memperlihat adanya butiran-butiran kristal pada dinding vial
sehingga pengerjaan difokuskan pada fraksi I. Kristal pada fraksi I ini kemudian
dimurnikan dengan cara rekristalisasi menggunakan pelarut n-heksana dan etil asetat
agar terpisah dari pengotornya.
Hasil rekristalisasi didapatkan senyawa murni IA sebanyak 17,8 mg. Senyawa
murni IA dilakukakn pengujian titik leleh dan pengujian KLT dengan beberapa eluen
yang berbeda. Selanjutnya senyawa murni IA dikarakterisasi secara organoleptis dan
spektrofotometri UV, IR dan NMR. Senyawa murni IA yang diperoleh dilakukan uji
titik leleh dengan menggunakan alat Melting point apparatus diperoleh nilai titik leleh
135-137°C.
Senyawa murni IA dilakukan uji spektrofotometer UV-Vis namun senyawa
tidak memberikan spektrum serapan maksimum, hal ini dimungkinkan karena tidak
adanya gugus kromofor yang terkandung pada senyawa ini. Selanjutnya dilakukan
karakterisasi dengan spektrum infra merah memperlihatkan adanya regangan O-H
dan muncul pada daerah 3344 cm berupa peak yang khas untuk regangan gugus
hidroksil. Adanya atom O yang terikat dengan atom H didukung oleh peak pada
bilangan gelombang 1040 cm-1-1 yang merupakan gugus C-O. Bilangan gelombang
3086 cm-1 menunjukkan intensitas peak sedang yang berasal dari regangan =CH
alkena, sedangkan pada bilangan gelombang 29632848 cm merupakan CH alifatis.
Karakterisasi senyawa murni IA menggunakan spektroskopi NMR meliputi 1H-
NMR, 13C-NMR, HSQC dan HMBC.

Gambar 1. Hasil KLT kristal senyawa IA dengan pereaksi Lieberman-Bourchard

NMR 1H ( mengukur inti atom ) yaitu untuk menentukan letak dan jumlah
proton dalam senyawa. Spektrofotometri NMR proton merupakan sarana unutk
menentukan struktur senyawa organik dengan mengukur momen magnet atom
hydrogen.
 Pada jurnal isolasi daun Meranti sabut, spektrum 1H-NMR senyawa IA, terlihat
bahwa pada pergeseran kimia 5,35 (d) memiliki intensitas 1H yang merupakan H dari
metin(CH). Pada spektrum 1H-NMR dari senyawa IA memperlihatkan adanya
beberapa puncak yang merupakan ciri khas dari suatu golongan senyawa seperti:
lupeol, lupenon, simiarenol, ß-amyrin, ß-sitosterol, stigmasterol dan campesterol.
Terlihat pada pergeseran kimia dH 0,0-1,5 ppm memberikan pola pemisahan puncak
yang tidak terpisah sempurna dan hampir berdempetan satu sama lainnya yang
merupakan spesifik dan ciri khas dari senyawa golongan terpenoid.

Gambar 2. Spektrum Spektrofotometri Infra Merah Senyawa Murni IA

 Gambar 3. Spektrum 1H-NMR Senyawa Murni IA
Pada jurnal isolasi daun Meranti sabut, analisa spektrofotometri 13C-NMR dari
senyawa IA memperlihatkan adanya 27 puncak dari atom karbon yang muncul pada
pergeseran kimia sebanyak 27 atom karbon ini terdiri dari satu atom karbon kuartener
jenuh, satu karbon kuartener rangkap dua dan satu karbon alkena. ppm. Hal ini
kemungkinan disebabkan adanya puncak-puncak yang tidak terbaca ataupun adanya
beberapa puncak yang muncul saling berhimpitan satu sama lain atau simetris.
 Gambar 4. Spektrum 13C-NMR Senyawa Murni IA.
Dari hasil pengamatan dan analisa pada spektrum HSQC senyawa IA, diperoleh
data yang menyatakan bahwa senyawa ini memiliki 6 atom C primer, 11 atom C-
sekunder, 8 atom C-tersier dan 2 atom C-kuartener. Sehingga dapat disimpulkan
jumlah proton dari senyawa ini berjumlah 48 proton. Sedangkan spektrum HMBC
memperlihatkan hubungan proton dengan atom karbon tetangga dengan jarak
maksimum 4 ikatan.

Gambar 5. HSQC Senyawa Murni IA

Hasil spektrum HMBC juga dapat dikorelasikan antara atom karbon dengan
atom proton yang dimiliki oleh atom karbon tetangga. Korelasi antara masing-masing
tetangga atom karbon dapat dengan mudah diinterpretasikan dengan melihat berbagai
perpotongan yang terjadi . Dilihat dari pergeseran kimia dC 140,8 ppm bertetangga
dengan atom karbon yang memiliki proton (dH C/ 2,30; E/1,86; L/1,01 ppm).
 Gambar 6. HMBC Senyawa Murni

Dari analisa data spektro 1H-NMR, 13C-NMR, HSQC, HMBC dan

perbandingan interpretasi data dengan senyawa hasil isolasi yang telah dilaporkan,
senyawa ini memiliki 29 atom carbon dan 48 atom proton dan 1 atom O yang dapat
diduga sebagai senyawa ß-sitosterol, namun dari hasil pembacaan NMR senyawa
murni IA secara keseluruhan belum dapat disimpulkan struktur lengkapnya, karena
masih diperlukan data-data penunjang dari spektrum Massa senyawa IA.
IV.1.4 Pengujian Toksisitas
Hasil uji sitotoksik pada konsentrasi uji 100 ppm terjadi persen kematian
hewan percobaan sebesar 56,6%, 10 ppm sebesar 40% dan 1 ppm sebesar 23,3%.
Konsentrasi yang menyebabkan 50% kematian hewan percobaan diperoleh pada nilai
Lethal konsentrasi (LC50) sebesar 40,45ppm. Suatu ekstrak dianggap memiliki efek
positif terhadap kematian larva Artemia salina jika harga LC nya <1000 ppm . Disini
terlihat bahwa ekstrak etil asetat daun meranti sabut (Shorea ovalis Kort.) positif
sitotoksik terhadap larva Artemia salina.
IV.2 Hasil

IV.2.1 .Profil Fitokimia Sampel

Pemeriksaan kandungan metabolit sekunder dari daun Cordyline fruticosa (L.)
A. Cheval menunjukan adanya beberapa kandungan senyawa metabolit sekunder
yaitu flavanoid, fenolik, kumarin, triterpenoid, steroid dan alkaloid.
IV.2.2 Ekstraksi
Proses ekstraksi dengan metode maserasi diperoleh ekstrak perkat n heksan
sebanyak 32,84 gram (rendemen 3,28%), ekstrak etil asetat sebanyak 43,93 gram
(rendemen 4,39%), ekstrak metanol sebanyak 52,46 gram (rendemen 5,25%).
IV.2.3 Isolasi senyawa metabolit sekunder
Pada proses kromatografi kolom diperoleh hasil sebanyak 582 vial. Setelah
dikelompokkan berdasarkan pola noda yang sama pada KLT didapatkan 26 fraksi
yang lebih sederhana yaitu dari fraksi A sampai Z. Fraksi yang dipilih untuk
dimurnikan lebih lanjut adalah fraksi E. Fraksi E dipilih karena memiliki noda
tunggal yang terlihat pada uap I2. Kemudian terhadap fraksi E dilakukan uji metabolit
sekunder dan didapatkan hasil bahwa fraksi E mengandung senyawa terpenoid,
dimana uji fitokimia dengan pereaksi lieberman-Burchard fraksi E memberikan
warna kemerahan yang menandakan adanya senyawa terpenoid. Senyawa hasil isolasi
berupa padatan putih dan memberikan noda tunggal pada plat KLT dengan
menggunakan beberapa eluen n-heksan: etil asetat, dimana nilai RF-nya 0,35 untuk
eluen n-heksan : etil asetat (9:1), 0,44 untuk eluen n-heksan : etil asetat (8:2), 0,56
untuk eluen n-heksan : etil asetat (7:3), 0,60 untuk eluen n-heksan : etil asetat (6:4),
dan 0,87 untuk eluen n-heksan : etil asetat (3:7).
IV.2.4 Karakterisasi dan analisis senyawa hasil isolasi

Hasil karakterisasi secara kimia senyawa hasil isolasi menunjukan bahwa

senyawa tersebut merupakan golongan senyawa terpenoid, dimana memberikan noda
tunggal berwarna merah kecoklatan yang diungkap dengan reagen Lieberman-
Burchard(LB).
 Berdasarkan hasil pengukuran spektrum UV-Vis senyawa hasil isolasi dapat
dilihat pada gambar 1 menunjukan adanya serapan pada daerah panjang gelombang
maksimum 200,80 nm adanya transisi dari n ke n*. Hal ini mengindikasikan adanya
ikatan rangkap yang tidak berkonjugasi yang terdapat pada senyawa hasil isolasi.
Spektrum ini semakin memperkuat hasil karakterisasi secara kimia, bahwa senyawa
yang diisolasi merupakan senyawa terpenoid.
 Hasil pengukuran dengan spektrofotometer IR didapatkan spektrum seperti
gambar 2.

Spektrum inframerah senyawa hasil isolasi memberikan indikasi beberapa pita

serapan penting yaitu pita serapan –OH bebas pada vibrasi regangan didaerah
3415,82 cm-1, pada bilangan gelombang 2917 cm-1 , dan 2849,50 cm-1 yang
mengindikasikan pita serapan C-H streching. Pada bilangan gelombang 1375,16 cm -1
mengindikasikan pita serapan metil CH3 dan pada pada bilangan gelombang 1636,53
cm-1 merupakan daerah serapan C=C alkena.

IV.2.5 Pengujian aktivitas antioksidan

Uji antioksidan dilakukan terhadap ekstrak n-heksan, etil asetat, metanol serta
senyawa hasil isolasi. Hasil uji antioksidan tersebut dapat dilihat pada Tabel 1. Suatu
senyawa atau ekstrak dapat bersifat antioksidan dilihat dari nilai IC50. Semakin rendah
nilai IC50 suatu senyawa maka semakin aktif senyawa tersebut sebagai antioksidan
dan sebaliknya, semakin besar nilai IC50 suatu senyawa maka akan semakin berkurang
sifat antioksidan suatu senyawa bahkan dapat dikatakan tidak aktif sebagai
antioksidan.

Menurut Jun et.al 2003 aktivitas antioksidan digolongkan sangat aktif jika nilai
IC50 kurang dari 50 mg/L, digolongkan aktif bila nilai IC50 50-100 mg/L, digolongkan
sedang bilai nilai IC50 101-250 mg/L, dan digolongkan lemah bilai nilai IC 50 lebih
besar dari 500 mg/L. Sehubungan dengan hal ini, maka ekstrak metanol dan etil asetat
tergolong aktif, ekstrak n-heksan tergolong sedang, sedangkan untuk senyawa hasil
isolasi tergolong lemah. Dimana ekstrak etil asetat nilai IC 50 paling rendah
dibandingkan ekstrak lainnya, ini menunjukan ekstrak etil asetat lebih aktif sebagai
antioksidan, hal ini diperkirakan banyaknya senyawa fenolik yang terdapat pada
ekstrak etil asetat dibandingkan ekstrak metanol dan n-heksan.
 Berdasarkan hasil diatas bahwa ekstrak etil asetat dan metanol memiliki potensi
sebagai antioksidan, sedangkan ekstrak n-heksan dan senyawa hasil isolasi tidak
memiliki potensi sebagai antioksidan.

IV.3 Hasil

IV.3.1 Isolasi dan Karakterisasi Isolat Ekstrak Kloroform Batang Tumbuhan

Bakau Merah (R.stylosa)
Dalam penenelitian ini sampel serbuk batang bakau merah dimaserasi dengan
pelarut kloroform p.a selama 5 hari dan diulang sebanyak 3 kali, setelah itu ekstrak
diuapkan dengan menggunakan rotary evaporator dan didapat ekstrak kental
sebanyak 15,342g. Selanjutnya diambil sebanyak 10,173 untuk dilakukan KCV
dengan eluen H =100 % sebanyak 2 kali, H:E= 9:1 sampai 6:4 dan E = 100% dan
metanol 100%) dan dihasilkan 8 fraksi (volume tiap fraksi 150 ml) selanjutnya hasil
pemisahan dimonitor dengan KCV seperti tampak pada gambar 1.

Gambar 1. Kromatogram Hasil KCV Ekstrak Kloroform Batang Bakau Merah.

