Anda di halaman 1dari 20

I.

Tujuan
 Melakukan deproteinase sampel darah menggunakan beberapa zat
pengendap protein
 Melakukan isolasi obat yang diuji dari matrik darah menggunakan
ekstraksi cair-cair

II. Prinsip
Prinsip proses deproteinasi adalah melepaskan ikatan ikatan antara
protein dan plasma dengan penambahan zat pengendap protein pada
serum sebelu melakukan pengukuran, yang berfungsi mengendapkan
protein.
Prinsip metode esktraksi cair-cair adalah proses pemisahan zat
terlarut berdasarkan pada kelarutan zat terlarut pada dua pelarut yang
tidak saling bercampur seperti eter, kloroform, karbontetra klorida, dan
karbon disulfida.

III. Teori Dasar


Penetapan kadar obat dalam plasma adalah salah satu bagian dari
pemantauan kadar obat didalam darah. Teknik ini biasa digunakan
klinisi untuk mengoptimalkan dosis obat dengan memberikan dosis
yang ditetapkan berdasarkan konsentrasi target dengan cara mengukur
kadar obat dalam darah dan bila perlu melakukan penyesuaian dosis.
Pemantauan kadar obat dalam darah ini bertujuan untuk membantu
meningkatkan penggunaan obat yang lebih rasional baik keamanan dan
efektifitas dosis pada individu penderita. (Chamberlain,1995)
Penelitian farmakokinetik melibatkan penentuan kadar obat dalam
sampel biologis. Metode analisi yang digunakan untuk penentuan
kuantitatif kadar obat dalam suatu sampel biologis merupakan hal yang
sangat penting dalam evaluasi dan interpretasi data farmakokinetika.
Berbagai sampel biologis dapat diambil untuk penentuan kadar dalam
tubuh untuk penelitian farmakokinetik, sebagai contoh darah, urin,
feses, saliva, jaringan tubuh, cairan blister, cairan spinal dan cairan
sinovial. (Chamberlain,1995)

Tabel XI. Daftar Sampel Biologis Bergantung pada Fluiditasnya


dalam Kaitanya dengan Tingkat Kemudahan Analisisnya
(Chamberlain,1995)

Tingkat Fluiditas Jenis Sampel Biologis


Cairan - Cairan serebrospinal
- Air mata.
- Keringat
- Ludah
- Urin
- Empedu
Campuran - Plasma
- Serum
- Darah
- Feses
Padatan - Otak
- Jantung, Ginjal dan Hepar
- Paru, Otot
- Tulang

