Perforin dan granzyme bekerja secara sinergi untuk menengahi

cedera cholangiocyte di atresia bilier eksperimental

Pranavkumar Shivakumar, Reena Mourya, and Jorge A. Bezerra

Division of Pediatric Gastroenterology, Hepatology and Nutrition and the Pediatric Liver Care Center of
Cincinnati Children's Hospital Medical Center, and the Department of Pediatrics of the University of Cincinnati
College of Medicine, Cincinnati, Ohio, USA

Abstract
Latar Belakang dan Tujuan-Biliary atresia mewakili cholangiopathy obstruktif pada bayi berkembang
pesat untuk penyakit hati sirosis dan stadium akhir. sel NK diaktifkan mengekspresikan NKG2D telah
dikaitkan dengan empedu cedera duktus dan obstruksi dengan membentuk kontak dengan cholangiocytes.
Untuk menentukan mekanisme yang digunakan oleh sel sitotoksik, kami menyelidiki peran perforin dan
granzyme pada model tikus neonatal rotavirus (RRV) -diinduksi atresia bilier.

Metode-Kami menggunakan pelengkap tes lisis sel, analisis aliran cytometric, PCR kuantitatif dan in
vivo sistem untuk menentukan mekanisme epitel cedera duktus empedu dan kontrol fenotip jaringan di
atresia bilier eksperimental.

Hasil-RRV terinfeksi hati sel NK dan CD8 T meningkatkan ekspresi perforin dan cholangiocytes terluka
dalam budaya jangka pendek secara perforin-dependent. Namun, hilangnya perforin in vivo tertunda tapi
tidak mencegah penyumbatan saluran empedu. Berdasarkan peningkatan ekspresi granzyme oleh sel
sitotoksik perforin-kekurangan dalam tes cytolytic jangka panjang, kami menemukan bahwa
penghambatan granzyme oleh nafamostat mesilate (FUT-175) diblokir cholangiocyte lisis. Administrasi
FUT-175 untuk perforin-kekurangan tikus setelah infeksi RRV menurun pengembangan penyakit kuning,
diminimalkan cedera epitel, dan meningkatkan kelangsungan hidup jangka panjang. Namun,
penghambatan granzyme sendirian di-tikus liar itu tidak cukup untuk mencegah fenotipe atresia pada
tikus yang baru lahir. Pada bayi dengan atresia bilier, hati granzyme A dan B mRNA, tetapi tidak
Perforin, meningkat pada saat portoenterostomy.
Kesimpulan-Perforin dan granzyme memiliki peran yang saling melengkapi mediasi cedera epitel oleh
sel NK dan CD8 T. Pencegahan atresia bilier eksperimental hanya dapat dicapai dengan menghambat
kedua butiran

PENGANTAR
Atresia bilier merupakan penyakit hati yang progresif dari bayi yang dihasilkan dari obstruksi inflamasi
dan fibrosis dari saluran-saluran empedu ekstrahepatik. Meskipun diagnosis dini dan bedah

© 2013 European Association of the Study of the Liver. Published by Elsevier B.V. All rights reserved.

Kontak informasi: Jorge A. Bezerra, M.D. Division of Gastroenterology, Hepatology and Nutrition Cincinnati Children's Hospital Medical
Center 3333 Burnet Avenue, Cincinnati, OH 45229 Telephone: 513-636-3008; Fax: 513-636-5581; jorge.bezerra@cchmc.org.

Penerbit Sangkalan: This is a PDF file of an unedited manuscript that has been accepted for publication. As a service to our customers
we are providing this early version of the manuscript. The manuscript will undergo copyediting, typesetting, and review of the resulting proof
before it is published in its final citable form. Please note that during the production process errors may be discovered which could affect the
content, and all legal disclaimers that apply to the journal pertain.

Konflik kepentingan:
Para penulis telah menyatakan bahwa tidak ada konflik kepentingan.

intervensi Kasai portoenterostomy dapat mengembalikan kontinuitas aliran empedu dari hati ke usus dua
belas jari, mayoritas pasien meninggal karena stadium akhir empedu sirosis pada anak usia dini. Studi
menggunakan hati dan / atau sisa-sisa empedu dari bayi dengan atresia bilier melaporkan jejak
proinflamasi ditingkatkan dan infiltrasi oleh limfosit CD4 + / CD8 + T, pembunuh alami (NK) dan sel
dendritik [1-8]. Dalam percobaan mekanistik menggunakan model tikus neonatal dari Rhesus rotavirus
(RRV) -diinduksi atresia bilier, gangguan respon imun adaptif dengan hilangnya sel Ifnγ atau CD8 T
berkurang obstruksi saluran empedu dan meningkatkan kolestasis fenotipe [9, 10]. Baru-baru ini, kami
berasal fungsi utama untuk sel NK dalam inisiasi cedera epitel dengan melibatkan dan lyzing
cholangiocytes melalui reseptor NKG2D [11]. Mekanisme efektor yang digunakan oleh sel NK untuk
menargetkan cholangiocytes, bagaimanapun, tetap tidak diketahui.