Selanjutnya pada fraksi 1 sampai 5 digabung untuk selanjutnya dilakukan KCV
bertingkat dengan menggunakan eluen n-heksan 100% , n-heksan : Etil asetat = 9:1
dan metanol 100%. Selanjutnya hasil KCV2 dimonitor dengan KLT dengan eluen n-
heksan : etil asetat = 9:1 sehingga didapat kromatogram sebagai berikut :
 Gambar 2. Kromatogram Hasil KCV2 Ekstrak Kloroform Batang Bakau
Merah.
Berdasarkan hasil kromatogram di atas, fraksi 5 dan 6 digabung untuk
selanjutnya dilakukan KKG dengan berat fraksi gabungan sebesar 1,78 g dan dielusi
menggunakan eluen n-heksan : etil asetat = 9:1 menghasilkan 25 fraksi dan Pada
fraksi ke-5 pada hasil KKG terdapat kristal amorf berwarna jingga sebanyak 157 mg.

Gambar 3. Isolat Pada Fraksi ke-5

Selanjutnya kristal yang didapat dilakukan rekristalisasi dalam pelarut n-heksan

dan kloroform dengan perbandingan 3:1. Isolat yang didapat, diuji kemurniannya
dengan KLT menggunakan sistem 3 eluen yang berbeda. Pada isolat ke-5 yang
diperoleh dari proses KKG diuji kemurniannya menggunakan sistem 3 eluen yang
berbeda metanol : kloroform= 8:2 (Rf= 0,88) : n-heksan : kloroform = 8:2 (Rf 0,42) ;
dan metanol : kloroform = 9:1 (Rf = 0,93)
IV.3.2 Tahap Karakterisasi Senyawa Hasil Isolasi
Selanjutnya isolat 5 dan 4 diuji dengan FeCl3 dan shinoda test untuk isolat ke-5
dengan FeCl3 menjadi berwarna hijau sedangangkan dengan shinoda test tetap tidak
berwarna, hal ini menandakan bahwa isolat mengandung senyawa fenolik yang
tergolong senyawa flavan. Dengan pengujian titik leleh isolat 5 mempunyai titik leleh
sebesar 298 °C - 299 °C, 299-300 °C, dan 299-300°C Berdasarkan pengukuran titik
leleh isolat tersebut cukup murni karena memiliki rentang tidak lebih dari 2°C.
Untuk mengetahui gugus fungsi pada isolat ke-5 dilakukan uji spektrofotometer
IR (Infra-Red) berdasarkan pengukuran IR serapan dari isolat 5 disajikan didalam
gambar 3 dibawah ini :

Gambar 3. Spektra IR isolat 5

Berdasarkan spektra diatas dapat dilihat adanya pita kuat pada 3406,1 cm-1
yang spesifik terhadap gugus OH, puncak tajam pada 2939,7 dan 2866,4 cm-1
menunjukkan adanya serapan pada gugus fungsi CH3 alkil, serapan pada daerah 1667
dan 1596,1 cm-1 menunjukkan serapan khas untuk gugus fungsi C=C aromatik,
sedangkan serapan pada daerah 1284,7 dan 1172,9 cm-1 menunjukkan serapan pada
gugus fungsi C-O. Hasil analisis menggunakan spektrofotometri UV-Vis isolat ke-5
memberikan satu serapan yang karakteristik untuk senyawa flavonoid golongan
katekin, yaitu serapan pada panjang gelombang 311 nm dan dapat ditunjukkan pada
gambar 5

Gambar 5. Spektra UV-Vis isolat 5 + metanol.

Dengan penambahan pereaksi geser isolat 5 ditunjukkan pada gambar dibawah

ini :

Gambar 6. Spektra UV-Vis isolat 5 + metanol + NaOH

 Gambar 7. Spektra UV-Vis isolat 5 + metano +NaOAc+ H3BO3

Gambar 8. Spektra UV-Vis isolat 5 + metano + AlCl3 + HCl

Berdasarkan spektra diatas isolat ini memiliki kerangka katekin diperoleh dari
diagnostik pereaksi geser seperti: NaOH, NaOAc, NaOAc-H 3BO3, AlCl3, dan AlCl3-
HCl. Hasil pergeseran panjang gelombang setelah penambahan tiaptiap pereaksi
geser tersebut dapat disimpulkan bahwa kemungkinan letak substituen gugus hidroksi
pada kerangka katekin adalah pada posisi atom C-3, C-7 dan C-4’.
 Spektrum UV-vis sebelum dan sesudah penambahan pereaksi geser dan data
tabulasinya dipaparkan pada tabel berikut.
Tabel 1. Tabel pergeseran panjang gelombang
Panjang
Geseran Panjang
Pereaksi geser Gelombang
Gelombang λmaks (nm)
λmaks(nm)
+ Metanol 311 nm -
+ Metanol + 359 nm, 311
48 nm
NaOH (bh)
+ Metanol +
307 nm 4 nm
NaOAc
+ Metanol +
307 nm 4 nm
NaOAc + H3BO3
+ Metanol +
300 nm 11 nm
AlCl3
+ Metanol +
298 nm 13 nm
AlCl3 + HCl

Hasil analisis menggunakan spektrofotometri GC-MS isolat 5 menunjukkan ada

3 puncak akan tetapi puncak dominan ada pada puncak ke-3 dengan waktu retensi
sebesar 32,058 menit merupakan senyawa yang mempunyai kelimpahan tertinggi (98
%), berikut merupakan kromatogram GC-MS.

Gambar 9. Kromatogram Isolat 5

 Sedangkan fragmentasi puncak ketiga sebagai berikut :

Gambar 10. Spektra MS puncak ke-3

Berdasarkan gambar 10, pola fragmentasi pada isolat 5 seperti gambar dibawah
ini

Gambar 11. Pola Fragmentasi Isolat 5

IV.3.3 Tahap Uji Aktivitas Biolarvasida Terhadap Larva Nyamuk Aedes aegypti
Uji aktivitas biolarvasida terhadap larva nyamuk Aedes aegypti dilakukan pada
didapatkan hasil sebagai berikut :

Tabel 2. Hasil Uji Aktivitas Biolarvasida

Konse Jumlah total larva
ntrasi Jumlah mati setelah pemaparan
larva total (N) 2 4 7
(mg/L)
4 jam 8 jam 2 jam
0 20 0 0 2
40 20 2 5 8
 1
60 20 5 6
0
1
80 20 7 9
3
1 1
100 20 8
2 6

Untuk mengetahui nilai LC50 tiap-tiap lama pemaparan digunakan analisis

probit dengan menggunakan program minitab versi 13.
Tabel 3. Nilai LC50 Dalam Rentang Waktu 24,48, dan 72 jam pemaparan
Pengamatan
LC50 (mg/L)
(jam)
24 104,376
48 84,7241
72 58,6507

Berdasarkan tabel 3 isolat 5 bersifat toksik, dan dikatakan efektif untuk

mematikan larva nyamuk Aedes aegypti.
IV.4 Hasil

Penapisan fitokimia berfungsi untuk mengetahui keberadaan golongan senyawa

metabolit sekunder yang terkandung di dalam simplisia serbuk maupun di dalam
ekstrak etanol. Penapisan fitokimia yang dilakukan secara kualitatif dengan
mengidentifikasi keberadaan suatu senyawa tanpa menentukan kadarnya. Prinsip
penapisan fitokimia ialah analisis golongan kimia tumbuhan dengan uji spesifik
dengan reagen yang memberikan uji spesifik terhadap golongan kimia tertentu.
Golongan yang diidentifikasi pada penelitian ini antara lain alkaloid, flavonoid, tanin,
saponin, kuinon, steroid dan triterpenoid. Hasil penapisan fitokimia dapat dilihat pada
Tabel 1.
Pada tabel 1 menunjukkan bahwa penapisan fitokimia pada serbuk dan ekstrak
etanol daun Mindi mengandung senyawa golongan alkaloid, flavonoid, saponin,
tanin, kuinon dan steroid. Hasil penapisan fitokimia yang diperoleh berbeda dengan
penelitian yang dilakukan yang melaporkan dalam ekstrak etanol daun mindi
mengandung senyawa metabolit sekunder alkaloid, tannin, saponin, fenolik,
glikosida, steroid, terpenoid dan flavonoid.

Proses isolasi alkaloid dari ekstrak metanol-air dilakukan dengan reaksi

penggaraman menggunakan HCl 2M untuk membentuk garam alkaloid, karena
alkaloid bersifat basa sehingga apabila ditambahkan dengan asam akan membentuk
garam. Garam alkaloid ini kemudian diekstraksi dengan pelarut etil asetat, untuk
memisahkan senyawa alkaloid dengan senyawa yang bukan alkaloid, karena alkaloid
terikat pada lapisan asam ini. Untuk membebaskan alkaloid dari bentuk garamnya,
maka ditambahkan NH4OH sampai suasana menjadi basa, sehingga alkaloid akan
terbentuk menjadi basa alkaloid kembali. Lapisan ini kemudian diekstraksi kembali
dengan pelarut etil asetat, selanjutnya diuapkan hingga terbentuk ekstrak alkaloid.
Untuk mengetahui ekstrak alkaloid yang didapatkan mengandung alkaloid atau tidak
maka ditambahkan pereaksi Dragendorff, terbentuknya endapan merah bata berarti
positif adanya alkaloid.
Ekstrak alkaloid selanjutnya dianalisis menggunakan KLT untuk mengetahui
jumlah senyawa yang ada di dalam ekstrak (Gambar 1).
 Pada gambar 1 terlihat jumlah senyawa (noda) ada 4 dengan harga Rf masing-
masing 0,22; 0,36; 0,64; dan 0;89. Selanjutnya disemprot dengan pereaksi Dragedorf
untuk mengetahui noda mana yang positif alkaloid, dan yang positif yaitu pada noda
ke-4, dengan Rf 0,89, yang ditandai dengan terbentuknya warna merah bata.
 Pemisahan alkaloid dengan KLT preparatif menggunakan eluen etil asetat :
kloroform (6:4) pada gambar 2, terlihat ada 4 pita dan yang positif alkaloid adalah
pita ke-4 dengan Rf 0,9. Selanjutnya pita ke-4 dikerok dan dilarutkan dalam pelarut
etil asetat untuk memisahkan isolat dengan silika gel. Selanjutnya isolat alkaloid
dilakukan uji kemurnian dengan KLT berbagai eluen tunggal, campuran, dan dua
dimensi. Pada gambar 3, terlihat hasil KLT hanya satu noda yang berwarna biru,
diduga isolat alkaloid yang didapatkan sudah murni.
Hasil analisis isolat alkaloid menggunakan spektrofotometer UV-Vis, pada
gambar 4, didapatkan serapan pada panjang gelombang 220 nm dan 270 nm,
merupakan serapan dari ikatan terkonjugasi aromatik dan merupakan serapan alkaloid
yang mempunyai kerangka dasar indol, seperti yang terlihat pada gambar 5.
 Serapan pada panjang gelombang 220 nm dan 270 nm mengindikasikan adanya
senyawa aromatik dan ikatan terkonjugasi.
Hasil analisis FTIR, pada gambar 6,menunjukkan serapan pada panjang
gelombang 3452,94 cm-1 yang merupakan serapan dari vibrasi ulur gugus N-H.
Vibrasi ulur C-H alifatik muncul pada panjang gelombang 2927,26 cm-1 dan 2860,37
cm-1. Serapan pada panjang gelombang 1735,83 cm-1 menunjukkan adanya vibrasi
ulur C=O. Vibrasi ulur C=C aromatik muncul pada panjang gelombang 1643,49 cm-
1. Adanya serapan 1552,66 cm-1 menunjukkan adanya N-H tekuk.Vibrasi tekuk C-H
alifatikasimetri muncul pada panjang gelombang 1460,28 cm-1. Vibrasi tekuk C-H
alifatik simetri muncul pada panjang gelombang 1385,65 cm-1. Adanya serapan pada
panjang gelombang 1095,97 cm-1 menunjukkan adanya vibrasi ulur C-N. Serapan
pada panjang gelombang 799,19 cm-1 menunjukkan adanya substitusi pada cincin
aromatik.
Isolat alkaloid dianalisis lebih lanjut menggunakan Liquid Chromatography – Mass
Spectroscophy (LC–MS) untuk mengetahui kemurnian dan berat molekul senyawa
alkaloid. Hasil kromatogram hasil LC-MS isolat alkaloid dapat dilihat pada gambar 7.
Berdasarkan kromatogram pada gambar 7, menunjukkan bahwa isolat alkaloid
belum murni, karena terdapat 3 puncak. Puncak pertama (T1) pada waktu retensi 1,8
menit, puncak kedua (T2) pada 2,3 menit, dan puncak ketiga (T3) pada 3,0 menit.

