i

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

INSTITUTO DE BIOFÍSICA CARLOS CHAGAS FILHO

CAROLINA MONTEIRO DE LEMOS BARBOSA

MODULAÇÃO DO CANAL DE CLORETO CFTR EM CÉLULAS

DE TÚBULO DISTAL RENAL PELA ARGININA
VASOPRESSINA E PELO CHOQUE HIPEROSMÓTICO

RIO DE JANEIRO

2009
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 ii

CAROLINA MONTEIRO DE LEMOS BARBOSA

MODULAÇÃO DO CANAL DE CLORETO CFTR EM CÉLULAS

DE TÚBULO DISTAL RENAL PELA ARGININA
VASOPRESSINA E PELO CHOQUE HIPEROSMÓTICO

Dissertação de mestrado apresentada ao programa de

pós-graduação em Ciências Biológicas (Fisiologia), do
Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho da
Universidade Federal do Rio de Janeiro como parte dos
requisitos necessários à obtenção do título de Mestre em
Ciências Biológicas (Fisiologia).

ORIENTADOR: MARCELO MARCOS MORALES

Universidade Federal do Rio de Janeiro

Centro de Ciências da Saúde
Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho
2009

FOLHA DE APROVAÇÃO
 iii

MODULAÇÃO DO CANAL DE CLORETO CFTR EM CÉLULAS DE TÚBULO

DISTAL RENAL PELA ARGININA VASOPRESSINA E PELO CHOQUE
HIPEROSMÓTICO

CAROLINA MONTEIRO DE LEMOS BARBOSA

DISSERTAÇÃO SUBMETIDA À UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO

VISANDO A OBTENÇÃO DO GRAU DE MESTRE EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
(FISIOLOGIA).

Rio de Janeiro, 10 de junho de 2009.

___________________________________________________ Data:___ / ___ / ___

Dr. MARCELO MARCOS MORALES (ORIENTADOR)

___________________________________________________ Data:___ / ___ / ___

Dra. CARMEN CABANELAS PAZOS DE MOURA

___________________________________________________ Data:___ / ___ / ___

Dra. JENNIFER LOWE

___________________________________________________ Data:___ / ___ / ___

Dr. MAURILO DE NAZARÉ DE LIMA LEITE JÚNIOR

___________________________________________________ Data:___ / ___ / ___

Dra. VÂNIA MARIA CORRÊA DA COSTA (REVISORA)
 iv

BARBOSA, Carolina Monteiro de Lemos

Modulação do canal de cloreto CFTR em células de túbulo
distal renal pela arginina vasopressina e pelo choque
hiperosmótico/ xviii, 72
Orientador: Morales, Marcelo Marcos
Dissertação de Tese de Mestrado apresentada à
Universidade Federal do Rio de Janeiro - UFRJ.
1. CFTR 2. AVP 3. Choque Hiperosmótico 4. MDCK
 v

O presente trabalho foi realizado no Laboratório de Fisiologia Celular e Molecular do

Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho da Universidade Federal do Rio de Janeiro na
vigência de auxílios concedidos pela Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do
Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), pela Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de
Nível Superior (CAPES), pelo Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e
Tecnológico (CNPq) e pelo Ministério da Saúde (MS).
 vi

Aos meus pais, pelo amor

incondicional e por não deixarem que
eu desista dos meus sonhos.
 vii

AGRADECIMENTOS

Agradeço a Deus pela saúde, inspiração e capacidade de realizar este trabalho.

Ao professor Marcelo Morales, meu orientador, pelos ensinamentos. Obrigada pela

paciência e confiança creditada em mim.

Ao professor e também amigo Jackson de Souza Menezes, por toda a ajuda e

dedicação, pela amizade e pelos momentos de descontração.

Ao professor William Guggino e à Roberta Marques Lassance, pela participação

essencial na elaboração do presente trabalho.

A Horacio Javier Novaira, pelo incentivo na realização do início deste projeto.

A todos do Laboratório de Fisiologia Celular e Molecular que conheci durante o

período de execução desse trabalho: Débora, Roberta, Sabrina, Felipe Prota, Felipe Ornellas,

Helber, Tatiana, Raquel, André, Viviane, Verônica, Maicon, Jaqueline, Miriam, Tiago,

Ricardo, Monique, Miquéias e Anna Carolina. Obrigada pelos ensinamentos e por fazerem do

nosso local de trabalho um ambiente tão agradável. Em especial à Raquel, pela amizade,

conversas, estudos, telefonemas, risos e choros.

À ex-colega de laboratório e também minha médica, Vera Tostes, pelos cuidados e

pelo carinho.

À professora Vânia pela revisão da dissertação. Muito obrigada.

Aos professores Carmen Cabanelas, Jennifer Lowe e Maurilo Leite pela participação

na banca desta dissertação.

Aos meus pais, agradeço pelo apoio, dedicação, incentivo, paciência e carinho.

A meus irmãos, Cristina e Fabrício, obrigada pela paciência, amor e por acreditarem

em mim.

A meu sobrinho e afilhado, Antonio, por ser minha luz e alegria todos os dias.
 viii

Ao meu namorado, Pedro, obrigada pelas palavras de incentivo, pelas longas

conversas e por todo amor e carinho.

Aos amigos especiais Gabriela, Jovanka, Renata e Helber, obrigada pela incrível

amizade que levarei para sempre.

A todos da minha família pela alegria, incentivo e palavras amigas.

A todos os amigos que de alguma forma contribuíram para esta conquista.

 ix

RESUMO

BARBOSA, Carolina Monteiro de Lemos. Modulação do canal de cloreto CFTR em células

de túbulo distal renal pela arginina vasopressina e pelo choque hiperosmótico. Dissertação de
Mestrado (Ciências Biológicas – Fisiologia) – Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho,
Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2009.

Pacientes com mutações no gene que codifica o canal de cloreto CFTR apresentam o quadro
conhecido como fibrose cística. Estes indivíduos não apresentam disfunções renais
importantes, mas estudos recentes mostraram que estes pacientes apresentam redução da
capacidade de concentração urinária. O objetivo deste trabalho é verificar se a expressão do
CFTR é modulada por fatores envolvidos com a concentração urinária tais como AVP e
hipertonicidade extracelular em células MDCK. A análise estatística deste estudo foi feita por
por ANOVA univariante (pós-teste de Newman-Keuls). Diferenças foram consideradas
significativas quando p<0,05. Foram utilizadas células MDCK, derivadas de rim canino. Pela
técnica de Western blot, foi observado que o tratamento com AVP, 10-8 M por 24 h a 370 C,
induziu um aumento na expressão da proteína CFTR em relação às células controle
(0,44±0,09; n=3; p<0,05). Pelo uso de PCR semi-quantitativo também foi observado que o
AVP induz um aumento na expressão do RNAm do CFTR em relação as células controle
(1,14±0,35, n=4, p<0,05). Células também foram tratadas com AVP juntamente com
antagonistas dos receptores V1 ([Pmp1,Tyr(Me)2]AVP) ou V2 (OPC-31260) a 10-5 M e
somente os grupos tratados com antagonistas V2 tiveram a inibição do aumento da expressão
do RNAm promovido pelo AVP, indicando que este receptor esteja envolvido na modulação
do CFTR (n=4, p<0.05). A análise do estímulo da região promotora do CFTR foi realizada
através da cotransfecção das células com plasmídeos contendo o promotor do gene do CFTR
e outro com um promotor associado ao gene da β-galactosidase (controle interno). Foi
observado um estímulo da região promotora quando as células são tratadas com AVP 10-8M e
10-9 M (0,21±0,03 e 0,19±0,05, respectivamente, n=4, p<0,01). Quando as células foram
tratadas com meios hipertônicos (NaCl 480 mOsm, ureia 480 mOsm, sacarose 480mOsm,
NaCl 560 mOsm, ureia 560 mOsm e sacarose 560 mOsm) foi possível observar um aumento
da expressão da proteína CFTR, presente na membrana plasmática das células, tanto por
microscopia confocal 0,62±0,11; 0,79±0,16; 0,61±0,12; 0,70±0,18; 0,54±0,18 e 0,64±1,44,
respectivamente quanto por ensaio de biotinilização de superfície (1,58±0,34 para NaCl
480mOsm 1,24±0,34 para ureia 560 mOsm) em comparação às células controle (n=7,
p<0,05). Os resultados obtidos sugerem que tanto o AVP, via receptor V2, quanto o choque
hiperosmótico são capazes de estimular a expressão do CFTR sugerindo, desta forma, que
fatores envolvidos com o processo de concentração urinária podem estar envolvidos com a
modulação do canal CFTR nos rins.
 x

ABSTRACT

BARBOSA, Carolina Monteiro de Lemos. CFTR chloride channel modulation in kidney

distal tubule cells by arginine vasopressin and hiperosmotic shock. Dissertação de Mestrado
(Ciências Biológicas – Fisiologia) – Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, Universidade
Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2009.

Patients carrying a mutation on the gene that codifies the CFTR chloride channel are affected
by a disease known as Cystic Fibrosis. These individuals do not present major renal
dysfunctions, but recent studies have shown that these patients present a reduction of the urine
concentration ability. The aim of this work is to verify if the CFTR expression is modulated
by factors involved in the concentration of the urine like AVP and extracellular hypertonicity
in MDCK cells. Statistical analysis was performed by One Way Analysis of Variance
followed by Newman-Keuls post-test. Differences were considered significant when p<0,05.
It was utilized MDCK cells, derived from canine kidney. Through Western blot technique, it
was observed that the treatment with 10-8 M AVP for 24 h, at 37o C, induced a CFTR protein
expression increase compared to control cells (0,44±0,09; n=3; p<0,05). By semi-quantitative
PCR, it was also observed that AVP induces a CFTR mRNA expression increase compared to
control cells (1,14±0,35, n=4, p<0,05). Cells, also treated with AVP, but now with V1 receptor
antagonist ([Pmp1,Tyr(Me)2]AVP) or V2 receptor antagonist (OPC-31260) in the
concentration of 10-5 M, only the groups treated with V2 antagonists had the inhibition of the
promoted AVP mRNA increase, indicating that this receptor is involved in the CFTR
modulation (n=4, p<0.05). The analysis of the CFTR promoter region stimulus was made
through cells cotransfection with plasmids containing the CFTR gene promoter and another
plasmid containing the β-galactosidase gene (internal control). It was observed a promoter
region stimulus when the cells are treated with 10-8M and 10-9M AVP (0,21±0,03 e
0,19±0,05, respectively, n=4, p<0,01). When cells are treated with hypertonic mediums (480
mOsm NaCl, 480 mOsm urea, 480 mOsm sacarose, 560 mOsm NaCl, 560 mOsm urea e
560mOsm sacarose) it was possible to observe a CFTR protein expression increase in the
plasmatic membrane through confocal microscopy (0,62±0,11; 0,79±0,16; 0,61±0,12;
0,70±0,18; 0,54±0,18 e 0,64±1,44, respectively) and through surface biotinylation (0,20±0,02
for 480 mOsm NaCl and 0,17±0,04 for 560 mOsm urea) when compared to control cells
(n=7, p < 0,05). The obtained results suggest that either AVP via its V2 receptor or
hyperosmotic shock are able to stimulate the CFTR expression suggesting that factors
involved in the urinary concentration process may be involved with the CFTR channel
modulation in the kidneys.
 xi

SUMÁRIO

AGRADECIMENTOS.......................................................................................................vii

RESUMO.............................................................................................................................ix

ABSTRACT..........................................................................................................................x

LISTA DE ILUSTRAÇÕES..............................................................................................xiv

LISTA DE TABELA.........................................................................................................xvi

LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS......................................................................xvii

1 INTRODUÇÃO.................................................................................................................1

1.1 Regulação do Fluido Extracelular.........................................................................................1

1.2 Os Rins..................................................................................................................................2

1.3 Transporte de Sódio e Cloreto ao Longo do Néfron.............................................................7

1.3.1 Transporte no Túbulo Proximal.......................……………………….…………..........7

1.3.2 Transporte nos Ramos Finos Descendente e Ascendente da Alça de Henle............... 10
1.3.3 Transporte no Ramo Grosso Ascendente da Alça de Henle.........................................11
1.3.4 Transporte no Túbulo Distal Convoluto e Túbulo Distal Reto....................................13
1.3.5 Transporte no Ducto Coletor........................................................................................14
1.4 O canal de Cloreto CFTR...................................................................................................16
1.4.1 A Família ABC.............................................................................................................16
1.4.2 Estrutura e Função do CFTR........................................................................................17
1.5 CFTR e Rim........................................................................................................................19

1.5.1 O CFTR e a Endocitose de Proteínas de Baixo Peso Molecular no Túbulo Proximal.20

1.5.2 CFTR como Regulador de Outras Condutâncias..........................................................21

1.6 Fibrose Cística e Rim..........................................................................................................25

1.7 Regulação Hormonal do CFTR no Rim..............................................................................26

1.8 O Hormônio AVP e sua Ação Renal..................................................................................27

1.9 A cascata de sinalização gerada por AVP...........................................................................31

2 JUSTIFICATIVA.............................................................................................................33
 xii

3 OBJETIVOS....................................................................................................................34

4 MATERIAL E MÉTODOS.............................................................................................35

4.1 Cultura de Células e Tratamento .......................................................................................35