limfosit imun bawaan sangat penting untuk system pertahanan tubuh dini terhadap infeksi virus dan
mengerahkan efek sitotoksik terhadap sel yang terinfeksi virus terutama oleh granul eksositosis [12].
Proses cytolytic ampuh ini terletak di dalam butiran sitoplasma kaya perforin, granzyme dan molekul
efektor lainnya. Selain itu, mengikat reseptor stimulasi seperti NKG2D pada sel-sel sitotoksik oleh ligan
dari sel target mengaktifkan kaskade kejadian signaling intraseluler yang mengakibatkan sekresi Ifnγ dan
TNF, dan dalam polarisasi dan eksositosis butiran cytolytic [13, 14]. Kepala di antara butiran ini perforin
dan granzyme yang bekerja di konser untuk membersihkan sel yang terinfeksi virus [15]. Berdasarkan
peran sentral signaling sel NK dan CD8 T cedera cholangiocyte dan pada peningkatan ekspresi perforin
dan granzyme di hati pasien dengan atresia bilier [10, 11], kita hipotesis bahwa sistem perforin-granzim
diperlukan untuk cedera epitel dari saluran empedu. Pengujian hipotesis ini menggunakan pelengkap in
vitro dan hewan pendekatan, kami menemukan bahwa hilangnya individu perforin atau penghambatan
granzyme memiliki dampak minimal pada perkembangan cedera duktus empedu setelah RRV. Namun,
simultan hilangnya / penghambatan kedua butiran dicegah cholangiocyte lisis dan saluran empedu
obstruksi, dan meningkatkan fenotip atresia bilier eksperimental.

BAHAN DAN METODE

Model eksperimental atresia bilier

BALB / c tikus yang dibeli dari Charles River Laboratories (Wilmington, MA) dan Balb / c Perforin
knockout (PKO) tikus hadiah semacam dari Dr. John T. Harty (University of Iowa, Iowa City, IA).
Newborn PKO dan tikus WT disuntik secara intraperitoneal dengan 1,5 × 106 unit fluoresensi pembentuk
(FFU) dari RRV volume 20μl dalam waktu 24 jam setelah kelahiran untuk menginduksi atresia bilier
eksperimental seperti yang dijelaskan sebelumnya [9]. Dalam studi memblokir granzim, yang mesilate
protease inhibitor nafamostat (FUT-175, Enzo Biologi, Inc, Farmingdale, NY) diberikan secara
intraperitoneal dengan dosis berat 15μg / g tubuh di 20 ml 1X phosphate buffered saline (PBS) segera
setelah lahir diikuti oleh infeksi RRV 24 jam kemudian; tikus kontrol menerima 20μl dari PBS [11/09].
Setelah itu, FUT-175 diberikan setiap hari sampai 14 hari dari kehidupan. Kelompok tikus dikorbankan
antara 3-14 hari dan sejauh mana cedera duktus ditentukan [16]. Komite Kelembagaan Perawatan Hewan
dan Penggunaan (IACUC) dari Anak Cincinnati Research Foundation menyetujui semua hewan
percobaan dan protokol.

hati manusia

RNA hati diisolasi dari bayi berusia 1-3 bulan pada saat diagnosis atresia bilier. biopsi kontrol diperoleh
dari hati dari donor meninggal berusia 2-3,5 tahun yang digunakan untuk transplantasi; donor usia yang
sama dari subyek sehat tidak dikejar karena pertimbangan etika. Mata pelajaran ini dijelaskan dalam
publikasi sebelumnya [3, 11]. Ditulis informed consent diperoleh dari wali pasien.
tes fungsi hati

Serum bilirubin total (Total Bilirubin Reagen Set; Pointe Scientific, Inc. Canton, MI) dan transaminase
alanin (DiscretPak ALT Reagen Kit; Catachem, Inc. Oxford, CT) yang dihitung sesuai dengan instruksi
produsen.

Mengalir analisis cytometric dan tes sitotoksisitas

sel mononuklear diisolasi dari hati tikus neonatal dan mengalami antibodi-pewarnaan untuk analisis dan
sitotoksisitas aliran cytometric tes untuk sel NK dan CD8 T seperti yang dijelaskan sebelumnya [11].
Deskripsi tes dan daftar antibodi dan reagen disediakan sebagai Bahan dan Metode Tambahan.

Protein dan ekspresi gen

Supernatan dari percobaan co-kultur digunakan untuk mengukur granzim B, Il-1α, Il-10, Il-12p40, Il-15
dan Il-17 dengan ELISA atau protein Milliplex ™. ekspresi gen dihitung dengan real-time PCR
menggunakan primer spesifik dan thermocycler Stratagen Mx3005P (Agilent Technologies, Inc., Santa
Clara, CA), seperti yang dijelaskan sebelumnya [9]. Deskripsi dari tes untuk ekspresi protein dan gen
disediakan sebagai Bahan dan Metode Tambahan.

Analisis statistic

Jumlah tikus atau jaringan yang digunakan dalam setiap percobaan disajikan dalam teks atau angka
legenda. Semua in vitro percobaan dilakukan di 6 sumur untuk setiap kondisi. Nilai dinyatakan sebagai
mean ± standar deviasi (S.D.) dan signifikansi statistik ditentukan dengan uji t berpasangan dengan atau
tanpa koreksi Welch dengan signifikansi ditetapkan pada P <0,05. kurva survival diciptakan oleh analisis
Kaplan-Meier menggunakan GraphPad Prism versi 5.00 Software (GraphPad Software, San Diego, CA).

