BIOMARKER DIAGNOSTIK BARU DIARE AKUT AKIBAT INFEKSI BAKTERI

PADA ANAK-ANAK

Hassan M. Al-Asy, Rasha M. Gamal, Ahmed M. Abd Albaset, Mohammed G. Elsanosy, Maali M.
Mabrouk

1. Pendahuluan
Meskipun merupakan penyakit yang dapat dicegah, diare akut tetap menjadi penyebab
utama morbiditas dan mortalitas pada anak-anak di seluruh dunia, yang mengakibatkan
lebih dari 1,8 juta kematian per tahun di antara mereka yang berusia kurang dari lima tahun.
Sebagian besar kematian ini terjadi di negara berkembang [1]. Diare pada anak-anak
disebabkan oleh berbagai patogen, termasuk patogen virus, bakteri, dan protozoa. Patogen-
patogen ini membuat dimana mengatasi beban penyakit yang tinggi menjadi tantangan
besar [2]. Di negara maju, morbiditas dan mortalitas yang disebabkan oleh diare akut telah
menjadi kurang mengancam dalam beberapa dekade terakhir. Namun, diare akut terus
menjadi penyebab rawat inap yang penting dan sering; memiliki morbiditas yang
signifikan, terutama pada anak-anak di bawah usia 5 tahun di negara berkembang [3].
Frekuensi infeksi gastrointestinal oleh bakteri dan parasit telah menurun dengan perbaikan
dalam infrastruktur kesehatan masyarakat (air dan pengelolaan limbah); Namun, ini tidak
terjadi pada gastroenteritis virus [4]. Sebuah tes yang cepat dan andal yang memprediksi
infeksi bakteri bermanfaat untuk meningkatkan hasil melalui pengobatan antibiotik awal
[5]. Biomarker infeksi bakteri adalah jumlah leukosit rutin dan C-reactive protein (CRP)
[6]. Selama respons fase akut, ada peningkatan kadar protein yang banyak dalam darah,
termasuk CRP dan prokalsitonin (PCT). Keduanya menunjukkan kinerja yang lebih baik
daripada Biomarker tradisional lain yang digunakan, seperti jumlah leukosit, untuk
membedakan antara infeksi bakteri dan virus [7-11]. Karena mereka cepat, tanpa
membutuhkan waktu untuk hasil bakteriologi, dan dapat menyingkirkan kemungkinan
infeksi bakteri, khususnya PCT, mereka secara rutin digunakan di negara maju [12,13].
Soluble triggering receptor expressed onmyeloid cells-1 (sTREM-1) adalah Biomarker
yang baru diusulkan [14].
Berat molekul CRP adalah 120 kDa, dan lokasi gennya adalah antara 1q21 dan 1q23.
Ini adalah komponen penting dari sistem imun bawaan terhadap infeksi [15]. Ia mengenali
fosfokolin di permukaan banyak bakteri; kemudian, ia mengaktifkan jalur komplemen
klasik dan memfasilitasi fagositosis oleh neutrofil. Karena CRP tidak memiliki spesifitas,
 ia digunakan sebagai marker tambahan dalam kombinasi dengan parameter yang lebih
konvensional, seperti jumlah leukosit dalam CSF, jumlah darah dan tingkat protein, untuk
membantu dokter mempersempit diagnosis banding [16]. Protein PCT (propeptida
pendahulu kalsitonin) disintesis dalam sel C kelenjar tiroid dan disekresikan dari leukosit
dalam darah perifer. Berat molekulnya adalah 13 kDa [17], dan gennya terletak di lengan
pendek kromosom 11 (11p15.4) [16]. Pada infeksi bakteri, sekresi PCT meningkat hingga
beberapa ribu kali lipat, tetapi tetap normal atau sedikit meningkat pada infeksi virus dan
reaksi inflamasi yang tidak infeksius [18]. Tingkat serum PCT meningkat dalam 2-3 jam
setelah infeksi dengan nilai puncak pada 6-12 jam, kembali normal dalam 2 hari.
Sebaliknya, tingkat CRP meningkat antara 12 dan 18 jam setelah infeksi bakteri [19,20].
PCT stabil dalam plasma dan waktu paruh plasma sekitar 22 jam. Tidak seperti kebanyakan
sitokin, PCT stabil secara in vitro, yang membuatnya menjadi penanda baru yang
menjanjikan untuk identifikasi awal dan sensitif dari pasien yang terinfeksi serta untuk
titrasi respon terhadap pengobatan [21]. Namun, PCT tidak dianggap sebagai penanda yang
ideal karena meningkat pada kondisi selain infeksi, dan mungkin tetap rendah pada infeksi
[22]. Selain itu, penggunaan PCT dipersulit oleh variasi dalam pilihan untuk nilai cutoff
abnormal dan rentang usia yang beragam.
Di sisi lain, TREM-1 adalah reseptor permukaan sel glikoprotein trans-membran
superfamili imunoglobulin. TREM-1 bertindak bekerja sama dengan toll-like receptors
(TLRs), dan kerjasama ini dikendalikan oleh nuclear factor-kb (NF-kb) [23]. Ekspresi
TREM-1 diregulasi pada sel fagositik dengan adanya bakteri dan jamur, memicu sekresi
sitokin proinflamasi yang memperkuat respon inang terhadap agen mikroba [24]. Beberapa
data telah menunjukkan bahwa ekspresi TREM-1 yang terikat-membran pada neutrofil dan
monosit/makrofag sangat berubah selama infeksi bakteri, memuncak pada 6 jam. Oleh
karena itu, tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengevaluasi kegunaan diagnostik dari
penanda-penanda ini (PCT dan sTREM1) pada diare akut dari infeksi bakteri dan
kegunaannya dalam membedakan antara diare akut dari infeksi bakteri dan non-bakteri.

