Spektrofotometer merupakan alat yang digunakan untuk mengukur absorbansi dengan cara

melewatkan cahaya dengan panjang gelombang tertentu pada suatu objek kaca atau kuarsa yang
disebut kuvet. Sebagian dari cahaya tersebut akan di serap dan sisanya akan dilewatkan. Nilai
absorbansi dari cahaya yang di serap sebanding dengan konsentrasi larutan di dalam kuvet
(Sastrohamidjojo, 2007).

Spektrofotometer adalah alat untuk mengukur transmitan atau absorbans suatu sampel sebagai
fungsi panjang gelombang, tiap media akan menyerap cahaya pada panjang gelombang tertentu
tergantung pada senyawa atau warna terbentuk (Cairns, 2009).

Spektrofotometri Sinar Tampak (UV-Vis) adalah pengukuran energi cahaya oleh suatu sistem
kimia pada panjang gelombang tertentu (Day, 2002). Sinar ultraviolet (UV) mempunyai panjang
gelombang antara 200- 400 nm, dan sinar tampak (visible) mempunyai panjang gelombang 400-
750 nm. Spektrofotometri digunakan untuk mengukur besarnya energi yang diabsorbsi atau
diteruskan. Sinar radiasi monokromatik akan melewati larutan yang mengandung zat yang dapat
menyerap sinar radiasi tersebut (Harmita, 2006).

Pengukuran spektrofotometri menggunakan alat spektrofotometer yang melibatkan energi

elektronik yang cukup besar pada molekul yang dianalisis, sehingga spektrofotometer UV-Vis
lebih banyak dipakai untuk analisis kuantitatif dibandingkan kualitatif. Spektrum UV-Vis sangat
berguna untuk pengukuran secara kuantitatif. Konsentrasi dari analit di dalam larutan bisa
ditentukan dengan mengukur absorban pada panjang gelombang tertentu dengan menggunakan
hukum Lambert-Beer (Rohman, 2007).

Hukum Lambert-Beer menyatakan hubungan linearitas antara absorban dengan konsentrasi

larutan analit dan berbanding terbalik dengan transmitan (Rohman, 2007).

Salah satu syarat senyawa dianalisis dengan spektrofotometri adalah karena senyawa tersebut
mengandung gugus kromofor. Kromofor adalah gugus fungsional yang mengabsorbsi radiasi
ultraviolet dan tampak, jika diikat oleh gugus ausokrom. Hampir semua kromofor mempunyai
ikatan rangkap berkonjugasi (diena(C=C-C=C), dienon (C=C-C=O), benzen dan lain-lain.
Ausokrom adalah gugus fungsional yang mempunyai elektron bebas, seperti –OH, N , N , -X
(Harmita, 2006).

Keuntungan utama metode spektrofotometri adalah bahwa metode ini memberikan cara
sederhana untuk menetapkan kuantitas zat yang sangat kecil. Selain itu, hasil yang diperoleh
cukup akurat, dimana angka yang terbaca langsung dicatat oleh detector dan tercetak dalam
bentuk angka digital ataupun grafik yang sudah diregresikan (Yahya S,2013).

Faktor-faktor yang sering menyebabkan kesalahan dalam menggunakan spektrofotometer dalam

mengukur konsentrasi suatu analit:
1. Adanya serapan oleh pelarut. Hal ini dapat diatasi dengan penggunaan blangko, yaitu larutan
yang berisi selain komponen yang akan dianalisis termasuk zat pembentuk warna.
2. Serapan oleh kuvet. Kuvet yang ada biasanya dari bahan gelas atau kuarsa, namun kuvet dari
kuarsa memiliki kualitas yang lebih baik.
3. Kesalahan fotometrik normal pada pengukuran dengan absorbansi sangat rendah atau sangat
tinggi, hal ini dapat diatur dengan pengaturan konsentrasi, sesuai dengan kisaran sensitivitas
dari alat yang digunakan (melalui pengenceran atau pemekatan) (Sri Suyono, 2013).

Hal-hal yang harus diperhatikan dalam analisis spektrofotometri UV-Vis antara lain
pembentukan molekul yang dapat meyerap sinar UV-Vis, waktu operasional untuk mengetahui
waktu pengukuran yang stabil, pemilihan panjang gelombang, pembuatan kurva baku, serta
pembacaan absorbansi sampel atau cuplikan. Panjang gelombang yang digunakan untuk analisis
kuantitatif adalah panjang gelombang yang mempunyai absorbansi maksimal. Beberapa alasan
menggunakan panjang gelombang maksimal, yaitu panjang gelombang maksimal maka
kepekaannya juga maksimal, sehingga perubahan absorbansi untuk setiap satuan konsentrasi
adalah yang paling besar; disekitar panjang gelombang maksimal, bentuk kurva absorbansi datar
dan pada kondisi tersebut hokum Lambert-Beer juga terpenuhi; jika dilakukan pengukuran ulang,
maka kesalahan yang disebabkan oleh pemasangan ulang panjang gelombang akan kecil sekali
ketika menggunakan panjang gelombang maksimal (Gandjar dan Rohman, 2007).
Menurut Farmakope Amerika (USP), sebuah tablet parasetamol seharusnya mengandung tidak
kurang dari 90% (450 mg) dan tidak lebih dari 110% (550 mg) parasetamol. Persentase
kandungan dari analisis sampel menggunakan KCKT memiliki rentang 51,04-103,84%,
sedangkan menggunakan UV, rentangnya 50,19-109,2%, yang mengindikasikan tidak ada
sampel yang mengandung kurang dari 50% zat aktifnya (Audu, dkk, 2012).

Paracetamol merupakan obat yang bersifat analgesic (penahan rasa sakit/nyeri) dan antipiretik
(penurun panas/demam) adalah obat yang paling banyak dikonsumsi oleh masyarakat, karena
obat ini dapat berkhasiat untuk menyembuhkan demam, sakit kepala dan rasa nyeri. Umumnya
obat yang bersifat analgetik dan antipiretik ini mengandung zat aktif yang disebut asetaminofen
atau lebih dikenal dengan nama parasetamol. Obat ini beredar di masyarakat dalam berbagai
macam sediaan tablet, kaplet, kapsul, sirup, dan serbuk (Rachdiati, 2008).

Menurut FI Edisi IV tahun 1995 kadar PCT dapat ditentukan dengan menggunakan kromatografi
cair kinerja tinggi (KCKT) menggunakan kolom (3,9 mm x 30 cm) dengan fase gerak campuran
air-metanol (3:1), dideteksi pada panjang gelombang 243 nm dengan laju alir 1,5 mL/menit. PCT
dapat juga ditentukan menggunakan spektrofotometri.

Secara teoritis serapan maksimum untuk PCT adalah 244 nm, terjadi pergeseran karena pada
PCT memiliki gugus auksokrom yang terikat pada gugus kromofor. Apabila Auksokrom terikat
pada gugus kromofor akan mengakibatkan pergeseran pita absorbansi menuju ke panjang
gelombang yang lebih besar/pergeseran batokromik (Dachriyanus, 2004).