Laporan Praktikum Hari, Tanggal : Senin, 20 Maret 2017

Biomolekul Senin, 27 Maret 2017

Waktu : 08.00-11.00
PJP : Puspa Julistia Puspita, M.Sc
Asisten : Nurma Sumar Sidik
M. Alwin Azhari
M. Maftuchin Sholeh, S.Si
Yuni Miftasari

ASAM NUKLEAT
(Penentuan Konsentrasi RNA dan DNA dalam Homogenat Hati Ayam)

Kelompok 4
Nindy Auliana G84150039
Aulia Regita C G84150009
Bayu Kurniawan Aji G84150001
M Nur Alfi Lail G84150077

DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2017
 PENDAHULUAN

Materi genetik dalam makhluk hidup memegang peranan penting dalam

mengatur perkembangan biologi seluruh bentuk kehidupan secara seluler. Materi
genetik menyimpan informasi genetik yang sangat penting. Materi genetik berupa
asam nukleat terdiri dari DNA dan RNA (Karmana 2009). DNA (Deoxiribose
Nucleic Acid) adalah materi genetik yang mengkode semua informasi genetik
yang dibutuhkan untuk proses metabolisme dalam setiap organisasi yang tersusun
atas basa nitrogen, gula ribosa, dan gugus fosfat. DNA merupakan sepasang
rantai/untai panjang polinukleotida berbentuk spiral ganda yang dihubungkan
dengan ikatan hidrogen dan berdiameter sekitar 2 nm (Alatas 2006). DNA di
dalam sel berupa DNA mitokondria, DNA kloroplas, dan DNA inti. Keseluruhan
DNA yang menyusun masing-masing komponen disebut DNA genom. DNA
memiliki tiga struktur, yaitu struktur primer, sekunder, dan tersier (Ngaliyatun
2013). DNA seringkali dirujuk sebagai molekul hereditas karena DNA
bertanggung jawab untuk penurunan sifat genetika dari kebanyakan ciri yang
diwariskan. Informasi genetik yang diwariskan oleh keturunan dari suatu
organisme ditentukan oleh barisan pasang basa (Tolistiawaty 2007). RNA (Ribose
Nucleic Acid) merupakan seutas benang tunggal yang tersusun atas molekul gula
ribosa, gugus fosfat, dan basa nitrogen. RNA dibentuk dari DNA di dalam
nukleus melalui proses transkripsi DNA. Berdasarkan letak dan fungsinya, RNA
dibagi menjadi 3, yaitu mRNA (molekul RNA yang mengkode urutan residu asam
amino pada peptida atau protein), tRNA (molekul yang membawa asam amino ke
ribosom pada proses perpanjangan rantai peptida selama sintesa peptida atau
protein), dan rRNA (molekul penting yang berasosiasi dengan protein membentuk
ribosom) (Azhar 2016). Molekul RNA jauh lebih pendek dari DNA dan
ditemukan dalam jumlah yang lebih banyak di dalam sel.
Isolasi materi genetik yaitu DNA dan RNA prinsipnya hampir sama, yaitu
pelisisan sel, pemisahan dari molekul lain, dan pemurnian. Isolasi DNA memiliki
tahapan antara lain penghancuran sel dan jaringan, pemisahan DNA dari bahan
padat seperti selulosa dan protein serta pemurnian DNA dari komponen seluler
lain seperti protein, RNA, dan lemak (Langga et al. 2012). Penghilangan protein
dilakukan dengan digesti menggunakan proteinase K, dilanjutkan dengan salting
out dan ekstraksi organik. DNA dipresipitasi menggunakan etanol atau
isopropanol (Vivikananda 2014). Isolasi RNA terdiri dari tiga tahapan utama yaitu
pelisisan membran sel untuk mengekspos RNA, pemisahan RNA dari zat-zat dan
molekul lainnya seperti DNA, lipid, protein, dan karbohidrat, dan pemulihan RNA
dalam bentuk murni (Annisa 2012).
Perbedaan antara DNA dan RNA yaitu pada substansi penyusun, struktur,
dan perannya. DNA tersusun atas gula pentosa berupa deoksiribosa, basa nitrogen
berupa adenin, guanin, sitosin, dan timin, serta gugus fosfat. RNA tersusun atas
gula pentosa berupa ribosa, basa nitrogen berupa adenin, guanin, sitosin, dan
urasil, dan gugus fosfat. Struktur molekul DNA ada dalam bentuk tiga dimensi
utas ganda sedangkan struktur molekul RNA adalah utas tunggal. DNA berperan
penting dalam penyimpanan, duplikasi, dan realisasi informasi genetik, sedangkan
RNA berperan dalam membawa informasi genetik dari DNA, menerjemahkan
informasi genetik tersebut, dan membawa molekul asam amino untuk sintesis
protein (Kundu et al. 2017). Praktikum asam nukleat ini memiliki tujuan
menghitung kandungan asam deoksiribonukleat (DNA) dan asam ribonukleat
(RNA) dalam sampel.