1. Darah
Pengukuran konsentrasi obat dalam darah, serum, atau plasma
merupakan pendekatan paling baik untuk memperoleh profil
farmakokinetik obat didalam tubuh (Shargel, Wu Pong & Yu,
2005). Plasma adalah suatu cairan kompleks yang berfungsi
sebagai media transportasi untuk zat-zat yang diangkut dalam
darah. Konstituen plasma antara lain air, elektrolit, nutrien, zat sisa,
gas, hormon, dan protein plasma (Ganong, 2009). Plasma diperoleh
dari supernatan darah yang telah ditambah antikoagulan kemudian
disentrifugasi (Shargel, Wu Pong & Yu, 2005).
Prinsip kerja dari sentrifugasi yaitu objek diputar secara
horizontal. Pada saat objek diputar, partikel-partikel yang ada akan
berpisah sesuai berat jenis masing-masing partikel. Gaya yang
berperan dalam sentrifugasi ini adalah gaya sentrifugal. Setelah
dilakukan sentrifugasi, spesimen terpisah menjadi dua bagian yaitu
pellet yang berada di bagian bawah berupa endapan yang memiliki
bobot jenis yang lebih besar dan supernatan yang berada pada
bagian atas dengan warna yang lebih jernih yang memiliki bobot
jenis yang lebih kecil. Pellet berupa plasma sedangkan supernatan
adalah serum. Serum adalah bagian cairan darah, tanpa faktor
pembekuan atau sel darah. Sedangkan plasma adalah cairan darah
sebelum darah membeku yang mengandung unsur pembekuan
darah.(Bernasconi G. 1995)
Penentuan kadar suatu obat dalam plasma merupakan hal yang
kompleks disebabkan plasma merupakan suatu matriks yang
kompleks. Perlakuan awal terhadap sampel meliputi isolasi obat
yang akan ditentukan dari sampel matriks biologis harus dilakukan.
Preparasi sampel plasma agar dapat memisahkan atau mengisolasi
obat diupayakan menggunakan prosedur seminimal mungkin untuk
menghindari kehilangan obat yang akan ditentukan didalam
plasma. Semakin panjang tahapan prosedur untuk preparasi sampel
plasma hingga proses memisahkan atau mengisolasi obat maka
semakin besar kemungkinan hilangnya obat yang akan ditentukan.(
Hendra Adijuwana. 1989)
Beberapa cara preparasi sampel untuk penetapan kadar obat
dalam plasma (Evans, 2004), yakni :
a. Pengendapan Protein Plasma
Contoh zat pengendap protein: asam tungsat, amonium
sulfat, tricloro acetic acid (TCA), asam perklorat, ZnSO4,
metanol, dan asetonitril. Protein dapat diendapkan karena
memiliki berbagai sifat diantaranya bersifat sebagai amfoter
yakni memiliki 2 muatan yang berlainan dalam 1 molekul, atau
yang dikenal juga sebagai zwitter ion. Sifat ini membuat
protein memiliki muatan yang berbeda pada pH yang berbeda
pula. Akibatnya protein dapat larut pada rentang pH tertentu
dimana protein bermuatan
Suatu saat di pH tertentu protein akan mencapai titik
isoelektriik, yakni pH dimana jumlah obat total muatan protein
sama dengan nol (muatan positif sebanding dengan muatan
negatif), hal ini akan mempengaruhi kelarutan protein. Pada
titik isoelektrik, kelarutan protein sangat rendah, sehingga
protein dapat mengendap.
Selain itu, protein juga dapat membentuk ikatan dengan
logam dimana beberapa asam amino dapat terikat pada satu
logam sehingga molekulnya menjadi besar, beratnya juga
menjadi besar sehingga protein mengendap. Selain itu, terdapat
juga beberapa sifat lain yang berhubungan dengan presipitasi
protein ini yang dijelaskan pada mekanisme pengendapan oleh
masing-masing reagen.
Larutan (NH4)2SO4 merupakan garam dengan
konsentrasi tinggi. Mekanisme (NH4)2SO4 sebagai anti
presipitasi protein dikenal sebagai salting out, yakni penurunan
kelarutan protein dengan adanya peningkatan konsentrasi
garam. Hal ini terjadi karena interaksi antara air dengan gugus
polar dari protein menurun.
Kelarutan protein akan berkurang bila terdapat garam-
garam anorganik dalam konsentrasi tinggi mengakibatkan
pengendapan protein tersebut. Sifat ini terjadi karena
kemampuan ion garam untuk terhidrasi dan terjadi kompetisi
antara garam dengan molekul protein untuk mengikat air.
Mekanisme ZnSO4 – NaOH sebagai agen presipitasi
adalah NaOH akan memberikan suasana basa pada larutan dan
mengakibatkan protein berada dalam keadaan ion negatif atau
anion. Anion protein ini akan berikatan dengan ion positif yang
berasal dari logam berat yakni Zn2+ membentuk logam protein
yang tidak larut. Logam berat juga akan merusak struktur
sekunder dan tersier dari protein. Ikatan dari ion logam
bermuatan positif akan menurunkan kelarutan protein. Ion
logam akan berkompetisi dengan proton-proton pada larutan
untuk berikatan dengan asam amino. Semakin kuat ikatan ion-
ion logam untuk menggantikan ikatan oleh proton-proton akan
menurunkan pH larutan. Kombinasi dari perubahan pI,
penurunan pH (baik akibat ion logam maupun NaOH) akan
menyebabkan protein mengendap.
Penambahan larutan organik seperti metanol dan
asetonitril pada larutan protein dalam air akan menurrunkan
KD (Konestanta Dielektrik) pelarut/air yang meningkatkan
tarikan antara molekul-molekul bermuatan dan memfasilitasi
interaksi elektrostatik protein. Pelarut organik ini juga akan
menggantikan beberapa molekul air disekitar daerah hidrofob
dari permukaan protein yang berasosiasi dengan protein
sehingga menurunkan konsentrasi air dalam larutan dengan
demikian kelarutan protein akan menurun dan memungkinkan
terjadinya pengendapan.
a. Ekstaksi Padat-Cair (Solid-Phase Extraction)
Ekstaksi padat-cair menggunakan catridge khusus
untuk memisahkan obat dari sampel dengan volume relatif
lebih kecil (0,5-1mL) yang tersedia secara komersial dengan
harga yang cukup mahal.
b. Ekstraksi Cair-Cair
Ekstraksi cair-cair merupaka suatu metode yang paling
banyak digunakan karena relatif cepat, simpel, dan murah
dibandingkan dengan ekstraksi padat-cair. Ekstraksi ini
menggunakan pelarut pengekstraksi diikuti proses pemekatan
obat yang akan dianalisis. Pemilihan pelarut pengekstraksi
dalam ekstraksi cair-cair harus didasarkan pada sifat fitokimia
obat maupun metabolit yang akan diisolasi. Berbagai faktor
dapat menjadi pertimbangan dalam seleksi pelarut yang akan
digunakan antara lain :
- Tidak bercampur dengan air
- Mempunyai kemampuan melarutkan obat yang diinginkan
dalam jumlah yang besar sehingga memberikan nilai
recovery yang besar
- Mempunyai titik didih yang relatif rendah sehingga waktu
evaporasi pelarut relatif lebih singkat
- Sedapat mungkin volume yang digunakan untuk ekstraksi
adalah minimal sehingga akan menekan biaya yang
dikeluarkan
- Jika memungkinkan gunakan pelarut dengan berat jenis
yang lebih kecil dari berat jenis air sehingga proses
pemisahan pelarut organik akan lebih mudah karena pelarut
organik akan berada pada lapisan atas
2. Urin
Urin, berbeda dengan plasma atau serum, biasanya bebas dari
protein atau lemak sehingga bisa diekstraksi langsung dengan
pelarut organic. Meskipun begitu, urin memiliki banyak variasi
komposisi dan sangat tergantung pada jenis makanan yang
dikonsumsi. Normalnya senyawa yang ditemukan dalam urin
adalah larut air, sedangkan sebagian besar obat larut lipid sehingga
dapat diekstraksi dengan pelarut yang cocok.
Kesulitan dalam pengumpulan sampel urin adalah volume urin
yang benar yang diproduksi selama interval waktu sampling, bukan
pada penetapan kadarnya. Jumlah analit diperoleh dengan
mengalikan volume dan konsentrasinya. Sampel urin juga sering
memberikan hasil negative palsu misalnya pada pemeriksaan
kreatinin. Urin juga memiliki variasi pH yang lebar, dipengaruhi
oleh konsumsi makanan atau obat-obatan. Penggunaan antasida
misalnya, kemungkinan bisa menyebabkan urin menjadi basa.
Asam kuat tidak besar pengaruhnya, pH urin normal berkisar 5,5-
7.( Katzung.2011)