Hasil

Peningkatan ekspresi perforin dan kebutuhan untuk lisis sel

Untuk menguji hipotesis bahwa sistem perforin-granzim diperlukan untuk cedera epitel saluran empedu,
kita dihitung ekspresi Perforin mRNA di saluran empedu ekstrahepatik dan protein dalam sel sitotoksik
setelah tantangan RRV. Inokulasi RRV ke tikus yang baru lahir mengakibatkan pertumbuhan yang buruk,
penyakit kuning, dan kematian pada> 95% dari tikus dengan 14 hari usia, seperti yang dilaporkan
sebelumnya [9]. Pada tingkat mRNA, Perforin semakin meningkat di atas kontrol saline dari awal cedera
epitel (3 hari) melalui waktu obstruksi duktus (7 hari; Gambar 1A). Menggunakan FACS, ekspresi
perforin di NK, CD8 dan CD4 T sel meningkat setelah RRV (Gambar 1B; Tambahan Gambar 1). Untuk
menyelidiki apakah peningkatan ekspresi ini merupakan mekanisme sitotoksisitas, kita bersama-
berbudaya sel NK dan CD8 T dari WT atau PKO tikus dengan cholangiocytes murine (MCL) pada rasio
yang berbeda dalam uji cytolytic. Seperti yang diharapkan untuk tikus WT, MCL lisis terjadi ketika
mereka co-kultur dengan RRV-prima tetapi tidak sel naif setelah 5 jam co-budaya; Namun, pada tikus
PKO, puncak lisis oleh sel NK dan CD8 T RRV-prima jauh lebih rendah dari sel-sel WT di 1:10 dan 1:25
rasio untuk menargetkan sel-sel MCL (Gambar 1C, D). Ini menurun lisis sel dan peningkatan ekspresi
perforin setelah RRV diperkuat kemungkinan bahwa perforin diperlukan oleh sel-sel ini untuk melukai
epitel saluran di atresia bilier eksperimental.

cedera epitel dan obstruksi duktus di PKO tikus

Untuk langsung memeriksa kemungkinan ini, kita disuntikkan RRV ke tikus yang baru lahir WT dan
PKO dan dipantau perkembangan kolestasis, cedera empedu dan obstruksi duktus. Seperti yang
diharapkan, WT tikus menerima RRV gagal menambah berat badan, mengembangkan penyakit kuning
dan meninggal antara hari 8-14 (Gambar 2A). Mengejutkan kami, sementara tikus PKO yang baru lahir
disuntik dengan garam tumbuh dengan baik dan tetap asimtomatik, paparan RRV diproduksi kolestasis
(jaundice, tinja acholic, bilirubinuria) dan penurunan kelangsungan hidup sama dengan tikus WT, dengan
pengecualian bahwa kematian secara signifikan tertunda untuk hari 12-20 setelah tantangan (Gambar 2A;
P <0,001). Mikroskopis, peradangan dan integritas epitel adalah serupa antara kedua genotipe pada 3 hari
setelah RRV, muncul kurang intens dalam PKO tikus pada 5 hari, dan berat dengan oklusi lengkap dari
lumen saluran di 7 hari (Gambar 2B, Tambahan Gambar 2A). Biokimia, ALT dan kadar bilirubin total
naik di WT dan PKO tikus setelah infeksi RRV, dengan tingkat pada tikus PKO tren ke puncak yang
lebih rendah (Tambahan Gambar 2B, C). Kelimpahan RRV adalah serupa pada saluran empedu
ekstrahepatik dari kedua genotipe pada 7 hari (WT = 1,2 ± 0,7 × 106 FFU vs PKO = 0,7 ± 0,5 × 106 FFU;
P = 0,36).

Berdasarkan cedera jaringan yang lebih ringan pada 5 hari dan kematian tertunda pada tikus PKO, kami
melakukan percobaan co-budaya baru untuk menentukan apakah inkubasi berkepanjangan sel sitotoksik
RRV-prima dari PKO tikus dihasilkan lisis sel MCL meningkat. Memang, setelah 24 jam dari co-budaya,
RRV-prima NK dan CD8 T sel dari PKO dan WT tikus diinduksi tingkat yang sama MCL lisis (Gambar
2C, D). Secara kolektif, in vivo dan kultur sel data yang menunjukkan bahwa dengan tidak adanya
perforin, tikus menggunakan mekanisme alternatif yang akhirnya menghasilkan cholangiocyte lisis dan
atresia bilier fenotipe.