METODE

Waktu dan Tempat

Praktikum dilakukan pada hari Senin, 20 dan 27 Maret 2017 pukul 08.00-
11.00 WIB bertempat di Laboratorium Pendidikan Biokimia, Lt. V, Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, IPB.

Alat dan Bahan

Alat yang digunakan selama praktikum yaitu timbangan, gelas piala, pipet,
batang pengaduk, sentrifus, penangas air, tabung reaksi, penjepit tabung, lemari
es, dan spektrofotometer. Bahan yang digunakan berupa homogenat hati, HClO4
0.6 M, KOH, HClO4 1.2 M, HClO4 0.2 M, pereaksi orsinol, air suling, standar
RNA, pereaksi defenilamin, dan TCA.

Prosedur Percobaan

Penentuan Konsentrasi RNA dalam Homogenat Hati Tikus

Sebanyak 2.5 mL homogenat hati dipipet ke dalam tabung sentrifus yang
sudah didinginkan dan ditambahkan 2.5 mL HClO4 0.6 M dingin. Campuran
tersebut dikocok dan didinginkan dalam penangas es selama 10 menit. Kemudian,
campuran homogenat disentrifugasi pada kecepatan 5000 rpm selama 10 menit.
Setelah disentrifugasi, supernatan dibuang tetapi pelet disuspensi dalam 4.0 mL
KOH 0.3 M dan dipanaskan dalam penangas air pada suhu 40°C selama 40 menit.
Tabung lalu didinginkan selama 5 menit dan ditambahkan 2.5 mL HClO4 1.2 M,
dikocok dan didinginkan dalam penangas es selama 10 menit. Setelah itu,
disentrifugasi kembali pada kecepatan 5000 rpm selama 10 menit. Supernatan
dituang ke dalam tabung reaksi. Disiapkan 4 tabung yang masing-masing tabung
pertama mengandung 3 mL pereaksi orsinol, dipanaskan dalam 100°C selama 20
menit, dan diberi 4 mL air suling. Tabung kedua mengandung 0.2 mL supernatan,
3 mL pereaksi orsinol, dipanaskan pada suhu 100°C selama 20 menit, dan diberi
3.8 mL air suling. Tabung ketiga mengandung 0.5 mL supernatan, 3 mL pereaksi
orsinol, dipanaskan pada suhu 100°C selama 20 menit, dan diberi 3.5 mL air
suling. Tabung keempat mengandung 0.5 mL standar RNA, 3 mL pereaksi
orsinol, dipanaskan pada suhu 100°C selama 20 menit, dan diberi 3.5 mL air
suling. Keempat tabung tersebut didinginkan dan kemudian dibaca absorbansinya
pada panjang gelombang 660 nm menggunakan spektrofotometer serta dinolkan
dengan tabung pertama (blanko).
Penentuan Konsentrasi DNA dalam Homogenat Hati Tikus
Suspensi pelet yang terdahulu disentrifugasi pada kecepatan 5000 rpm
selama 10 menit. Supernatan dibuang, pelet disuspensi dalam 2.0 mL HClO4 0.2
M dingin dan dipindahkan ke dalam 2 botol mikrofuse kecil. Mikrofuse
disentrifugasi selama 10 menit. Sebanyak 1.0 mL HClO4 0.2 M dingin
ditambahkan ke setiap tabung dan disentrifugasi kembali selama 10 menit.