3. Feses
Penanganan sampel feses cukup rumit, mengingat bentuknya
semi padat dan juga berupa campuran sisa-sisa proses pencernaan
maupun senyawa-senyawa sisa proses metabolisme tubuh. Harus
dipikirkan pengambilan cuplikan yang tepat dan juga jenis pelarut
yang cocok karena banyaknya senyawa yang terkandung, apalagi
jika kadar analit dalam sampel kecil. .( Katzung.2011)

4. Sampel biologis lain


Sampel biologis yang lain bisa berupa air susu, cairan
serebrospinal, empedu, ludah dan lain-lain, masing-masing
memiliki kekhasan sifat dan kandungan senyawa yang berbeda.
Kelarutan obat dalam tiap larutan juga berbeda sehingga pemilihan
pelarut harus dilakukan secara cermat. ( Katzung.2011)
IV. Alat dan Bahan

NO Alat Bahan
1 Vortex zat pengendap protein 10%
(b/v) TCA
2 Sentrifugasi Larutan Jenuh (NH2SO4)

3 Rotari evaporator 10% (b/v) ZnSO4 – NaOH 0,5N


vakum (1:1)
4 Tabung acetonitrile
Mikrosentrifugasi
5 Mikropipet Metanol
6 Roller mixer Plasma blangko
7 Kloroform
8 N-heksan
V. Prosedur
 Presipitasi Protein I
Dipipet 250 µL plasma blanko ke dalam tabung Mikrosentrifugasi

Ditambahkan zat pengendap protein 10% (b/v) TCA dengan


perbandingan 1 : 2, Larutan Jenuh (NH2SO4), 10% (b/v) ZnSO4 –
NaOH 0,5N (1:1), acetonitrile dan Metanol dengan perbandingan
plasma 1 : 2

Divortex selama 2 detik

Disentrifugasi dengan kecepatan 3500 – 6000 rpm selama 15 menit

Diamati supernatan dan endapan yang diperoleh dan


bandingkan hasil yang diperoleh menggunakan berbagai zat
pengendap protein yang digunakan.
 Ekstraksi cair-cair

Dipipet 1 ml plasma balanko ke dalam 2 tabung sentrifugas

Ditambahkan pelarut pengekstraksi : Kloroform sebanyak 5 ml ke


dalam tabung 1 dan n-heksan sebanyak 5 ml ke dalam tabung 2

kemudian divortex 15 menit

Disentrifugasi dengan kecepatan 3500 -6000 rpm selama 15 menit.