Granzyme menengahi cholangiocyte lisis oleh sel PKO-NK

Untuk menyelidiki apakah mekanisme alternatif melibatkan butiran fungsional terkait, kita dihitung
tingkat granzim B di supernatan dari co-budaya cytolytic assay diuraikan di atas; kami juga diukur sitokin
Il-1α, Il-10, Il-12p40, Il-15 dan Il-17 untuk mengeksplorasi apakah molekul lain yang berpotensi terlibat
dalam lisis perforin-independen MCL. Granzyme B sangat rendah di sumur kontrol dan meningkat
beberapa kali lipat setelah 24 jam inkubasi (Gambar 3A), sedangkan tingkat sitokin lain tidak bermakna
secara statistik (Tambahan Tabel 2). Ekspresi granzim B tergantung pada kontak langsung antara sel-sel
NK dan MCL, terbukti dengan tingkat dasar ketika membran transwell itu sela antara jenis sel dua
(Gambar 3A). Selanjutnya, untuk menentukan apakah sel PKO-NK digunakan sinyal granzim-dimediasi
untuk melukai cholangiocytes, kami mengulangi uji lisis dengan penambahan antibodi granzim B atau
sintetis pan-granzim inhibitor FUT-175. Kami menemukan bahwa inhibitor secara signifikan menekan
cholangiocyte lisis ke tingkat yang lebih besar dibandingkan dengan terhadap granzim B pada 5 dan 24
jam inkubasi (Gambar 3B). Data ini diidentifikasi granzyme sebagai mediator penting dari sifat cytolytic
tertunda sel NK pada cholangiocytes, mungkin kompensasi untuk tidak adanya perforin.

Granzyme penghambatan mencegah cedera duktus dan obstruksi pada tikus PKO

Untuk menyelidiki apakah granzyme dapat merupakan efektor penting dari cedera duktus empedu, kita
dihitung persentase sel NK dan CD8 T mengungkapkan granzim B dari hati tikus PKO disuntik dengan
RRV atau garam. Pada 7 hari setelah RRV, 64,5 ± 3,5% dari PKO-NK dan 41,4 ± 8,2% dari sel CD8 T
menyatakan granzim B, dibandingkan dengan 21,8 ± 0,5% dan 6,2 ± 1,1% masing-masing pada kontrol
saline usia-cocok (P <0,001; Gambar 3C). Pada tingkat mRNA, ekspresi untuk GzmA dan GzmB di
PKO-hati meningkat setelah RRV sekitar 3 kali lipat di atas kontrol saline di fase awal cedera duktus
(hari 3), dan 6 kali lipat pada saat obstruksi duktus (hari 7, Gambar 3D ). Berdasarkan data tersebut, kita
disuntikkan FUT-175 (15 ug / g berat badan) atau PBS intraperitoneal segera setelah lahir tikus PKO,
diikuti oleh suntikan RRV (atau garam sebagai kontrol) 24 jam kemudian; dosis yang sama dari FUT-175
atau PBS diberikan setiap hari sampai 14 hari dari kehidupan. Suntikan ditoleransi dengan baik seperti
yang ditunjukkan oleh penampilan normal dan pertumbuhan di atas 2 minggu pada tikus garam-
disuntikkan menerima baik FUT-175 atau PBS. Administrasi FUT-175 untuk PKO tikus tidak mencegah
kenaikan miskin berat diamati dalam 2-3 minggu pertama setelah infeksi RRV (Gambar 4A), namun
pertumbuhan ditingkatkan kemudian, ikterus dibersihkan, dan tikus selamat melampaui 21 hari di 77%
dari PKO tikus (Gambar 4A). Mikroskopis, saluran empedu ekstrahepatik tikus PKO diobati dengan
FUT-175 menunjukkan cedera ringan epitel dan submukosa limfositik infiltrasi, dan tidak ada obstruksi
mukosa saluran, berbeda dengan perubahan histologis parah di PKO tikus yang tidak menerima FUT-175
(Gambar 4B ). Gabungan, in vitro dan in vivo data yang menunjukkan bahwa penghambatan tambahan
granzyme dengan keadaan defisiensi perforin berkurang cedera cholangiocyte oleh sel sitotoksik in vitro
dan meningkatkan fenotipe bilier in vivo. Itu tetap harus ditentukan apakah granzim penghambatan oleh
FUT-175 berkurang sel pembunuhan NK dan cedera epitel independen dari perforin.

FUT-175 menurun cholangiocyte lisis tetapi tidak mencegah cedera empedu pada tikus WT

Untuk menyelidiki apakah penghambatan granzyme oleh FUT-175 dapat menurunkan NK-diinduksi
MCL lisis dengan adanya perforin, kami melakukan tes cytolytic menggunakan RRV-prima dan sel NK
naif dari tikus WT dan sel MCL di tidaknya FUT-175 . MCL lisis setelah 5 jam inkubasi dicegah oleh
FUT-175 (<5%), tetapi perpanjangan uji sampai 24 jam menunjukkan beberapa peningkatan MCL lisis
tetapi menyimpannya pada sekitar setengah dari lisis sel yang tidak diobati (Tambahan Gambar 3A) .
Konsisten dengan efek ini parsial, administrasi FUT-175 untuk WT tikus menunjukkan peningkatan
ringan dalam kejadian penyakit kuning, tapi tidak mencegah kegagalan pertumbuhan atau kematian
secara keseluruhan disebabkan oleh RRV (85% diperlakukan FUT-175 vs 100% diobati dengan PBS ; P>
0,05; Tambahan Gambar 3B) atau obstruksi lumenal dari saluran-saluran empedu ekstrahepatik
(Tambahan Gambar 3C). Dengan demikian, penghambatan granzim saja tidak cukup untuk mencegah
fenotip empedu yang disebabkan oleh RRV, dan menggarisbawahi adanya mekanisme kompensasi untuk
mengatasi defisit fungsional butiran individu.