Spektrogram dari intensitas tertinggi yaitu pada puncak pertama, dapat dilihat
pada gambar 8, menunjukkan bahwa muncul puncak dengan protonasi ion molekular
[M+H+MeOH]+ m/z 324,91 dari (m/z) [M+33], sehingga dapat disimpulkan bahwa
berat molekul isolat yaitu 291,45 g/mol.
Berdasarkan analisis dengan spektrofotometer UV-Vis, FT-IR, dan LC-MS,
diduga senyawa alkaloid T1adalah alkaloid jenis indol (gambar 5), dengan berat
molekul 291,45 g/mol.
Hasil uji aktivitas sitotoksik ekstrk alkaloid daun Mindi menggunakan metode
BSLT diperoleh harga LC50 sebesar 21,273 ppm. Harga tersebut menunjukkan bahwa
ekstrak alkaloid bersifat sangat sitotoksik. Hasil uji sitotoksik ekstrak alkaloid daun
Mindi dapat dilihat pada tabel 2 sebagai berikut:

IV.5 Hasil

Serbuk kering kulit batang V.cofassus diekstraksi dengan menggunakan metode

maserasi pada suhu kamar dengan menggunakan pelarut n-heksana yang mampu
mengikat senyawa-senyawa nonpolar.Pada proses ekstraksi ini terjadi pemindahan
massa senyawa aktif yang semula berada dalam sel, ditarik oleh pelarut n-heksana.
Penggunaan metode maserasi dipilih untuk mencegah kerusakan senyawa aktif yang
terkandung di dalam kulit batang. Hal ini dikarenakan senyawa aktif dalam suatu
ekstrak cenderung tidak stabil pada suhu tinggi, sehingga pemanasan pada suhu tinggi
perlu dihindari. Maserasi sampel dengan n-heksana dilakukan dalam waktu 3 x 24
jam hingga diperoleh ekstrak padat berwarna kuning sebanyak 7,5794gram.
Selanjutnya, dilakukan uji fitokimia pada ekstrak n-heksana yang menunjukkan hasil
bahwa ekstrak nheksana positif mengandung senyawa metabolit sekunder alkaloid,
terpenoid dan steroid. Ekstrak nheksana kemudian di uji KLT untuk mengetahui eluen
yang baik digunakan pada kromatografi kolom cair vakum (KKCV). Dari beberapa
uji eluen, diperoleh eluen n-heksana:etil asetat dengan perbandingan 8:2 yang
menunjukkan pemisahan noda yang baik dengan penampakan noda yang jelas.
Kromatogram hasil uji KLT dengan eluen tersebut menunjukkan gambaran beberapa
komponen senyawa yang terkandung dalam ekstrak n-heksana. Ekstrak n-heksana
selanjutnya difraksinasi dengan kromatografi kolom cair vakum (KKCV) dengan
menggunakan adsorben silika gel G60 F254 sebagai fasa diam dan eluen n-
heksana:etil asetat (8:2) sebagai fasa gerak untuk memisahkan senyawasenyawa pada
ekstrak berdasarkan tingkat polaritasnya. Bagian larut n-heksana dielusi dengan
berbagai komposisi pelarut berdasarkan gradien polaritas, yang dimulai dari pelarut
nonpolar yang selanjutnya tingkat kepolaran dinaikkan secara perlahan-lahan.
Hasil fraksinasi tersebut selanjutnya dianalisis menggunakan KLT dengan
tujuan pengelompokkan lebih lanjut terhadap fraksi-fraksi yang diperoleh
berdasarkan kesamaan profil kandungan kimia dari bercak KLT yang terbentuk
dengan nilai Rf yang sama. Fraksi hasil KKCV yang menunjukkan adanya tanda-
tanda kristal yakni pada fraksi B dilanjutkan pada kromatografi kolom gravitasi,
dengan fase diam silika GF254 7734 dan fase gerak berupa eluen nheksana:etil asetat
dengan perbandingan komposisi sama dengan yang digunakan pada KKCV dan
diperoleh 53 fraksi. Setelah diuapkan, hasil pengamatan menunjukkan bahwa pada
fraksi 10-16 nampak adanya kristal putih berbentuk jarum. Selanjutnya, kristal
tersebut dianalisis KLT dan nampak bercak noda hanya satu. Untuk memastikan
kemurnian kristal tersebut, dilakukan pengujian KLT tiga sistem eluen.
Hasil analisis KLT tiga eluen menunjukkan hasil satu noda dengan Rf masing-
masing eluen kloroform:n-heksana Rf = 0,2 ; etil asetat:n-heksana Rf = 0,6, dan etil
asetat-kloroform Rf = 0,8. Dengan demikian dapat disimpulkan bahwa senyawa yang
diperoleh sudah dapat dikategorikan sebagai senyawa murni. Senyawa murni yang
didapatkan yaitu seberat 0,4745 gram. Selanjutnya hasil identifikasi uji warna
menunjukkan bahwa senyawa murni positif bereaksi
positif dengan pereaksi Lieberman Burchard yang ditandai adanya warna biru. Hal ini
menunjukkan bahwa senyawa tersebut merupakan salah satu senyawa golongan
steroid. Pada pereaksi Lieberman Burchard, asam asetat anhidrida dan asam sulfat
pekat bereaksi dan menghasilkan warna hijau biru. Reaksi yang terjadi antara steroid
dengan asam asetat anhidrat adalah reaksi asetilasi gugus –OH pada steroid yang
akan menghasilkan kompleks asetil steroid. Hasil karakterisasi spektroskopi Infra
Red (IR) yang tertera pada Gambar 1 menghasilkan serapan pada bilangan
gelombang 3425,58-3325,28 cm-1 yang menandakan adanya serapan ulur gugus O-
H, adanya pita dengan intensitas kuat pada daerah serapan 3024,38 cm-1
menunjukkan gugus =C-H, pada serapan 2933,73-2864,29 cm-1 merupakan C-H, pita
tajam dan intensitas kuat pada daerah serapan 1463,97 cm-1 merupakan CH2,
sedangkan pada daerah serapan 1377,17 cm-1 adalah CH3 dan pada daerah bilangan
gelombang 1058,82 cm-1 menunjukkan uluran C-OH siklik. Pita serapan yang
menunjukkan adanya gugus O-H dan C-OH memberikan gambaran bahwa
kemungkinan senyawa isolat merupakan suatu senyawa siklik steroid yang
mengandung gugus OH. Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) merupakan suatu
metode skrining untuk menentukan toksisitas suatu senyawa ekstrak bahan-bahan
alami yang bersifat sitotoksik secara akut dengan menggunakan hewan uji larva
Artemia salina Leach. Suatu ekstrak dinyatakan mempunyai potensi toksisitas akut
jika mempunyai harga LC50< 1000 µg/mL. LC50 (Lethal Concentration 50)
merupakan konsentrasi zat yang dapat menyebabkan terjadinya kematian pada 50%
hewan uji yaitu larva Artemia salina Leach. Semakin besar nilai LC50 berarti
menunjukkan toksisitasnya semakin kecil dan sebaliknya semakin kecil nilai LC 50
semakin besar nilai toksisitasnya

Berdasarkan hasil analisis probit yang menunjukkan harga LC 50 ekstrak n-heksana

sebesar 74,079 µg/mL, fraksi sebesar 118, 850 µg/mL dan kristal murni sebesar
88,201 µg/mL. Hasil nilai LC50 pada ekstrak, fraksi maupun kristal tersebut
menunjukkan bahwa ketiganya bersifat toksik karena memiliki nilai
LC50<1000µg/mL. Dengan demikian, dapat dikatakan bahwa kulit batang kayu bitti
mempunyai potensi untuk dikembangkan sebagai senyawa antikanker. Hasil analisis
probit juga menunjukkan bahwa ekstrak n-heksana memiliki nilai LC50 yang paling
kecil dibandingkan pada fraksi dan kristal. Kemungkinan hal ini dikarenakan pada
ekstrak memiliki banyak komponen senyawa teraktifnya, sehingga pada ekstrak n-
heksana cenderung bersifat lebih toksik dibandingkan pada fraksi maupun kristal.
IV.6 Hasil

IV.6.1 Ekstraksi, pemisahan dan Pemurnian

Serbuk daun Terap sebanyak ± 3 kg dimaserasi dengan metanol selama 3x24
jam pada suhu kamar (25°C) diperoleh sebanyak 40.19 gr. Metode maserasi dipilih
sebagai cara ekstraksi dikarenakan proses yang mudah dan sederhana. Prinsip metode
ini didasarkan pada distribusi zat terlarut dengan perbandingan tertentu antara dua
pelarut yang tidak saling bercampur, seperti benzen, karbon tetraklorida atau
kloroform.
Setelah disaring, residu yang diperoleh dapat diekstraksi kembali dengan
menggunakan pelarut yang sama. Metanol digunakan sebagai pelarut awal karena
metanol merupakan salah satu pelarut yang dapat melisiskan membran sel pada
tanaman dan memilikki struktur molekul yang kecil sehingga mampu menembus
jaringan tumbuhan untuk menarik senyawa aktif keluar. Pada proses maserasi,
metanol akan masuk ke rongga sel menembus dinding sel daun Terap melarutkan zat
aktif yang ada dalam sel sehingga konsentrasi yang tinggi terbentuk di bagian dalam
daun Terap. Karena perbedaan konsentrasi zat aktif di dalam dan di luar sel
menyebabkan terjadinya difusi zat aktif yang ada dalam sel akan keluar sel. Demikian
seterusnya sampai terjadi kesetimbangan konsentrasi antara larutan disebelah dalam
dan disebelah luar sel.
Hasil maserat yang diperoleh dilakukan Rotary evaporator dengan hasil warna
ekstrak hijau pekat dan kental. Rotary evaporator mempermudah proses penguapan
pelarut dengan memperkecil tekanan dengan vakum sehingga saat temperatur berada
di bawah titik didih pelarut maka pelarut dapat menguap.
Rotary evaporator lebih sering digunakan karena mampu menguapkan
pelarut dibawah titik didih sehingga zat yang terkandung di dalam pelarut
tidak rusak oleh suhu tinggi (Robinson, 1995). Ekstrak kasar metanol ini
dilanjutkan pemisahan berdasakan kepolarannya dengan cara fraksinasi, mulai dari
fraksinasi n-heksana sampai fraksinasi kloroform dengan diperoleh 8.12 gram.
Evaporasi dilakukan pada suhu 35-40°C untuk menghindari kerusakan senyawa
metabolit sekunder yang mudah rusak pada suhu tinggi (Robinson, 1995).
Pada tahap awal sebelum kromatografi Vakum cair (KVC) dilakukan uji
fitokimia pada masing- masing fraksi yaitu fraksi metanol dan fraksi kloroform untuk
mengetahui senyawa metabolit sekunder yang terkandung dalam sampel dimana
hasilnya pada fraksi metanol menunjukan posotif adanya senyawa steroid (asam
asetat glasial + H2SO4 pekat) dan flavonoid (serbuk Mg dan HCl) yang menunjukan
warna hijau, hal ini mengindikasikan bahwa sampel mengandung senyawa steroid
dan flavonoid.

Senyawa flavonoid yang berhasil ditemukan dari genus Artocarpus adalah

flavan-3-ol yang merupakan salah satu turunan flavonoid. Berdasarkan literatur
tumbuhan genus Artocarpus yang mengandung senyawa flavan-3-ol yakni katecin
dari kulit akar A. reticulates (Udjiana,1997) dan dari kulit batang A.integra yakni
afzelecin ramnoside.
Keberadaan senyawa flavonoid dalam daun tumbuhan A. odoratissimus B. ini
kemungkinan memiliki kesamaan senyawa dengan tumbuhan satu genus seperti
A.Champeden (cempedak) dalam ekstrak metanol telah ditemukan dua senyawa baru
flavonoid Artoindonesianin A dan Artoindonesianin B. Berdasarkan literatur
tumbuhan yang berada dalam satu family atau satu genus akan ada hubungan
senyawa kimia baik dalam bentuk rangka yang sama, ataupun dalam bentuk
keseluruhan yang sama, atau senyawa yang satu bersamaan namun mempunyai
tingkat oksidasi kimia yang lebih tinggi.
 Oleh karena itu, untuk memastikan bahwa dalam sampel daun Terap
(Artocarpus odoratissimus Blanco) terdapat turunan senyawa flavonoid, maka
dilanjutkan tahap pemisahan dan pemurnian dengan melalui tahap kromatografi
kolom Vakum Cair (KVC) dan kromatografi Kolom flash. Namun sebelum
dilanjutkan ketahap kolom, maka dilakukan uji KLT awal untuk mengetahui
perbandingan eluen yang memberikan pemisahan yang baik, dengan menggunakan
pelarut etil asetat dan n-heksana, dimana pada eluen ini memberikan noda paling
banyak pada eluen n-heksana-etil asetat 3:7. Perbandingan eluen yang memberikan
pemisahan pola noda yang lebih baik digunakan untuk monitoring KLT vial-vial hasil
elusi dalam kolom vakum dan kolom flash. Pemisahan ini didasarkan pada sifat
polaritas senyawa. Senyawa yang memiliki polaritas hampir sama dengan fasa
geraknya akan terelusi lebih dahulu dibandingkan dengan senyawa yang memiliki
sifat polaritas yang berbeda dengan fasa geraknya.