Diamati perbedaan yang terjadi dari hasil ekstraksi menggunakan


pelarut kloroform dan n-heksan

VI. Hasil Pengamatan


a. Pengendapan protein plasma

Zat pengendap Endapan Kejernihan Gambar


protein
10% (b/v) TCA 0,1 +
(sangat tidak
jernih )
Larutan jenuh 0,4 ++++
(NH4)2SO4 (jernih)

10% (b/v) ZnSO4- 0,5 +++++


NaOH 0,5 N (1:1) (paling
jernih)

Acetonitril 0,2 +++


(kurang
jernih)

Metanol 0,3 ++
(tidak
jernih)

Keterangan :
Zat pengendap protein paling bagus dilihat dari hasil pengendapan dan
kejernihannya yaitu pada ZnSO4 + NaOH. Sedangkan zat pengendap
protein paling buruk yaitu pada TCA.
b. Ekstraksi cair-cair
Pelarut pengekstraksi Pengamatan
1. n-heksan Bagian yang paling atas yang
bening merupakan bagian pelarut
n-heksan. Bagian tengah yang
terlihat keruh merupakan emulsi.
Dan bagian paling bawah yang
berwarna kuning merupakan
plasma.
Emulsi yang terbentuk lebih
sedikit.
2. Kloroform Bagian yang paling atas yang
berwarna kuning merupakan
plasma. Bagian tengah yang
terlihat keruh merupakan emulsi.
Dan bagian paling bawah yang
terlihat bening merupakan pelarut
kloroform.
Emulsi yang terbentuk lebih
banyak.