4.1.1 Células MDCK-I e Tratamento Hormonal...................................................................35

4.1.2 Células MDCK GFP-CFTR e Tratamento com Hipertonicidade................................36

4.2 Isolamento de RNA Total..................................................................................................37

4.3 Transcrição reversa seguida por reação em cadeia da polimerase (RT-PCR)...................37

4.4 Transfecção Transiente de Células MDCK-I.....................................................................38

4.5 Western Blotting..................................................................................................................40

4.5.1 Western Blotting de Células MDCK-I..........................................................................40

4.5.2 Western Blotting de Células MDCK GFP-CFTR.........................................................42

4.6 Microscopia Confocal.........................................................................................................42

4.7 Biotinilização de Superfície................................................................................................43

4.8 Análise Densitométrica.......................................................................................................43

4.9 Análise Estatística...............................................................................................................44

5 RESULTADOS................................................................................................................45

5.1 Estudo da ação do hormônio AVP sobre a expressão do RNAm do canal de cloreto CFTR
em células MDCK-I por RT-PCR.……………………………………………………………45
5.2 Análise da Expressão da Proteína do CFTR em Células MDCK-I após tratamento com
AVP por Western Blotting........................................................................................................46
5.3 Estudo da ativação da região promotora do CFTR pelo AVP em células MDCK-I..........47
5.4 Estudo da participação dos receptores de AVP na expressão do RNAm do CFTR em
células MDCK-I por RT-PCR...................................................................................................48
5.5 Análise da expressão da proteína total do GFP-CFTR por Western Blotting em células
MDCK GFP-CFTR...................................................................................................................48
5.6 Análise da expressão de GFP-CFTR na membrana plasmática por microscopia
confocal.....................................................................................................................................50
5.7 Análise da expressão da proteína GFP-CFTR por biotinilização de superfície..................52
 xiii

6 DISCUSSÃO...................................................................................................................53

7 CONCLUSÕES...............................................................................................................58

8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.............................................................................59
 xiv

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1 - Visão longitudinal do rim..........................................................................................4

Figura 2 - Esquema representativo do néfron............................................................................6

Figura 3 - Representação esquemática dos principais mecanismos de transporte da primeira

fase da reabsorção do túbulo proximal.......................................................................................9

Figura 4 - Representação esquemática dos principais mecanismos de transporte da segunda

fase da reabsorção proximal......................................................................................................10

Figura 5 - Representação esquemática dos principais mecanismos de transporte no ramo

grosso ascendente da alça de Henle..........................................................................................12

Figura 6 - Representação esquemática dos principais mecanismos de transporte no túbulo

distal..........................................................................................................................................13

Figura 7 - Representação esquemática dos principais mecanismos de transporte no ducto

coletor........................................................................................................................................15

Figura 8 - Modelo bidimensional do canal de cloreto CFTR..................................................18

Figura 9 - O CFTR como regulador de outras condutâncias...................................................23

Figura 10 - Desenho esquemático Desenho esquemático do hipotálamo, onde o hormônio

AVP é sintetizado; da hipófise posterior, onde este hormônio é liberado e de seu local de ação

no néfron...................................................................................................................................29

Figura 11 - Eventos celulares associados com a ação do AVP na permeabilidade à água da

célula principal do ducto coletor...............................................................................................30

Figura 12 - A cascata de sinalização do AVP..........................................................................32

Figura 13 - Passos para a transfecção transiente de células MDCK-I.....................................39

Figura 14 - Figura e gráfico representativos do RT-PCR do CFTR........................................45
Figura 15 - Figura e gráfico representativos do Western Blotting do CFTR...........................46
Figura 16 - Gráfico do ensaio luminométrico da luciferase para análise do estímulo da região

promotora do gene do CFTR....................................................................................................47

 xv

Figura 17 - Figura e gráfico representativos do RT-PCR do CFTR........................................49

Figura 18 - Figura e gráfico representativos do Western Blotting do GFP-CFTR..................50

Figura 19 - Figura e gráfico representativos da expressão de GFP-CFTR por microscopia

confocal.....................................................................................................................................51

Figura 20 - Figura e gráfico representativos da expressão de GFP-CFTR por

biotinilização.............................................................................................................................52
 xvi

LISTA DE TABELA

Tabela 1 - Oligonucleotídeos utilizados na reação de PCR para os genes do CFTR e da β-

actina.........................................................................................................................................38
 xvii

LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

ABC – Do inglês “ATP-binding cassette”

AC – Adenilato ciclase

ADH – Hormônio antidiurético

ADP – Adenosina difosfato

AMPc - 3',5'-monofosfato cíclico de adenosina

AQP - Aquaporina

ATP – Adenosina trifosfato

AVP – Arginina vasopressina

CFTR – Canal de cloreto regulador da condutânica transmembranar na fibrose cística (do

inglês “cystic fibrosis transmembrane conductance regulator”)

ClC – Canal de cloreto (do inglês “chloride channel”)

DAG – Diacilglicerol

DAPI - 4',6-diamidino-2-fenilindol dihidrocloreto

Domínio R - Domínio regulatório

DMEM - Dulbecco’s Modified Eagle Medium

DNA – Ácido desoxirribonucléico

DNAc – DNA complementar

dNTPs – Desoxirribonucleotídeos trifosfatados

DTM – Domínio transmembranar

EDTA – Ácido etilenodiamino tetra-acético

ENaC – Canal de sódio epitelial (do inglês “epithelial sodium channel”)

FEC – Fluido extracelular

GFP – Proteína verde fluorescente (do inglês “green fluorescent protein”)

WGA – Aglutinina de germe de trigo (do inglês “ wheat germ agglutinin”)

 xviii

IP3 - Inositol (1,4,5)-trifosfato

IP3R - Receptor de IP3

KCC – Cotransportador de potássio e cloreto (do inglês potassium chloride cotransporter)

MDCK – Do inlgês “Madin-Darby canine kidney”

NaCl – Cloreto de sódio

NaHCO3- - Bicarbonato de sódio

NaOH – Hidróxido de sódio

NBD – Domínio ligador de nucleotídeo

NCC – Cotransportador de sódio e cloreto (do inglês "sodium chloride cotransporter”)

NHE – Trocador sódio-hidrogênio (do inglês “sodium-hydrogen exchanger”)

NKCC – Cotransportador de sódio-potássio-cloreto (do inglês “sodium-potassium-chloride

cotransporter”)

ORCC – Canal cloreto retificador de condutância para fora (do inglês “outwardly rectifying

chloride channel”)

pb – Pares de base

PCR – Reação em cadeia da polimerase

Pi – Fosfato inorgânico

PIP2 - Fosfatidil inositol (4,5)-bifosfato

PIP3 – Fosfatidilinositol-3,4,5-trifosfato

PKA – Proteína cinase A

PKC – Proteína cinase C

PLCβ - Fosfolipase Cβ

RNA – Ácido ribonucleico

RNAm – RNA mensageiro

 xix

ROMK – Canal de potássio da medula externa renal (do inglês “renal outer medullary

potassium channel”)

rpm – Rotações por minuto

RT-PCR – Transcrição reversa seguida por reação em cadeia da polimerase

SDS – Dodecil sulfato de sódio

T3 - Triiodotironina

T4 – Tiroxina

TAE – Tampão tris-acetato EDTA

UT – Transportador de ureia
 1

1. INTRODUÇÃO

1.1 Regulação do Fluido Extracelular

O fluido extracelular (FEC) é composto pelos volumes compreendidos nos

compartimentos vasculares, linfáticos, intersticiais e líquidos de transição. A manutenção

deste fluido dentro de faixas estreitas de variação de volume e composição é essencial para a

homeostase (JACOBSON & RECTOR, 1990). A regulação do FEC é determinada pelo

balanço entre a absorção intestinal e/ou reabsorção e secreção renal de sais e água. Esta

regulação está relacionada com um dos mais importantes parâmetros hemodinâmicos: a

pressão arterial sistêmica.

O sódio é o íon mais abundante do meio extracelular e, juntamente com o

cloreto, participam de forma importante na determinação da osmolaridade plasmática e

também do FEC. Alterações na ingestão de cloreto de sódio (NaCl) ou dos mecanismos que

levem à retenção deste sal constituem os processos responsáveis pela expansão do volume do

FEC podendo estar relacionadas com a gênese da hipertensão entre outras patologias

(MAYER, 2008; COWLEY & ROMAN, 1996).

O papel que os diferentes mecanismos de transporte iônico presentes ao longo

do néfron têm na regulação da excreção urinária de NaCl e, conseqüentemente, no volume do

fluido extracelular, é importante alvo de estudos. Muitos fatores endócrinos e parácrinos

podem modular a excreção urinária e/ou intestinal de NaCl através da ação sobre seus

transportadores iônicos presentes no epitélio desses órgãos. Nesse sentido, vários processos

patológicos, principalmente os que alteram a excreção renal de NaCl, podem conduzir a

desequilíbrios eletrolíticos. Alterações dos níveis circulantes e locais de substâncias que

aumentam a eliminação de sódio (Na+), ou seja, natriuréticas (fator atrial natriurético, lis-

bradicinina, adenosina) e as que diminuem a eliminação de sódio, antinatriuréticas

 2

(angiotensina II, arginina vasopressina, aldosterona) estão associadas a modificações na

atividade e expressão dos transportadores iônicos e a mudanças do volume extracelular.

Como dito anteriormente, o sódio é o principal cátion osmoticamente ativo e é

o mais abundante do meio extracelular. Geralmente, está acompanhado por quantidades

equimolares de cloreto, que é o principal ânion osmoticamente ativo deste meio

(MACKNIGHT et al., 1977). A concentração de cloreto contido tanto no plasma quanto no

fluido intersticial varia entre 95 e 105 mM. Desta forma, é valido postular que os mecanismos

reguladores do transporte de sódio também modulem os de cloreto, já que grande parte do

cloreto filtrado pelo glomérulo é reabsorvida juntamente com o sódio ao longo do néfron por

mecanismos ativos e passivos (HAMLYN & BLAUSTEIN, 1986; TERRY, 1994).

O rim, portanto, desempenha um importante papel na manutenção do FEC. O

entendimento dos mecanismos através dos quais esse órgão manipula as cargas filtradas tanto

de sódio quanto de cloreto é fundamental para a compreensão deste papel.

1.2 Os Rins

Os rins são os órgãos responsáveis pela manutenção do volume e da

composição do fluido extracelular dentro dos limites fisiológicos compatíveis com a vida.

Eles fazem essa manutenção do meio interno regulando o volume de água do organismo e o

equilíbrio ácido-base, controlando o balanço eletrolítico por transportes tubulares,

conservando nutrientes importantes (glicose, aminoácidos, proteínas) e excretando resíduos

metabólicos (uréia, ácido úrico, creatinina) (AIRES et. al, 2008).

Um indivíduo saudável tem o volume e a composição do fluido extracelular

variando dentro de estreitos limites fisiológicos, enquanto que a urina deste indivíduo pode ter

sua quantidade de água e solutos bastante variável. A quantidade e composição da urina

eliminada são conseqüências do papel regulador dos rins.

 3

A depuração renal indica o volume virtual de plasma que fica livre de certa

substância em determinada unidade de tempo. Este processo além de se dar pela filtração

glomerular pode também ser feito pela secreção tubular, já que o sangue que passa pelos

glomérulos e não é filtrado vai para a rede capilar peritubular. Por outro lado, há a reabsorção

tubular onde substâncias filtradas voltam ao sangue que percorre os capilares peritubulares e

entram na circulação sanguínea sistêmica pela veia renal (BRENNER et. al, 2007).

Os rins são órgãos retroperitoneais situados na parte posterior do abdômen, um

de cada lado da coluna vertebral. Em humanos, os rins situam-se entre a terceira vértebra

lombar e a vigésima vértebra torácica. Eles possuem uma borda convexa e outra côncava e,

nesta última, localiza-se o hilo. É por ele que passam o ureter, a artéria renal, a veia renal,

vasos linfáticos e um plexo nervoso. Envolvendo este órgão, existe uma cápsula fibrosa de

tecido conjuntivo denso (BRENNER et. al, 2007).

O rim é dividido em duas zonas: a cortical e a medular. Em humanos, a zona

medular contém 8 a 18 pirâmides de Malpighi, cujos lados e bases estão em contato com a

zona cortical e os vértices fazem projeções nos cálices renais. Essas projeções são as papilas

que contem, cada uma, uma área cribiforme. Esta área apresenta orifícios que correspondem à

desembocadura dos ductos coletores papilares. Cada papila renal é envolta por uma extensão

membranosa da parte superior do ureter, a pélvis renal, formando os cálices menores. Estes se

unem para formar os cálices maiores (AIRES et. al, 2008).

A zona cortical ocupa o espaço compreendido entre as bases das pirâmides e a

cápsula renal. Estão nesta região, além dos vasos sanguíneos, glomérulos, túbulos proximais,

túbulos distais e as alças de Henle e os ductos coletores dos néfrons mais superficiais. A

região medular possui vasos sanguíneos, os segmentos retos proximais, as alças de Henle e os

ductos coletores apenas dos néfrons mais profundos (Figura 1) (AIRES et. al, 2008).
 4

Cápsula

C órtex Medula

Ductos Papilares
de Bellini

Papilas
Artéria Renal

Veia Renal Pirâmide Renal

Pelve R enal Junção

Corticomedular

Cálices

Figura 1. Visão longitudinal do rim. Brenner et al., 2007.