Gambar 1. Kromatogram Hasil KLT awal

Fraksi kloroform sebanyak 8 gram dikromatografi kolom Vakum untuk
memisahkan senyawa flavonoid yang ada di dalam fraksi kloroform menjadi senyawa
yang murni. Metode elusi yang digunakan adalah metode Step Gradient Polarity
(SGP) dengan cara meningkatkan kepolaran eluen secara bertahap dari nonpolar
sampai ke polar. Metode ini dipilih karena tidak ditemukan perbandingan eluen yang
mampu memisahkan dengan baik senyawa-senyawa yang terdapat dalam fraksi
Kloroform.
 Pada tahap kolom dilakukan perlakuan impregnasi ditujukan untuk memperluas
permukaan silika gel sebagai fasa diam sehingga sampel yang akan dielusi dapat
tersebar dengan homogen. Ukuran partikel silika impregnan harus lebih besar untuk
memudahkan proses elusi.
Pemisahan kolom vakum yang di tampung sebanyak 25 botol, kemudian
dimonitor dengan KLT menggunakan eluen n-heksana : etil asetat (3:7). Penampakan
hasil uji KLT 25 botol di bawah lampu UV λ = 366 nm.

Gambar 2. Hasil kromatogram Fraksi gabungan KVC (Kromatografi Vakum Cair)

Hasil kromatogram diatas fraksi yang mempunyai nilai Rf yang sama
dikelompokkan menjadi satu fraksi, sehingga dihasilkan 3 fraksi gabungan yaitu
fraksi A (1-18), B (19-21) dan C (22-25). Masing-masing fraksi gabungan dipekatkan
dengan rotary evaporator kemudian di monitoring dengan KLT dengan dibawah
eluen n-Heksana : etil asetat (3:7). seperti yang disajikan:

Gambar 3. Hasil uji KLT fraksi gabungan

 Berdasarkan hasil KLT fraksi gabungan yang diperoleh, fraksi B sebanyak 0.42
gr dilanjutkan tahap kromatografi kolom flash karena pada fraksi ini menunjukkan
noda yang paling sedikit, noda yang dihasilkan pada plat KLT preparatif
menghasilkan 2 noda pada saat disinari lampu UV pada panjang gelombang 366 nm
dengan warna noda warna merah. Berdasarkan pustaka bahwa warna merah
menunjukkan adanya senyawa flavonoid.
Kemudian dilakukan tahap kromatografi kolom flash dengan metode elusi
gradient. Hasil kromatografi kolom flash di peroleh 123 vial. Vial-vial tersebut
dimonitoring dengan KLT dengan menggunakan eluen n- heksana dan etil asetat
( 3:7) dan diamati dengan lampu UV λ = 366 nm.
Vial-vial yang mempunyai Rf yang sama digabung dalam satu fraksi. Pemisahan ini
menghasilkan 5 fraksi yaitu B1, B2, B3, B4 dan B5
 Selanjutnya pada tahap kolom flash diperoleh 5 fraksi gabungan, dimana faksi
B1 menghasilkan kristal warna kehijauan setelah pelarutnya teruapkan, namun kristal
ini belum murni karena belum menunjukkan noda tunggal pada saat KLT dengan
beberapa perbandingan eluen. Oleh karena itu dilakukan rekristalisasi untuk
memurnikan kristal yang terbentuk. Proses rekristalisasi menggunakan pelarut
etilasetat dan metanol, karena pada pelarut ini melarutkan jumlah zat yang agak besar
pada suhu tinggi, namun akan melarutkan dengan jumlah sedikit pada suhu rendah
kemudian di diamkan dalam freezer untuk membiarkan zat tersebut mengkristal
kembali atau terjadi endapan agar mudah dipisahkan, hasil rekristalisasi yang
diperoleh berupa serbuk warna putih kekuningan, berdasarkan penelitian Artocarpus
champeden yang berhasil diisolasi yaitu senyawa flavan-ol memiliki karakteristik
yang sama berupa padatan berwarna putih kekuningan.
Oleh karena itu untuk lebih memperkuat dugaan bahwa isolat yang diperoleh
relatif murni maka dilakukan KLT dengan berbagai perbandingan pelarut (eluen),
komposisi eluen yang digunakan untuk uji kemurnian menggunakan KLT yaitu etil
asetat : n-heksana (1:8), n-heksana : etil asetat (1:4), Kloroform (100 %), n-heksana :
etil asetat (1:5), n-heksana : kloroform (1:3), kloroform : etil asetat (1:3), n-Heksana :
etil asetat (6:4), dari semua perbandingan komposisi eluen yang digunakan
menunjukkan satu noda tunggal.
Selanjutnya di uji fitokimia terhadap senyawa hasil isolat dengan serbuk Mg dan HCl
memperlihatkan warna kuning kehijauan. Hal ini mengindikasikan bahwa senyawa
hasil isolasi tersebut adalah senyawa golongan flavonoid

Gambar 5. Hasil uji fitokimia isolat

Karakterisasi Senyawa Flavonoid

Isolat dikarakterisasi menggunakan serapan spectrum UV-tampak dan
spektroskopi infra merah (IR) dengan tujuan untuk mengetahui panjang gelombang
maksimum serta gugus fungsi yang terdapat dalam isolat. Spektrum UV-tampak dan
infra merah yang diperoleh dapat dilihat pada gambar dibawah.
 Hasil spektrum UV menunjukkan dua serapan maksimum pada panjang
gelombang 254,37 nm dan 281,26 nm yang merupakan serapan khas untuk kromofor
flavan atau flavan-3-ol. Oleh karena itu untuk memperkuat dugaan bahwa isolat
tersebut merupakan golangan flavan atau flavan-3-ol, hasil

Karakterisasi spektra dari IR dapat mendukung dari hasil serapan

spektrofotometer UV-Vis.

Sedangkan hasil karakterisasi analisa spektrum FTIR senyawa hasil isolasi

memberikan informasi adanya puncak serapan gugus hidroksil pada bilangan
gelombang 3427 cm-1. Gugus hidroksil ini merupakan regang –OH terikat (dapat
berikatan hidrogen), OH terikat terlihat pada bilangan gelombang 3570-3200 cm-1
yang membentuk pita lebar dengan intensitas yang kuat (John coates,2000). Selain itu
spektrum IR juga menunjukkan gugus alkil pada bilangan gelombang 1633 dan
aromatik (C=C-H aromatik) pada panjang gelombang 2962 , gugus aromatik ini
diperkuat dengan munculnya ikatan rangkap pada bilangan gelombang 3198.
Sedangkan pada serapan 1391 terdapat tarikan C-H2 dan diperkuat dengan
munculnya serapan 703 CH=CH dan pada serapan 1094 adanya gugus ulur C-O-C
(John coates, 2000).
Sedangkan hasil karakterisasi analisa spektrum FTIR senyawa hasil isolasi
memberikan informasi adanya puncak serapan gugus hidroksil pada bilangan
gelombang 3427 cm-1. Gugus hidroksil ini merupakan regang –OH terikat (dapat
berikatan hidrogen), OH terikat terlihat pada bilangan gelombang 3570-3200 cm-1
yang membentuk pita lebar dengan intensitas yang kuat (John coates,2000). Selain itu
spektrum IR juga menunjukkan gugus alkil pada bilangan gelombang 1633 dan
aromatik (C=C-H aromatik) pada panjang gelombang 2962, gugus aromatik ini
diperkuat dengan munculnya ikatan rangkap pada bilangan gelombang 3198.
Sedangkan pada serapan 1391 terdapat tarikan C-H2 dan diperkuat dengan
munculnya serapan 703 CH=CH dan pada serapan 1094 adanya gugus ulur C-O-C
(John coates, 2000).
Jadi berdasarkan hasil karasteristik di atas, dapat diduga bahwa senyawa
flavonoid yang diisolasi merupakan flavonoid golongan flavan-3-ol karena adanya
gugus alkil, gugus hidroksil, gugus aromatik yang diperkuat dengan adanya ikatan
rangkap dan ulur C-O-C yang terikat pada gugus bensena. Seperti pada gambar
dibawah.

Gambar 8. Senyawa Flavonoid

IV.6.2 Uji toksisitas BSLT (Brine Shrimp Lethality Test)

Uji toksisitas terhadap larva udang Artemia salina Leach atau Brine Lethality
Shrimp Test (BSLT) dapat digunakan sebagai uji pendahuluan pada penelitian yang
mengarah pada uji sitotoksik. Korelasi antara uji toksisitas akut ini dengan uji
sitotoksik adalah jika mortalitas terhadap Artemia salina Leach yang ditimbulkan
memiliki harga LC50< 1000 μg/mL. Parameter yang ditunjukkan untuk menunjukkan
adanya aktivitas biologi pada suatu senyawa pada Artemia salina Leach adalah
kematiannya (Ghisalberti, 2008). Telah ditemukan bahwa toksisitas metode BSLT
merupakan prediksi sitotoksisitas dan aktivitas pestisida. Secara khusus, korelasi
positif ditemukan antara toksisitas BSLT dan sitotoksisitas menuju garis 9 KB cell
(karsinoma nasofaring manusia) dan tumor padat lainnya, serta untuk ine sel P388 (in
vivo murine leukemia) (Ghisalberti,2008).
Tingkat toksisitas dari isolat yang diperoleh dapat diketahui dengan dilakukan
uji toksisitas menggunakan Artemia salina (L), dalam pengamatan ini dilakukan
berdasarkan nilai Lethal Concentration 50 % (LC50) yaitu suatu nilai yang
menunjukkan konsentrasi zat toksik yang dapat mengakibatkan kematian organisme
sampai 50%.
Apabila LC50 30 ppm maka ekstrak sangat toksik dan berpotensi mengandung
senyawa bioaktif antikanker. Tapi tidak spesifik anti kanker, dari 24 sampel 14
diantaranya bisa sebagai aktivitas sitotoksik. Meyer (1982) menyebutkan tingkat
toksisias suatu ekstrak :
LC50 ≤ 30 ppm : Sangat toksik
31 ppm ≤ LC50 ≤ 1000: Toksik
LC50 > 1000 ppm : tidak toksik
Berdasarkan hasil analisis diketahui LC50 dari isolat B1 yaitu 80,25 ppm, pada
fraksi kloroform 147.78 ppm, dan ekstrak metanol 110.51 ppm. Hal ini menunjukkan
bahwa konsentrasi zat toksik yang dapat mengakibatkan kematian organisme sampai
50% dan mengindikasikan bahwa isolat B1, fraksi metanol dan kloroform bersifat
toksik dan bisa dikatakan mempunyai potensi senyawa bioaktif.
IV.7 Hasil