Keterangan : ekstraksi cair- cair yang paling bagus adalah ekstraksi


yang menggunakan pelarut n-heksan karena emulsi yang terbentuk
sedikit. Sedangkan ekstraksi cair-cair yang paling buruk yang
menggunakan pelarut kloroform karena emulsi yang terbentuk lebih
banyak.
VII. Pembahasan
Pemeriksaan farmakokinetika melibatkan penentuan kadar obat
dalam sampel biologis. Sampel biologis adalah sampel yang diambil
dari sebagian tubuh untuk tujuan analisis, misalnya darah, urine,
liver/hati, empedu, otak, ginjal, otot, rambut, atau bagian tubuh
(Shargel et al., 2005). Penentuan kadar obat dalam sampel biologis
mempunyai beberapa tujuan, diantaranya yaitu untuk
mengetahui/menetapkan adanya atau jumlah senyawa endogenik
tertentu dengan tujuan diagnosa, untuk menetapkan adanya atau
jumlah senyawa eksogenik (berasal dari luar tubuh) seperti analisis
metabolit, keracunan, dan ketersediaan hayati suatu obat, dan untuk
memantau penggunaan obat baik dalam analisis farmakodinamik,
pemantauan maupun kepatuhan pasien (Shargel et al., 2005). Berbagai
kendala perlu diperhatikan dalam penentuan kadar obat dalam sampel
biologis diantaranya yaitu kadar analit biasanya rendah sehingga perlu
metode analisis yang sensitif, dalam sampel biologis biasanya
mengandung berbagai senyawa baik endogen maupun eksogen yang
dapat mempengaruhi hasil analisis sehingga perlu analisis yang selektif
atau dilengkapi dengan teknik pemisahan sebelum dilakukan analisis
(Shargel et al., 2005).
Pada percobaan kali ini dilakukan percobaan perlakuan awal
sampel biologis dan pemisahan zat aktif dengan tujuan untuk
melakukan berbagai teknik presipitasi protein dari sampel plasma dan
melakukan ekstraksi cair-cair terhadap plasma menggunakan berbagai
pelarut organik. Preparasi sampel biologis bertujuan untuk
menghilangkan pengotor atau bahan yang dapat menggangu proses
analisis.
Sampel yang digunakan pada percobaan kali ini yaitu plasma.
Plasma merupakan komponen darah berbentuk cairan berwarna
kuning, sebagian besar terdiri dari air (95%), protein (7%) dan nutrien
(1%). Didalam plasma terdapat faktor-faktor pembeku darah,
komplemen, haptoglobin, transferin, feritin, seruloplasmin, kinina,
enzim, polipeptida, glukosa, asam amino dan lain-lain (Evelyn, 2009).
Pengambilan plasma dari darah dapat dilakukan dengan metode
sentrifugasi dimana darah langsung disentrifugasi menggunakan alat
centrifuge, hasil dari sentrifugasi berupa supernatan yang berwarna
kuning jernih disebut plasma (Evelyn, 2009).
Penentuan kadar obat didalam plasma sangat dipengaruhi oleh
adanya protein plasma, dimana dapat berikatan dengan obat sehingga
diperlukan tahap perlakuan awal dan/atau penyiapan sampel sebelum
penentuan kadar obat dapat dilakukan. Tahap tersebut harus dapat
memutuskan ikatan antara obat dengan protein, sehingga obat tidak
lagi berikatan dengan protein yang dapat mengganggu proses analisis.
Pemutusan ikatan antara obat dengan protein tersebut dapat dilakukan
dengan beberapa cara diantaranya yaitu mengatur pH sampel pada pH
ekstrim (pH<3 atau pH>9) dengan penambahan asam atau basa,
presipitasi protein menggunakan pelarut polar dan penambahan asam
atau garam anorganik. Parameter yang digunakan untuk melihat
apakah proses pemisahan menggunakan berbagai cara tersebut
sempurna atau tidak yaitu dengan melihat kejernihan supernatan dan
volume endapan yang diperoleh.
Pengendapan protein bertujuan untuk memutuskan ikatan antara
obat–protein dengan cara mengendapkan protein. Pengendapan protein
plasma dilakukan dengan cara menambahkan zat pengendap protein
seperti TCA 10%, larutan jenuh (NH4)2SO4, ZnSO4 10% –NaOH 0,5N
(1:1), asetonitril dan metanol dengan perbandingan yang sesuai
kedalam masing-masing tabung mikrosentrifuga yang telah berisi 250
µL plasma blanko. Kemudian semua tabung mikrosentrifuga divortex
selama 2 menit, hal ini bertujuan agar protein plasma kontak dengan
zat pengendap protein sehingga menghasilkan larutan yang homogen.
Setelah itu disentrifugasi dengan kecepatan 3500 rpm selama 15 menit.
Sentrifugasi adalah metode sedimentasi untuk memisahkan partikel-
partikel dari suatu fluida berdasarkan berat jenisnya dengan
memberikan gaya sentripetal (Khopkar, 2010). Sentrifugasi dengan
kecepatan tinggi bertujuan untuk memisahkan komponen-komponen
yang ada didalam plasma. Prinsipnya yakni dengan meletakkan sampel
pada suatu gaya dengan memutar sampel pada kecepatan tinggi,
sehingga terjadi pengendapan partikel, atau organel-organel sel
berdasarkan bobot jenisnya (Artika, 2010). Substansi yang bobot
jenisnya lebih besar akan berada dibawah yang disebut dengan
endapan, sedangkan substansi yang bobot jenisnya lebih kecil akan
berada diatas yang disebut dengan supernatan (Miller, 2000).
Kemudian diamati supernatan dan endapan yang diperoleh.
Terbentuknya endapan menunjukkan bahwa zat pengendap protein
yang digunakan berhasil mengendapkan protein tersebut.
Setalah disentrifugasi dilakukan pengamatan terhadap supernatant
dan endapan yang diperoleh.
Pengamatan dilakukan terhadap 2 aspek, yaitu kejernihan
supernatant dan banyaknya endapan. Dari kedua aspek pengamatan
tersebut dapat disimpulakan zat pengendap protein yang mana yang
lebih baik. Jika suatu campuran memiliki supernatant yang lebih jernih
dan mengandung endapan yang lebih banya maka zat pengendap
