ANTÍGENOS DE BACTERIAS.

TIPOS, PROPIEDADES,
MÉTODOS DE OBTENCIÓN,
USOS.

Lic. Esther Valencia Bazalar

D.A. Microbiología Médica
OBJETIVOS
 Determinar los antígenos bacterianos y tipos
 Describir sus propiedades

 Conocer los métodos de obtención

 Conocer usos y aplicaciones

LAS BACTERIAS
 Procariotas (Cocos,
bacilos y espiroquetas)

 Extracelulares o
intracelulares

 Saprófitas, Patógenas o
Oportunistas

 GRAM (+) y GRAM (-)

 Diferencias
morfológicas,
bioquímicas y
estructurales
ESTRUCTURA
BACTERIANA
 Antígeno F

Antígeno Vi
glucolipidica

Antígeno H Antígeno Antígeno K

Flagelina O Polisacaridos
40 Kda (Exopol)
BACTERIAS GRAM (+) EXTRACELULARES
 Producen enfermedad
principalmente a través de
TOXINAS

 Las EXOTOXINAS que se

liberan al medio producen:
 Citotoxicidad
 Daño a membranas
 Disminución de la síntesis
proteica
 fiebre
BACTERIAS GRAM (-) EXTRACELULARES
 Producen ENDOTOXINAS o
lipopolisacáridos con efectos
deletéreos

 En concentraciones ↓ actúan
sobre macrófagos, PMN,
Neutrófilos, Linfocitos B y
Complemento

 En altas concentraciones son

responsables del shock
endotóxico (hipotensión y
coagulación intravascular
diseminada)
PRODUCCIÓN DE TOXINAS
PRODUCCIÓN DE TOXINAS
BACTERIAS INTRACELULARES
ANTÍGENOS BACTERIANOS
GRAM POSITIVOS GRAM NEGATIVOS

 Peptidoglicanos  Lipopolisacáridos
(LPS) o endotoxinas
 Ácidos lipoteicoicos
 (Lipo)proteínas de
membrana
 Proteínas de
membrana (proteina
A)  Enzimas

 Enzimas y exotoxinas  Cápsula

 Antígeno bacteriano
Pared celular de Gram + Pared celular de Gram –
1. Peptidoglucano 1. Peptidoglucano
2. Acido lipoteicocico 2. Membrana externa
lipopolisacáridos (Ag O)
PARED BACTERIANA CELULAR
PRINCIPALES CLASES DE COMPONENTES QUÍMICOS DE LAS
ESTRUCTURAS DE SUPERFICIE Y LOS COMPARTIMENTOS DE
BACTERIAS GRAM+
PRINCIPALES CLASES DE COMPONENTES QUÍMICOS DE
LAS ESTRUCTURAS DE SUPERFICIE Y LOS
COMPARTIMENTOS DE BACTERIAS GRAM-
Los PAMP bacterianos más conocidos
son:
 Lipopolisacáridos (LPS)
 Peptidoglucano
 Ácidos lipoteicoicos
 Mananos (manosa)
 DNA bacteriano
 RNA de doble cadena
 Glucanos
 Estos PAMP son esenciales para la supervivencia y
patogenicidad de las bacterias.
 Cuando los RRP reconocen un PAMP los componentes de la
inmunidad innata se activan inmediatamente.
Staphylococcus aureus
 Proteínas de  Toxinas
superfície  Hemolisinas
 Proteína A - unión  Exotoxinas (leucocidinas
F y S)
a la región Fc de la Enterotoxinas
IgG.