Granzyme meningkat di hati bayi dengan atresia bilier

Untuk lebih mengeksplorasi potensi keterlibatan dari perforin dan granzyme dalam patogenesis atresia
bilier pada manusia, kita dihitung ekspresi mRNA hati untuk perforin, Granzyme A (GZMA) dan
Granzyme B (GZMB) pada bayi berusia 1-3 bulan dan hati kontrol. Sementara ekspresi mRNA untuk
perforin tidak berbeda antara kedua kelompok (Tambahan Gambar 4A), GZMA dan GZMB mRNA
meningkat secara signifikan pada subyek dengan atresia bilier diatas kontrol (Tambahan Gambar 4B, C).
Temuan ini mendukung pengayaan lingkungan hati dengan granzyme pada saat diagnosis.

DISKUSI

Yang ingin memahami sirkuit molekul yang digunakan oleh sel NK dan CD8 T untuk melukai epitel
saluran empedu pada atresia bilier eksperimental, kami menemukan bahwa kedua perforin dan granzyme
diperlukan untuk sifat cytolytic cepat terhadap cholangiocytes di jangka pendek co-budaya. Jika salah
satu dari mereka hilang, sitotoksik lisis sel yang diinduksi langsung terganggu. Dalam budaya jangka
panjang, bagaimanapun, hilangnya perforin atau penghambatan granzyme tidak substansial menekan
cedera cholangiocyte dalam waktu 24 jam dari co-budaya. Temuan serupa direproduksi in vivo, di mana
hilangnya genetik perforin atau penghambatan farmakologis dari granzyme tidak mencegah hasil akhir
dari cedera duktus empedu, ikterus persisten, dan tingkat kematian yang tinggi. Namun, simultan
hilangnya / inaktivasi kedua molekul efektif diblokir sel-induced cedera cholangiocyte sitotoksik dalam
budaya lama, menunjukkan bahwa setidaknya satu dari butiran exocytic harus hadir untuk fungsi sel
efektor. Jelas kurangnya mekanisme cytolytic alternatif untuk mengimbangi kekurangan perforin /
granzim direproduksi in vivo, dengan pengurangan cedera duktus empedu, pencegahan obstruksi lumenal,
dan kematian yang lebih rendah dari tikus neonatal terinfeksi RRV.

Kemampuan sel NK dan CD8 T melukai cholangiocytes dengan baik perforin atau granzim saja
menunjukkan bahwa setiap butir dapat mengerahkan sitotoksisitas secara mandiri, atau memainkan peran
sekunder cedera sel, mungkin berkaitan dengan faktor proinflamasi lain bahwa sel-sel ini menghasilkan
dalam atau di luar sinaps imunologi. Hal ini didukung oleh penelitian sebelumnya melaporkan
kemampuan granzyme masuk sel target oleh endositosis independen dari perforin [17]; Namun, jumlah
sub-litik dari perforin masih diperlukan untuk menginduksi apoptosis cepat sel target. Di negara-negara
perforin-kekurangan, granzyme telah terlibat dalam peradangan ekstraseluler, leukosit ekstravasasi, dan
kematian sel tertunda, serta pembelahan protein matriks ekstraselular, vitronektin, fibronektin dan laminin
mengakibatkan detasemen dan kematian sel target rentan [18, 19] . Peran baru untuk granzim penyerapan
independen perforin dalam sel mengekspresikan Hsp70 adalah relevansi khusus berdasarkan pada link
diusulkan Hsp70 dengan beberapa cholangiopathies [20]. Selain itu, sel-sel cytolytic juga dapat
menggunakan jalur cytokine- dan Fas / FasL-dependent sebagai mekanisme efektor kematian sel [21, 22].
Salah satu jalur ini mungkin melibatkan Ifnγ dan TNF, yang telah terbukti untuk bekerja secara sinergi
untuk menampilkan aktivitas co-stimulasi dan memicu apoptosis dalam model eksperimental atresia bilier
[16]. Meskipun pendekatan eksperimental kami tidak menyelidiki kemungkinan bahwa granzyme atau
bekerja perforin dalam konser dengan sitokin ini, pencegahan cholangiocyte lisis dan penindasan cedera
duktus empedu ketika pan-granzim inhibitor FUT-175 itu ditumpangkan kekurangan perforin mendukung
peran sinergis untuk kedua jenis butiran mekanisme efektor yang digunakan oleh sel NK untuk
menghasilkan fenotip atresia bilier eksperimental.

Berbeda dari tikus perforin-kekurangan, penghambatan farmakologis dari granzyme di WT tikus tidak
memodifikasi sel-dependent pembunuhan NK dari cholangiocytes atau cedera duktus empedu yang
disebabkan oleh RRV. Hal ini sesuai dengan peran perforin independen granzyme. Untuk mendukung
konsep ini, perforin telah ditunjukkan untuk mengatur penolakan tumor dalam proses NKG2D-dimediasi,
perforin-dependent, dengan NKG2D bertindak sebagai sitotoksisitas reseptor yang dominan [23].
Meskipun fungsi efektor untuk perforin dan granzim independen satu sama lain, data kami jelas
menunjukkan bahwa hilangnya / penghambatan baik menjadikan sel NK dapat melukai cholangiocytes di
jangka pendek atau jangka panjang co-budaya. Kurangnya mekanisme kompensasi yang efektif didukung
oleh penindasan cedera empedu pada tikus PKO diobati dengan FUT-175. Jadi, meskipun secara
individual tidak diperlukan, sinergi fungsional antara perforin dan granzyme memainkan peran kunci
dalam sel NK menargetkan epitel saluran.