A unidade funcional do rim é o néfron e um humano possui de 600 mil a 1

milhão e 400 mil néfrons. (NYENGAARD & BENDTSEN, 1992). O néfron é formado pelo

glomérulo e por uma estrutura tubular (figura 2). Este primeiro é formado de capilares

glomerulares e pela cápsula de Bowman. Os capilares glomerulares formam um enovelado

capilar formado a partir de uma arteríola aferente, que se divide em 5 a 8 ramos e, por sua

vez, subdividem-se em 20 a 40 alças capilares. Estas são sustentadas por células mesangiais e

sua matriz. Estas células fagocitam agregados moleculares presos à parede capilar e possuem

receptores para vários hormônios, regulando a hemodinâmica intraglomerular através de sua

propriedade contrátil. Posteriormente, as alças capilares se reúnem formando a arteríola

eferente. O endotélio dos capilares glomerulares é fenestrado e pode ser atravessado durante a

filtração (AIRES et. al, 2008).

A cápsula de Bowman tem forma de cálice e possui parede dupla e o espaço

entre elas há o espaço de Bowman, que é ocupado pelo filtrado glomerular. As células da
 5

parede interna da cápsula de Bowman são os podócitos, estes emitem projeções chamadas de

pedicélios. Os pedicélios envolvem os capilares e formam entre eles fendas de filtração.

Conectando os pedicélios vizinhos, há a membrana diafragmática que se apóia sobre a

membrana basal dos capilares (AIRES et. al, 2008).

O glomérulo é responsável pela produção do ultrafiltrado do plasma. A

barreira de filtração entre o sangue e o espaço urinário não permite a passagem de elementos

figurados do sangue e é composta pelo epitélio fenestrado do capilar, pela membrana basal

glomerular e pela parede interna da cápsula de Bowman (podócitos). As células endoteliais

são recobertas por um glicocálix rico em glicosaminoglicanas polianiônicas e glicoproteínas

que conferem carga negativa à barreira de filtração. Este glicocálix contribui para as

propriedades da permeabilidade seletiva da barreira. A membrana basal é contínua, porém,

com poros funcionais e é constituída de uma rede de fibrilas. Ela também é carregada

negativamente devido à sua estrutura de glicosaminoglicanas rica em heparan sulfato

(BRENNER et. al, 2007).

A estrutura tubular do néfron é composta por túbulo proximal, alça de Henle,

túbulo distal e ducto coletor. O túbulo proximal é constituído por um segmento convoluto e

outro reto. Com base em diferenças anatômicas ele ainda pode ser dividido em três

segmentos: S1, S2 e S3. S1 se estende até metade da porção convoluta, S2 inclui a parte final da

porção convoluta e metade da inicial reta e S3 corresponde ao restante da parte reta e pode

atingir a medula (AIRES et. al, 2008).

Após o túbulo proximal, inicia-se a alça de Henle, que possui três segmentos:

ramo fino descendente, ramo fino ascendente e ramo grosso ascendente. A alça de Henle

penetra na medula renal e a sua configuração em forma de alça tem importante papel na

concentração urinária que será explicada mais adiante (AIRES et. al, 2008).
 6

No final do ramo grosso ascendente, inicia-se o túbulo distal convoluto e em

seguida o túbulo distal reto e ducto coletor cortical. Segmentos de conexões de vários néfrons

drenam para um mesmo ducto coletor cortical. A partir daí, o fluido caminha sequencialmente

pelos ductos coletores medulares, cálices, pélvis, ureteres e bexiga. Os ductos coletores

localizados próximos à área cribiforme são chamados de ductos papilares de Bellini. São

usualmente referidas como néfron distal as estruturas compreendidas entre o segmento

espesso ascendente até o ducto coletor medular (AIRES et. al, 2008).

Figura 2. Esquema representativo do néfron. Adaptado de www.infoescola.com

A formação da urina inicia-se no glomérulo, aonde 20% do plasma que chega

aos rins são filtrados graças à pressão hidrostática do sangue nos capilares glomerulares. Os

80% de plasma restantes que não foram filtrados se dirigem para a circulação capilar

peritubular.

O ultrafiltrado é um fluido de composição semelhante à do plasma, não

possuindo os elementos celulares do sangue e sendo essencialmente livre de proteínas, porém

as concentrações de sais e moléculas orgânicas são similares. A membrana filtrante dificulta a

 7

passagem dessas substâncias com alto peso molecular e/ou carregadas negativamente. Após

ser formado, o filtrado caminha pelos túbulos renais e sua composição e volume são

modificados pelos mecanismos de reabsorção e secreção ao longo do néfron até que a urina

final seja formada e excretada pela uretra.

A secreção e a reabsorção dos solutos através do epitélio renal são feitas por

transportadores através de mecanismos específicos, passivos ou ativos, localizados nas

membranas das células tubulares. Esses mecanismos são interdependentes e atuam no sentido

de modificar a concentração das substâncias presentes no filtrado glomerular, variando a

quantidade de solutos que são excretados na urina final (AIRES et. al, 2008).

Para compreender como o filtrado é processado até formar a urina, é preciso

compreender os mecanismos de reabsorção e secreção que ocorrem ao longo do néfron. Serão

destacados os mecanismos de transporte do sódio e do cloreto que são os principais

responsáveis na manutenção da tonicidade e do volume do FEC.

1.3 Transporte de Sódio e Cloreto ao Longo do Néfron

1.3.1 Transporte no Túbulo Proximal

O túbulo proximal é responsável pela reabsorção isosmótica de dois terços do

ultrafiltrado glomerular. A reabsorção de solutos compreende duas fases. A primeira fase da

reabsorção se dá em S1, onde há, principalmente, reabsorção de glicose, aminoácidos, solutos

orgânicos e sais de sódio. Todos esses solutos são transportados para o interior da célula

através de transporte ativo secundário dirigido pelo gradiente eletroquímico gerado pela

Na+/K+-ATPase localizada na membrana basolateral. Ela retira o sódio de modo ativo da

célula criando um gradiente de concentração lúmen-célula para o sódio.

A reabsorção de sódio neste primeiro segmento é dada por co-transporte

eletrogênico de sódio com solutos orgânicos (açúcares e aminoácidos), contratransporte

eletroneutro de Na+/H+ (pelo trocador NHE3) e cotransporte eletroneutro de sódio com ânions
 8

orgânicos (lactato e fosfato), todos pela via transcelular. A Na+/K+-ATPase diminui a

concentração intracelular de sódio, gerando um gradiente eletroquímico favorável à

reabsorção de sódio pela membrana luminal, assim, os transportadores da membrana luminal

podem realizar seus transportes. Os solutos transportados se concentram no interior da célula

e saem por difusão pela membrana basolateral, acoplados ou não ao sódio, e vão para o

sangue peritubular. Este transporte de sódio nesta primeira fase da reabsorção proximal gera

uma diferença de potencial transepitelial lúmen-negativa de -2 mV devido à retirada

eletrogênica de sódio do lúmen.

Desta forma, a luz tubular no início do túbulo proximal é negativa e, além

disso, sua via paracelular (entre as células) é permeável ao sódio e ao cloreto. A diferença de

potencial lúmen-negativa serve para conduzir a reabsorção paracelular de cloreto e o

“vazamento” de sódio do espaço peritubular de volta para o lúmen. Cerca de um terço do

sódio que foi reabsorvido pela via transcelular difunde-se de volta para o lúmen pela via

paracelular (GARCÍA et. al, 1998). Os mecanismos de transporte da primeira fase da

reabsorção proximal estão ilustrados na figura 3.

A segunda fase da reabsorção proximal se dá em S2 e S3 e corresponde,

principalmente, à reabsorção de NaCl. Nesta fase, o cloreto está concentrado na luz tubular,

pois no segmento inicial do túbulo proximal há a reabsorção preferencial de bicarbonato de

sódio (NaHCO3-) e não de NaCl. As concentrações de bicarbonato e outros solutos começam

a diminuir e a concentração de NaCl vai aumentando até ser maior que a do espaço

peritubular. Este evento é acompanhado pela reversão da diferença de potencial lúmen

negativa de -2mV para lúmen positiva de +2mV em consequência à difusão do cloreto. A

diferença de potencial lúmen positiva faz com que o sódio seja reabsorvido pela via

paracelular, enquanto que o gradiente químico entre lúmen e espaço peritubular promove uma

força motriz para a reabsorção de cloreto. Portanto, NaCl é reabsorvido pela via paracelular e
 9

esta via passiva corresponde a, aproximadamente, 47% da reabsorção transepitelial de NaCl

nesta fase. Além da diferença de potencial lúmen positiva, o NaCl é reabsorvido por solvent

drag, onde as moléculas de NaCl são transferidas pelo efeito do fluxo de água.

Luz tubular Célula Interstício

Cl -

Na+
Glicose ou
Aminoácidos
3Na+

2K+
Na+
NHE3
H+
ClC-2 Cl-

Na+
Glicose,
Ânions aminoácidos,
orgânicos ânions orgânicos

Figura 3. Representação esquemática dos principais mecanismos de transporte da primeira fase da

reabsorção do túbulo proximal. Na membrana luminal, estão representados os transportadores ativos
secundários. A bomba Na+/K+ gera um gradiente eletroquímico para a entrada do sódio, que é cotransportado
com glicose, aminoácidos e ânions orgânicos ou contratransportado com o hidrogênio. O sódio vai para o
espaço peritubular através da bomba e os demais solutos por canais (caso do cloreto) ou por transportadores
(demais solutos) presentes na membrana basolateral. O cloreto, nesta fase, é reabsorvido pela via paracelular.
Figura original.

A reabsorção transcelular de sódio corresponde a dois terços do transporte de

sódio. Isso pode acontecer por transporte não acoplado (canais de sódio) ou por transporte

acoplado neutro, ambos descritos na figura 4. A reabsorção de sódio pela membrana

basolateral se dá pela Na+/K+-ATPase.

São reabsorvidos no túbulo proximal 50 a 70% do cloreto filtrado. A maior

parte da reabsorção de cloreto é transcelular. O cloreto entra na célula pelo trocador NHE3,

pelo trocador Cl--OH- (Slc26a6) e por cotransporte eletroneutro de NaCl. (SINDIC et. al,
 10

2007). Ele sai pela membrana basolateral via co-transportador K+-Cl- (KCC). As proteínas

KCC1, KCC3 e KCC4 são todas expressas nos rins. O cloreto também sai da célula pela

membrana basolateral por canais de cloreto. Eles são funcionalmente análogos ao CFTR, são

canais de cloreto da família ClC. No caso dos túbulos proximais, são os canais ClC-2

(PLANELLES, 2004).

Luz tubular Célula Interstício

Cl-

Na+ 3Na+
NHE3
H+ 2K+

Cl-
Cl-
Slc26a6
ClC-2
OH-

Na+ K+
KCC
Cl -
Cl-

NaCl
+
H2O

Figura 4. Representação esquemática dos principais mecanismos de transporte da segunda fase da reabsorção
proximal. O sódio e o cloreto são reabsorvidos, sendo transportados pela membrana luminal por transporte
ativo secundário. A Na+/K+-ATPase é quem gera o gradiente eletroquímico para o transporte secundário. O
sódio vai para os capilares peritubulares pela Na+/K+-ATPase e o cloreto pelo cotransportador KCC ou por
canais de cloreto ClC-2. Nesta fase, o cloreto e o cloreto de sódio são reabsorvidos paracelularmente por
difusão passiva. Figura original
1.3.2 Transporte nos Ramos Finos Descendente e Ascendente da Alça de Henle

Os ramos finos descendente e ascendente da alça de Henle funcionam

reabsorvendo água e NaCl de modo passivo. O ramo fino descendente expressa

abundantemente aquaporina-1 (AQP-1) fazendo com que ele seja permeável à água. Ele

também é moderadamente permeável a alguns solutos como o sódio, o cloreto e a uréia.

Porém, neste segmento, esses solutos são secretados de modo passivo e paracelular e não
 11

reabsorvidos. A atividade da Na+/K+-ATPase neste segmento é quase indetectável, sugerindo

que essas células não fazem transporte ativo. As células desta parte do néfron estão expostas a

um interstício medular progressivamente mais hipertônico em direção à papila. O fluido

tubular, portanto, se concentra neste segmento.

O fluido que chega ao ramo fino ascendente tem uma alta concentração de

sódio e cloreto devido ao equilíbrio osmótico estabelecido no segmento anterior. O ramo fino

ascendente, ao contrário do ramo fino descendente, é impermeável à água e altamente

permeável ao sódio, ao cloreto e à ureia. O sódio é reabsorvido de modo passivo e paracelular

enquanto que o cloreto é reabsorvido de modo passivo transcelular e a ureia é secretada

também de modo passivo e transcelular. O cloreto atravessa a célula por canais de cloreto do

tipo ClC-K1 presentes tanto na membrana luminal quanto na basolateral. A ureia é

reabsorvida por canais de ureia UT2 também presentes em ambas as membranas. O fluido que

chega à dobradura da alça de Henle está bastante concentrado e vai diluindo-se na porção fina

ascendente por perda de soluto.