protein yang digunakan lebih baik, karena semakin jernih dan semakin
banyak endapan yang diperoleh makan zat tersebut bekerja dengan
baik dalam memisahkan sampel dari padatan.
Pada tabung mikrosentrifuga yang ditambahkan zat pengendap
protein ZnSO4 10%–NaOH 0,5N (1:1) dengan perbandingan 1:2
(plasma: ZnSO4 10%–NaOH 0,5N (1:1) menghasilkan volume
endapan sebanyak 0,5 mL dan supernatan yang diperoleh dengan
tingkat kejernihan pada urutan ke-1 sebagai zat pengendap protein
yang bekerja maksimal. ZnSO4–NaOH sebagai zat pengendap protein
memiliki mekanisme dalam mengendapkan protein yaitu NaOH akan
memberikan suasana basa pada larutan dan mengakibatkan protein
berada dalam keadaan ion negatif atau anion. Anion protein ini akan
berikatan dengan ion positif yang berasal dari Zn2+ sehingga
membentuk logam protein yang tidak larut. Ikatan dari ion logam
bermuatan prositif akan menurunkan kelarutan protein. Logam berat
juga akan merusak struktur sekunder dan tersier dari protein. Ion
logam akan berkompetisi dengan proton pada larutan untuk berikatan
dengan asam amino, semakin kuat ikatan ion-ion logam untuk
menggantikan ikatan oleh proton maka akan menurunkan pH larutan.
Kombinasi dari penurunan pH akan menyebabkan protein mengendap
(Moshage et al., 1995).
Pada tabung mikrosentrifuga yang ditambahkan zat pengendap
protein larutan jenuh (NH4)2SO4 dengan perbandingan 1:2
(plasma:larutan jenuh (NH4)2SO4 menghasilkan volume endapan
sebanyak 0,4 mL dan supernatan yang diperoleh dengan kejerniha
pada urutan ke-2. Larutan jenuh (NH4)2SO4 merupakan garam dengan
konsentrasi tinggi, dimana (NH4)2SO4 sering disebut sebagai anti
presipitasi protein (salting out). (NH4)2SO4 sebagai zat pengendap
protein memiliki mekanisme dalam mengendapkan protein yaitu
salting out dimana terjadi penurunan kelarutan protein dengan adanya
peningkatan konsentrasi garam. Protein kurang terlarut ketika berada
pada daerah yang konsentrasi kadar garam anorganik tinggi sehingga
kelarutan protein akan menurun dan protein akan mengendap. Protein
larut didalam plasma yang sebagian besar komponen utamanya yaitu
air kemudian ditambahkan garam yang memiliki sifat meretensi atau
menarik air, sehingga terjadi kompetisi antara protein dengan garam
dalam menarik atau mengikat air. Pada konsentrasi tinggi, kekuatan
ionik garam semakin kuat sehingga garam lebih dapat mengikat
molekul air, maka jumlah air yang tersedia untuk molekul protein akan
berkurang. Dengan demikian, tidak cukup banyak air yang terikat pada
protein sehingga gaya tarik menarik antar molekul protein lebih
menonjol dibandingkan dengan tarik menarik antara air dan protein.
Dalam kondisi seperti itu protein akan mengendap (Mayes et al.,
1990).
Pada tabung mikrosentrifuga yang ditambahkan zat pengendap
protein asetonitril dengan perbandingan 1:2 (plasma:asetonitril)
menghasilkan volume endapan sebanyak 0,2 mL dan supernatan yang
diperoleh dengan kejernihan (+++) pada urutan ke-3. Pada tabung
mikrosentrifuga yang ditambahkan zat pengendap protein metanol
dengan perbandingan 1:2 (plasma:metanol) menghasilkan volume
endapan sebanyak 0,3 mL dan supernatan yang diperoleh dengan
kejernihan (++) pada urutan ke-4. Metanol dan asetonitril merupakan
pelarut organik polar yang dapat mengendapkan protein. Konstanta
dielektrik menggambarkan tingkat kepolaran suatu pelarut. Semakin
tinggi nilai KD maka sifat pelarut semakin polar sebaliknya semakin
rendah nilai KD maka sifat pelarut semakin non polar. Suatu zat akan
terlarut sempurna dalam pelarut yang nilai KDnya sama. Protein larut
didalam plasma yang sebagian besar komponen utamanya yaitu air,
sehingga KD protein dianggap hampir sama dengan KD air atau
plasma. Metanol dan asetonitril sebagai zat pengendap protein
memiliki mekanisme dalam mengendapkan protein yaitu plasma
sebagian besar komponen utamanya yaitu air ditambahkan dengan
metanol dan asetonitril (pelarut organik polar) akan menurunkan nilai
konstanta dielektrik plasma yang mengandung protein terlarut
sehingga nilai KD plasma akan semakin jauh dengan protein
sedangkan nilai KD protein tetap karena merupakan zat terlarut bukan
pelarut, akibatnya nilai KD protein dengan plasma berbeda. Perbedaan
nilai KD tersebut menyebabkan protein menjadi tidak larut sempurna
dan protein akan mengendap. Pengendapan ini berkaitan dengan
potensi Ion (pI) protein, dimana semakin jauh dari titik isoelektrik
maka kelarutan akan semakin meningkat dan semakin dekat dengan
titik isoelektrik maka kelarutan akan semakin menurun. Penambahan
pelarut organik pada larutan protein dalam air akan menurunkan nilai
KD. Pelarut atau air yang meningkatkan tarikan antara molekul-
molekul bermuatan dan memfasilitasi interaksi elektrostatik protein.
Selain itu pelarut organik ini juga akan menggantikan beberapa
molekul air di sekitar daerah hidrofob dari permukaan protein yang
berasosiasi dengan protein sehingga menurunkan konsentrasi air dalam
larutan dengan demikian kelarutan protein akan menurun dan
memungkinkan terjadinya pengendapan (Guevara, 1998).
Pada tabung mikrosentrifuga yang ditambahkan zat pengendap
protein TCA 10% dengan perbandingan 1:0,2 (plasma:TCA 10%)
menghasilkan volume endapan sebanyak 0,01 mL dan supernatan yang
diperoleh dengan kejernihan (+) pada urutan ke-5. Protein dapat