2. Pasien dan Metode

Subyek: Penelitian ini dilakukan pada delapan puluh bayi dan anak-anak dengan diare
akut, usia 3-36 bulan, dirawat di Departemen Pediatrik di Rumah Sakit Universitas Tanta,
Tanta, Mesir. Sebanyak 40 anak-anak yang memenuhi kriteria usia dan jenis kelamin. Diare
didefinisikan sesuai dengan kriteria definisi kasus WHO [1].
Kriteria eksklusi: Pasien dengan diare kronis, malnutrisi, infeksi sistemik lainnya, atau
mereka yang telah menerima antibiotik dalam 14 hari terakhir sebelum pendaftaran atau
memiliki morbiditas bersama tidak dimasukkan. Informed consent diperoleh dari wali anak
yang dipelajari dan anak-anak sebelum partisipasi studi.
Anak-anak dengan diare akut dibagi lagi menjadi dua kelompok berikut:
Kelompok 1: anak-anak dengan diare akut karena infeksi bakteri (no = 40). Infeksi
bakteri didiagnosis dengan adanya semua hal berikut: demam, manifestasi toksik,
leukositosis dan kultur bakteri feses positif (bakteri patogen yang terisolasi termasuk
berikut: Escherichia coli pada 47%, Campylobacter jejuni pada 20%, Shigella pada 17%
dan Salmonella dalam 16%).
Kelompok 2: anak-anak dengan diare akut karena infeksi non-bakteri (no = 40),
termasuk yang positif untuk antigen rotavirus dalam feses dan mereka dengan infeksi
protozoa terbukti (Entamoeba histolytica atau Giardia lamblia) dalam analisis feses dengan
hasil negatif untuk kultur bakteri feses.
Saat masuk, data-data berikut dicatat untuk setiap pasien: usia, jenis kelamin, tanda-
tanda vital dan gejala klinis dan tanda-tanda (demam, muntah dan diare). Diare akut
didefinisikan sebagai peningkatan jumlah pelepasan feses hingga lebih dari jumlah normal
(yaitu, peningkatan menjadi >2 per hari) untuk jangka waktu <15 hari. Pengambilan
riwayat meliputi hal-hal berikut: pemberian antibiotik, perjalanan ke luar negeri baru-baru
ini, tanggal dan durasi masuk, lama sakit dan rawat inap sebelumnya atau riwayat diare.
Pemeriksaan klinis menyeluruh dilakukan dengan penekanan khusus pada penilaian tingkat
dehidrasi mengikuti rekomendasi dari Program WHO untuk Pengendalian Penyakit Diare.
Gejala-gejala dievaluasi secara teratur dan dicatat setiap hari pada grafik tindak lanjut
bersama dengan episode diare.