1.3.3 Transporte no Ramo Grosso Ascendente da Alça de Henle

A porção espessa da alça de Henle é um local importante de reabsorção de

NaCl (cerca de 30% do NaCl filtrado). Do total de sódio reabsorvido neste segmento, metade

atravessa o epitélio pela via paracelular e a outra metade pela transcelular. Da carga filtrada

de cloreto, 20 a 25% são reabsorvidas no ramo grosso ascendente (GREGER, 1985).

A reabsorção de NaCl se dá por transporte ativo secundário que é dirigido pelo

gradiente eletroquímico favorável para o sódio estabelecido pela Na+/K+-ATPase. Sódio,

potássio e cloreto são cotransportados pela membrana apical pelo cotransportador tríplice

Na+-K+-2Cl- (NKCC2) (JENTSCH, 2005). A ativação deste transportador requer a presença

simultânea desses três íons. O transporte de sódio e cloreto são mutualmente codependentes e,
 12

por sua vez, dependem da presença de potássio. Desta forma, os canais apicais de potássio

(ROMK2) são necessários para o contínuo funcionamento do NKCC2 (WANG et al., 1997).

A diferença de potencial no ramo grosso ascendente é lúmen positiva, cerca de

+7 mV, devido à secreção de potássio e a reabsorção de cloreto. Esta diferença de potencial é

crítica para a reabsorção de sódio, potássio, cálcio e magnésio neste segmento. Ela faz com

que estes íons sejam reabsorvidos pela via paracelular, atravessando as tight junctions. A

permeabilidade à água no ramo grosso ascendente é extremamente baixa. Esse fato, associado

ao transporte de solutos, permite que o fluido tubular seja diluído.

O gradiente eletroquímico gerado pela atividade da Na+/K+-ATPase permite a

entrada de sódio, potássio e cloreto via NKCC2. O sódio sai da célula pela membrana

basolateral através da Na+/K+-ATPase e o potássio e o cloreto são transportados passivamente

por canais específicos. O potássio utiliza os canais tipo ROMK2 e o cloreto utiliza canais da

família ClC, provavelmente, ClC-K2 (figura 5).

. Luz tubular Célula Interstício

3Na+

Na+ 2K+
K+ NKCC2
2Cl-

ROMK K+

K+ ROMK

ClC Cl-

Figura 5. Representação esquemática dos principais mecanismos de transporte no ramo grosso ascendente da
alça de Henle. O sódio, o cloreto e o potássio são transportados pelo transportador tríplice na membrana
luminal por transporte ativo secundário. O sódio sai da célula pela Na+/K+-ATPase, o cloreto pelo canal ClC e
o potássio pelo canal ROMK2. Parte do potássio volta para a luz tubular, também através de canais ROMK2,
e retroalimenta o transportador tríplice. Figura original.
 13

1.3.4 Transporte no Túbulo Distal Convoluto e Túbulo Distal Reto

No túbulo distal convoluto, há reabsorção de 5 a 10 % da carga de sódio

filtrada e de cerca de 5% da de cloreto. Esses íons são co-transportados para dentro da célula

pelo cotransportador NCC presente na membrana apical. O canal epitelial de sódio (ENaC)

apical é a via de transporte preferencial, principalmente, no túbulo distal reto. Já o trocador

Na+-H+ (NHE2) está mais presente no túbulo distal convoluto.

Na membrana basolateral, como nos outros segmentos do néfron, a Na+/K+-

ATPase gera um gradiente eletroquímico para o funcionamento dos transportadores da

membrana luminal. O sódio vai para o espaço peritubular ativamente pela Na+/K+-ATPase e o

cloreto passa passivamente por canais de cloreto da família ClC, provavelmente, por ClC-K2.

As células dos túbulos distais convoluto e reto expressam na membrana basolateral o

cotransportador de K+-Cl-, KCC4, por onde são reabsorvidos o potássio e o cloreto para o

espaço peritubular. As vias paracelulares neste segmento são pouco permeantes (Figura 6).

Luz tubular Célula Interstício

Na+
Cl- 3Na+
2K+

Na+ ENaC K+
KCC4
Cl -

Na+
NHE2 ClC Cl -
H+

Figura 6. Representação esquemática dos principais mecanismos de transporte no túbulo distal. A partir do
gradiente eletroquímico gerado pela Na+/K+-ATPase, sódio e cloreto são reabsorvidos pelo cotransportador
apical NCC. O sódio também pode ser reabsorvido pelo trocador NHE2 e pelo canal de sódio ENaC. Na
membrana basolateral a saída do sódio se dá pela Na+/K+-ATPase e a do cloreto pelo cotransportados KCC4.
Figura original.
 14

1.3.5 Transporte no Ducto Coletor

O ducto coletor é composto por três tipos celulares: as células principais, as

células intercalares α e as células intercalares β. As células principais representam 70% das

células do ducto coletor e as intercalares, 30%. Enquanto as células principais reabsorvem

sódio e secretam potássio, as intercalares tipo α secretam hidrogênio e reabsorvem potássio e

as tipo β secretam bicarbonato.

No ducto coletor, a reabsorção de água, sódio, cloreto e outros íons pode variar

dependendo das necessidades do organismo. Nas células principais, a entrada de sódio pela

membrana apical se dá por canais de sódio altamente seletivos, os ENaCs. Essa absorção

seletiva de cargas positivas gera uma diferença de potencial lúmen-negativa de -20mV. Essa

eletronegatividade é crítica para a secreção de potássio por canais apicais de potássio e para o

transporte paracelular de cloreto.

Ao longo do ducto coletor ocorre a reabsorção de aproximadamente 4% do

cloreto filtrado e essa porcentagem é variável, dependendo da ação de hormônios.

(GÖGELEIN, 1988; STRANGE et al., 1996; FRANCIOLINI & PETRIS, 1990; FONG &

JENTSCH, 1995) (HIKI et al, 1999). Há duas vias principais para a reabsorção de cloreto: a

paracelular e a transcelular pelas células intercalares β. A reabsorção paracelular é passiva e

dirigida pela diferença de potencial lúmen-negativa que possibilita que o cloreto passe através

das tight junctions.

A reabsorção transcelular de cloreto é quantitativamente maior que a

paracelular. Ela se dá pela entrada de cloreto nas células intercalares β pelo trocador apical

Cl--HCO3- e pela sua saída por canais de cloreto basolaterais. As células adjacentes

intercalares α fazem a reciclagem de cloreto pela membrana basolateral resultando em

reabsorção de bicarbonato e secreção de prótons pela membrana apical.

 15

Em suma, o efeito do trocador apical Cl--HCO3- nas células intercalares β leva

à secreção apical de bicarbonato; e a reciclagem de cloreto na membrana basolateral das

células intercalares α leva à secreção apical de hidrogênio.

Na membrana basolateral das células intercalares, há canais semelhantes ao

ClC para que o cloreto passe para o espaço peritubular. Assim, menos de 1% da carga filtrada

de cloreto é excretada na urina (ROCHA & KUDO, 1990; SINGH et al., 1995). Todos esses

mecanismos de transporte estão ilustrado na figura 7.

Luz tubular CP Interstício

3Na+
Na+ ENaC
2K+
K+ ROMK ROMK K+

Cl-
CI β

H+
Cl-

HCO3-
ClC Cl-

CI α

HCO3-

Cl-
H+
K+

Figura 7. Representação esquemática dos principais mecanismos de transporte no ducto coletor. Nas células
principais (CP), há reabsorção de sódio através dos canais ENaCs presentes na membrana luminal. Esta
reabsorção acontece devido ao gradiente eletroquímico gerado pela Na+/K+-ATPase. Nas células intercalares
β (CI β), há reabsorção de cloreto pelo trocador apical Cl--HCO3-. Nas células intercalares α (CIα), há
secreção ativa de próton e secreção de cloreto e reabsorção de bicarbonato. Figura original.

Diferentes canais de cloreto têm sido identificados através da sua sensibilidade

farmacológica a diferentes drogas e de suas características eletrofisiológicas. Pelo uso de

 16

técnicas de biologia molecular, muito desses genes de canais têm sido clonados, permitindo o

estudo dos mecanismos reguladores tanto da expressão de seus RNAs mensageiros (RNAm)

como das proteínas transportadoras codificadas por eles, contribuindo assim para o

entendimento de seus papéis fisiológicos (STRANGE et al., 1996; GÖGELEIN , 1988;

FONG & JENTSCH, 1995).

Existem vários transportadores de cloreto ao longo do néfron e o canal de

cloreto regulador de condutância transmembranar da fibrose cística, o CFTR, é um deles. Este

canal está localizado ao longo do néfron e está envolvido no fluxo de cloreto através do

epitélio renal e na regulação de outras condutâncias de outros canais também neste tecido

(CRAWFORD et al., 1991).

1.4 O Canal de Cloreto CFTR

1.4.1 A Família ABC

A família de transportadores ABC (ATP binding cassette) é uma das maiores

famílias de proteínas homólogas e consiste de proteínas de membrana transmembranares que

compartilham de características topológicas únicas. Todos os seus membros possuem dois

domínios transmembranares e dois domínios ligadores de nucleotídeos. Para que realizem

transporte, eles utilizam energia proveniente de ATP. Há um grande espectro de substratos

transportados pelas proteínas da família ABC incluindo açúcares, aminoácidos, íons, drogas,

polissacarídeos e proteínas (GADSBY et. al, 2006; VASILIOU et al., 2009).

As proteínas ABC estão presentes em procariotos e eucariotos e, nestes

últimos, elas têm ampla distribuição nos tecidos. No genoma humano já foram identificados

48 transportadores ABC e baseado em análises filogenéticas, a superfamília ABC foi dividida

em sete subfamílias (ABCA-ABCG) (DEELEY & COLE, 2006),

A importância destes transportadores na fisiologia é atestada pelo fato de que

17 das 48 proteínas ABC estão ligadas a doenças genéticas. Entre estes pode-se destacar o
 17

canal de cloreto regulador da condutância transmembranar da fibrose cística (CFTR), que

pertence à subfamília ABCC. Ele é um canal que tem como função permitir a passagem dos

íons cloreto por difusão (CHEN & HWANG, 2008).

1.4.2 Estrutura e Função do CFTR

O canal de cloreto CFTR está presente na membrana luminal de diferentes

epitélios secretores de cloreto e corresponde a uma proteína de aproximadamente 180-kDa

quando completamente glicosilada (CHANG et al., 1991; MORALES et al, 2000; SOUZA

-MENEZES & MORALES, 2009). A partir da porção N terminal, possui um conjunto de seis

domínios que atravessam a membrana citoplasmática (DTM-1). Logo em seguida, apresenta

um primeiro domínio de ligação de nucleotídeos (NBD-1), o qual possui sítios de ligação para

ATP. Um grande domínio regulatório (domínio R) segue o NBD-1, rico em sítios de ligações

de proteínas cinases A e C (PKA e PKC). Após o domínio R, há outro conjunto de seis

domínios transmembranares (DTM-2) seguidos de um segundo domínio de ligação de

nucleotídeos (NBD-2) que completam a proteína (SOUZA-MENEZES &MORALES, 2009;

SHEPPARD et al., 1999; MORALES et al, 1999; AMES et al., 1990; HYDE et al., 1990)

(Figura 8).

A estrutura primária deste canal permite que ele seja classificado entre os

membros da família de transportadores ATP-binding cassette (ABC), pois utilizam a energia

da hidrólise de ATP para transportar substratos através das membranas celulares (HYDE et

al., 1990; HIGGINS, 1992; DEAN & ALLIKMETS, 1995). Riordan e colaboradores (1989)

identificaram o gene codificante do CFTR na região q21-31 do cromossomo 7 e propuseram

uma estrutura para a proteína baseada em comparações entre o CFTR e outros membros da

família ABC, como permeases periplasmáticas em procariotos, STE6 e P-glicoproteína.

O CFTR tem características distintas dos outros canais da sua família: uma

baixa condutância entre 6 e 10 pS, a relação corrente-voltagem (I/V) é linear (BERGER et al.,
 18

1991; TABCHARANI et al., 1990), ele é seletivo para ânions, tem abertura independente de

tempo e voltagem e é regulado por fosforilação dependente de AMPc e por outros

nucleotídeos intracelulares (ANDERSON et al., 1991b).

Extracelular

R
BD1
N
NH2
R D2
Intracelular NB
COOH
Figura 8. Modelo bidimensional do canal de cloreto CFTR, onde são indicados os principais domínios da
proteína: sítios de ligação de nucleotídeos (NBD1 e NBD2) e sítios de ação de proteínas cinases (Domínio R).
Também são mostrados os dois domínios transmembranares da proteína. Adaptado de Gadsby & Nairn,

A abertura e fechamento do CFTR são controlados pelo balanço das atividades

cinase e fosfatase da célula e pelos níveis de ATP celular. A fosforilação dos resíduos de

serina do domínio R é pré-requisito para o funcionamento do CFTR. Não só a fosforilação por

PKA regula a atividade deste canal, mas ela também pode ser regulada por PKC (CHEN &

HWANG, 2008). Uma vez que o domínio R é fosforilado, a abertura do canal é regulada por

um ciclo de hidrólises de ATP nos NBDs. Quando ATP liga-se aos NBDs, eles se aproximam

unindo os ATPs na interface entre NBD-1 e NDB-2. Essa interação transmite, então, um sinal

que abre o canal através de seu domínio transmembranar. Este sinal se mantém até que haja a

hidrólise de um dos ATPs. Desta forma, ocorre o desligamento da interface de NBD-1 e

NBD-2 e eles se separam. O fim do sinal permite que o canal se feche, encerrando o fluxo de
 19

ânions até que o ATP ligue-se aos NBDs de novo (ANDERSON et al., 1991a; GADSBY et

al., 2006).