Hasil pengujian fitokimia menunjukan bahwa ekstrak etanol positif terhadap

semua golongan senyawa yang diujikan, yaitu saponin, tanin/fenolik, flavonoid,
alkaloid, terpenoid dan kuinon. Sesuai dengan penelitian Fasya et al., (2012) bahwa
ekstrak etanol biji O.basilicum mengandumg saponin, flavonoid, alkaloid, asam
amino, dan minyak atsiri. Pengujian aktivitas antioksidan dengan metode DPPH
dilakukan untuk mengetahui potensi antioksidan pada ekstrak tersebut. Metode
pengujian DPPH berdasarkan pada kemampuan substansi antioksidan tersebut dalam
menetralisir radikal bebas. Radikal bebas yang digunakan adalah 1,1-difenil-2-
pikrilhidrazil (DPPH). Adapun persen rendamen hasil fraksinasi dan aktivitas
antioksidan.
Ekstrak dengan persen rendemen terbesar adalah ekstrak etanol-air sebesar
42.40% karna golongan senyawa yang terkandung dalam biji kemangi kebanyakan
mempunyai kepolaran yang hampir sama dengan pelarut etanol-air sehingga senyawa
tersebut cenderung larut pada etanol-air. Ekstrak yang memiliki aktivitas antioksidan
paling tinggi adalah ekstrak n-butanol dengan nilai IC50 sebesar 41.90 pmm. Secara
spesifik, suatu senyawa dikatakan sebagai antioksidan sangat kuat jika nilai IC 50
bernilai 50-100 pmm, sedangkan jika 100-150 pmm, dan lemah jika IC50 adalah 151-
200 pmm (Mardawati et al.,2008). Nilai IC50 ekstrak n-butanol lebih tinggi dibanding
ekstrak etanol sebelum fraksinasi (IC50 67.08 pmm) hal ini sesuai dengan pernyataan
abbas et al.,(2010) bahwa teknik pemurnian melalui fraksinasi dilakukan untuk
mendapatkan aktivitas yang lebih tinggi. Jika dibandingkan dengan penelitian lain,
ekstrak n-butanol biji O.basilicum yang dapat memiliki nilai IC50 lebih besar dari
ekstrak etanol biji O.basilicum yang memiliki nilai IC50 sebesar 356.21 pmm (Patil et
al,2011), ekstrak etil asetat dan aseton biji O. Sanctum yang memiliki nilai IC50
sebesar 59.27 pmm (Nurcahyanti et al.,2011)
Semakin besar konsentrasi maka terjadi peningkatan persen inhibisi. Hal ini
dirkarnakan intensitas warna larutan DPPH berkurang dari ungu menjadi kuning
seiring bertambahnya konsentrasi yang disebabkan tidak terjadinya reaksi resonansi
molekul DPPH (Pratimasari, 2009). Kontrol positif Ekstrak n-butanol yang memiliki
aktivitas antioksidan paling tinggi selanjutnya dipisahkan dengan menggunakan
metode KLT. Metode KLT digukan karena merupakan metode pemisahan awal untuk
menentukan fase gerak yang akan digunakan untuk kromatografi kolom. Hasil
analisa kromatografi lapis tipis ekstrak butanol bili kemangi.
Profil KLT menggunakan fase gerak n-heksan:etil asetat (1:9) yang kemudian
plat KLT disemprotkan dengan pereaksi FeCL3 1% yang bertujuan selain untuk
memperjelas noda yang terbentuk pada plat KLT, juga untuk mengetahui adanya
gugus fenol senyawa fenolik pada noda (Harbone, 1996) dengan membentuk warna
hijau, merah bata, ungu atau hitam kuat, tergantung pada struktur fenoliknya
(Achmadi, 1990). Hasil yang didapat empat noda berwarna hijau lembayung dengan
RF masimg-masing adalah 0.18; 0.34; 0.75 dan 0.85 dan satu noda dengan RF 0.67
berwarna merah lembayung.
Kemudian sebanyak 200 mg ekstrak n-butanol difraksinasi menggunakan
kolom kromatografi dengan fase diam silika gel 60 0.2-0.5 mm Merk dan
menggunakan fasa gerak campuran n-heksan : etil asetat (1:9). Dari hasil fraksi diperoleh
16 macam fraksi yang masing-masing ditampung sebanyak 2 ml dan diidentifikasi dengan
menggunakan KLT.
NO botol Berat
Fraksi Vial (mg) % Rendemem
F1 1-3 130.50 65.25%
F2 4-6 29.40 14.70%
F3 7-9 12-47 6.24%
F4 10-11 5-55 2.78%
F5 12-16 7-30 3.65%

Fraksi yang menunjukan pola noda dengan warna dan nilai RF yang sama
digabungkan, sehingga diperoleh 5 fraksi yang sama digabungkan dengan masing-
masing berat fraksi gabungan. Pada lempeng KLT terdapat noda dominan dengan RF
yang sama menunjukan aktif terhadap antioksidan setelah disemprotkan DPPH pada
F4 dengan RF 0,67. Uji autografi menggunakan pereaksi DPPH bertujuan untuk
mengetahui adanya senyawa yang bersifat aktif antioksidan yang ditunjukan dengan
perubahan warna ungu menjadi kuning (Sukandar et al.,2012)

Fraksi F4 memiliki aktivitas antioksidan dengan nilai IC50 sebesar 39.70 ppm
dan total fenolik 0.003 mg/g. Nilai IC 50 isolat F4 lebih kecil dibandingkan ekstrak n-
butanol (IC50 41.90 pmm) dan ekstrak etanol (IC 50 67.08 ppm) yang menunjukan
bahwa aktivitas antioksidan isolat F4 mengalami peningkat setelah dilakukan
fraksinasi. Abbas et al.(2012) menyatakan bahwa senyawa murni memiliki aktivitas
antioksidan yang lebih tinggi dibandingkan ekstrak kasarnya. Didukung pula oleh
penelitian Rachmawati dan Ciptati (2011) yang melaporkan bahwa aktivitas
antioksidan isolat hasil pemurnian ekstrak etil asetat daun sirih merah memiliki nilai
IC50 sebesar 50,91 ppm lebih tinggi dibandingkan ekstrak etil asetat (IC 50 127,74
ppm). Tetapi terjadi penurunan total fenolik dari ekstrak n-butanol 0,24 mg/g menjadi
0,003 mg/g pada fraksi F4. Hal ini mengindikasikan bahwa tingginya aktivitas
antioksidan pada fraksi F4 dipengaruhi oleh senyawa golongan terpenoid (Bando,
dkk, 2004).
Hasil identifikasi menggunakan GCMS menghasilkan beberapa puncak
kromatogram yang menunjukkan bahwa fraksi F4 belum murni. Berdasarkan data
pada Wiley7 Library GCMS Merck Shimadzu QP2010 terdapat sembilan senyawa
dalam fraksi F4. Diantara senyawa-senyawa tersebut diduga senyawa yang bersifat
antioksidan pada fraksi F4 adalah senyawa skualena yang memiliki kemiripan 80%
dengan waktu retensi 26.04 menit dan luas puncak 12.34 %. Senyawa skualena
memiliki massa molekul relatif (m/z) 410 dengan rumus molekul C3OH50. Hal ini
didukung oleh Conforti et al.(2005) yang melaporkan uji antioksidan dari skualena
dengan metode TBA memiliki nilai IC50 sebesar 23 ppm. Sedangkan skualena juga
telah dilaporkan memiliki sifat antioksidan sebagai scavenger oxygen yang sangat
efektif. Fungsi skualena sebagai pemadam oksigen singlet dapat mencegah
peroksidasi lipid pada permukaan kulit manusia (Saint-Leger et al.,1986). Aktivitas
antioksidan skualena ini dipengaruhi oleh strukturnya yang mirip dengan β-karoten
yang juga dikenal sebagai pemadam oksigen singlet yang bekerja samadengan
vitamin E yang bertindak sebagai agen perlindungan kulit (Bando et al., 2004).
Hasil spektrum massa fraksi F4 dengan massa molekul relatif (m/z) 410
menunjukkan adanya beberapa puncak hasil fragmentasi senyawa. Adapun perkiraan
pola fragmentasi dari senyawa yang diperkirakan memiliki kemiripan dengan pola
fragmentasi skualena tersebut. Senyawa skualena pada m/z 410 (M+)
kehilangan ion propil (M+-C3H7) sehingga membentuk puncak ion m/z 367. Fragmen
ion pada m/z 327 sesuai dengan hilangnya ion C6H11 dengan masa 83 (Oyugi et al.,
2011). Selanjutnya kemungkinan terjadi pemutusan berturut-turut M+-C11H20 dan
M+-C7H10 dari puncak ion m/z 327 hingga menjadi membentuk m/z 175 dan m/z 81.
Fragmen ion m/z 367 diusulkan kehilangan masa 298 membentuk puncak ion m/z 69
sebagai baseion.
Senyawa lain yang diduga mendukungaktivitas antioksidan pada fraksi F4
adalah 2,4-di-tert-butil-fenol. Senyawa ini pula yangmungkin memberikan kontribusi
padakandungan total fenolik dari isolat F4. Senyawa 2,4-di-tert-butil fenol merupakan
senyawa fenol yang umumnya adalah senyawaantioksidan (Pratt, 1992). Selain itu,
Nurestri et al. (2010) melaporkan bahwa hasil isolasi fraksi etil asetat Pesreskia bleo
yang mengandung senyawa 2,4-di-tert-butil-fenol memiliki aktivitas antioksidan
terkait dengan strukturnya yang mirip dengan BHT (Butil Hidroksi Toluen), yaitu
suatu antioksidansintetik. Nurestri et al. (2009) juga menyebutkan bahwa senyawa
2,4-di-tert-butilfenol hasil isolasi fraksi etil asetat daun Pereskia grandifolia memiliki
aktivitas terhadap 6 jenis sel kanker, yaitu sel kanker epidermoid nasofaring, serviks,
kolon,payudara, paru-paru dan fibroblast manusia.
Berdasarkan analisa GCMS, 2,4-di-tertbutil-fenol memiliki kemiripan 90%
denganwaktu retensi 8.15 menit dan luas puncak 7.76%. Senyawa ini bermasa
molekul relatif (m/z) 206 dengan rumus molekul C14H22O. Perkiraan pola fragmentasi
dari senyawa yang diperkirakanmemiliki kemiripan dengan pola fragmentasi 2,4-di-
tert-butil-fenol Pola fragmen ion senyawa 2,4-di-tert-butil-fenol menunjukkan adanya
base ion pada m/z 191 dan m/z 57. Pada puncak ion m/z 206 (M+) terjadi
pelepasangugus metil (M+-CH3) dan menghasilkan C13H19O+ yang akan mengalami
resonansi pada senyawa aromatiknya hingga pada keadaan stabil (Pratt, 1992).
Selanjutnya, akan mengalami pemutusan M+C3H7 dan M+-C6H3O- hingga
menghasilkan base ion m/z 57.

Hasil analisa UV-Vis fraksi F4) menunjukkan adanya puncak serapan pada
λmaks 281.04; 328.86; dan 383.56 nm. Puncak serapan pada λmaks 281.04;328.86
dan 383.56 nm disebabkan adanya transisi elektron  - * yang disebabkan kromofor
tak jenuh C=C terkonjugasi poliena atau polisiklik aromati(Supratman, 2010).
Selanjutnya berdasarkan analisis FTIR (gambar 10) diperoleh data adanya vibrasi
pada bilangan gelombang (υ)3388.93; 2945.90; 2834.73;2522.83; 2227.10;2043.60;
1707.32; 1655.04; 1450.20; 116.12;1032.13; dan 698.80 cm-1.
Vibrasi pada bilangan gelombang 3388.93 cm-1 menunjukkan adanya gugus –
OH yang diperkuat vibrasi gugus C-O pada 116.12 dan1032.13 cm-1. Vibrasi pada
bilangan gelombang 2945.93 dan 2834.73 cm-1 masingmasing disebabkan vibrasi
ulur gugus =CH dan –CH alifatik yang diperkuat vibrasi tekuk–CH alifatik pada
1450.20 dan 698.80 cm-1 .Vibrasi pada 2522.83; 2227.10; dan 2043.60cm-1
menunjukkan adanya benzenetersubstitusi dan vibrasi pada 1707.32 dan 1655.04 cm-
1 disebabkan gugus C=O ester.