diendapkan karena memiliki 2 muatan yang berlainan didalam 1
molekul. Muatan tersebut membuat protein dapat larut dalam plasma
pada rentang pH tertentu. Pada pH tertentu protein akan mencapai titik
isoelektrik, dimana jumlah total muatan protein sama dengan nol
(netral) sehingga akan mempengaruhi kelarutan protein. Ketika
kelarutan protein sangat rendah protein akan dapat diendapkan. TCA
10% sebagai zat pengendap protein memiliki mekanisme dalam
mengendapkan protein yaitu TCA memiliki muatan ion negatif
sehingga akan bergabung dengan protein yang ada pada kondisi kation
(pH larutan dalam kondisi asam hingga pH isoelektrik protein)
sehingga akan membentuk garam protein, beberapa garam yang
dihasilkan tersebut tidak larut (mengendap) sehingga plasma dan
protein terpisah (Hurana et al, 2001).
Pada percobaan ini dapat disimpulkan zat pengendap protein yang
paling baik dalam mengendapkan protein yaitu ZnSO4-NaOH karena
menghasilkan volume endapan paling banyak yaitu 0,5 mL sehingga
banyak protein yang terendapkan dimana semua protein yang
terdenaturasi terendapkan pada proses sentrifugasi. Dan menghasilkan
supernatan dengan kejernihan pada urutan ke-1. ZnSO4-NaOH
memiliki mekanisme dalam mengendapkan protein yaitu pembentukan
kompleks yang tidak larut antara logam dengan protein dan logam
dapat merusak struktur sekunder dan tersier dari protein.
Selanjutnya pada percobaan ini dilakukan ekstraksi cair-cair
dengan menggunakan pelarut organik (klorofom dan n-heksan) yang
bertujuan untuk mengisolasi atau menarik obat dari plasma. Parameter
yang digunakan untuk melihat apakah proses isolasi atau penarikan
obat dari plasma tersebut terpisah sempurna atau tidak yaitu dengan
melihat lapisan yang terbentuk. Keberhasilan suatu proses ekstraksi
cair-cair ditandai dengan banyaknya obat yang dapat diisolasi atau
ditarik dari plasma. Tetapi pada percobaan kali ini plasma yang
digunakan tidak mengandung obat sehingga tidak dapat ditentukan
jumlah obat yang dapat ditarik dari plasma.
Ekstraksi cair-cair merupakan metode ekstraksi yang didasarkan
pada sifat kelarutan komponen target dan distribusinya dalam dua
pelarut yang tidak saling bercampur (Khopkar, 2002). Pemilihan
pelarut yang akan digunakan harus memilki sifat immiscible (tidak
bercampur dengan air dan mampu melarutkan oabt yang diinginkan
(Basset et al., 1994). Syarat pelarut untuk ekstraksi cair-cair adalah
memiliki kepolaran yang sesuai dengan bahan yang diekstraksi
(Harvey, 2000). Keterbatasan ekstraksi cair-cair yaitu tidak bisa
digunakan untuk senyawa obat yang polar atau larut didalam air, hal
ini karena tidak adanya pelarut yang lebih polar dari air sehingga obat
tidak dapat diisolasi. Prinsip ekstraksi cair-cair yaitu pemisahan
berdasarkan partisi yang dinyatakan dengan nilai koefisien partisi.
Ektraksi cair-cair ditentukan oleh distribusi Nerst atau hukum partisi
yang menyatakan bahwa “pada konsentrasi dan tekanan yang konstan,
analit akan terdistribusi dalam proporsi yang selalu sama diantara dua
pelarut yang saling tidak campur” (Khopkar, 2002).
Langkah awal yang dilakukan dalam percobaan ini adalah
mencampurkan 1 ml plasma blanko dengan dua jenis pelarut, yaitu
chloroform dan n-heksan yang diletakkan pada tabung yang berbeda.
Setelah dicampurkan ke dalam tabung sentrifuga lalu divortex selama
15 menit dan disentrifuga selama 15 menit dengan kecepatan 4000
rpm. Tujuan disentrifuga dengan kecepatan tinggi adalah proses
ekstraksi terjadi dengan sempurna, sedangnkan fungsi dari sentrifugasi
adalah agar komponen-komponen yang telah terpisah setelah proses
ekstraksi dengan bantuan vortex dapat terpisah sepurna antara fasa air
dengan fasa pelarut.
Parameter yang digunakan yaitu dengan melihat berat jenis dan
lapisan yang terbentuk. Diperoleh hasil pada tabung pertama dengan
menggunakan pelarut kloroform yaitu terbentuk 2 lapisan dimana pada
bagian atas berwarna kuning bening berupa plasma dan bagian bawah
berwarna putih susu berupa emulsi protein bercampur dengan pelarut
kloroform. Kloroform memiliki berat jenis 1,476 g/mL (DepKes RI,
2014) sedangkan plasma memiliki berat jenis 1,024-1,028 g/mL, berat
jenis kloroform lebih besar daripada berat jenis plasma sehingga posisi
kloroform akan berada dibawah sedangkan posisi plasma berada diatas
karena berat jenisnya lebih kecil daripada kloroform.
Pada tabung kedua dengan menggunakan pelarut n-heksan yaitu
terbentuk 3 lapisan dimana pada bagian atas berwarna bening berupa
pelarut n-heksan, pada bagian tengah berwarna putih susu berupa
emulsi protein, dan pada bagian bawah berwarna kuning bening berupa
plasma. N-heksan memiliki berat jenis 0,6548 g/mL (DepKes RI,
2014) sedangkan plasma memiliki berat jenis 1,024-1,028 g/mL, berat
jenis n-heksan lebih kecil daripada berat jenis plasma sehingga posisi
n-heksan akan berada diatas sedangkan posisi plasma berada dibawah
karena berat jenisnya lebih besar daripada n-heksan.
Lapisan emulsi dapat terbentuk karena protein dapat berfungsi
sebagai emulgator sehingga ketika disentrifugasi akan terbentuk
emulsi. Dilihat dari jumlah emulsi protein yang terbentuk dapat
disimpulkan bahwa ekstraksi menggunakan pelarut n-heksan lebih
baik dibandingkan pelarut kloroform karena emulsi protein yang
terbentuk hanya sedikit sehingga akan lebih mudah dianalisis.