A função do CFTR não é importante apenas para o transporte de cloreto, ele

também é capaz de interagir com outros transportadores inibindo ou aumentando seus

transporte iônicos. Este fato é importante para os epitélios que apresentam intenso transporte

de íons e fluido, como o epitélio pulmonar e renal. Por exemplo, o CFTR é capaz de estimular

os canais de cloreto retificadores para fora (ORCC) (SCHWIEBERT et al.1998; FULMER et

al. 1995) e inibir canais epiteliais de sódio (ENaC) (KUNZELMAN et al., 2001).

O epitélio renal tem uma enorme quantidade e variedade de transportadores em

sua membrana e suas expressões diferem ao longo de diferentes segmentos do néfron. A

importância do CFTR nos rins e sua interação com outros transportadores têm sido

amplamente investigadas (SOUZA-MENEZES et al., 2008; DE ANDRADE PINTO et al.,

2007; MORALES et al., 1996; MORALES et al., 2000; MORALES et al., 2001).

1.5 CFTR e Rim

É bem conhecido de que o CFTR é abundantemente expresso no rim. Vários

estudos já demonstraram a presença de CFTR e seu RNA mensageiro (RNAm) ao longo do

néfron por transcrição reversa seguida da reação da polimerase em cadeia (RT-PCR)

(RIORDAN et al., 1989; MORALES et al., 1996). A proteína do CFTR foi detectada em

túbulo proximal, ramo fino da alça de Henle e na membrana luminal de túbulo distal, ducto

coletor cortical e ducto coletor medular por imunocitoquímica (CRAWFORD et al., 1991).

Análises de patch-clamp também confirmaram sua presença nos túbulos proximal e distal e

nos ductos corticais medulares (STANTON, 1989; SEGAL et al., 1993; HUSTED et al.,

1995; LETZ & KORBMACHER, 1997).

Análises de rins de camundongos revelaram que o CFTR no túbulo proximal é

expresso, principalmente, na área apical das células tubulares proximais. Sua distribuição é
 20

subcelular compatível com a distribuição de endossomos (JOURET & DEVUYST, 2008).

No rim humano, a proteína do CFTR foi detectada em túbulo proximal, ramos finos da alça

de Henle, túbulos distais e ductos coletores (MORALES et al., 1996; CRAWFORD et al.,

1991; DEVUYST et al., 1996).

Além da sua localização na membrana plasmática, o CFTR está localizado em

organelas intracelulares ao longo das vias endocíticas e secretórias do túbulo proximal. Neste

local, ele pode estar agindo como um regulador do pH das vesículas importando cloreto para

dentro delas e equilibrando o acúmulo de prótons feito pela H+-ATPase (BRADBURY,

1999).

Devido a estes achados, o canal de cloreto CFTR que já é um bem conhecido

regulador de outras condutâncias pode ter outro papel nos rins. Ele pode estar também

envolvido na regulação de vias intracelulares.

1.5.1 O CFTR e a Endocitose de Proteínas de Baixo Peso Molecular no Túbulo Proximal

A distribuição do CFTR em endossomos apicais de células de túbulo proximal

de camundongos revelou que possa haver um envolvimento deste canal com a endocitose de

proteínas de baixo peso molecular (JOURET et al., 2007). Recentemente, esta hipótese teve

maior embasamento com a utilização de camundongos knockout para CFTR utilizados para

caracterizar o papel do CFTR no rim (JOURET & DEVUYST, 2008). Análises urinárias e

plasmáticas desses animais revelaram que a função renal desses animais era normal. No

entanto, a excreção urinária de proteínas de baixo peso molecular foi significativamente

maior em relação a camundongos controle. Isso reflete um possível defeito na endocitose

apical de células de túbulo proximal (JOURET & DEVUYST, 2008).

A endocitose de proteínas de baixo peso molecular é mediada por um

complexo de receptores multiligantes, a megalina e a cubulina (CHRISTENSEN & BIRN,

2002). A cubulina é uma glicoproteína de membrana altamente conservada e ela é

 21

caracterizada pela ausência de um domínio transmembranar (BIRN & CHRISTENSEN,

2006). Uma ligação de alta afinidade da megalina com a região N-terminal da cubulina já foi

demonstrada in vitro, o que sugere que a megalina participa não apenas da endocitose e do

tráfego intracelular da cubulina, mas também atuando no ancoramento da cubulina na

membrana plasmática (MOESTRUP et al., 1998). Nos camundongos Cftr-/- foi observado um

aumento da excreção de cubulina e seus ligantes. Investigações demonstraram que o a falta de

CFTR no rim não está relacionada com mudanças na biossíntese de cubulina, e sim, com um

aumento significativo da excreção urinária de cubulina. Já a megalina, não teve sua expressão

renal nem sua excreção urinária alteradas (JOURET et al., 2007). Esses dados sugerem que a

falta do CFTR no túbulo proximal pode induzir uma instabilidade da cubulina na borda em

escova e isto levaria ao seu aparecimento na urina (JOURET & DEVUYST, 2008).

O modo como o CFTR age nas células de túbulo proximal ainda não está claro

até este momento. Ele pode estar contribuindo, junto com outras proteínas, para a acidificação

de vesículas endossomais. Já é descrito que distúrbios nesses mecanismos de acidificação

causam uma endocitose errônea das proteínas de baixo peso molécula e tem por consequência

uma proteinúria dessas proteínas, como descrito na doença de Dent (JENTSCH, 2008;

SOUZA-MENEZES et al., 2008).

1.5.2 CFTR como Regulador de Outras Condutâncias

Além de funcionar como canal de cloreto em diversos epitélios, o CFTR

também pode regular a atividade de outros transportadores como o canal de cloreto retificador

de corrente para fora (ORCC – outwardly rectifying chloride channel), o canal epitelial de

sódio (ENaC – epithelial sodium channel) e o canal de potássio da medula externa (ROMK -

renal outer medullary potassium channel). Esses papéis potencializam a importância do

CFTR (figura 9).

 22

Os canais de cloreto CFTR e ORCC são canais distintos, porém, são ligados

funcionalmente. Algumas hipóteses explicam como o CFTR pode controlar os ORCCs:

interação proteína-proteína, ativação de um mensageiro secundário em comum ou o transporte

de uma substância que poderia ativar os ORCCs (CHENG et al., 1991).

Suportando esta última hipótese, foi demonstrado que o CFTR é capaz de

regular ORCCs através de um mecanismo autócrino envolvendo a liberação de ATP

(SCHWIEBERT et al. 1995), enquanto outros estudos sugerem que, na verdade, o CFTR seja

uma canal duplo capaz de transportar Cl- e ATP (REISIN et al., 1994; ABRAHAN et al.,

1997). Uma vez fora da célula, o ATP pode interagir e ativar receptores purinérgicos P2U que,

depois de ativados, podem estimular ORCC. Essa ativação pode ser por acoplamento direto

do receptor P2U com o ORCC ou por uma via de sinalização acoplada à proteína G deste

receptor, aumentando a secreção de Cl- (SCHWIEBERT et al., 1998). Há três possíveis

modelos propostos de liberação e função do ATP relacionados ao CFTR (DEVIDAS &

GUGGINO, 1994): 1) ATP e Cl- passam pelo poro do CFTR; 2) ATP passa por algum canal

diferente do CFTR, porém, regulado por este; 3) vesículas contendo ATP fusionam-se na

membrana com o CFTR, seguidas de liberação exocitótica de ATP via gradiente osmótico de

Cl- mediado pelo CFTR.

Os canais de sódio epiteliais (ENaCs) são expressos em vários epitélios como

o dos rins, intestino e vias aéreas. Ele é essencial para a reabsorção eletrogênica de eletrólitos

nesses epitélios e é inibido quando o CFTR está ativado. Estudos recentes mostram que a

ativação de receptores purinérgicos luminais não só aumenta uma condutância de cloreto

luminal diferente do CFTR, como também inibe ENaC. Vários modelos são sugeridos para a

interação do CFTR com o ENaC como a interação direta entre as proteínas (BERDIEV et al.,

2009), interação via elementos do citoesqueleto e a participação da porção C-terminal do

CFTR que se ligaria a uma proteína ligadora de domínio PDZ (KUNZELMAN et al., 2001).
 23

AT
+ PCl- + -
Apical

Cl- K+ Na+
N
ORCC CFT
CFTR ROMK a ENa
ENaC
R C

Basolateral
Basolatera
l

Figura 9. O CFTR como regulador de outras condutâncias. Desenho esquemático representando o CFTR
estimulando o canal de cloreto ORCC e o canal de potássio ROMK e inibindo o canal de sódio ENaC. Figura
original.

A reabsorção de sódio através dos ENaCs é inibida durante a ativação de

secreção de Cl- em células que também expressam CFTR, o que sugere que quando o CFTR

seja ativado, os ENaCs são inibidos (STUTTS et al., 1995; MALL et al., 1996; MORALES et

al., 1999). Outros trabalhos já sugeriram que o CFTR e os ENaCs interagem diretamente por

ligação proteína-proteína, além do transporte de Cl- pelo CFTR contribuir para a inibição de

ENaCs, mas sem um mecanismo ainda definido. (ISMAILOV et al., 1996 e 1997;

KUNZELMAN et al., 1997; BRIEL et al., 1998).

Os canais de potássio ROMK medeiam a reciclagem de potássio apical no

ramo grosso ascendente da alça de Henle e a secreção de potássio no ducto coletor cortical

através de sua expressão luminal nestes segmentos (WANG et al., 1997). A reciclagem do

potássio é importante para a reabsorção de NaCl e para o mecanismo de diluição do ramo

grosso ascendente, que leva à concentração destes solutos na medula renal (GREGER, 1985).

Há três fenômenos importantes em relação ao potássio no ramo grosso ascendente da alça de

Henle. Primeiro, a reciclagem de potássio hiperpolariza a membrana luminal da célula, o que

 24

promove um gradiente eletroquímico para a difusão de cloreto pela membrana basolateral.

Segundo, a reciclagem de potássio é essencial para o potencial lúmen-positivo, que é a força

motriz para e reabsorção de sódio, cálcio e magnésio. E por terceiro, a reciclagem de potássio

gera um suprimento adequado de potássio para o cotransportador Na+-K+-2Cl- e seu adequado

funcionamento (WANG, 1999; LU et. al, 2006).

Estudos anteriores demonstraram que a inibição do receptor de sulfonilureia

(SUR), também membro da família ABC com funcionamento semelhante ao do CFTR,

também inibe a atividade de ROMK2. Esta inibição ocorre, provavelmente, por aumento da

concentração local de ATP ou por interação direta entre SUR e ROMK2 (INAGAKI et al.,

1995). Portanto, uma proteína acessória é necessária para a completa atividade de ROMK2.

Os canais SUR1 e SUR2, envolvidos na interação com ROMK2, não são expressos nos rins

(AGUILAR-BRYAN et al., 1998). Já que o CFTR é abundantemente expresso no rim e tem a

capacidade de regular outras condutâncias, vários grupos têm investigado a possibilidade do

CFTR se acoplar ao ROMK para formar um canal de potássio sensível ao ATP e de baixa

condutância. McNicholas e colaboradores (1996) descreveram que quando o CFTR é

coexpresso juntamente com ROMK2, a aplicação de agentes que inibem SUR, como

glibenclamide, bloqueia a atividade de ROMK2.

Estudos em ovócitos de Xenopus com a técnica de voltage clamp sugerem que

haja um acoplamento entre o CFTR e o ROMK1, fazendo com que ROMK1 tenha sua

sensibilidade ao ATP aumentada. Isso faz com que sua atividade também seja aumentada.

Concentrações milimolares de ATP-Mg não tiveram efeito sobre ROMK1 quando este estava

expresso sozinho. No entanto, sua coexpressão com CFTR fez com que o canal de potássio se

tornasse mais sensível ao ATP (RUKNUDIN et. al, 1998). Esses dados sugerem que o CFTR

tenha um papel importante no rim e em outros órgãos onde o ROMK é expresso.

 25

A função do CFTR nos rins, provavelmente, não é apenas de um canal de

cloreto que participa do fluxo desse íon. A sua principal função talvez seja a de regular outras

condutâncias de diversos transportadores no epitélio renal.

1.6 Fibrose Cística e Rim

A fibrose cística é causada por mutações no canal de cloreto CFTR. Estas

mutações causam a deficiência da secreção de cloreto e da capacidade deste canal de regular

outras condutâncias. Entre os distúrbios presentes nesta doença, pode-se destacar obstrução

intestinal severa, espessamento do muco das vias respiratórias ocasionando infecções

recorrentes e fibrose pulmonar, insuficiência pancreática, infertilidade masculina, entre outros

(RIORDAN et al., 1989; BOAT et al., 1989; MORALES et al., 2001)

A fibrose cística é a doença genética recessiva mais frequente na população

caucasiana (1:2500 nascidos vivos) (QUINTON, 1994). Dois terços dos casos de fibrose

cística são atribuídos à uma única mutação: deleção da fenilalanina 508 em NBD-1. Apesar

disso, ainda há mais mil mutações associadas à fibrose cística. A proteína ∆508-CFTR não

consegue se formar adequadamente e é degradada (DU et al., 2005). Outras mutações

produzem uma proteína truncada ou canais que possuem sua capacidade de transporte

diminuída (GADSBY et al., 2006).