Sebanyak 4 tabung disiapkan untuk uji kadar DNA. Tabung 1 diisi dengan 1mL
akuades, 2.0 mL pereaksi defenilamin, dan 3.0 mL asam trikloroasetat. Tabung 2
diisi dengan 0.5 mL supernatan, 2.0 mL pereaksi defenilamin, dan 3.5 mL asam
trikloroasetat. Tabung 3 diisi dengan 1.0 mL supernatan, 2.0 mL pereaksi
defenilamin, dan 3.0 mL asam trikloroasetat. Tabung 4 diisi dengan 1.0 mL
standar DNA, 2.0 mL pereaksi defenilamin, dan 3.0 mL asam trikloroasetat.
Tabung-tabung tersebut ditempatkan pada penangas yang bersuhu 80°C selama 30
menit. Tabung-tabung tersebut didinginkan di dalam penangas es. Absorbansi
keempat tabung dibaca pada 660 nm dengan spektrofotometer yang dinolkan
dengan blanko. Jumlah nukleotida yang larut dihitung dalam tabung 2 dan 3.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Materi genetik pada hewan, tumbuhan, mikroba, dan darah dapat diisolasi
dengan menggunakan metode yang berbeda masing-masingnya. Perbedaan yang
terlihat adalah pada tahap awal persiapan dan pelisisan sel. Isolasi materi genetik
pada hewan diawali dengan pembentukan homogenat yang diambil dari organ.
Biasanya dilakukan dengan cara penggerusan atau dicincang halus (Izzah 2014).
Isolasi materi genetik tumbuhan pada tahap pelisisan sel dilakukan secara
mekanik maupun kimiawai, misal dengan penggerusan atau penggunaan detergen
dan garam. Pelisisan sel tumbuhan juga dapat dilakukan secara enzimatik dengan
menggunakan enzim lisozim. Tahapan presipitasi atau pemisahan materi genetik
dengan molekul lain seperti protein dapat menggunakan enzim protease dan
ribonuklease, sedangkan pengendapannya dengan etanol atau alkohol dingin
(Hapsari 2015). Isolasi materi genetik pada mikroba contohnya bakteri diawali
dengan pengkulturan pada media (Fitriya et al. 2015). Tahapan pelisisan sel
bakteri dilakukan secara enzimatik dengan menggunakan lisozim dan EDTA yang
dapat merusak protein tanpa merusak molekul DNA atau RNA (Susanti dan
Ariani 2004). Isolasi materi genetik darah pada tahap pelisisan langsung
menggunakan larutan pelisis sel. Hal ini dikarenakan darah sudah dalam bentuk
cairan sehingga lebih mudah pada proses pemisahan yaitu dengan metode
sentrifugasi (Lelana et al. 2003).

Tabel 1 Kadar RNA hati ayam

Absorbansi
Tabung [RNA] µg/mL
Terukur Terkoreksi
Banko 0.068 - -
Sampel 1 0.306 0.238 130.054
Sampel 2 0.564 0.496 271.038
Standar 0.983 0,915 500.00
Tabel 2 Kadar DNA hati ayam
Absorbansi
Tabung [DNA] μg/mL
Terukur Terkoreksi
Blanko 0.344 - -
Sampel 1 0.378 0.034 31.250
Sampel 2 0.386 0.042 38.603
Standar 0.616 0.272 250.000

