BENEMERITA UNIVERSIDAD AUTONOMA DE PUEBLA

FACULTAD DE ESTOMATOLOGÍA

PATOLOGÍA GENERAL

CASARRUBIAS CARRANZA JOEL

HEMATOXILINA-EOSINA.
 Imagen: En esta imagen podemos observar un
corte histológico de tejido pulmonar humano usando la tecnica de tincion
hematoxilina-eosina que se encarga de facilitar la observación de las células
individuales así como su núcleo, (Hematoxilina) tiñe estructuras ácidas dando como
resultado los núcleos celulares se tiñen de color azul intenso y la (eosina) tiñe
componentes básicos como citoplasma de color rosa y los músculos de color rojo.

Es una tinción basada en dos etapas, la primera una tinción nuclear por un colorante
básico (hematoxilina) y la segunda, una tinción citoplasmática por un colorante
xantenico ácido (eosina).

La hematoxilina en combinación con sales de aluminio, hierro o cromo, forma un

colorante activo, la hemateina, formada por oxidación de la hematoxilina.

Este se usa como colorante nuclear, tiñendo los núcleos de color azul/negro y
aportando un buen detalle de los mismos. Por este motivo, se suele usar junto con
un colorante citoplasmático, generalmente la eosina, que aporta una gradación entre
el rosa, y el rojo a las estructuras y matrices celulares de carácter catiónico (a las
que la hematoxilina no tiñe o lo hace muy débilmente).
Se consigue así un buen contraste de las preparaciones microscópicas facilitando
su observación.

➔ Preparación de las muestras:

Todas las muestras deben tratarse de acuerdo con el estado de la tecnología.
Todas las muestras deben estar rotuladas inequívocamente.

➔ Diagnóstico:
Los diagnósticos deberán ser establecidos solamente por personas autorizadas y
cualificadas. Cada aplicación debería implicar controles adecuados para descartar
resultados erróneos.

➔ Caducidad:
El producto almacenado a temperatura ambiente y en envase bien cerrado, es
utilizable hasta la fecha de caducidad indicada en el envase.

➔ Dato sobre el empleo.

Para evitar errores, la tinción ha de ser realizada por personal especializado.
Solamente para uso profesional. Deben cumplirse las directivas nacionales sobre
seguridad en el trabajo y aseguramiento de la calidad.

➔ Resultados.

HISTOQUÍMICA.

Imagen: Se puede apreciar a las células

teñidas utilizando la técnica de histoquímica, la cual es utilizada para la detección de
células en tejidos que se pueden presentar grandes, aquí ocurre una modificación
química que va a provocar que el reactivo Schiff se conjugue con grupos aldehídos
y gracias a esto dara un color rojizo brillante.
Las técnicas histoquímicas son aquellas que supongan una reacción química en la
que intervienen moléculas pertenecientes al propio tejido.

Estas moléculas son difícilmente discernibles con colorantes generales. Durante el

procesamiento del tejido previo a la reacción histoquímica, como la fijación o la
inclusión, hay que evitar dañar a la molécula que se quiere detectar porque de otra
manera resultaría en falsos negativos, es decir, no tener tinción cuando en realidad
la molécula de interés sí está presente en el tejido, aunque deteriorada.
En algunas ocasiones es necesario realizar pasos previos a la reacción histoquímica
para descubrir la molécula que se quiere detectar, por ejemplo usando un fijador
adecuado, ya que de otra manera no reaccionaría con los reactivos químicos.

➔ Reacciones químicas:
Existen técnicas histoquímicas para detectar glúcidos, proteínas y nucleótidos. La
técnica histoquímica más empleada es la reacción de PAS (Periodic Acid Schiff). Se
utiliza para la detección de hidratos de carbono, libres o conjugados, cuando están
en cantidades relativamente grandes en los tejidos.
La modificación química del tejido consiste en la oxidación mediante el ácido
periódico de los enlaces entre los carbonos próximos que contienen grupos
hidroxilos. Esto provoca la formación de grupos aldehídos que serán reconocidos
por el reactivo de Schiff, el cual se combinará con ellos para dar un color rojizo
brillante.

➔ Tinciones.
El objetivo de la histoquímica es poner de manifiesto una molécula o familia de
moléculas presentes en una sección histológica y estudiar su distribución tisular "in
situ".

➔ Técnica de Tinción:

● Desparafinar e hidratar (xilol y decrecientes alcoholes)

● Ácido periódico 0.5 %…………………………………… 5 min.
● Lavar en agua (d).
● Reactivo de Schiff……………………………………….. 15- 30 min.
● Aclarar en 3 baños de agua sulfurosa…………………… 2 min. Cada uno.
● Lavar en agua corriente
● Colorante de contraste
● Lavar con agua corriente.
● Deshidratar, aclarar y montar.

➔ Resultados:
Material PAS: tiñe de color rojo brillante.
Pone en manifiesto una molécula o familia de moléculas pertenecientes a una
sección histológica.