Apesar das alterações funcionais nos diferentes órgãos, pacientes com fibrose

cística não apresentam disfunções renais importantes, a não ser pelo fato de possuírem a

excreção renal de NaCl e a capacidade de diluir e concentrar urina diminuídas, mas sem

alterações significativas dos parâmetros urinários. (DONCKERWOLCKE et al., 1992;

STENVINKEL et al., 1991). Esta falta de um fenótipo renal é, a priori, paradoxal, já que o

CFTR é bastante expresso nos rins e está envolvido na regulação de mecanismos de secreção

e reabsorção tubulares (MORALES et al., 1996; 2000, 2001; DE ANDRADE PINTO et al.,

2007; SOUZA-MENEZES et al., 2008).

 26

Na ausência do CFTR no rim, outros canais de cloreto pode compensar a

função do CFTR. Isso não parece ocorrer já que o CFTR não está envolvido apenas com o

transporte de cloreto, mas também com a regulação de outros canais.

1.7 Regulação Hormonal do CFTR no Rim

A regulação de transportadores iônico nos epitélios renal e intestinal é

fundamental para a regulação do volume do fluido extracelular. Os hormônios clássicos que

regulam este volume como a aldosterona e o fator atrial natriurético induzem o transporte

iônico não só nos rins, mas também no cólon distal (GROTJOHANN et al, 1999; CORIC et

al., 2004; NOVAIRA et al., 2006). Esses hormônios regulam a expressão de canais de cloreto

no tecido renal (MORALES et al., 2001; JENTSCH et al., 2002; ORNELLAS et al., 2002) e

na parte distal do intestino, particularmente, no cólon proximal e distal (NOVAIRA et al.,

2006; SCHROEDER et al., 2000; ESTEVEZ et al., 2001)

Nosso grupo também mostrou que a arginina vasopressina é capaz de modular

o canal de cloreto CFTR em córtex e medula de rim de rato e também em células da linhagem

MDCK-I. Ratos privados de água também tiveram o aumento da expressão do CFTR no rim

(MORALES et al., 2001).

Embora os hormônios tireoidianos não sejam tidos como reguladores clássicos

do VFEC, receptores do hormônio T3 estão presentes no epitélio renal, sugerindo uma

potencial ação deste hormônio (SHAHRARA et al., 1999). De fato, os hormônios

tireoidianos tiroxina (T4) e triiodotironina (T3) afetam tanto a morfologia quanto a atividade

de transportadores renais alterando tanto sua função e/ou expressão no néfron (DE

ANDRADE PINTO et al., 2007)

O hormônios tireoidianos, dependendo de seus níveis plasmáticos, podem

regular a excreção renal de NaCl (AZUMA et al., 1996). No hipotireoidismo, há diminuição

tanto do ritmo de filtração glomerular quanto da capacidade de concentrar urina (KATZ et al.,
 27

1975). Recentemente, nós demonstramos que ratos com hipotireoidismo têm a expressão de

CFTR diminuída e os ratos com hipertireoidismo têm essa expressão aumentada (DE

ANDRADE PINTO et al., 2007).

Estudos realizados por nosso grupo explorou o papel do fator atrial

natriurético na modulação do CFTR. Foi observado que este hormônio é capaz de aumentar a

expressão de RNAm do CFTR em cólon proximal de rato e numa linhagem celular de

intestino humano (CaCo-2) (NOVAIRA et al., 2006).

A modulação do CFTR por todos esses hormônios – AVP, fator atrial

natriurético e hormônios tireoidianos – sugerem que este canal participe de mecanismos de

transporte iônicos relacionados com a regulação do FEC.

A AVP tem importante papel no transporte de água no néfron distal. Porém,

sua ação sobre os transportadores de íons é também relevante para a formação e manutenção

da concentração urinária e deve ser considerada.

1.8 O hormônio AVP e sua Ação Renal

Em mamíferos, pequenas mudanças na osmolalidade plasmática ou na

concentração extracelular de sódio induzem respostas fisiológicas e comportamentais para

que a pressão osmótica sistêmica seja mantida (BOURQUE et al., 1994). A

hiperosmolalidade tem como resposta fisiológica a liberação de arginina vasopressina (AVP)

também conhecida como hormônio antidiurético (ADH), que tem a propriedade de regular a

osmolalidade plasmática promovendo a reabsorção de água nos túbulos renais distais. Há

também a liberação de hormônios natriuréticos (oxitocina, por exemplo), estes por sua vez

aumentam a excreção de sódio (DENTON et. al, 1996).

As respostas comportamentais à hipertonicidade compreendem o aumento da

sede e a inibição do apetite por sal. Em condições de hipotonicidade, essas respostas são

moduladas no sentido oposto. O estímulo mais potente para a sede é o aumento da

 28

osmolalidade plasmática e a conseqüente desidratação celular. A diminuição do volume do

fluido extracelular, a redução de 10% ou mais do volume sangüíneo e a diminuição da pressão

arterial também induzem à sede, embora de maneira menos eficiente (STRICKER &

VERBALIS, 1999).

As respostas osmorregulatórias são controladas por osmorreceptores e por

detectores centrais de sódio (BOURQUE & OLIET, 1997). Os neurônios osmorregulatórios

estão localizados no tronco cerebral e no núcleo do prosencéfalo adjacente à parede anterior

do terceiro ventrículo. As células neurossecretórias magnocelulares sintetizam

individualmente a vasopressina e estão localizadas no núcleo supraóptico e paraventricular do

hipotálamo, de onde elas projetam axônios que vão até a neurohipófise. Este hormônio é

transportado em vesículas pelo axônio até as terminações nervosas. Como a neurohipófise não

possui uma barreira hematoencefálica, a vasopressina vai imediatamente para a circulação

sistêmica (figura 10) (BROWNSTEIN et. al, 1980; OLDFIELD et. al, 1991).

As células da porção final do néfron são relativamente impermeáveis à água,

tendo sua permeabilidade aumentada na presença de AVP, devido à estimulação da expressão

da aquaporina-2 (AQP2), na membrana apical das células principais destes segmentos. Este

hormônio liga-se ao receptor localizado na membrana basolateral que ativa uma cascata de

sinalização que resulta na inserção de vesículas contendo AQP2 pré-formadas na membrana

luminal. Esta inserção de AQP2 na membrana luminal e a presença constitutiva de

aquaporinas 3 e 4 na membrana basolateral permitem a reabsorção da água (MARPLES et al.,

1995, KATSURA et al., 1997) (figura 11).

 29

Figura 10. Desenho esquemático do hipotálamo, onde o hormônio AVP é sintetizado; da hipófise posterior,
onde este hormônio é liberado e de seu local de ação no néfron. Voisin & Bourque, 2002.

Além da ação antidiurética, a arginina vasopressina também tem outras ações:

ativar o transporte de cloreto de sódio no ramo grosso ascendente da alça de Henle, ativar o

transporte de ureia no ducto coletor e tem ação vasoconstritora na musculatura lisa arteriolar.

A hipertonicidade da medula é necessária para o mecanismo de concentração

urinária. A medula permite que haja um gradiente osmótico para a reabsorção de água na

presença do hormônio AVP. Este processo ocorre pelo acúmulo progressivo de solutos no

interstício renal, principalmente, cloreto de sódio e ureia. O AVP controla tanto a reabsorção

de cloreto de sódio quanto a de ureia.

 30

Luz tubular Célula Interstício

C B A

AVP

AQP2

AQP3
Vesículas de AQP4
AQP2

Figura 11. Eventos celulares associados com a ação do AVP na permeabilidade à água da célula principal do
ducto coletor. (A) O ADH liga-se ao receptor localizado na membrana basolateral e, através da proteína G
(G), ativa a adenilato ciclase (AC), produzindo AMP cíclico (AMPc) que ativa proteína cinase A (PKA). (B)
Esse evento faz com que vesículas de aquaporina 2 (AQP2) pré-existentes no citoplasma (C) insiram-se na
membrana luminal, tornando este epitélio permeável à água e possibilitando a sua reabsorção. Outras
aquaporinas não sensíveis ao ADH são constitutivas da membrana basolateral (AQP3 e AQP4). Figura
original.

O cotransportador apical NKCC2 é altamente expresso nas células do ramo

grosso ascendente da alça de Henle e é crucial para a reabsorção de cloreto de sódio. Ele

também serve para manter o gradiente osmótico corticomedular que permite que a urina seja

concentrada em resposta ao AVP. O AVP aumenta a quantidade de transportadores NKCC2

na membrana luminal, aumentando, desta forma, a reabsorção de cloreto de sódio (WELKER

et. al, 2008; GREGER, 2000). Isso ocorre quando o AVP se liga ao receptor V2 acoplado à

proteína Gαs, que aumenta AMPc e ativa PKA. A PKA fosforila o NKCC2 e aumenta a sua

atividade. A fosforilação também aumenta a translocação desse transportador para a

membrana luminal (GIMÉNEZ & FORBUSH, 2003).

A vasopressina também é capaz de regular, também via AMPc, os canais de

ureia UT-A1, UT-A2 e UT-A3. Esses transportadores estão presentes nas células do ducto
 31

coletor da medula interna e medeiam a reabsorção de ureia para o interstício. Assim como o

cotransportador NKCC2, os transportadores UT têm um papel fundamental no mecanismo de

concentração urinária, mantendo a medula renal interna hipertônica. O UT-A1 está localizado

na membrana apical, o UT-A2 tanto na membrana apical quanto na basolateral e o UT-A3

apenas na basolateral (STEWART et. al, 2007; SHAYAKUL et. al, 2000)

Outro efeito do AVP é o vasoconstrictor. A vasoconstrição renal ocorre no

glomérulo e, possivelmente, regula o ritmo de filtração glomerular. A contração das células

mesangiais provoca estrangulamento dos capilares glomerulares e consequente diminuição do

fluxo sanguíneo glomerular e, portanto, reduz o ritmo de filtração glomerular

(SCHLONDORFF, 1987; KREMER et al., 1992; SCHOR et al., 1981).

1.9 A cascata de sinalização gerada pelo AVP

O AVP age nas células-alvo através de seus receptores que pertencem à família

de receptores acoplados à proteína G e são classificados em dois tipos principais: V1 e V2,

associados com vias de sinalização diferentes. O receptor tipo V1 foi subdividido

molecularmente em V1a e V1b, que estimulam a subunidade Gq da proteína G heterodimérica

levando ao aumento de cálcio intracelular. Já o receptor V2 estimula a subunidade Gs levando

ao aumento de AMPc intracelular (BIRNBAUMER et al., 2000; LOLAIT et al., 1992)

O mecanismo de acoplamento do hormônio AVP aos seus receptores V1 e V2

levam à uma cascata de sinalização distinta para cada um deles. Quando o receptor V2 é

ocupado no rim, há a dissociação da Gs –GTP em suas subunidades α e βγ; a subunidade α

estimula a atividade da adenilato ciclase (AC), e um aumento subseqüente do AMP cíclico

(AMPc) aumenta a proteína cinase A (PKA) e leva à inserção do canal de água AQP-2 na

membrana luminal da célula; os dímeros βγ dissociados da Gs podem causar estimulação da

atividade de fosfolipase Cβ (PLCβ) (FAHRENHOLZ, et al., 1993).

 32

A sinalização iniciada pelo receptor V1 promove a dissociação de Gq-GTP. A

estimulação da atividade de PLCβ induzida pela subunidade αq promove a hidrólise de

fosfatidil inositol (4,5)-bifosfato (PIP2), aumentando os níveis intracelulares de diacilglicerol

(DAG) e inositol (1,4,5)-trifosfato (IP3). O IP3 por sua vez, estimula o receptor de inositol

(1,4,5)-trifosfato (IP3R), que reside na membrana do retículo endoplasmático e promove

liberação de cálcio dos estoques intracelulares. Esta liberação ativa canais catiônicos

divalentes chamados trp, que permite o fluxo de cálcio extracelular para dentro da célula para

repor os estoques (OMURA et al., 1999).

A ativação dos receptores do AVP desencadeia primeiramente respostas

citoplasmáticas (resposta a curto prazo) como a inserção de AQP-2 na membrana luminal e,

mais tarde, respostas no núcleo da célula (resposta a longo prazo). Este último se deve devido

ao acúmulo intracelular de AMPc e conseqüente ativação de PKA, podendo estar relacionado

com a modulação da expressão do gene do CFTR, embora as bases moleculares deste processo

ainda não tenham sido demonstradas (DJELIDI et al., 1999) (Figura 12).