Hasil analisa UV-Vis dan FTIR sangat sesuai dengan senyawa 2 metoksi
etilftalatyang diduga bersifat antioksidan. Senyawa tersebut termasuk kedalam jenis
senyawa fenolik turunan asam organik polifungsional yang merupakan senyawa aktif
antioksidan.
Menurut Ardiansyah (2007), senyawa antioksidan alami pada tumbuhan
umumnya adalah senyawa fenolik atau polifenolik dapat berupa golongan flavonoid,
turunan asam sinamat, kumarin, tokoferol dan asam-asam organik polifungsional. Seo
et al. (2006) melaporkan dua senyawa asam organik dari ganggang coklat
Saragassum thunbergii, yaitu asam 9-(3,4 dihidro-2,8-dimetil-6 hidroksi-2H-1-
benzopiran-2-il)-6-metil-2-(4-metil-3-pentenil)-(2E,6E) nonadienoat dan asam 1D-
(2,3-dihidro-5-hidroksi-7-metil-1benzofuran2-il)-10 hidroksi-6-metil-2-(4-metil-3-
pentenil) (2E,6E) undeka dienoat memiliki kemampuan dalam meredam radikal
bebas.
 BAB V
KESIMPULAN

V.1 Kesimpulan

Isolasi adalah proses pengambilan atau pemisahan senyawa bahan alam dengan
menggunakan pelarut yang sesuai. Rekristalisai memiliki sejarah yang panjang
seperti distilasi. Merupakan estimasi atau penentuan konsentrasi atau potensi
fisik, kimia atau zat biologi (agent) dengan cara mengukur dan membandingkan
besarnya respon dari tes dengan standar atas sistem biologis yang sesuai di
bawah standar set kondisi. Merupakan estimasi atau penentuan konsentrasi
atau potensi fisik, kimia atau zat biologi (agent) dengan cara mengukur dan
membandingkan besarnya respon dari tes dengan standar atas sistem biologis
yang sesuai di bawah standar set kondisi.
Hasil isolasi senyawa metabolit sekunder dari tanaman daun meranti sabut
(Shorea ovalis [Kort.]) yaitu senyawa phytosterol, dan berdasarkan hasil karekterisasi
menggunakan analisa spektrofotometri IR, 1H-NMR, 13C-NMR, HSQC dan HMBC
senyawa phytosterol memiliki 29 atom karbon 48 proton dan 1 atom O.Ekstrak etil
asetat daun meranti sabut (Shorea ovalis (Kort.) dengan uji BSLT tergolong sangat
toksik dengan persen kematian hewan uji larva Artemia salina sebesar 56,6 % pada
konsentrai 100, 10, dan 1 ppm, dengan nilai LC50 = 40.45 ppm.
Hasil isolasi fraksi etil asetat daun Shorea ovalis (Kort) diperoleh senyawa
murni IA sebanyak 17.8 mg berupa kristal jarum berwarna putih, mudah larut dalam
etil asetat, tidak larut dalam n-heksan, agak sukar larut dalam metanol, memiliki titik
leleh 135-137˚C, memberikan perubahan warna merah muda dengan pereaksi
Lieberman-Bourchard, merupakan senyawa golongan fitosterol, dan hasil analisa
spektrofotometri IR, 1H-NMR, 13C-NMR, HSQC dan HMBC telah diperoleh data
yang menyatakan senyawa IA dari ekstrak Etil Asetat meranti Sabut Shorea Ovalis
(korth) adalah senyawa phytosterol yang memiliki 29 atom karbon 48 proton dan 1
atom O.
 Ekstrak etil asetat daun meranti sabut (Shorea ovalis (Kort.) dengan uji BSLT
pada konsentrai 100, 10, dan 1 ppm diperoleh nilai LC 50 = 40.45 ppm dengan persen
kematian hewan uji larva Artemia salina sebesar 56,6 % dan tergolong sangat toksik.
V.2 Kesimpulan

1. Karakterisasi senyawa adalah usaha mengenali sifat kimia dan fisika dari suatu
senyawa baru untuk menyediakan informasi penting yang berguna dalam
prediksi parameter farmakokinetik dan efek biologis
2. Bioassay adalah prosedur untuk menentukan konsentrasi, kemurnian, dan/atau
aktivitas biologis (misalnya: vitamin, hormon, faktor pertumbuhan tanaman,
antibiotik, enzim) dengan mengukur efeknya pada organisme, jaringan, sel,
enzim atau reseptor persiapan dibandingkan dengan persiapan standar
3. Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan dapat disimpulkan beberapa hal,
yaitu dari uji fitokimia diketahui bahwa daun andong mengandung senyawa
metabolit sekunder, yaitu flavanoid, fenolik, alkaloid, terpenoid, steroid, dan
kumarin. Ekstrak etil asetat dan ekstrak metanol dari daun andong memiliki
potensi sebagai antioksidan dengan ekstrak etil asetat sebagai ekstrak paling
aktif dengan nilai IC50 86,738 mg/L. Senyawa hasil isolasi dari ekstrak etil
asetat daun andong merupakan senyawa golongan terpenoid dengan adanya
ikatan rangkap yang tidak berkonjugasi serta memiliki gugus fungsi C=C
alkena, C=O, CH streching dan CH3. Senyawa hasil isolasi menunjukan sifat
antioksidan yang sangat lemah dengan IC50 434,86 mg/L.

V.3 Kesimpulan

1. Isolasi adalah suatu usaha bagaimana cara memisahkan senyawa yang

bercampur sehingga kita dapat menghasilkan senyawa tunggal yang murni.
2. karakterisasi senyawa dapat dilakukan dengan menggunakan spektrofotometri
yaitu spektroforometer UV-Vis, FT-IR, NMR dan GC-MS
3. Bioassay adalah sebuah metode yang dirancang untuk menganalisis suatu
senyawa oleh dosis yang sesuai terhadap sistem biologi seperti binatang,
jaringan mikroba dll. Metode bioassay terdiri dari pengujian antioksidan,
pengujian antimikroba dan pengujian toksisitas.
4. Berdasarkan hasil penelitian yang diperoleh dapat disimpulkan bahwa dalam
ekstrak kloroform batang tumbuhan tumbuhan bakau merah (Rhizophora
 stylosa. Griff) ditemukan senyawa flavonoid golongan katekin yang
mempunyai gugus hidroksil pada C-3, C-7 dan C-4’ serta memiliki gugus O-
Glikosida. Uji aktivitas biolarvasida pada isolat 5 memiliki nilai LC50 sebesar
104,376 mg/L; 84,7241 mg/L; dan 58,6507 mg/L untuk 24, 48, dan 72 jam
pemaparan.
V.4 Kesimpulan

Hasil penelitian menunjukkan Identifikasi isolat alkaloid menggunakan

spektrometri UV-Vis menunjukkan alkaloid golongan indol, dengan panjang
gelombang 220 nm dan 270 nm. Analisis menggunakan spektrometri FTIR
menunjukan isolat alkaloid memiliki gugus fungsi N-H, O-H, CH3, CH2, C=C
aromatik, C-N, dan C=O, dan analisis dengan LC-MS isolat alkaloid memiliki berat
molekul 291,45 g/mol. Hasil uji sitotoksik ekstrak alkaloid menunjukkan LC 50
sebesar 21,273 ppm, sehingga dapat disimpulkan bahwa ekstrak alkaloid bersifat
sangat sitotoksik.
V.5 Kesimpulan

Senyawa bioaktif ekstrak n-heksana kulit batang kayu bitti (Vitex cofassus)
diperoleh berupa kristal putih berbentuk jarum seberat 0,4745 gram yang diduga
merupakan senyawa golongan steroid. Nilai LC50 yang diperoleh pada ekstrak n-
heksana sebesar 74,079 µg/mL, pada fraksi sebesar 118,850 µg/mL dan kristal murni
sebesar 88,201 µg/mL, sehingga dapat disimpulkan bahwa kulit batang kayu bitti
(Vitex cofassus) bersifat toksik.
V.6 Kesimpulan

Karakterisasi senyawa Flavonoid yang terdapat dalam fraksi kloroform daun

tumbuhan Terap (A. odoratissimus) dengan spektrofotometer UV dan
spektrofotometer IR yang diisolasi merupakan flavonoid golongan flavan-3-ol. Hasil
uji toksisitas pada larva udang (Brine Shrimp Lethality Test) dari Ekstrak Metanol,
Fraksi Kloroform, dan Isolat diperoleh nilai LC 50 masing-masing sampel yaitu
110.5176 ppm, 147.7895 ppm, dan 80.2568 ppm. Maka dapat disimpulkan bahwa
pada ekstrak metanol, Fraksi Kloroform dan Isolat bersifat toksik.
V.7 Kesimpulan

1. Aktivitas antioksidan hasil fraksinasi kolom ekstrak etanol biji kemangi

memiliki nilai IC50 sebesar 39.70 ppm lebih tinggi dari ekstrak n-butanol (IC50
41.90 ppm) dan ekstrak etanol (IC50 67.08 ppm).

2. Berdasarkan hasil analisis GCMS isolat F4 didug mengandung senyawa

aktifantioksidan yang merupakan golongan terpenoid dan fenolik, yaitu
skualena dan 2,4 –di tert-butil-fenol.

DAFTAR PUSTAKA
Achmad, S. A. 1986. Kimia Organik Bahan Alam.Jakarta: Karunika.
Achmad, Syamsul Arifin., 2004, Tumbuh-Tumbuhan Obat Indonesia, jilid I, ITB
Bandung.
Agilent Technologies. 2001. Agilent LC-MS Primer. U.S.A 5988- 2045EN.
Agoes, Goeswin. 2009. Seri Farmasi Industri-2: Teknologi Bahan Alam (Edisi
Revisidan Perluasan). Bandung: Penerbit ITB. Hal: 18-20, 31.
Agoes.G.2007. Teknologi Bahan Alam, ITB Press Bandung.
Aliefman, H dan A. Wahab Jufri. 2011. Aktifitas Anti Malaria dan Analisis Metabolit
Sekunder Kayu dan Kulit Batang Artocarpus odoratissimus
blanco.FakultasKeguruandanIlmuPendidikanJurusan FMIPA: Universitas
Mataram.
Alimin, dkk., 2007. Kimia Analitik. Makassar: Alauddin Press.
Anonim, 2000. Standarisasi Ekstrak. Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan
Makanan. Departemen Kesehatan Republik Indonesia. Jakarta
Anonim. (2001). British Pharmacopoeia. Published on The Recommendation of The
Medicines Commission. The Stationery Office, London.
Anonim. 2015. Penuntun dan Buku Kerja Fitokimia II. Universitas Muslim
Indonesia; Makassar.
Arisman. 2009. Keracunan Makanan. EGC. Jakarta.
Article in Journal: Ahmed, M. F., et al.,2012, Phytochemical Studies and Antioxidant
Activity of Melia azedarach Linn Leaves By DPPH Scavenging Assay. Journal
of Pharmaceutical Applications, 3(1), 271-276
Article in Journal:Azam, M. M., et al. (2013). Pharmacological Potentials of Melia
azedarach L. -A review. American Journal of BioScience, 1, 44- 49
Article in Journal:Mishra, G. e. a. (2013). Melia azedarach: A Review. Medicinal
Chemistry & Analysis, 3(2), 53-56.
Article in Journal:Sharma, D. a. Y. P. (2013). Preliminary and Pharmacological
Profile of Melia azedarach L.: An Overview. Journal of Applied Pharmaceutical
Science, 3(12), 133-138.Company. German. 18-19.
Asih. A. 2009. Isolasi dan Identifikasi Senyawa Isoflavon Dari Kacang Kedelai
(Glycine max). Bukit Jimbaran: Jurusan Kimia FMIPA UniversitasUdayana.
Asriani Ilyas, Iin Novianty, Irmayanti. 2015. Senyawa Golongan Steroid dari Ekstrak
n-Heksana Kulit Batang Kayu Bitti (Vitex cofassus) dan Uji Toksisitas Terhadap
Artemia salina Leach. Fakultas Sains dan Teknologi. UIN Alauddin. Makassar.
Atikah, N. 2013. Uji Aktivitas Antimikroba Ekstrak Herba Kemangi (Ocimum
americanum L.) terhadap Staphylococcus aureus dan Candida ablicans.
Jakarta: UIN Syarif Hidayatullah. Skripsi.
Baseer M. and Jain K. 2016. Review of Botany, Phytochemistry, Pharmacology,
Contemporary applications and Toxicology of Ocimum sanctum. Int. J.
Pharm. Life Sci., 7(2):4918-4929.
Betina. 1972, Analytical Microbiology, Vol.II, Academic Press, London, New York.
Cahyadi, R. 2009. Uji toksisitas akut ekstrak etanol buah pare (Momordica charantia
L.) terhadap larva Artemia salina Leach dengan metode BSLT.
Cazes, J. 2004. Encyclopedia Of Chromatography. New York: Marcel Dekker. Inc.
Cordell and Geoffrey A., 2006, Introduction to Alkaloid, John Willey and Sons,
Toronto.
Crews, P., Rodriguez, J. and Jaspars,M. 1998. Organic Structure Analysis. University
of California, Santa Cruz.
Cronquist, A., 1981. An Integrated System of Classification of Flowering Plants, Columbia,
University Press, New York, 316-318.
Cushnie, T.P.T., Lamb, A.J., 2005. Antimicrobial activity of flavonoids. International
Journal of Antimicrobial Agents, 26(5), pp.343–356.
Dahlan, M.S. 2012. Statistik Untuk Kedokteran dan Kesehatan. Ed.5. Jakarta:
Indonesia.
Dalimartha, Setiawan. 2003. Atlas Tumbuhan Obat Jilid 3. Jakarta: Puspa Swara
Dalimartha., 2004, Atlas Tumbuhan Obat Indonesia, Trobus Agriwidya : Bogor.