 Toxina exfoliativa
 Toxina del Shock Tóxico.
 Enzimas
 Coagulasa
 Catalasa
 Hialuronidasa
 Estafiloquinasa
 B-lactamasas
 lipasas.
SUPER ANTIGENO: Staphylococcus aureus
Síndrome de Shock toxico
Streptococcus pneumoniae

La composición antigénica de la
cápsula es variable en diferentes
cepas y permite agrupar a los
S. pneumoniae en más de 90
diferentes serotipos capsulares y
aproximadamente 45 serogrupos.
Streptococcus pyogenes
Neisseria gonorrhoeae
Neisseria meningitidis

No se ha elaborado vacunas
contra el grupo B a base de
polisacáridos por el
mimetismo antigénico de
estos con polisacáridos del
tejido nervioso humano
(NCAM).
Haemophylus influenzae
 Ag capsular b
PRP: Fosfato de
poliribosa-ribitol
 Otros antígenos;
somático
PME
LPS
Salmonella typhi
Flagelo
Ag H
Capsula Ag Vi

Polisacárido
Ag O
Bacterias intracelulares: Mycobacterium y
Listeria
 Sobreviven en el interior de
células durante largo tiempo

 Son INEFICACES los mecanismos

inespecíficos de defensa,
fagocitosis y sistema de
complemento

 Mecanismos de hipersensibilidad
retardada o respuesta citotóxica
son las encargados de combatirlas

 Se produce gran daño al

organismo
Micobacterium tuberculosis: pared
celular
Antigenos de Mycobacterias
 Solubles o citoplasmáticos
 Insolubles; ligados a la pared celular

 Las proteínas son las que confieren las propiedades

antigénicas
a. Naturaleza polisacárido: arabinomanano,
arabinogalactano, glucano
b. Proteínas: derivado proteico purificado
c. Lipídica: glicolípidos fenólicos específicos para M. t
d. Ag 60
Ag 60
4 grupos
 Proteínas de estres térmico (polipéptidos
citoplasmáticos)
 Las lipoproteínas constitutivas de la pared
celular (19 y 38 Kda. Respuesta humoral y
celular)
 Proteínas secretorias

 Constituida por la L- alanina DH y

superoxidismutasa (defensa del bacilo dentro del
macrófago)
RESPUESTA INMUNE CONTRA
BACTERIAS
RESPUESTA RESPUESTA
INESPECÍFICA ESPECIFICA
 Reconocimiento de  Inmunidad humoral
MAMPs por los TLR (producción de
anticuerpos)
 Fagocitosis por macrófagos
y células PMN
 La inmunidad celular
(cooperación de Células
 Activación del T CD4+ y liberación de
complemento (vía alterna) citocinas)

 Liberación de citoquinas  Mecanismos efectores de

por macrófagos y células
endoteliales
la Respuesta inmune
Obtención de Antígenos Totales y Metabólicos

Métodos Físicos:
 Ag somático Ultracentrifugación:
(inactivación x calor)  Flagelos - Flagelina

Métodos Químicos: Cromatografía

 Precipitación con sales  Proteínas, Enzimas,
de amonio (proteínas) Toxinas, etc
Métodos físico-químicos:
 Fenol:Cloroformo:Agu
a + Calor (LPS)
Aislamiento y separación de Ag bacterianos

 Obtención de cultivos:
depende de la bacteria
Enterobacteria: 1mg/ml
Agitación: duplica
B. pertussis: mas
rendimiento
Obtención Ag libre de proteínas del
medio

 Condición: Metabolitos dializables

 Obtención de exotoxinas bacterianas
Obtención Ag bacterianos
 Suspensión de bacterias muertas, libres de medio
de cultivo separadas por centrigugación
 Cultivo 60 ºC 1 hora o tratados con Merthiolate
0.01-0.02%
 Toxina Toxoide (Formol 6 por
mil)
 Aislamiento de flagelo bacterianos y obtención de
flagelina
Primera etapa

Sembrar
4

AN 1.25% 37ºC
Crecimiento log

1 5 Cosechar y suspender
NaCl 0.15 M

6. Centrifugar
Agar 0.3%
3
37 ºC – 24 h 7. Lavar 2 veces H2O d y
centrifugar
Repetir
 AISLAMIENTO DE FLAGELO BACTERIANOS Y
OBTENCIÓN DE FLAGELINA
 Segunda etapa
- Suspender sedimento bacteriano en H2O d (30 a 60 mg/ml)
- Agitar 10 minutos
- Eliminar bacterias sin flagelo: centrifugar 3,300 por 30 minutos
- Sobrenadante: centrifugar 16,000 por 15 a 20 minutos
- Separación de flagelos: 40,000 por 2 a 3 horas
- Sedimento refrigerar