Membrana basolateral

AC AVP AVP

V2R V1R
γ
β DAG PIP2 γ
α β +
GS + α
α GTP Gq
PLCβ
+ α
AC
+ IP3 + [Ca++]
cAMP
+ Núcleo
PKA
Inserção
do canal
AQP-2

H2O

Membrana apical

Figura 12. A cascata de sinalização do AVP. Representação de uma célula hipotética contendo receptor V1
(V1R) ao lado direito e o receptor V2 (V2R) ao lado esquerdo e suas respectivas consequências da sinalização.
Adaptado de Birnbaumer, 2000.
 33

2. JUSTIFICATIVA

Pacientes com mutações no gene que codifica o canal de cloreto CFTR

apresentam o quadro conhecido como fibrose cística. Estes indivíduos não apresentam

disfunções renais importantes, mas estudos recentes mostraram que estes pacientes

apresentam redução da capacidade de concentração urinária. Este presente trabalho teve o

intuito de verificar se fatores envolvidos com o processo de concentração urinária tais como

AVP e hipertonicidade extracelular podem estar envolvidos com a modulação do canal CFTR

nos rins.
 34

3. OBJETIVOS

3.1 Objetivo Geral

Verificar a modulação do canal de cloreto CFTR por mecanismo sistêmico através

da arginina vasopressina e por mecanismos locais através da tonicidade de meios hipertônicos

em células MDCK.

3.2 Objetivos Específicos

Verificar a ação da AVP sobre o CFTR em células MDCK-I:

1) Analisar a expressão do RNAm do canal de cloreto CFTR por RT-PCR;

2) Analisar a expressão da proteína do CFTR por Western Blotting;

3) Analisar a ativação da região promotora do CFTR;

4) Identificar qual receptor de AVP está envolvido na expressão de RNAm do CFTR.

Verificar a ação da hipertonicidade do meio sobre o CFTR em células MDCK-II

que expressam CFTR associado à green fluorescent protein (GFP):

1) Analisar a expressão de proteína total do GFP-CFTR por Western Blotting;

2) Quantificar a expressão de GFP-CFTR na membrana plasmática por microscopia

confocal;

3) Analisar a expressão de GFP-CFTR na membrana plasmática através de biotinilização

de superfície.
 35

4. MATERIAL E MÉTODOS

4.1 Cultura de Células e Tratamentos

4.1.1 Células MDCK-I e Tratamento Hormonal

Foram utilizadas células da linhagem Madin-Darby canine kidney do tipo I

(MDCK-I), originárias de néfron distal de cachorro, escolhidas por representarem um modelo

conveniente para o estudo do CFTR (MOHAMED et al., 1997).

As células MDCK-I foram cultivadas em garrafas plásticas (TPP, Suíça) com

Dulbelcco’s modified Eagle’s medium (D-MEM) contendo 5% de soro fetal bovino

(Invitrogen®, Grand Island, NY, EUA) suplementado com 25 mM glicose, 2 mM L-

glutamina, 100 U/ml penicilina e 100 µg/ml estreptomicina (Gibco, EUA) a 37o C até

atingirem 70% de confluência. Em seguida, as células foram incubadas com meio D-MEM na

ausência de soro fetal bovino por 12 horas e posteriormente tratadas com AVP ([Arg8]-

Vasopressina) na concentração de 10-8 M (MORALES et al., 2001), a 370 C por 24 horas em

placas de 6 poços. Para o estudo das vias de sinalização secundária na ação do AVP sobre a

expressão do RNAm do CFTR, as células foram previamente incubadas com antagonistas dos

receptores V1 ([β-Mercapto-β,β-ciclopentametilenepropionil1, O-me-Tir2, Arg8]-

Vasopressina) e de V2 ([Adamantaneacetil1, O-Et-D-Tir2, Val4, Aminobutiril6, Arg8,9]-

Vasopressina) ambos na concentração de 10-5 M por 24 horas (todos da Sigma-Aldrich, St.

Louis, Missouri, EUA) (OMURA et al., 1999).

Os grupos experimentais foram divididos em:

1) Controle (não tratadas);

2) AVP;

3) antagonista de V1;

4) antagonista de V2;

5) antagonista de V1+ antagonista de V2;

 36

6) AVP + antagonista de V1;

7) AVP + antagonista de V2;

8) AVP + antagonista de V1 + antagonista de V2.

4.1.2 Células MDCK GFP-CFTR e Tratamento com Hipertonicidade

Foi utilizada uma linhagem estável de células MDCK-II transfectadas com o

plasmídeo do CFTR juntamente com o gene da green fluorescent protein (GFP). Esta

linhagem celular constitui células de túbulo proximal com maior expressão de CFTR. Estas

células foram chamadas de MDCK GFP-CFTR e possibilitam o estudo da translocação do

CFTR para a membrana plasmática. Esta linhagem foi gentilmente cedida pelo professor

Garry Cutting do Instituto de Medicina Genética da Universidade John Hopkins, Baltimore,

Maryland, E.U.A. (KRASNOV et. al, 2008)

Os meios hipertônicos foram feitos utilizando o meio DMEM com higromicina

de osmolaridade normal (320 mOsm) adicionando a ele NaCl ou ureia ou sacarose até atingir

a osmolaridade de 480 mOsm ou 560 mOsm. As osmolaridades dos meios foram confirmadas

por um osmômetro (Vapor Pressure Osmometer, Model 5100C, WESCOR). Estes solutos

foram escolhidos porque o NaCl e a ureia são os responsáveis pela formação da

hipertonicidade medular e a sacarose por não permear a membrana plasmática e garantir,

assim, o choque hiperosmótico. A linhagem celular estável de MDCK foi tratada durante 18

horas com o meio normal, com os meios de 480 mOsm de cada soluto e com os meios de 560

mOsm também de cada soluto antes da extração de proteína, da microscopia confocal e da

biotinilização. Resumindo, as células são divididas de acordo com os meios: controle (Ctrl)

(células tratadas com o meio normal), meio com 480 mOsm de NaCl (NaCl 480), meio com

480 mOsm de ureia (Ureia 480), meio com 480 mOsm de sacarose (Sac 480), meio com 560

mOsm de NaCl, (NaCl 560), meio com 560 mOsm de ureia (Ureia 560) e meio com 560

mOsm de sacarose (Sac 560).

 37

4.2 Isolamento de RNA Total

O RNA total foi extraído das células utilizando-se o reagente Trizol® (GIBCO-

BRL, N.Y., EUA) seguindo o protocolo sugerido pelo fabricante. Em seguida, o RNA foi

tratado com DNase I (GIBCO-BRL, N.Y., EUA) durante 30 minutos a 37oC para eliminação

de possível contaminação com DNA genômico. A integridade do RNA extraído foi verificada

por eletroforese em gel de agarose a 1% corado com brometo de etídio para permitir a sua

visualização.

4.3 Transcrição reversa seguida por reação em cadeia da polimerase (RT-PCR)

Quinhentos nanogramas de RNA total foram utilizados para a síntese de DNA

complementar (DNAc) através da sua incubação a 65oC por 3 minutos, na presença de 0,5

µg/µl de oligonucleotídeo-dT (GibcoBRL-Life Technologies, Rockville, MD, EUA). A

transcrição reversa das amostras foi realizada em um volume total de 50 µl contendo 2,5 U da

enzima transcriptase reversa (SuperScriptTM Gibco BRL, N.Y, EUA), 10mM de dNTPs

(Amershan Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, EUA), 0,1M DTT (GibcoBRL-Life

Technologies, Rockville, MD, EUA) e 5X First Strand Buffer (GibcoBRL-Life Technologies,

Rockville, MD, EUA). O controle negativo correspondeu a uma alíquota de 500 ng do RNA

total utilizado para a síntese de DNAc na ausência da enzima transcriptase reversa,

denominado RT(-). A reação de síntese de DNAc foi interrompida por incubação a 65°C por

10 min e posterior precipitação com etanol absoluto e acetato de amônio na concentração de

7,5 M por 24 horas à temperatura de -20oC. O DNAc foi lavado com etanol 70% e

ressuspendido em 10 µl de água obtida através do processador Milli-Q.

Para a reação de PCR foram utilizados os DNAc sintetizados na presença de

2,5 U da enzima Taq DNA-polimerase (GibcoBRL-Life Technologies, Rockville, MD, EUA),

0,2 µM de cada primer (CFTR e β-actina), 1,25 mM de dNTPs (Amershan Pharmacia

 38

Biotech, Piscataway, NJ, EUA), 2mM de MgCl2, tampão de PCR 10X (Amershan Pharmacia

Biotech, Piscataway, NJ, EUA), O PCR foi realizado nas seguintes condições: desnaturação

inicial a 94oC por 4 minutos, seguida de 35 ciclos caracterizados por: 1 minuto a 54oC para

anelamento dos primers, 1 minuto a 72oC para alongamento e nova desnaturação a 94oC por 1

minuto. A reação foi concluída com uma etapa de alongamento por 10 minutos a 72oC. A

determinação do número de ciclos ideais, bem como a quantidade de RNA total para a

realização da técnica de PCR já haviam sido padronizados por nosso laboratório em trabalho

anterior (MORALES et al., 2001), sendo um passo fundamental para validação do RT-PCR

semi-quantitativo.

Os oligonucleotídeos utilizados para as reações de PCR para amplificação do

CFTR e da β-actina em células MDCK-I, foram confeccionados com base na seqüência dos

genes em estudo já publicada no GeneBank como pode ser observado na tabela 1.

Tabela 1: Oligonucleotídeos utilizados na reação de PCR para os genes do CFTR e da β-actina.

Molécula Sequência do oligonucleotídeo Posição Tamanho

CFTR (humano)

Sense 5’TCACCGAAAGACAACAGCATCCACACGAAAAG3’ 2481-2512 297 pb

Antisense 5’ CACAGCACAACCAAAGAAGCAGCCACCTC 3’ 2747-2777

β-actina (canina)
5’ GCCGTCTTCCCCTCCATCGTG 3’ 21-41
Sense 482 pb
433-502
5’ CGGGACCTGACCGACTACCT 3’
Antisense

4.4 Transfecção Transiente de Células MDCK-I

A fim de determinar se a região promotora do gene do CFTR era estimulada

por hormônio AVP foi realizada uma transfecção transiente com plasmídeo da luciferase

acoplado à seqüência do promotor do gene do CFTR para quantificar a atividade desta região.
 39

Foi utilizado também o plasmídeo com o gene da β-galactosidase para fins de normalização

do experimento.

A linhagem celular MDCK-I foi cultivada numa placa de 6 poços e ao

atingirem um estágio de aproximadamente 70% de confluência, foi realizado o ensaio de

transfecção transiente utilizando LipofectAMINE® 2000 (Invitrogen Corporation, Carlsbad,

CA, EUA), segundo o protocolo fornecido pelo fabricante. Desta maneira, 2 µg da construção

do promotor do CFTR (gentilmente cedido pelo Dr. G. Stanley McKnight, Departamento de

Farmacologia, Universidade de Washington, Seattle, WA, EUA) foram adicionados a 250 µl

de meio D-MEM sem soro e sem antibióticos para a preparação da diluição do DNA. Foi

realizada também a diluição do plasmídeo contendo o gene da β-galactosidase utilizado para

controle interno do experimento (gentilmente cedido pelo Dr. Peter Kopp, Departamento de

Endocrinologia, Northwestern University, Chicago, Illinois, EUA) realizado da mesma forma

que a diluição do plasmídeo do CFTR. Por outro lado, foi feita a diluição do lipídeo catiônico

para a transfecção, adicionando 10 µl de LipofetAMINE® 2000 a 250 µl de meio D-MEM

sem soro e sem antibióticos, posteriormente a mistura das amostras diluídas foi incubada a

temperatura ambiente por 30 minutos para permitir a associação dos DNA plasmidial ao

lipídeo. Após a incubação, os 500 µl do meio de cultura contendo os complexos DNA/lipídeo

foram adicionados a cada poço da placa de cultura reagindo durante 3 horas, sendo retirado

depois desse tempo, e com a posterior adição de 2 ml de meio D-MEM contendo 5% de soro

fetal bovino em cada poço (figura 13). As células foram submetidas ou não ao tratamento com

AVP, e após 24 horas as células foram lisadas utilizando tampão de lise (gly-gly 25mM,

MgSO4 15mM, EgTA 4mM, Triton X 25% e DTT 2mM), para obtenção do extrato de

proteína a ser utilizado para análise da atividade da luciferase.

 40

Lipofectamina Lipofectamina
Adicionar complexos
DNA 2000® diluída +
à cultura celular
diluído DNA

Ensaio para
expressão dos genes
transfectados

Incubar por 20
Incubar por 24 horas
minutos

Figura 13. Passos para a transfecção transiente de células MDCK-I.

A análise da atividade da luciferase foi realizada através de geração de luz

medida por 30 segundos a temperatura ambiente no TD-20/20 Luminometer (Turner Designs,

Ann Arbor, MI, EUA), após a adição de 100 µl do reagente de ensaio (gly-gly 25mM, MgSO4

15mM, EgTA 4mM, KH2PO4 15mM, ATP 6mM e DTT 3mM). Depois da quantificação da

atividade da luciferase foi realizada a normalização dos grupos experimentais através da

quantificação da atividade da enzima β-galactosidase das células tratadas.

Os grupos experimentais foram feitos por triplicata sendo divididos em:

1) Não transfectadas;

2) Não transfectadas + AVP;

3) Transfectadas sem AVP;

4) Transfectadas + AVP;

Os grupos que não foram transfectados foram utilizados para indicar se a

transfecção das células foi bem sucedida.

4.5 Western Blotting

4.5.1 Western Blotting de Células MDCK-I

A expressão da proteína codificada pelo gene do CFTR foi comparada entre os

diferentes grupos experimentais por Western Blotting. Foi utilizado um anticorpo primário

policlonal de coelho que reconhece o domínio R do CFTR humano

(IEEDSDEPLERRLSLVPDSEQGE), gentilmente cedido pelo Dr. William Guggino do

 41

Departamento de Fisiologia da Universidade Johns Hopkins, Baltimore, Maryalnd (ZHANG

et al. 2003).