Selain NK sel, perforin dan granzyme juga diungkapkan oleh limfosit CD8 T dan fungsi sebagai efektor
dari cholangiocyte lisis. Kedua sel NK dan CD8 telah terbukti untuk mengatur patogenesis cedera duktus
empedu pada tikus neonatal [10, 11]. Dalam karya ini, kami fokus pada menyelidiki peran perforin dan
granzyme di sitotoksisitas sel NK dan CD8 T karena mereka menggunakan granul eksositosis sebagai
mekanisme kepala lisis di sel target rentan, dengan acara utama yang melibatkan pelepasan butiran pori
pembentuk kaya di perforin [24]. Sesuai dengan kemungkinan ini, jumlah sel dan ekspresi perforin dan
granzyme perforin-positif NK dan CD8 T meningkat secara signifikan dalam hati tikus RRV-menantang
hingga saat obstruksi saluran empedu. Namun, tingkat konten granzim intraseluler dan tingkat
cholangiocyte sitotoksisitas dieksekusi oleh sel CD8 T lebih rendah dari aktivitas sel NK. Tingkat
perbaikan dalam fenotipe empedu yang dihasilkan oleh hilangnya perforin dan penghambatan granzim
oleh FUT-175 kurang dari peningkatan yang diamati pada tikus habis sel NK, karena didukung oleh
cedera epitel ringan diamati pada tahap awal setelah infeksi RRV. Konsisten dengan cedera ini, tikus
yang baru lahir juga memiliki infiltrasi sel inflamasi dalam kompartemen subepitel. Meskipun perubahan
ini, hilangnya ganda perforin fungsional dan granzyme mencegah penyumbatan saluran empedu
ekstrahepatik dan dipupuk kelangsungan hidup jangka panjang di sebagian besar tikus dengan cara yang
sama dengan tikus habis NK atau CD8 sel [10, 11]. Pada manusia, kami menemukan ekspresi meningkat
untuk granzyme tetapi tidak untuk perforin pada diagnosis atresia bilier.

perbedaan antara model eksperimental dan pasien dengan BA mungkin berhubungan dengan tahap
variabel luka hati pada saat diagnosis, karena didukung oleh penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa
tingkat peradangan dapat bervariasi, bahkan ketika pasien dicocokkan berdasarkan usia [25]. Hal ini juga
mungkin bahwa mungkin ada perbedaan dalam sistem kekebalan tubuh bayi dan dalam saluran empedu
menanggapi cedera antara manusia dan hewan pengerat. Selanjutnya, RRV-model atresia bilier
eksperimental tidak menampilkan fibrosis menonjol, fitur kunci dari penyakit hati pada manusia. Oleh
karena itu, setiap terjemahan potensi temuan terhadap penyakit manusia membutuhkan validasi hati
prinsip biologi dan studi pra-klinis tambahan.

Temuan kami memperluas repertoar molekul efektor digunakan oleh sistem kekebalan tubuh bayi untuk
menghasilkan fenotip atresia bilier eksperimental. Perforin dan granzyme bekerja sama untuk
menginduksi cholangiocyte lisis oleh sel NK, dan jangan jadi memerlukan kontak langsung antara dua
sel. molekul efektor lainnya termasuk ligan larut Th1 Ifnγ dan Il-15 [8, 9], dan mungkin TNF [16], serta
Th2 sitokin Il-13 [3]. Khususnya, studi sebelumnya melaporkan peningkatan ekspresi mRNA sitokin ini,
termasuk mRNA untuk granzyme A dan B, dalam hati bayi pada saat diagnosis atresia bilier [3, 8, 9, 11].
Sementara masing-masing molekul ini dapat menjadi fokus uji klinis masa depan [26], data kami
menunjukkan bahwa strategi terapi untuk memblokir sistem perforin-granzim harus menargetkan molekul
secara bersamaan untuk menjadi efektif dalam mengurangi cedera empedu dan memblokir perkembangan
penyakit hati.

Materi tambahan
Merujuk ke versi Web di PubMed Central untuk bahan tambahan.

Ucapan Terima Kasih

Para penulis berterima kasih kepada Dr John T. Harty (University of Iowa, Iowa City, IA) untuk
menyediakan Perforin - / - tikus. Kami juga berterima kasih kepada Ibu Jayme Ogino untuk melakukan
tes biokimia hati dan Bryan Donnelly untuk bantuan dengan tes untuk titer RRV.

Sumber dukungan:

Karya ini didukung oleh dana dari Yayasan Hati Amerika dan American Association of Studi Penyakit
Hati (untuk PS) dan oleh NIH hibah DK-64008 dan 83781 (untuk JAB) dan DK-078392 mendanai
Integrative Morfologi Core dan Gene dan Ekspresi Protein Inti dari Cincinnati Digestive Disease
Penelitian Inti Center.