INMUNOFLUORESCENCIA.
 Imagen: Aqui se muestra un corte histológico
de piel humana que presenta depósitos en tres diferentes lugares aparecen en
forma de banda que recorre la periferia de la molécula, este tipo de tinción se
caracteriza gracias a que emiten luz visible con una determinada longitud de onda,
el color de la tinción es verde manzana para una reacción positiva.
Consiste en conjugar colorantes fluorescentes con anticuerpos, exponiendo
después este conjugado a los anticuerpos o antígenos correspondientes en cortes
de tejidos, frotis de microorganismos o de células, o cultivo de tejidos en capa única.

Cuando la reacción es positiva y se expone a la luz ultravioleta se producirá

fluorescencia observable bajo el microscopio de inmunofluorescencia.
Se realiza un acople a un anticuerpo de fluoróforo o una enzima que cataliza una
reacción por la cual se emite fluorescencia.

➔ Tinciones.
Estructuras subcelulares, antígenos en cortes de tejido, en color verde manzana
para una reacción positiva.
La inmunofluorescencia es un conjunto de técnicas en donde se emplean
anticuerpos para detectar y localizar, antígenos específicos en células y/o tejidos.

La inmunofluorescencia es una técnica que consiste en incubar una muestra de un

anticuerpo que detecta la molécula o componente que queremos detectar. Dicho
anticuerpo lleva unida una molécula fluorescente (inmunofluorescencia directa) o
bien es reconocido por un segundo anticuerpo marcado fluorescentemente
(inmunofluorescencia indirecta.

➔ Pasos claves de una inmunofluorescencia.

1. Fijación
2. Permeabilización
3. Bloqueo
 4. Inmunodetección

1. Fijación.
Preservar la localización, composición y estructura del material biológico a analizar
manteniendo lo más fielmente posible a la situación que existe in vivo.
2. Permeabilización
Existen distintos métodos de permeabilización que son más “suaves” o mas
“fuertes”. Esto dependerá de la naturaleza del compuesto permeabilizante a utilizar.
Produce poros en las membranas celulares. Lo que permite el ingreso de los
anticuerpos a la célula si queremos detectar estructuras internas de la célula.
3. Bloqueo.
-Su función es impedir interacciones inespecíficas de los anticuerpos con el material
biológico a analizar y así reducir la marcación inespecífica.
-En general se utilizan soluciones proteicas concentradas (Generalmente Albúmina
bovina sérica o gelatina de pescado).
-El anticuerpo primario debe competir con la proteína bloqueante para unirse a su
epitope y así detectar la estructura de interés.
4. Inmunodetección.
Los anticuerpos son proteínas que tienen la capacidad reconocer específicamente y
unirse con alta afinidad a otras moléculas (antígenos).

➔ Resultados.
El anticuerpo marcado se hace reaccionar contra un preparado biológico y luego se
expone la muestra así tratada a una fuente de luz de onda corta (ultravioleta o azul)
seleccionada por medio de un monocromador.
Esta luz de onda corta genera un fenómeno de fluorescencia en la molécula
marcadora que a su vez emite luz a una longitud de onda más larga verde, amarillo
o naranja.
En el caso de la utilización de la inmunofluorescencia como método de tinción para
microscopía óptica, el fluorescente revela la localización a nivel celular o subcelular
de la molécula diana.

INMUNOHISTOQUÍMICA.
 Imagen: Esta técnica permite mostrar una variedad de
antígenos que pueden estar presentes en una célula utilizando anticuerpos, esta
reacción es visible cuando un anticuerpo está marcado con una sustancia que
absorbe, emite luz o produce coloración.
La inmunohistoquímica, es un procedimiento especial de coloración con tinta que se
realiza sobre tejido mamario canceroso fresco o congelado extirpado durante una
cirugía. Se lo utiliza para determinar si las células cancerosas tienen receptores de
hormonas en su superficie
La inmunohistoquímica es una técnica basada en la tinción de tejido fijado e incluido
en parafina, procedente de biopsias de ganglios linfáticos, médula ósea y otros
tejidos hematopoyéticos, con anticuerpos específicos marcados con una enzima que
torna visible un sustrato invisible.

El complejo antígeno-anticuerpo se identifica en el tejido mediante microscopía,

localizandolo allí donde se ha unido a moléculas específicas presentes en las
células del tejido en estudio.

➔ Importancia.
El uso de la inmunohistoquímica para estudiar marcadores celulares permite definir
inmunofenotipos específicos y provee de una importante herramienta para el
diagnóstico y la predicción del pronóstico relativo al estado de enfermedad y la
biología de la misma.

➔ Utilidad.

-Reconocimiento de marcadores de estirpe celular

-Identificación de agentes infecciosos en tejidos (virus, bacterias, hongos, parásitos)

-Clasificacion de leucemias y linfomas
-Detección de receptores hormonales, antígenos de proliferación y producto de
oncogenes en neoplasias.

-Determinación del origen de tumores metastásicos.

Porqué usar inmunohistoquímica en cáncer.

Los protocolos de tratamiento son diferentes para los distintos tipos de tumores, de
ahí la importancia de sub clasificarlos.