Dari hasil pengamatan didapatkan hasil bahwa pelarut n-heksan


dapat mengekstrak zat aktif lebih baik dari pada kloroform. Hal ini
dapat dilihat dari lapisan cairan yang terentuk setelah proses
sentrufugasi. Pada pelarut n-heksan plasma dan pelarut terpisah
dengan baik dan hanya menyisakan sedikit lapisan emulsi pada lapisan
antarmuka kedua pelarut, sedangkan pada pelarut kloroform lapisan
kedua pelarut tidak terpisah dengan baik dan terdapat lapisan emulsi
yang banyak.

VIII. Kesimpulan
• Zat pengendap protein yang paling efektif adalah ZnSO4 + NaOH
(NaSO4), sedangkan yang kurang efektif adalah TCA.
• Pelarut yang lebih efektif dalam memisahkan zat aktif dengan
metode ekstraksi cair-cair adalah n-heksan
Daftar Pustaka

Adnan, M. 1997. Teknik Kromatografi Untuk Analisis Bahan


Makanan. Yogyakarta : Penerbit Andi.
Artika IM, Safithri M. 2010. Diktat Kuliah Struktur dan Fungsi
Subseluler.
Basset dkk. 1994. Buku Ajar Vogel Kimia Analisis Kuantitatif
Anorganik. Jakarta : EGC.
Bernasconi G. 1995. Teknologi Kimia I. Jakarta: Pradya Paramita
Chamberlain, J.,1995. The Analysis of Drugs in Biological Fluids 2 nd
Ed. New York : CRC Press.
Departemen Kesehatan Republik Indonesia. 2014. Farmakope
Indonesia Edisi V. Jakarta. Direktorat Jenderal Pengawasan
Obat dan Makanan.
Evelyn CP, 2009. Anatomi dan Fisiologi untuk Paramedis. Jakarta.
Gramedia.
Evans, G. 2004. A Handbook of Bioanaysis and Drug Metabolism.
USA : CRC Press.
Ganong, W. F. 2009. Buku Ajar Fisiologi Kedokteran. Edisi 22.
Jakarta: EGC.
Guevara et al. 1998. Determination of Nitrite/Nitrate in Human
Biological Material by the Simple Griess Reaction. Clin. Chim.
Acta.
Hendra Adijuwana. 1989. Teknik pemisahan Dalam Analisis Biologis.
Bogor: IPB Press
Harvey David. 2000. Modern Analytical Chemistry. New York :
McGraw-Hill Comp.
Hurana et al. 2001. Biochemistry. Partially Folded Intermediates as
Critical Precursor of Light Chain Amyloid Fibrils and
Amorphous Aggregates.
Katzung.Bertram, G. 2011 farmakologi dasar dan klinik, edisi 10.
Jakarta: pustaka buku kedokteran
Khopkar, S.M., 2002. Konsep Dasar Kimia Analitik. Jakarta : UI
Press.
Khopkar.S.M. 2010. Konsep dasar Kimia Analitik. Jakarta : UI Press.
Martin, Alfred. Ph.D. 1990. Farmasi Fisik: Dasar-dasar kimia fisik
dalam ilmu farmasetik. Jakarta : Penerbit Universitas Indonesia.
Mayes, P.A., Granner, D.K., Rodwell, V.W., dan Martin, D.W., 1990.
Biokimia Harper Edisi 20. Jakarta : Penerbit Buku Kedokteran.
Miller J.N. 2000. Statistics and Chemometrics for Analytical
Chemistry 4th ed. Harlow: Prentice. Hall.
Moshage et al. 1995. Nitrite and Nitrate Determination in Plasma: a
Critical Evaluation. Clin. Chem.
Shargel, Leon., Susanna Wu-Pong, Andrew B. C. Yu. 2005.
Biofarmasetika dan Farmakokinetika Terapan, Edisi V,
terjemahan Fasich dan Budi Suprapti. Surabaya : Airlangga
University Press.

Anda mungkin juga menyukai