Daftar Singkatan
PKO perforin knockout
RFU unit fluoresensi pembentuk
RRV Rhesus rotavirus tipe A
tipe liar WT
REFERENCES

1. Bessho K, Bezerra JA. Biliary atresia: will blocking inflammation tame the disease? Annu Rev Med. 2011;
62:171–185. [PubMed: 21226614]

2. Bezerra JA, Tiao G, Ryckman FC, Alonso M, Sabla GE, Shneider B, et al. Genetic induction of proinflammatory
immunity in children with biliary atresia. Lancet. 2002; 360:1653–1659. [PubMed: 12457789]
3. Li J, Bessho K, Shivakumar P, Mourya R, Mohanty SK, Dos Santos JL, et al. Th2 signals induce
epithelial injury in mice and are compatible with the biliary atresia phenotype. J Clin Invest. 2011;
121:4244–4256. [PubMed: 22005305]

4. Mack CL, Falta MT, Sullivan AK, Karrer F, Sokol RJ, Freed BM, et al. Oligoclonal expansions of CD4+
and CD8+ T-cells in the target organ of patients with biliary atresia. Gastroenterology. 2007; 133:278–
287. [PubMed: 17631149]

5. Mack CL, Tucker RM, Sokol RJ, Karrer FM, Kotzin BL, Whitington PF, et al. Biliary atresia is
associated with CD4+ Th1 cell-mediated portal tract inflammation. Pediatr Res. 2004; 56:79–87.
[PubMed: 15128911]

6. Muraji T, Suskind DL, Irie N. Biliary atresia: a new immunological insight into etiopathogenesis.
Expert Rev Gastroenterol Hepatol. 2009; 3:599–606. [PubMed: 19929581]

7. Santos JL, Carvalho E, Bezerra JA. Advances in biliary atresia: from patient care to research. Braz J Med
Biol Res. 2010; 43:522–527. [PubMed: 20464347]

8. Saxena V, Shivakumar P, Sabla G, Mourya R, Chougnet C, Bezerra JA. Dendritic cells regulate
natural killer cell activation and epithelial injury in experimental biliary atresia. Sci Transl Med. 2011;
3:102ra194.

9. Shivakumar P, Campbell KM, Sabla GE, Miethke A, Tiao G, McNeal MM, et al. Obstruction of
extrahepatic bile ducts by lymphocytes is regulated by IFN-gamma in experimental biliary atresia. J Clin
Invest. 2004; 114:322–329. [PubMed: 15286798]
10. Shivakumar P, Sabla G, Mohanty S, McNeal M, Ward R, Stringer K, et al. Effector role of neonatal
hepatic CD8+ lymphocytes in epithelial injury and autoimmunity in experimental biliary atresia.
Gastroenterology. 2007; 133:268–277. [PubMed: 17631148]

11. Shivakumar P, Sabla GE, Whitington P, Chougnet CA, Bezerra JA. Neonatal NK cells target the mouse
duct epithelium via Nkg2d and drive tissue-specific injury in experimental biliary atresia. J Clin Invest.
2009; 119:2281–2290. [PubMed: 19662681]

12. Russell JH, Ley TJ. Lymphocyte-mediated cytotoxicity. Annu Rev Immunol. 2002; 20:323–370.
[PubMed: 11861606]

13. Chen X, Trivedi PP, Ge B, Krzewski K, Strominger JL. Many NK cell receptors activate ERK2 and
JNK1 to trigger microtubule organizing center and granule polarization and cytotoxicity. Proc Natl Acad
Sci USA. 2007; 104:6329–6334. [PubMed: 17395718]

14. Bryceson YT, March ME, Ljunggren HG, Long EO. Synergy among receptors on resting NK cells for
the activation of natural cytotoxicity and cytokine secretion. Blood. 2006; 107:159–166. [PubMed:
16150947]

15. Strbo N, Oizumi S, Sotosek-Tokmadzic V, Podack ER. Perforin is required for innate and adaptive
immunity induced by heat shock protein gp96. Immunity. 2003; 18:381–390. [PubMed: 12648455]

16. Erickson N, Mohanty SK, Shivakumar P, Sabla G, Chakraborty R, Bezerra JA. Temporal-spatial
activation of apoptosis and epithelial injury in murine experimental biliary atresia. Hepatology. 2008;
47:1567–1577. [PubMed: 18393301]

17. Chamberlain CM, Ang LS, Boivin WA, Cooper DM, Williams SJ, Zhao H, et al. Perforin-
independent extracellular granzyme B activity contributes to abdominal aortic aneurysm. Am J
Pathol. 2010; 176:1038–1049. [PubMed: 20035050]

18. Boivin WA, Cooper DM, Hiebert PR, Granville DJ. Intracellular versus extracellular granzyme B in
immunity and disease: challenging the dogma. Lab Invest. 2009; 89:1195–1220. [PubMed: 19770840]

19. Buzza MS, Zamurs L, Sun J, Bird CH, Smith AI, Trapani JA, et al. Extracellular matrix remodeling
by human granzyme B via cleavage of vitronectin, fibronectin, and laminin. J Biol Chem. 2005;
280:23549–23558. [PubMed: 15843372]
 20. Gross C, Koelch W, DeMaio A, Arispe N, Multhoff G. Cell surface-bound heat shock protein 70
(Hsp70) mediates perforin-independent apoptosis by specific binding and uptake of granzyme B. J Biol
Chem. 2003; 278:41173–41181. [PubMed: 12874291]