Isolasi materi genetik baik DNA maupun RNA pada percobaan

menggunakan organ hati ayam dikarenakan materi yang dihasilkan dari hasil
isolasi cukup banyak, mudah didapat, dan lebih mudah dalam hal preparasi.
Materi genetik seperti DNA pada hewan dapat diisolasi dari semua bagian organ,
seperti daging, sperma, ginjal, jantung, hati, limfa, dan lain-lain (Hapsari 2015).
Penentuan RNA ditentukan dengan mereaksikan RNA dengan pereaksi orsinol.
Pereaksi orsinol spesifik terhadap gula pentosa dan tergantung pada pembentukan
furfural jika dipanaskan dengan asam kuat pekat, misalnya HCl. Pereaksi orsinol
kemudian bereaksi dengan furfural apabila ada katalisator sehingga membentuk
warna hijau. Reaksi positif pengukuran ini diberikan pada basa nitrogen purin.
Kekurangan dari penentuan RNA menggunakan pereaksi orsinol yaitu orsinol
tidak spesifik juga pada basa nitrogen pirimidin karena RNA tersusun atas basa
nitrogen purin dan pirimidin sehingga tingkat kemurnian RNA yang dihasilkan
masih kurang (Bintang 2010).
Tabel 1 menunjukkan hasil pengukuran kadar RNA pada hati ayam. Nilai
absorbansi pada pengukuran spektrofometer menunjukkan hubungannya dengan
konsentrasi RNA. Semakin besar nilai absorbansinya semakin besar pula
konsentrasi RNA. Sampel 1 dengan nilai absorbansi terkoreksi sebesar 0.238
menunjukkan konsentrasi RNA sebesar 130.054 mg/mL. Sampel 2 dengan nilai
absorbansi sebesar 0.496 menunjukkan konsentrasi RNA sebesar 271.038 mg/mL.
Penambahan KOH 0,3 M pada suspensi RNA yang akan diisolasi kemudian
dipanaskan bertujuan untuk proses pelisisan sel dan mengendapkan RNA
sehingga RNA terpisah dengan DNA (Mangunwardoyo 2002).
Penentuan DNA ditentukan dengan mereaksikan DNA dengan pereaksi
difenilamin pada kondisi asam. Hasil reaksinya membentuk warna kebiruan yang
kemudian diukur menggunakan spektrofotometer. Warna yang terbentuk
diakibatkan 2-deoksipentosa yang tidak spesifik untuk DNA. Suasana asam
mengubah rantai lurus deoksipentosa menjadi β-hidroksi-levulinaldehida yang
sangat reaktif sehingga bereaksi dengan difenilamin yang membentuk kompleks
warna biru sehingga dapat terbaca pada spektrofotometer. Pengukuran dengan
metode ini hanya spesifik pada gula deoksiribosa dan basa nitrogen purin
(Bintang 2010).
Tabel 2 menunjukkan hasil pengukuran kadar DNA pada hati ayam.
Absorbansi dengan konsentrasi memiliki hubungan yang linear. Semakin besar
nilai absorbansinya semakin besar pula konsentrasi DNA. Sampel 1 dengan nilai
absorbansi sebesar 0.034 menunjukkan konsentrasi DNA sebesar 31.25 mg/mL.
Sampel 2 dengan nilai absorbansinya sebesar 0.042 menunjukkan konsentrasi
DNA sebesar 38.60 mg/mL. Kemurnian DNA ditentukan oleh tingkat
kontaminasi protein dalam larutan. Kemurnian DNA tersebut dapat dilihat dari
rasio absorbansi DNA (A260:A280). Molekul DNA dikatakan murni jika rasio
kedua nilai tersebut berkisar antara 1,8 sampai 2,0 (Tenriulo et al. 2001).
Metode dalam penentuan DNA secara murni selain menggunakan
difenilamin juga dapat menggunakan metode konvensional seperti penambahan
fenol-kloroform, sentrifugasi gradien EtBr dan CsCl. Namun metode tersebut
membutuhkan waktu yang lama dan prosedur yang rumit. Cara lain dapat
menggunakan metode adsorpsi silika. Prinsip dari metode ini adalah pengikatan
molekul air oleh denaturan dan adanya ikatan hidrogen antara gugus silanol
(SiOH-) pada silika dengan atom oksigen pada gugus fosfat DNA. Metode ini
tidak membutuhkan waktu yang lama dan biaya yang tinggi, tidak menggunakan
perlarut organik, serta dapat menghilangkan residu fenol dan kloroform (Ayu et
al. 2011). Metode yang dapat dilakukan dalam penentuan RNA selain
menggunakan orsinol yaitu dengan penambahan buffer guanidin tiosianat. Buffer
guanidin tiosianat dapat mendenaturasi protein sehingga mengubah struktur tersier
molekul RNase. Berubahnya struktur tersier molekul RNase ini akan menghambat
daya rusaknya terhadap RNA. Guanidin tiosianat (GITC) juga dapat
menonaktifkan enzim RNase sehingga menghasilkan isolat RNA yang utuh (tidak
terdegradasi) dan dapat menghancurkan serta melarutkan sel dengan cepat
(Amanda dan Cartealy 2015).