2.1. Sampel Feses

Satu spesimen feses dikumpulkan dari setiap anak dengan bantuan orang tua mereka.
Spesimen diperiksa untuk warna dan konsistensi feses. Spesimen feses segar diperiksa
dengan mikroskop cahaya untuk keberadaan ovum parasit, kista, darah, lendir, sel-sel pus,
tetes lemak dan sel darah putih (leukosit) serta oleh pewarnaan asam-cepat yang
dimodifikasi untuk Cryptosporidium parvum. Semua spesimen feses dikultur untuk
Salmonella, Shigella, Campylobacter jejuni, Vibrio cholerae, dan Escherichia coli dengan
metode standar [25]. Sampel feses diuji untuk antigen rotavirus oleh enzim immunoassay
 (EIA) menggunakan kit (RIDASCREEN® Rotavirus test, R-Biopharm AG, Landwehrstr.
Darmstadt, Jerman) [26].
Sampel darah digunakan untuk pemeriksaan laboratorium rutin, termasuk
pengukuran CRP, jumlah leukosit, PCT, dan sTREM-1. Setelah 72 jam pengobatan
antibiotik untuk kasus dengan bukti diare akut karena infeksi bakteri, CRP, serum PCT dan
tingkat sTREM-1 dinilai kembali.
Analisis serum: Serum dipisahkan dari sampel darah yang diambil saat masuk dari
semua pasien dan setelah 3 hari dari pasien yang menerima pengobatan antibiotik untuk
diare bakteri akut. Serum itu kemudian disimpan pada suhu -20°C.
C-reactive protein (CRP): Sebuah uji nephelometric (Dade-Behring, Perancis)
digunakan untuk mengukur CRP dengan batas deteksi 0,2 mg/l dan variasi koefisien intra-
assay pada konsentrasi rendah dan tinggi dari 3,3% dan 2%, masing-masing, menggunakan
nilai normal 6 mg/l [27].
Procalcitonin (PCT): Uji imunoluminometrik spesifik (LUMItest®, Brahms
Diagnostica GmbH, Jerman) digunakan untuk mengukur PCT dalam duplikat.
Luminescence secara otomatis diukur pada Berilux Analyzer 250 (Behring Diagnostics,
Germany). Batas deteksi adalah 0,08 ng/ml, dan variasi koefisien intra-assay pada
konsentrasi rendah dan tinggi masing-masing 12% dan 5%. PCT serum normal untuk
pengujian ini adalah <0,5 ng/ml [28].
Soluble triggering receptor expressed on myeloid cell-1 (sTREM-1) ELISA:
Menurut instruksi produsen (Quantikine Human TREM-1 Immunoassay, Sistem R & D,
USA), TREM-1 diukur dengan kit ELISA manusia yang tersedia secara komersial
menggunakan antibodi monoklonal khusus untuk lapisan TREM-1 manusia pada pelat 96-
well, 50 μl standar TREM-1 manusia rekombinan dan/atau sampel, 200 μl antibodi
poliklonal terhadap TREM-1 terkonjugasi ke horseradish peroksidase dan 200 ml larutan
TMB yang mengandung tetramethylbenzidine sebagai substrat. Warna dikembangkan
secara proporsional dengan tingkat ikatan TREM-1, yang berubah dari biru menjadi kuning
dengan larutan penghenti, dan intensitas diukur pada 450 nm. Konsentrasi sTREM-1
kemudian diperoleh dari kurva standar. Dosis minimum yang dapat dideteksi rata-rata
adalah 13,8 pg/ml dengan variabilitas intra-assay sebesar 3-7% dan variabilitas interasay
6-8% ketika diukur dalam duplikatnya [29].

3. Analisis Statistik
 Data dinyatakan dalam rentang dan mean ± standar deviasi (SD) untuk data kuantitatif atau
angka dan persentase untuk data kualitatif. Analisis statistik dilakukan dengan
menggunakan SPSS for Windows, versi 16. Tingkat signifikansi diadopsi pada P <0,05.
Plot Receiver Operator Characteristic (ROC) dibuat menggunakan perangkat lunak
MedCalc untuk menentukan area di bawah kurva (AUCs) dengan interval kepercayaan
95% untuk tiga penanda untuk mendeteksi diare bakteri akut.