21. Young JD, Liu CC, Persechini PM, Cohn ZA. Perforin-dependent and -independent pathways of cytotoxicity
mediated by lymphocytes. Immunol Rev. 1988; 103:161–202. [PubMed: 3292393]
22. Aung S, Rutigliano JA, Graham BS. Alternative mechanisms of respiratory syncytial virus
clearance in perforin knockout mice lead to enhanced disease. J Virol. 2001; 75:9918–9924.
[PubMed: 11559824]

23. Hayakawa Y, Kelly JM, Westwood JA, Darcy PK, Diefenbach A, Raulet D, et al. Cutting edge:
tumor rejection mediated by NKG2D receptor-ligand interaction is dependent upon perforin. J
Immunol. 2002; 169:5377–5381. [PubMed: 12421908]

24. Cullen SP, Martin SJ. Mechanisms of granule-dependent killing. Cell Death Differ. 2008; 15:251– 262.
[PubMed: 17975553]

25. Moyer K, Kaimal V, Pacheco C, Mourya R, Xu H, Shivakumar P, et al. Staging of biliary atresia at
diagnosis by molecular profiling of the liver. Genome Med. 2010; 2:33. [PubMed: 20465800]

26. Fehniger TA, Cai SF, Cao X, Bredemeyer AJ, Presti RM, French AR, et al. Acquisition of murine NK
cell cytotoxicity requires the translation of a pre-existing pool of granzyme B and perforin mRNAs.
Immunity. 2007; 26:798–811. [PubMed: 17540585]

Fig. 1. Perforin expression and cholangiocyte lysis

(A) mRNA expression for Perforin in extrahepatic bile ducts from WT mice at 3, 5 and 7 days after saline or RRV
challenge as a ratio to mouse Gapdh; N=3 per time-point; *=P<0.001. (B) Median Fluorescence Intensity (MFI)
histograms showing perforin expression by NK and CD8 T cells after saline or RRV challenge. N=3 per time-point;
Mean

± SD MFI values are shown. Lower panels show percent cholangiocyte lysis after incubation with NK (C) or
CD8 T cells (D) from RRV- WT (grey bars), PKO (black bars) and saline-injected mice (open bars). Hepatic NK
and CD8 T cells were obtained from a pool of 6–8 livers; *=P<0.01, **= P<0.003, ns: not significant.

Fig. 2. Impact of perforin deficiency on outcome and cholangiocyte lysis after RRV infection

(A) RRV infection resulted in poor growth and onset of jaundice, acholic stools and bilirubinuria
in WT and PKO mice, but mortality was delayed in PKO mice (Kaplan-Meier survival analysis,
N=9-33 per group in each experiment). In panel (B), sections of extrahepatic bile ducts from
RRV-challenged WT (top panel) and PKO (middle panel) mice show severe cholangitis and
lumenal obstruction at 5-7 days. Lower panel shows normal anatomy in age-matched control
PKO mice. Arrows: subepithelial inflammation; arrowheads: intact duct epithelium; asterisks:
lumen. Percent cholangiocyte lysis after incubation with NK (C) and CD8 T cells (D) from RRV-
WT (grey bars), PKO (black bars) and saline-injected mice (open bars). Hepatic NK and CD8 T
cells were obtained from a pool of 6–8 livers; *=P<0.001.
Fig. 3. Contribution of NK cell granzymes to cholangiocyte lysis

(A) Granzyme-B levels in supernatants following co-culture of PKO NK cells and cholangiocytes (mCL). Arrows
indicate non-detectable levels in saline group (blue) or in the RRV group (green) with a transwell between NK and
mCL. N=6-8 mice per group; *=P<0.0001. (B) Percent lysis after co-culture of PKO NK cells with mCL in the
presence or absence of 10μg/mL granzyme-B antibodies or 15mg/mL FUT-175. Hepatic NK cells were obtained
from a pool of 6–8 livers; *=P<0.006. (C) Scatter plots showing granzyme-B expression by NK and CD8 T cells
from PKO mice 7 days after RRV infection. Numbers represent percent NK or CD8 T cells expressing granzyme-B;
N=3 mice per time-point. (D) mRNA expression of Granzyme A and B in PKO mice expressed as a ratio to mouse
Gapdh. N=3 replicates per time-point; *=P<0.003.

Fig. 4. Prevention of experimental biliary atresia by FUT-175 treatment of perforin-deficient mice

(A) Daily injections of FUT-175 improved long-term weight, jaundice, acholic stools,
bilirubinuria and long-term survival of Perforin knockout (PKO) mice challenged with RRV.
N=9-29 mice per group; *=P<0.001; Kaplan-Meier survival analysis shows increased survival
after FUT-175 treatment (P=0.013). (B) Longitudinal sections of extrahepatic bile ducts from
PKO mice showing normal histology after saline (top panel), typical duct inflammation and
obstruction after RRV (middle panel), and prevention of duct obstruction in mice receiving FUT-
175 (lower panel). Arrows point to inflammation, arrowheads to the duct epithelium, and
asterisks to the lumen.