SIMPULAN

Asam nukleat yang merupakan materi genetik pada makhluk hidup terdiri
dari RNA dan DNA yang dapat diisolasi dengan metode yang berbeda-beda.
Penggunaan organ hati dalam mengisolasi RNA maupun DNA lebih banyak
menghasilkan isolat. Isolat RNA lebih banyak dibandingkan dengan isolat DNA.

DAFTAR PUSTAKA

Alatas Z. 2006. Efek pewarisan akibat radiasi pengion. Buletin Alara. 8(2): 65-74.
Amanda UD, Cartealy IC. 2015. Isolasi RNA total dari mesokarp buah kelapa
sawit (Elaeis guineenssis Jacq.var. Tenera). Prosiding Seminar Nasional
Masyarakat Biodiversitas Indonesia. 1(2): 171-176.
Annisa. 2012. Isolasi RNA dan pengklonaan gen tripsin kation dari pankreas sapi
ke Escherechia coli DH5α [skripsi]. Depok (ID): Universitas Indonesia.
Ayu BP, Ria P, Aminin ALN. 2011. Purifikasi DNA kromosom Geobacillus sp.
dYTae-14 menggunakan kolom silika dengan denaturan urea. Jurnal Sains
dan Matematika. 19(4): 101-106.
Azhar M. 2016. Biomolekul Sel: Karbohidrat, Protein, dan Enzim. Padang (ID):
UNP Press.
Bintang M. 2010. Biokimia Teknik Penelitian. Jakarta (ID): Erlangga.
Fitriya RT, Ibrahim M, Lisdiana L. 2015. Keefektifan metode isolasi DNA kit dan
CTAB/NaCl yang dimodifikasi pada Staphylococcus aureus dan Shigella
dysentriae. 4(1): 87-92.
Hapsari AI. 2015. Isolasi DNA tanaman bayam (Amaranthus sp.) dan ikan lele
(Clarias sp.) sebagai kajian dalam biologi molekuler. Didaktika. 13(2): 23-
30.
Izzah AN. 2014. Perbandingan antara metode SYBR Green dan metode Hydrolisis
Probe dalam analisis DNA gelatin Sapi dan DNA gelatin babi dengan
menggunakan Real Time PCR [skripsi]. Jakarta (ID): Universitas Islam
Negeri Syarief Hidayatullah.
Karmana IW. 2009. Kajian evolusi berbasis urutan nukleotida. Ganec Swara.
3(3): 75-81.
Kundu A, Nandi S, Nandi AK. 2017. Nucleic acid based polymer and
nanoparticle conjugates: synthesis, properties, and applications. Progress in
Materials Science. 88: 136-185.
Lelana NE, Sutarno, Etikawati N. 2003. Identifikasi polimorfisme pada fragmen
ND-5 DNA mitokondria sapi Benggala dan Madura dengan teknik PCR-
RFLP. Biodiversitas. 4(1): 1-6
Langga IF, Restu M, Kuswinanti T. 2012. Optimalisasi suhu dan lam inkubasi
dalam ekstraksi DNA tanaman bitti (Vitex cofassus Reinw) serta analisis
keragaman genetik dengan teknik RAPD-PCR. Jurnal Sains dan Teknologi.
12(3): 265-276.
Mangunwardoyo W. 2002. Transformasi fragmen DNA kromosom Xanthomonas
campestris ke dalam Escherechia coli. Makara Sains. 6(1): 21-24.
Ngaliyatun. 2013. Uji daya infektivitas Plasmodium berghei iradiasi pada hati dan
limpa mencit menggunakan metode nested-polymerase chain reaction
[skripsi]. Semarang (ID): Universitas Negeri Semarang.
Susanti E, Ariani SRD. 2004. Kloning gen penisilin V asilase dari Bacillus sp.
BAC4 melalui pembuatan pustakan genom. Biodiversitas. 5(1): 1-6.
Tenriulo A, Suryati E, Parenrengi A, Rosmiat. 2001. Ekstraksi DNA rumput laut
Kappaphycus alvarezzi dengan metode fenol kloroform. Marina Chimica
Acta. 2(2): 6-10.
Tolistiawaty I. 2007. Perkembangan dan pertumbuhan plasenta tikus (Rattus
norvegicus) pada umur kebuntingan 13, 17, dan 21 hari akibat penyuntikan
bST (bovine Somatotropin) [skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
Vivikananda E. 2014. Deteksi DNA babi dan DNA sapi dengan menggunakan
metode Insulated Isothermal Polymerase Chain Reaction (ii-PCR) [skripsi].
Jakarta (ID): Universitas Islam Negeri Syarief Hidayatullah.
 LAMPIRAN