4. Hasil
Penelitian kami menunjukkan bahwa tidak ada perbedaan yang signifikan antara semua
kelompok yang diteliti mengenai usia atau jenis kelamin. Demikian pula, nilai rata-rata
untuk natrium serum, kalium serum dan hemoglobin tidak berbeda secara signifikan antara
kelompok yang diteliti. Nilai suhu tubuh rata-rata secara signifikan lebih tinggi pada anak-
anak dengan diare bakteri dibandingkan pada mereka dengan diare non-bakteri atau dalam
kontrol, dan mereka secara signifikan lebih tinggi pada kelompok diare non-bakteri
dibandingkan dengan kelompok kontrol. Sehubungan dengan jumlah total dan diferensial
leukosit, anak-anak dengan diare bakteri akut memiliki tingkat signifikan lebih tinggi dari
jumlah total leukosit dan persentase segmented neutrofil dibandingkan dengan diare non-
bakteri dan kontrol. Di sisi lain, persentase limfosit secara signifikan lebih tinggi pada
mereka dengan diare non-bakteri daripada pada kelompok kontrol dan lebih tinggi pada
dua kelompok sebelumnya dibandingkan pada mereka dengan diare bakteri, seperti yang
ditunjukkan pada Tabel 1.
Anak-anak dengan diare bakteri memiliki darah, lendir dan pus pada feses mereka.
Secara signifikan lebih banyak pasien dalam kelompok diare bakteri memiliki lebih banyak
sel darah merah dan pus pada pemeriksaan feses dibandingkan pada mereka dengan diare
non-bakteri, seperti yang terlihat pada Tabel 2.
C-reactive proterin serum secara signifikan lebih tinggi pada anak-anak dengan diare
bakteri akut dibandingkan pada anak-anak dengan diare non-bakteri dan kontrol. Untuk
procalcitonin serum dan TREM 1 serum, tingkat rata-rata secara signifikan lebih tinggi
pada anak-anak dengan diare bakteri akut dibandingkan pada anak-anak dengan diare non-
bakteri dan kontrol, tetapi tidak ada perbedaan signifikan yang ditemukan pada
perbandingan antara anak-anak dengan diare non-bakteri dan kontrol.
Kadar tiga penanda yang diteliti, CRP serum, prokalsitonin serum dan TREM1 serum,
secara signifikan menurun pada anak-anak dengan diare bakteri akut pada penilaian ulang
 72 jam setelah memulai pengobatan antibiotik, seperti yang ditunjukkan pada Tabel 3 dan
4.
Dalam penelitian kami, analisis kurva ROC menunjukkan bahwa sTREM1, dengan
nilai cutoff> 14,5 ng/ml, memiliki sensitivitas yang lebih tinggi (93,33%) dan spesifisitas
(93,33%) dibandingkan prokalsitonin (66,7% dan 80%, masing-masing, pada nilai cutoff>
4,95 ng/ml), tetapi CRP menunjukkan sensitivitas tertinggi (100%) dan memiliki
spesifisitas yang mirip dengan procalcitonin. Sensitivitas tertinggi adalah untuk CRP
(100%), sedangkan sTREM-1 memiliki spesifisitas tertinggi (93,33%), seperti yang
ditunjukkan pada Tabel 5. Daerah di bawah kurva sebesar 0,99 untuk CRP, 0,95 untuk
sTREM-1 dan 0,88 untuk PCT (Gbr. 1).