David, G. W.2005. Farmasi, Edisi kedua, EGC, Jakarta

Day, R.A dan Underwood, A.L.2001. Analisis Kimia Kuantitatif. Jakarta : Erlangga.
Dede, sukandar, 2000. Flavonoid terpenilasi darikayu batang tumbuhan
artocarpusch ampedens preng. Tesis tidak diterbitkan. Bandung. ITB
Departemen Kesehatan Republik Indonesia. 1985. Cara Pembuatan Simplisia.
Jakarta: Ditjen POM. Hal: 1-21.
Departemen Kesehatan Republik Indonesia. 1995. Farmakope Indonesia. Edisi IV.
Jakarta: Ditjen POM.
Departemen Kesehatan Republik Indonesia. 2000. Acuan Sediaan Herbal.
Jakarta:Ditjen POM.
Departemen Kesehatan Republik Indonesia. 2008. Pengelolaan Pasca Panen
Tanaman Obat. Jakarta: Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Tanaman
Obat dan Obat Tradisional. Hal: 36.
Departemen Kesehatan RI. 1985. Pembuatan Simplisia. Jakarta: Direktorat
Pengawasan Obat dan Makanan Direktorat Pengawasan Obat Tradisional. Hal 4-
10.
Djide, M. N., Sartini dan Syahruddin, K. 2003. Analisis Mikrobiologi Farmasi,
Djide, M. N., Sartini dan Syahruddin, K.2005., Mikrobiologi Farmasi Terapan,
Djide, M. N., Sartini dan Syahruddin, K.2006, Analisis Mikrobiologi Farmasi ,
Donatus, I.A. 2001. Toksikologi Dasar. 124-159, 200-209. Yogyakarta : Laboratorium
Farmakologi dan Toksikologi Farmasi UGM.
Dong Li Li; Xiao-Ming Li; Bin-Gui Wang. 2007.Flavanol Derivatives from
Rhizophora stylosa and their DPPH Radical Scavenging Activity. Molekul.
ISSN 1420- 3049.
Drozd, J.. 1985. Chemical Derivatization in Gas Chromatography, Journal of
Chromatography Library, 19
Drs. Priyanto, Apt, M. Biomed. 2009. Toksikologi: mekanisme, terapi antidotum, dan
penelitian risiko Lembaga Studi dan Konsultasi Farmakologi Indonesia
(LESKONFI). Jakarta
Etizen Yazid, Kimia Fisika Untuk paramedic, h 1994
Ewing, Galen Wood. 1985. Instrumental of Chemical Analysis Fifth edition.
McGraw-Hill. Singapore.
Farnsworth, N. R., 1966, Biological and Phytochemical Screening of Plants,J. Pharm
Sci. 55, 225-276.
Fessenden R.J dan J.S Fessenden., 2003, Dasar-dasar kimia organik. Jakarta,
Erlangga
Fessenden, R.J. dan Fessenden J.S., 1997, Dasar-Dasar Kimia Organik, Binapura
Aksara : Jakarta.
Fessenden, R.J., dan J. S.Fessenden. 1986. Kimia Organik. Alih Bahasa
HadyanaPujaatmaka. Erlangga. Jakarta.
Firdaus, Teknik Dalam Laboratorium Kimia Makassar ; UNHAS, 2010, h 14
Fowlis, Ian A.,1998. Gas Chromatography Analytical Chemistry by Open Learning.
John Wiley & Sons Ltd: Chichester.
Fowlis, Ian A.,1998. Gas Chromatography Analytical Chemistry by Open Learning.
John Wiley & Sons Ltd: Chichester.
Fried, Bernard & Hherma Joseph. 1999. Thin Layer Chromatography 4 edition.
Revised and Expanded: New York
Gandjar, I.G., dan Rohman, A. 2009. Kimia Farmasi Analisis. Yogyakarta: Pustaka
Pelajar. Hal: 220-255.
Gandjar, Ibnu Gholib dan Abdul Rohman., 2007,Kimia Farmasi Analisis, pustaka
pelajar, yogyakarta
Ganiswarna, S.G. dkk. (1995). Farmakologi dan Terapi, Edisi IV. Gaya Baru, Jakarta.
Ghisalberti, E.L., 1993.Detection and Isolation of Bioactive Natural Products. Jordan
Journal of Biological Sciences 4(1) : 51 – 54
Gholib, Ibnu dan Rohman, Abdul. 2008. Kimia Farmasi Analisis. Pustaka Pelajar:
Yogyakarta.
Gholib, Ibnu.2007. Kimia Farmasi Analisis. Yogyakarta : Pustaka Pelajar.
Gibbon, J. 2006. Employee Engagement A Review of Current Research and Its
Implications. USA: The Conference Board.
Gritter J.R, dkk., 1991., “Pengantar Kromatografi”., Penerbit ITB, Bandung.
Gunawan, D & S. Mulyani. 2004. Ilmu Obat Alam (Farmakognosi) Jilid I. Penebar
Swadaya,Jakarta.
Gunawan, S. G.2007., Farmakologi dan Terapi, Edisi 5, Bagian Farmakologi
FakultasKedokteran, Universitas Indonesia, Jakarta
Gupta M.P., Monge A., Karitas G., et al. 1996. Screening of Panamanian Medicinal
Plants for Brine Shrimp Toxicity, Crown GallTumor Inhibition,
Cytotoxicity and DNA Interaction. International J. PharmacolVol 34: 123 –
127
Gupta M.P., Monge A., Karitas G., et al. 1996. Screening of Panamanian Medicinal
Plants for Brine Shrimp Toxicity, Crown Gall Tumor Inhibition, Cytotoxicity
and DNA Interaction. International J. PharmacolVol 34: 123 – 127
Hakim, E.H., 2002, Oligostilbenoid dari tumbuhan Dipterocarpaceae. Buletin of the
Indonesian Socienty of Natural Product Chemistry.2. 1-19.
Hanapi, 1995. Isolasi beberapa senyawa metabolit sekunder dari kayu batangar
tocarpusch ampeden. Jurnal penelitian. Bandung. Lembaga penelitian ITB
Hanif, Z. 2012. Uji Toksisitas Ekstrak Kasar Organospesifik Anchanshanter dengan
Metode Brine Shrimp Letality Test (BSLT)
Hanifah, Salma., 2014, Skripsi : Isolasi dan Elusidasi Struktur Senyawa Metabolit
Sekunder dari Ekstrak Etil Asetat Daun Angiopteris palmiformis, Fakultas
Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Program Studi Farmasi : Jakarta.
Harbone, J.B. (1987) Metode Fitokimia:Cara Modern Memganalisis Tumbuhan.
Terjemahan K. Padmawinata Edisi II. Bandung: Penerbit ITB
Harborne, J.B. 1996. Metode Fitokimia: Penuntun Cara Modern Menganalisa
Tumbuhan. Terbitan Kedua. ITB. Bandung.
Hargono, Djoko., Sirait, Midian, Farouq. (1985). Cara Pembuatan Simplisia.Jakarta :
Departemen Kesehatan RI
Harmita. 2007. Buku Elusidasi Struktur. Depok: Departemen Farmasi Universitas
Indonesia.
Harmita., 2015. Analisis Fitokimia Potensiometri dan Spektroskopi. Buku
Kedokteran EGC : Jakarta
Hayani, E., 2007. “Pemisahan Komponen Rimpang Temu Kunci Secara Kromatografi
Kolom”.Buletin Teknik Pertanian Vol. 12 No. 1.
Hendayana, Sumar. Kimia Pemisahan. Bandung: PT. Remaja Rosdakarya, 2006.
Heyne, 1987. Tumbuhan Berguna Indonesia. Badan Litbang Kehutanan. Jakarta
Hites. Ronald. Gas Chromatography Mass Spectrometry. School of Public and
Enviromental Affairs and Departement of Chemstry. Indiana Universitas
Hodgson E, Levi P E, (2000). A Textbook of Modern Toxicology. New York:
McGraw-Hill Companies, Inc. 207-10.
Hossetmann.K., 1991.Methods in Plant BiochemistryVoume 6.Academic Press. New
York.
Ibnu, G & Rohman. 2007. Kimia Farmasi Analisis. Pustaka Pelajar. Yogyakarta.
Iskandar, A., dan Bantacut, T., 1990, Kristalisasi,Argo Industri. Press,Bandung.
Ismarti., 2011, Isolasi Triterpenoid Dan Uji Antioksidan Dari Fraksi Etil Asetat Kulit
Batang Meranti Merah (Shorea Singkawang(Miq).Miq), Tesis Pascasarjana
Universitas Andalas, Padang.
Istiqomah, Perbandingan Metode Ekstraksi Maserasi dan Sokletasi Terhadap Kadar
Piperin Buah Cabe Jawa (Pipersretrofracti Fructus) Skripsi, Jakarta Stusi
Farmasi Fakultas Kedokteran Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah, 2013 h. 11-
14
Jayasinghe L., Balasooriya BAIS, Padmini W C Hara N, and Fujimoto Y.
2004.Geranyl Chalcone Derivatives with Antifugal and Radical
 Scavenging.Phytochem 65: 1287-1290. [8] Cao, S., Butler, M. S., and Buss,
A. D. 2003. Flavonoids from Artocarpus lanceifolius. Natural Product
Research 17(2):79-81.
John, Coates. 2000.Interpretation of Infrared Spectra, A Practical Approach, in
Encyclopedia of Analytical Chemistry, eds. J. Workman, A.W. Sprinsteen.
New York : Academic Press.
Kartasapoetra, A G., 2000, Hama Tanaman Pangan dan Perkebunan, Bumi Aksara :
Jakarta.
Katno. 2008. Pengelolaan Pasca Panen Tanaman Obat. Cetakan Pertama. Jakarta:
Badan Penelitian dan Pengembangan Kesehatan Depkes RI.
Katzung, B.G. (1997). Farmakologi Dasar dan Klinik, Edisi VI. Alih Bahasa, Staf
Dosen Farmakologi Fakultas Kedokteran UNSRI. EGC, Jakarta.
Khamidinal. 2009. Teknik Laboratorium Kimia. Yogyakarta: Pustaka Pelajar
Khan M R, Omoloso Ad, Kihara M. 2003. Antibacterial activity of Artocarpus
heterophyllus. Fitoterapia 74: 501-505 8. Ko H H, Lu Y H, Yang S Z, Won S J,
and Lin C N. 2005. Cytotoxic Prenyl flavonoids from Artocarpus elasticus. J
Nat Prod 68: 1692-1695.
Khopkar, S.H. 1985. Konsep Dasar Kimia Analitik. Penerbit Universitas Indonesia
(UI-Press) : Indonesia
Khopkar, S.M. 2002. Konsep Dasar Kimia Analitik. UI-Press. Jakarta.
Kusuma, Weda, 2010. Eek ekstrak daun kemangi (Ocimum sanctum L)terhadap
kerusakan hepatosit mencit akibat mintak sawit dengan pemanasan berulang.
Surakarta: fakultaskedokteran Universitas sebelas maret.
L. Brunton, Laurence, SL, John, L. Parker, Keith. 2006. Good&Gilman’s the
Pharmacological Basis of Therapeutics. 11th edition. The MCGraw-Hill
companies
Laboratorium Mikrobiologi dan Bioteknologi Farmasi, Fakultas MIPA,
Lenny, S. 2006. Senyawa Flavanoida, Fenilpropanida dan Alkaloida, Karya Ilmiah
Departemen Kimia Fakultas MIPA Universitas Sumatera Utara
Mangoting, D. et al., 2008. Tanaman Lalap Berkhasiat Obat. Penerbit Penebar
Swadaya, Jakarta.
Mardiyah, U., dkk. 2014. Ekstraksi Uji Aktivitas Antioksidan dan Identifikasi
Golongan Senyawa Aktif Alga Merah Eucheuma spinosum dari Perairan
Banyuwangi. Malang: UIN Maulana Malik Ibrahim Malang
Markham, K.R.,1988.Cara Identifikasi Flavonoid. Penerjemah : Padmawinata, K.
Bandung : Penerbit ITB Negara,
Mc Laughlin, J.E., 1998. A Blind Copaison of Simple Bench-top Bioassays and
Human Tumour Cel Citotoxities as Antitumor Prescreens Natural Product
Chemistry, Elsiver; Amsterdam.
Meyer, B. N.,Ferigni, N.R., Putman, J. E.,Jacobsen, L.B., Nicholas, D. E., and Mc
Laughin, J.L., 1982,Brine shrimps : A Convenients General Bioassay for Active
Plant Constituents, Journal of PlantaMedica. Vol. 45
Muelyono, E. 1996. Karekterilisasi CNSL dan metode ekstraksinya : isolasi kardanol
dan karakteristiknya. Laporan penelitian bogor.
Mulya dan Suharman,1995. Analisis Instrumental. hal 107,111-114 Airlangga
University Press : Surabaya.
Musyarrifah, “ Identifikasii Metabolit Skunder Ekstrak Etil Asetat Biji Alpukat
( Persea Americana Mill). Dan Uji Toksisitas Larva Udang (Artemia salina
Leach) Skripsi Jurusan Kimia, UIN Alauddin Makassar (2013), hal. 22
Nadesul, H. 2006. Sehat Itu Murah. PT Kompas Media Nusantara. Jakarta.
Ngunyen, Nam. 2015. Penting 18000 Kata Medicinal Dictionary Di Indonesia Author
by Nam Nguyen. Diakses Tanggal 5 April 2018.
Nguta J.M., Mbaria J.M., Gakuya D.W.P., Gathumbi K., Kabasa J.D., and Kiama
S.G., 2012. Evaluation of Acute Toxicity of Crute Plant 35 Extracts from
Kenyan Biodi-versity using Brine Schrimp, Artemia salina L. (Artemidae).
Noviany and Sutopo Hadi, 2009. The Isolation of α- Viniferin, a Trimer Stilbene from
Shorea ovalis Blume, Modern Apll.Scie., 3(4).
Nuraini, Ariani Ilyas, Iin Novianty. 2015. Identifikasi dan Karakterisasi Senyawa
Bioaktif Antikanker dari Ekstrak Etanol Kulit Batang Kayu Bitti (Vitex
cofassus). Fakultas Sains dan Teknologi. UIN Alauddin. Makassar.
Nurdyana, Mita. 2012. Aktivitas Antioksidan Zat Ekstraktif Dari Pohon Mindi (Melia
Azedarach Linn.). Institut Pertanian Bogor.
Octaviani, T., Guntarti, A., Susanti.,H. 2014.”Penetapan Kadar ß-karoten pada
Beberapa Jenis Cabe (Genus Capsicum) dengan Metode Spektrofotometri
Tampak”.Pharmaciana. 4 (2): 101-109.
Olowa, Lilybeth. F and Olga M., Nufreza. Brine Shrimp Lethality Assay of
TheEthanolic Extracts of Three Selected Species of Medicinal Plants from
Iligan City, Philippines. International Research Journal of Biological Sciences
Vol 2(11) : 74 – 77