Tabel 1 Kadar RNA homogenat hati ayam

Absorbansi Terkoreksi
 A sampel 1 terkoreksi = A sampel 1 terukur – A blanko
= 0.306 – 0.068
= 0.238
 A sampel 2 terkoreksi = A sampel 2 terukur – A blanko
= 0.564 – 0.068
= 0.496
 A standar terkoreksi = A standar terukur – A blanko
= 0.938 – 0.068
= 0.870
Konsentrasi RNA (mg/mL)
 [RNA] standar = 500.000 µg/mL
A sampel 1 terkoreksi
 [RNA] sampel 1 = x konsentrasi standar RNA
A standar RNA terkoreksi
0.238
 = 0.915 x 500.000 µg/mL
= 130.054 µg/mL
A sampel 2 terkoreksi
 [RNA] sampel 2 = A standar RNA terkoreksi x konsentrasi standar RNA
0.496
= 0.915 x 500.000 μg/mL
= 271.038 µg/mL

Tabel 2 Kadar DNA homogenat hati ayam

Absorbansi Terkoreksi
 A sampel 1 terkoreksi = A sampel 1 terukur – A blanko
= 0.378 – 0.344
= 0.034
 A sampel 2 terkoreksi = A sampel 2 terukur – A blanko
= 0.386– 0.344
= 0.042
 A standar terkoreksi = A standar terukur – A blanko
= 0.616 - 0.344
= 0.272
Konsentrasi DNA (mg/mL)
 [DNA] standar = 250.000 µg/mL
A sampel 1 terkoreksi
 [DNA] sampel 1 = A standar DNA terkoreksi x konsentrasi standar DNA
0.034
= 0.272 x 250.000 µg/mL
= 31.25 µg/mL
A sampel 2 terkoreksi
 [DNA] sampel 2 = x konsentrasi standar DNA
A standar DNA terkoreksi
0.042
= 0.272 x 250.000 µg/mL
= 38.60 µg/mL