5. Diskusi
Diagnosis penyebab diare akut, disebabkan oleh bakteri atau tidak, dianggap sebagai
landasan dalam manajemen diare. Diagnosis yang tepat akan mencegah pemberian
antibiotik yang tidak perlu dan masuk rumah sakit, di satu sisi, dan hasil keluaran negatif
yang serius, termasuk kematian. Strategi terbaru dalam manajemen diare telah diarahkan
pada penggunaan kombinasi informasi klinis dan laboratorium, seperti pemeriksaan darah
lengkap, jumlah neutrofil, dan konsentrasi CRP; Namun, ada kemungkinan tumpang tindih
antara infeksi bakteri dan infeksi non-bakteri pada hingga 40% dari kasus [30]. Metode
diagnostik baru yang akurat, cepat, dan dapat diandalkan untuk membedakan antara diare
bakteri dan non-bakteri telah diteliti secara intensif dan dilakukan dengan berbagai tingkat
kesuksesan. Hanya sedikit dari metode ini yang telah dilaporkan [31]. Oleh karena itu, studi
ini bertujuan untuk mengevaluasi penggunaan sTREM dibandingkan dengan PCT dan CRP
dalam diagnosis awal dan diferensiasi antara penyebab diare infeksi bakteri dan non-bakteri
akut pada anak-anak. Awalnya, Assicot dkk. menggambarkan prokalsitonin sebagai
penanda potensial penyakit bakteri [32]. PCT diasumsikan sebagai protein fase akut
peradangan dengan kinetika lebih cepat daripada CRP. Memang, penanda ini telah
memperoleh dasar ilmiah yang kuat karena banyak penelitian telah menunjukkan bahwa
evaluasi kuantitatif PCT lebih unggul daripada biomarker lainnya. Hasil kami
menunjukkan bahwa anak-anak dengan diare akut karena infeksi bakteri memiliki kadar
procalcitonin bermakna lebih tinggi dibandingkan dengan diare infeksi non-bakteri dan
kontrol. Studi kami mendukung peran pengukuran PCT serum dalam membedakan antara
diare bakteri akut dan diare non-bakteri akut dengan sensitivitas 66,7% dan spesifisitas
80% pada saat masuk pada nilai cut off> 4,95 ng/ml. Kinetika cepat dan spesifisitas PCT
yang lebih tinggi membuatnya lebih unggul daripada CRP dalam memprediksi infeksi
bakteri [10], meskipun kinerja PCT dan CRP sama. Penting untuk dicatat bahwa
peningkatan PCT dan CRP dalam infeksi bakteri adalah karena multiplikasi ekstraseluler
dalam aliran darah, yang menginduksi respons inflamasi sistemik yang kuat. Dalam studi
oleh Ibrahim dkk. [33], kadar serum PCT secara signifikan lebih tinggi pada meningitis
bakterial dibandingkan pada meningitis non-bakteri. Ini didukung oleh penelitian Afrika
yang dilaporkan oleh Carrol dkk. [14] yang menyimpulkan bahwa PCT adalah penanda
diagnostik dan prognostik terbaik dari sepsis bakteri berat pada anak-anak Malawi,
termasuk mereka dengan meningitis septik. Oleh karena itu, PCT serum dianggap memiliki
nilai diagnostik dan nilai prognostik yang lebih baik untuk membedakan antara infeksi
bakteri dan non-bakteri. PCT juga merupakan indikator yang baik dari efikasi pengobatan
untuk infeksi bakteri [34]. Keterlibatan khusus TREM-1 dalam kasus infeksi bakteri telah
menyebabkan para peneliti untuk menyelidiki nilai diagnostik dari plasma sTREM-1 assay
dalam membedakan infeksi dari peradangan non-infeksi sistemik yang berat di antara
pasien sakit kritis yang baru dirawat dengan dugaan infeksi bakteri. Meskipun tingkat
plasma awal CRP, PCT dan sTREM-1 lebih tinggi pada pasien septik dibandingkan pada
pasien dengan sindrom respon inflamasi sistemik, hanya serum sTREM-1 level yang
tampaknya menjadi parameter yang paling membantu dalam membedakannya [35]. Sebuah
studi perbandingan keakuratan lima penanda dalam diagnosis infeksi bakteri yang serius
(SBI), termasuk meningitis, menyimpulkan bahwa PCT dan bukan sTREM-1 adalah
penanda diagnostik terbaik [36]. Sayangnya, sedikit yang diketahui tentang peran sTREM
dalam diare bakteri. Oleh karena itu, salah satu tujuan utama kami dalam penelitian ini
adalah untuk mengevaluasi peran pengukuran kadar sTREM-1 serum dalam membedakan
antara diare akut karena infeksi bakteri dan diare karena infeksi non-bakteri. Seperti halnya
PCT, tetapi dengan kekuatan diskriminatif diagnostik yang sangat tinggi, sTREM-1 serum
menunjukkan konsentrasi yang secara signifikan lebih tinggi pada diare akut awal karena
infeksi bakteri dibandingkan dengan diare non-bakteri. Setelah 72 jam pengobatan, pasien
dengan diare bakteri akut masih memiliki kadar TREM-1 serum terlarut yang tinggi, yang
secara signifikan menurun dibandingkan dengan kadar saat masuk. Menariknya,
mekanisme dimana sTREM memodulasi respon imun masih belum jelas. Namun,
penelitian Jepang oleh Oku dkk., Dilakukan dengan menggunakan model tikus,
menunjukkan bahwa pensinyalan sTREM-1 yang dihambat berkurang, tetapi tidak
menghapuskan, aktivasi NF-kB dan produksi sitokin melalui kompetisi dengan ligan alami
TREM-1 dan / atau merusak dimerisasi TREM-1, melindungi hewan sepsis dari
hyperresponsiveness dan kematian [37].
Kesimpulannya, baik serum PCT dan sTREM berharga dalam membedakan diare
bakteri dari diare non-bakteri pada anak-anak, tetapi sTREM-1 memiliki kekuatan
diskriminatif diagnostik yang jauh lebih tinggi. Namun, temuan ini tetap harus dikonfirmasi
pada populasi yang lebih besar. Selain itu, penelitian lebih lanjut diperlukan untuk
mengevaluasi nilai prognostik sTREM-1 pada diare bakteri akut.