➔ Tinciones.
La inmunohistoquímica es un procedimiento que tiene como objetivo detectar,
amplificar y hacer visible un antígeno específico, que generalmente es una proteína.
Esta técnica permite identificar la localización de una sustancia específica a nivel
tisular o celular.

MÉTODOS MOLECULARES.

En principio se denomina así a todas las técnicas de laboratorio que se usan para
aislar ADN o extraerlo en alta pureza, visualizarlo para ver su estado, cortarlo y
pegarlo.
Diagnóstico de enfermedades infecciosas así como genéticas. Detectar
específicamente el microorganismo de interés.

El concepto de diagnóstico molecular es un término amplio que incluye técnicas de

biología molecular en beneficio de la salud humana, detectando y/o cuantificando
secuencias genéticas específicas de ácido desoxirribonucleico (ADN), ácido
ribonucleico (ARN) o proteínas. Inicialmente, el concepto de Biología Molecular se
aplicó a los trabajos realizados sobre el ADN.

Las técnicas moleculares se basan en el análisis de los ácidos nucleicos extraídos

de los microorganismos en forma directa o bien de una muestra conteniendo el
microorganismo en cuestión.

➔ Ventajas de los métodos moleculares.

1.- Especificidad (pueden detectar solo la molécula o microorganismo de interés),
2.- Sensibilidad (son capaces de detectar la presencia de un solo microorganismo),
3.-Rapidez (se puede identificar un microorganismo en menos de 24 horas)
4.- Pueden ser automatizadas (permiten tener un diagnóstico en un menor tiempo y
reducir los costos).
 ➔ Desventajas.

1.-No distinguen entre organismos vivos y muertos, aunque algunas veces esto no
es precisamente una desventaja
2.-Se tiene que contar con conocimientos de secuencias de nucleótidos específicas
del patógeno diagnosticar,
3.-Se requiere de personal altamente capacitado para el desarrollo de las pruebas
de identificación,
4.-Se requiere equipo mas especifico para el diagnóstico, lo cual eleva la inversión
inicial,
5.-Se desarrollan procedimientos con múltiples etapas, lo que incrementa la
posibilidad de errores, además de la posibilidad de obtener falsos positivos y falsos
negativos.

➔ Tinciones.
Considerando que las técnicas de biología molecular se basan en la detección de
segmentos de ADN, no es necesaria la presencia de un microorganismo viable en la
muestra, sino que sólo su material genético.

HIBRIDACIÓN IN SITU Y PCR.

Imagen: Aqui podemos apreciar de una forma

directa la ubicación especial se secuencias específica, en esta técnica se marca la
hebra sencilla de ADN o ARN, se pueden observar el tejido de los cromosomas.

Hibridación in situ es una técnica que detecta secuencias de ácidos nucleicos en

células, cromosomas o tejidos preservados. La detección in situ provee una
visualización directa de la localización espacial de secuencias específicas que es
crucial para dilucidar la organización y función génica, por lo que el método de
hibridación in situ se ha convertido en una técnica importante en diversos campos,
incluyendo diagnóstico de rearreglos cromosomales, detección de infecciones
virales y análisis de la función génica durante el desarrollo embrionario.
 ➔ Ventajas.
La principal ventaja de la técnica es que permite usar al máximo la muestra de un
tejido, logrando realizar cientos de hibridaciones diferentes en el mismo tejido.

➔ Desventaja.
Está limitada por su incapacidad para detectar secuencias que tienen bajo número
de copias de ADN y ARN.

➔ Tinciones.
Es una técnica de laboratorio que consiste en marcar una hebra sencilla de ARN o
ADN denominada sonda y permitir que se empareje con su secuencia
complementaria en el ARN o el ADN presente en una muestra de tejido o de
cromosomas.

PCR.

Esta es la técnica más utilizada para la detección de microorganismos, se basa

principalmente en realizar millones de copias de un segmento de ADN específico
de un microorganismo.

La técnica de PCR se ha utilizado para la identificación de virus, bacterias hongos,

fitoplasmas nematodos etc.

Se usa para la amplificación de secuencias específicas de ADN o ARN en células o

secciones de tejido, de forma que el número de copias se incrementen en PCR in
situ a niveles detectables por métodos estándar de hibridación in situ.
Su principal utilidad se da para identificar secuencias de ADN que no son fáciles de
detectar usando hibridación in situ estándar.

BIBLIOGRAFÍA.

https://www.itwreagents.com/download_file/ce_ivd_instructions/CEIVD17/es/CEIVD17
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https://mmegias.webs.uvigo.es/6-tecnicas/5-histoquimica.php

http://iib.unsam.edu.ar/archivos/docencia/licenciatura/biotecnologia/2017/BioCel/1504
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http://cdb.hospitalclinic.org/laboratorios/anatomia-
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https://inmunologiaclinicalabfcquna2016.files.wordpress.com/2016/05/inmunohistoqui
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http://www.elsevier.es/es-revista-revista-medica-clinica-las-condes-202-articulo-
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http://www.posgradoeinvestigacion.uadec.mx/AQM/No.%201/AQMmicroorganismos.h
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https://www.genome.gov/glossarys/index.cfm?id=110

http://www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/met/hibridacion_in_situ.pdf