Owen, T. 1996. Fundamental of UV-Visible Spectroscopy. Hewlett-Packard

Pavia, D.L., Lampiran, G.M., and George S. Kris (2001). Spectroscopy : A Guide for
Students of Organic Chemistry Introduction to (Third Edition). Washington :
Thomson Learning
Pavia, Donald L., Gary M. Lampman, George S. Kritz, Randall G. Engel (2006).
Introduction to Organic Laboratory Techniques (4th Ed.). Thomson
Brooks/Cole. pp. 797–817.
Pinalia. 2011. Pnentuan Metode Rekristalisasi Yang Tepat Untuk Meningkatkan
Kemurnia Kristal Amonium Perklorat (AP).Majalah Sains dan Teknologi
Dirgantara Vol. 6 No. 264-70
Pitojo, S., 1996, Kemangi dan Selasih, 5-7, 13-14, 40, 42-43, PT. Trubus Agriwidya,
Semarang
Pratiwi, S.T. (2008). Mikrobiologi Farmasi. Erlangga, Jakarta.
Priyanto, 2009. Toksikologi Mekanisme, Terapi Antidotum, dan Penilaian resiko,
Penerbit Lembaga Studi dan Konsultasi Farmakologi (Leskonfi,) Depok.
Pudjaatmaka, A Hadyana. ( 1994) Buku Ajar Vogel: Kimia Anakisis Kuantitatif
Anorganik Jakarta : Buku Kedokteran EGC
Putri, A. A., dkk. 2015. Uji Aktivitas Antioksidan Senyawa Fenolik Ekstrak Metanol
Kulit Batang Tumbuhan Nyiri Batu (Xylocarpus moluccensis). Surabaya:
Universitas Surabaya.
Ramadhani , Artika. “ Pengaruh Pelaksanaan Pengawasan Menelan Obat (Pmo)
Terhadap Konversi Bta (+) Pada pPsien Tuberkolosis Paru Di Rsdk Tahun
2009/2010”, Karya Tulis Ilmiah. Semarang Kedokteran UnDip. 2012
Raymond G. Reid and Satyajit D. Sarker, 2006.Isolation of natural Product by Low-
Pressure Collum Chromatografi in Sharker SD., Latif,Z and Gray , Al (ED).
Natural Product Isolation Humana Press.Inc. Totowa New jersey
Robinson, T., 1995, Kandungan Organik Tumbuhan Tinggi, Edisi VI, Hal 191-216,
Diterjemahkan oleh Kosasih Padmawinata, ITB, Bandung.
Rohman , A. 2007. Kimia farmasi analisis.pustaka pelajar : Yogyakarta
Rohman, Abdul. 2009. Kromatografi untuk Analisis Obat. Graha Ilmu: Jakarta
Rubiyanto, Dwiarso. 2017. Metode Kromatografi. CV. Budi Utama, Yogyakarta.
Sabrina, T. I., Sudarno, dan Suprapto, H. 2014. Uji Aktivitas Antifungi Perasan Daun
Kemangi (Ocimum sanctum Linn.) Terhadap Aspergillus terreus secara In
Vitro. Jurnal Ilmiah Perikanan dan Kelautan. Vol. 6. No. 2. Hal. 176.
Sarayobudiyono, et all, 2008. Oligostilbenoids from Shorea gibbosa andtheir
cytotoxic properties agains P-388 cells. J. Nat Med. 62. 195-198.
Sarma, D. Sai Koteswar., Babu, A. 2011. Pharmacognostic and phytochemical studies
of Ocimum americanum. Journal of Chemical and Pharmaceutical Research.
Sartika, Y., & Andi Hairil Alimuddin, R.2017. “Karakterisasi Senyawa Klorofil Pada
Daun Langsat (Lansium domesticum Corr)”. Jurnal Kimia Khatulistiwa, 6(1).
Sastrohamdjojo Hardjono. 2002. Kromatografi. Liberty: Yogyakarta.
Sastrohamidjojo, H. 1985. Kromatografi. Edisi I. Cetakan I. Yogyakarta : Liberty.
Sastrohamidjojo, H. 1991. Spektrosfotokopi, edisi kedua. Jogjakarta:
PenerbitLiberty.
Sastrohamidjojo, H. 2001. Dasar-Dasar Spektroskopi. Yogyakarta: Liberty.
Sayuti,K. Yenrina,R. 2015. Antioksidan Alami dan Sintetik. Andalas University Press:
Padang.
Seidel V., 2006.Initial and bulk extrac-tion. In: Sarker SD, Latif Z, & Gray AI,
editors. Natural Products Isola-tion.2nd ed. Totowa (New Jersey).
Silverstein, R. M., Webster. Fx., Kiemle DJ., 2005. Spectrometric Identification of
Organic Compounds 7th Edition, John Willey & Sons. : New York.
Silverstein, R.M., 1991, Penyelidikan Spektrometrik Senyawa Organik, Edisi 4,
diterjemahkan olehHartomo, 249-278, Erlangga, Jakarta.
Skoog, Douglas A., Donald M. West, F. James Holler. 1991. Fundamental of
Analytical Chemistry. Seventh Edition. New York: Saunders College
Publishing.
Skoog, Douglas A., West, Donald M., dan Holler, F.James. 1996. Analytical
Chemistry. Saunders College Publishing : Amerika.

Soebagio, dkk. 2000. Kimia Analitik II. JICA. Malang

Soebagio., 2002, Kimia Analitik, Universitas Negeri Makassar Fakultas MIPA,

Makassar.
Sparkman, O.D., Penton, Z., Fulton, G..2011. Gas Chromatography and Mass
Spectrometry : a practical guide, Elsevier
Stahl, E. 1985.Analisis Obat Secara kromatografi dan Mikroskopi, diterjemahkan
oleh Kosasih Padmawinata dan Iwang Soediro, 3-17, ITB, Bandung.
Stahl, E.1985. Analisis Obat Secara Kromatografi dan Mikroskopis. Terjemahan
kosasih P., Iwang S., Penerbit ITB ;Bandung.
Stahl, Egon(1969) Appartus And General Techniques in TLC. Berlin : Spinger verlag
Stuart, B. 2004. Infrared Spectroscopy: Fundamentals and Applications. John Wiley
and Sons. New York. 2.
Sudarsono, Gunawan, D., Wahyuono, S., Donatus, I. A., dan Purnomo, 2002,
Tumbuhan Obat 2 : Hasil Penelitian, Sifat-sifat dan Penggunaan, 112, PPOT
UGM, Yogyakarta cit. Avivah, S. M., 2012, Inventarisasi Ramuan Obat
Tradisional Yang Digunakan Oleh Dukun Bayi Pada Ibu-Ibu Setelah
Melahirkan Di Kecamatan Gamping, Godean, Minggir, Mlati, Moyudan, dan
Seyegan, Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.
Sudjadi, 1986.” Metode Pemisahan”. Fakultas Farmasi, Universitas Gadjah. Mada,
Yogyakarta.
Sudjadi. 1983. Penentuan Struktur Senyawa Organik. Ghalia Indonesia. Jakarta
Sudjadi., 1994., “Metode Pemisahan”.,Kanisius, Yogyakarta.
Sumar Hendayana. 2010. Kimia Pemisahan. PT Remaja Rosdakarya: Bandung.
Suryanto, E., Lidya., 2017. Isolasi dan Aktivitas Antioksidan Fraksi dari Ekstrak
Tongkol Jagung (Zea mays). Manado: Universitas Sam Ratulangi.
Sutopo Hadi dan Noviany, 2009, The Isolation of Hopeaphenol, a Tetramer Stilbene from
Shorea ovalis Blume, Advances, in Nat. Apll.Scie., 3(1); 107-112.
Syamsu, Hidayat dan Hutapea, J.R., 1991, Inventaris Tanaman Obat Indonesia, 305-
306, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Badan Penelitian dan
Pengembangan Kesehatan , Jakarta.
Syamsuhidayat dan Hutapea, J.R., 1991, Inventaris Tanaman Obat Indonesia, 305-
306, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Badan Penelitian dan
Pengembangan Kesehatan , Jakarata.
Takara, Kensaku; Ayako Kuniyoshi, Koji Wada, Kazuhiko Kinjyo, and Hironori
Iwasaki. 2008. Antioxidative Flavan-3-ol Glycosides from Stems of Rhizophora
stylosa. Biosci. 72, 2191-2194.
Underwood, A.L, 1986, Analisis Kimia Kuantitatif. Erlangga : Jakarta
Verheij EWM, Coronel RE (eds). Plant Resources of South Asia No. 2 Edible Fruits
and Nuts. Bogor: Prosea Foundation.
Wibowo, S.2013 .Artemia. Jakarta: Penebar Swadaya,
Widyaningrum, H. 2011. Kitab Tanaman Obat Nusantara. Medpress, Yogyakarta.
Willard, Robert H., Merrit jr, Lynne L., et al. (1988) Instrumental Methods of
Analysis. California : Wadsworth Publishing Company
Wink, M. (2008). Ecological Roles of Alkaloids. Wink, M. (Eds.)Modern Alkaloids,
Structure, Isolation Synthesis and Biology,Wiley, Jerman: Wiley-VCH Verlag
GmbH & Co. KgaA.
Wulandari, Lestyo. 2011. Kromatografi Lapis Tipis. Penerbit PT. Taman Kampus
Presindo, Jember.
Yazid, E.,2005. Kimia Fisika Untuk Paramedis. Andi Yogyakarta: Yogyakarta.
Yuhana, S.A., Kusdarwati, R., Meles, K., 2013. Daya antibakteri ekstrak daun
kemangi (Ocimum sanctum L.). [Skripsi]. Surabaya. Fakultas Perikanan dan
Kelautan. Universitas Airlangga.