 Tercera etapa: Obtención flagelina

- Suspensión de flagelos acidificiar suspensión 1/20 HCL 1 N a
temperatura ambiente 30 minutos
- Ultracentrifugar: 80,000 por 1 hora
- Separar el sobrenadante y neutralizar NaOH 1 N
- Adicionar 2 vol Sol Sat Sulfato de amonio 16 horas
- Centrifugar 20,000 15 minutos
- Eliminar sobrenadante y dializar sedimento
- Liofilizar flagelina
Obtención exopolisacárido
1. Cultivar en medio líquido y separar por
centrifugación (Exopolisacárido viscoso) 25.000
por 2 a 3 horas
2. Sobrenadante: en acetona enfriada -20 ºC
mesclar con varilla de vidrio (adhiere). Separar
y conservar por desecación al vacío
3. Purificar por desproteinización
Polisacárido neumocócico
 Depende la característica
a. Cultivo dializable
b. Purificación: Trabajar en cámara fría 4 ºC,
cutivos de 12 horas a 37 ºC. Importante la
pureza. Esterilizar fenol 1% 18 horas.
Subcultivo negativo . Centrifugar. Concentrar
por filtración
c. Centrifugar el filtrado 2,500 por varias horas a
0 ºC
d. Purificación final: Sol sat Acetato de sodio pH
6.05, concentración sal 8% y precipitando con
alcohol 95 ªC
PARED CELULAR
 Ag pared se puede utilizar desecadas
 Ag pared libres a partir de bacterias rotas:
- Trituración con abrasivos
- Ultrasonido: sonicador
- Prensa neumática
- Congelación y descongelación
- Desintegrador mecanico
 Separación pared celular:
- Centrifugación diferencial: primero a 2,500 por 15
minutos y luego 8,000 a 12,000 30 minutos
Purificar
- Gradiente de centrifugación: sacarosa 10-40%
LIPOPOLISACÁRIDO
 Bacterias Gram- , cultivo, NaCl 0.15 M,
suspender, centrifugar 5,000 por 15 minutos,
lavar con acetona y secar en capa fina.
Trituración de la masa.
 Suspender en agua a 65ºC y fenol 90%.
Mantener 65ºC 10 a 15 minutos enfriar a 10ºC en
hielo, centrifugar 3,000 rpm 45 minutos.
Se forman tres capas
PURIFICACIÓN EXOTOXINAS Y ENZIMAS
 A partir de filtrados estériles de medio liquido
a. Precipitación con sulfato de amonio
b. Resinas de intercambio iónico
TOXOIDE

 Toxina detoxificada
capaz de inducir la
formación de
anticuerpos
 Perdida de su
toxigenicidad pero
retiene su
inmunogenicidad.
USOS Y APLICACIONES
MPT64 Antigen Detection for Rapid Confirmation
of Mycobacterium tuberculosis Complex
Retroalimentación
 ¿Qué tienen en común todos los antígenos
bacterianos?
 ¿Dónde se encuentran estos antígenos? Pon 3
ejemplos.
 Pueden extraerse u obtenerse los Ag? Ej

 ¿Qué relación hay entre los antígenos que

presenta una bacteria y su virulencia?
 Son importantes para el diagnóstico? Porque?
Bibliografía
 Weir DM 1978. Handbook of experimental immunology. Blackwell
(Oxford, Edinburgh).
 Kronvall G & Williams RC 1969. Differences in anti-protein A among
IgG subgroups. J Immunol; 103(4): 828-833.
 Perdomo R & Montero V 2006. Purification of E. coli 055:B5
lipopolysaccharides by size exclusion chromatography. Biotecnología
Aplicada; 23(2): 124-129.
 Logan SM & Trust TJ 1983. Molecular identification of surface protein
antigens of Campylobacter jejuni. Infect Immun; 42(2): 675–682.
 PDB Structures. Disponible em:
http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do
 García Ângulo Lidia y col. Identificación de Mycobacterium
tuberculosis por inmunocromatografía a partir de cultivos sólidos.
Enferm Infecc Microbiol Clin 2011;29:711-2