As células MDCK-I dos grupos experimentais foram homogeneizados num

homogeneizador Potter em solução de homogeneização contendo 250 mM de sacarose, 1mM

de EDTA, 20mM de Imidazol e coquetel de inibidor de protease (ROCHE). Após

homogeneização o material é centrifugado a 1000x g por 10 minutos. O sobrenadante desta

centrifugação foi separado e reservado. O precipitado foi ressuspendido em 3 vezes o volume

inicial do preparo de solução de homogeneização e nova centrifugação a 1000x g por 10

minutos foi realizada. O precipitado foi descartado e o sobrenadante das duas centrifugações

foram misturados. O homogenato foi, então, centrifugado a 10.000 g por 20 minutos. O

precipitado desta centrifugação é descartado e o sobrenadante novamente centrifugado a

100.000x g por 60 minutos. O precipitado contendo as membranas celulares foi ressuspendido

em solução de homogeneização gelada. A concentração da proteína foi determinada pelo

método de Bradford (1976), utilizando albumina sérica bovina (BSA) a 1mg/ml como padrão

(BSA). Todos os extratos de proteínas são solubilizados por aquecimento a 95°C por 2

minutos em solução tampão de proteínas (solução de homogeneização). 100 microgramas de

cada homogenato de proteínas de membranas são colocadas em cada poço de gel de SDS-

PAGE (7,5%) e submetidas a eletroforese por 90 minutos a 200V a 50 mA. Após a

eletroforese as proteínas são transferidas para uma membrana de nitrocelulose com poros de

0.45 µm de espessura (Millipore, Sigma Chemical Co. St. Louis-USA).

As membranas após a transferência são bloqueadas com leite desnatado

diluído a 5% em tampão salino TBS-T 0,05% e incubadas com anticorpo contra a proteína do

CFTR na diluição de 1:1000 por 1 hora à temperatura ambiente em tampão (leite desnatado a

3% diluído em TBS-T 0,05%). O anticorpo secundário específico para o anticorpo primário

 42

do CFTR é o IgG anti-coelho marcado com fosfatase alcalina para revelação na diluição de

1:1000 (GREGORY et al., 1990; CHENG et al., 1991).

A revelação do immunoblotting para o CFTR será revelada utilizando

75mg/ml de nitroblue tetrazolium chloride (NBT) e 50 mg/ml de 5-bromo-4-cloro-3-

indolylphosphate p-toluidine salt (BCIP) (ambos reagentes da Gibco-BRL-Life tecnologies,

Rockvile - USA) em solução alcalina contendo 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 100 mM Tris

pH 9,5 overnight. As variações da expressão da proteína serão observadas através de análise

densitométrica (Sigma Gel v1.1, gel analysing software, Jandel, EUA).

4.5.2 Western Blotting de Células MDCK GFP-CFTR

As células MDCK-GFP CFTR foram revestidas e processadas como descrito

anteriormente (CHENG et. al, 2002).Resumidamente, as células foram solubilizadas em

tampão de lise (50 mM de NaCl, 150 mM de Tris-HCl, pH 7.4, 1% Nonidet P-40) com

inibidor de protease (Roche Applied Science). Os lisados celulares foram centrifugados a

14.000g por 15 minutos a 4oC. As concentrações de proteínas dos sobrenadantes foram

quantificadas pelo método de Bradford. As proteínas do sobrenadante foram submetidas a um

gel de SDS-PAGE e posterior Western Blotting.

O Western Blotting foi revelado por quimioluminescência (Super Signal -

Amersham Biosciences) capturada pelo sistema FujiFilm LAS-1000 com câmera CCD de

1.300.000-pixel, com linearidade de 3,7 ordens de magnitude. As proteínas marcadas com

GFP foram reconhecidas utilizando anticorpo de coelho policlonal anti-GFP (1:1000; BD

Biosciences, Boston, MA) enquanto as proteínas de gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase

(GAPDH) foram detectadas com anticorpo de camundongo monoclonal (1:10000, US

Biological - Biochemical & Biological Reagents Mouse).

4.6 Microscopia Confocal

A linhagem estável de MDCK GFP-CFTR foi cultivada em poços transwell até

 43

a confluência ser atingida antes do tratamento com os meios hipertônicos. Após o tratamento

de 18 horas com o meio hipertônico, as células foram fixadas com paraformaldeído a 4% e

permeabilizadas com Nonidet P-40 a 0,2%. Ligações não-específicas foram bloqueadas com

soro normal de cabra a 5%.

As células foram coradas com wheat germ agglutinin (WGA- Invitrogen, 1:500)

mostrado em cor vermelha, sem permeabilização, para a marcação de membrana plasmática.

O 4',6-diamidino-2-fenilindola (DAPI – Roche) foi utilizado para marcação do núcleo

mostrado na cor azul. Para análise do GFP-CFTR, ele foi visualizado no espectro da

fluorescência verde. As células foram montadas e visualizadas num microscópio confocal

UltraVIEW (PerkinElmer Life Sciences).

A técnica de microscopia confocal foi realizada pela aluna de Doutorado Roberta

Lassance no laboratório do Professor William Guggino no Departamento de Fisiologia da

Universidade Johns Hopkins, Baltimore, Maryalnd.

4.7 Biotinilização de Superfície

Para a biotinilização de superfície apenas o meio hipertônico de 480 mOsm foi

utilizado, uma vez que ambos os meios hipertônicos (480 e 560 mOsm) apresentaram os

mesmos resultados na microscopia confocal. A biotinilização de superfície do CFTR foi

realizada como já foi descrito anteriormente (KRASNOV et. al, 2008). As proteínas de

superfície forma marcadas com Sulfo-NHS-SSBiotin EZ-LinkTM impermeável

(sulfosuccinimidyl-2-(biotinamido)ethyl-1,3-dithiopropionate; Pierce) a 4oC por 15 minutos.

Essas proteínas, então, foram isoladas do lisado através de uma incubação com NeutrAvidin

beads a 4oC por 2 horas (Pierce; número de catálogo 53151). As proteínas ligadas foram

eluídas com tampão 2x Laemmli (50mM de Tris, 0,38M de glicina, 0,2% de SDS),

suplementado com 100 mM de ditiotreitol a 42oC por 30 minutos. As proteínas eluídas foram

submetidas a um gel de SDS-PAGE e posterior Western Blotting. A revelação foi feita por
 44

quimioluminescência com Super Signal (Amersham Biosciences). O anticorpo para o GFP-

CFTR utilizado foi um anticorpo de coelho policlonal anti-GFP (Amersham Biosciences).

4.8 Análise Densitométrica

A densitometria das bandas do CFTR dos experimentos de RT-PCR, Western

Blotting e biotinilização de superfície foi realizada com a utilização do programa de análise

computacional (Sigma Gel v1.1, gel analysing software, Jandel, EUA).

4.9 Análise Estatística

O software GraphPad Prism Trial 5.0 foi utilizado para fazer as análises estatísticas.

Os resultados foram apresentados como média ± erro padrão. As comparações estatísticas

entre os grupos experimentais foram avaliadas por análise de variância (One Way ANOVA)

seguido do teste de comparação múltipla de Newman-Keuls. Quando havia apenas dois

grupos experimentais para serem comparados, foi utilizado o teste t não pareado. Os valores

de p<0,05 foram considerados significativos.

 45

5. RESULTADOS

5.1 Estudo da ação do hormônio AVP sobre a expressão do RNAm do canal de cloreto

CFTR em células MDCK-I por RT-PCR

A modulação do RNAm do CFTR pelo hormônio AVP foi verificada através

da técnica de RT-PCR semiquantitativo, como já havia sido demonstrada por Morales e

colaboradores (2001)

Foi feita a análise densitométrica das bandas correspondentes aos genes do

CFTR e da β-actina. Este último utilizado como gene interno. Demonstrou-se que houve um

aumento da expressão do RNAm de 1,14 (± 0,35) em relação ao controle quando as células

são tratadas com AVP na concentração de 10-8 M (n=4, p<0,05) (figura 14).

Esses resultados confirmam que o hormônio AVP é capaz de aumentar a

expressão do RNAm do canal de cloreto CFTR em células MDCK-I a longo prazo (24 horas).

A Ctrl AVP

β-actina (482 pb)

CFTR (297 pb)

B
2.5 *
CFTR/Beta-Actina em relação

2.0
ao controle

1.5

1.0

0.5

0.0
Ctrl AVP

Figura 14. RT-PCR semiquantitativo dos genes do CFTR e da β-actina. (A) Gel de agarose representativo do
experimento de RT-PCR onde foram amplificados tanto o CFTR (297pb) quanto a β-actina (482pb). (B)
Gráfico representando os valores densitométricos obtidos pela razão do CFTR pela β-actina correspondente
em relação ao grupo controle (n=4, p< 0,05).
 46

5.2 Análise da expressão da proteína do CFTR em células MDCK-I após tratamento

com AVP por Western Blotting

Foi realizada a extração da fração de membrana de células epiteliais de túbulo

renal distal da linhagem MDCK-I crescidas em cultura e submetidas a tratamentos com AVP

durante 24 h na concentração de 10-8 M, concentração que promoverá a máxima modulação

do RNAm do CFTR, resultado obtido em experimentos anteriores. A análise densitométrica

da banda da proteína do CFTR obtidas por Western Blotting dos diferentes grupos mostrou

um aumento da expressão de 0,44 (± 0,09) no grupo tratado com AVP quando comparado

com o grupo controle (n=3, p<0,05) (figura 15). O experimento foi normalizado com a

expressão da β-actina.

1.6
*
CFTR/Beta-Actina em relação

1.5
1.4
ao controle

1.3
1.2
1.1
1.0
0.9
0.00
CTRL AVP

Figura 15. Expressão da proteína do CFTR em células MDCK-I não tratadas (Ctrl) e em células tratadas com
AVP na concentração de 10-8 M por 24 horas. (A) Figura representativa das bandas do CFTR e da β-actina
numa membrana de nitrocelulose. (B) Gráfico representativo da média dos valores densitométricos relativos
obtidos para as bandas do CFTR normalizados com a β-actina. (n=3, p<0,05).
 47

5.3 Estudo da ativação da região promotora do CFTR pelo AVP em células MDCK-I

A fim de verificar se o aumento da expressão do RNAm do CFTR em células

MDCK-I induzido por AVP era produzido pelo estímulo da sua transcrição gênica, foi

realizado o ensaio com o gene repórter da luciferase acoplado ao promotor do CFTR.

As células transfectadas e tratadas com AVP nas concentrações 10-8M e 10-9M

tiveram um aumento significativo em relação às células que foram transfectadas sem

hormônio de 0,21 vezes (±0,03)e 0,019 vezes (±0,06), respectivamente (p<0,05, n=4). Estes

resultados demonstram que a região promotora sofre ativação sugerindo aumento da

transcrição gênica pelo tratamento com AVP (Figura 16).

Os grupos experimentais que não sofreram transfecção do gene do CFTR

associado ao da luciferase apresentaram atividade desta enzima praticamente nula. Já os

grupos que sofreram transfecção apresentaram atividade enzimática aumentada, indicando

que a transfecção celular foi bem sucedida. Todo os resultados foram normalizados pela

atividade da enzima β-galactosidase.

1.25 * *
(Luciferase/Beta-Galactosidase)

1.20
Valores Arbitrários

1.15

1.10
1.05

1.00
0.95
0.1
0.0
AVP - AVP + AVP - AVP 10-8M AVP 10-9M

Não Transfectado Transfectado

Figura 16. Representação gráfica das médias obtidas da análise da atividade da luciferase normalizada
através da quantificação da β-galactosidase (n=4, p< 0,05).
.
 48

5.4 Estudo da participação dos receptores de AVP na expressão do RNAm do CFTR em

células MDCK-I por RT-PCR

A participação do receptor V2 na modulação da expressão de RNAm do CFTR

via AVP em células MDCK-I foi demonstrada através da técnica de RT-PCR semi-

quantitativo.

A análise densitométrica das bandas correspondentes ao gene do CFTR,

devidamente normalizadas pelo gene da β-actina, mostrou que houve um aumento da

expressão de RNAm do canal de 1,14 (± 0,35) no grupo tratado com AVP em relação ao

controle (n=4, p<0,05). Nas células que foram tratadas com AVP e antagonista do receptor

V1, também foi observado um aumento significativo de 1,3 (± 0,53) em relação ao controle

(n=4, p<0,05). Já no grupo tratado com AVP e antagonista do receptor V2, o aumento da

expressão do RNAm pelo AVP foi inibido em relação ao controle. Os demais grupos, onde

foram utilizados apenas antagonistas, serviram como controles negativos (figura 17).

Estes resultados demonstram a participação do receptor V2 na modulação do

canal de cloreto CFTR em células MDCK-I tratadas com AVP (figura 15).

5.5 Análise da expressão de proteína total do GFP-CFTR por Western Blotting em

células MDCK GFP-CFTR

A linhagem MDCK GFP-CFTR foi tratada por 18 horas com os meio

hipertônicos (NaCl 480mOsm, ureia 480mOsm, sacarose 480mOsm, NaCl 560mOsm, ureia

560mOsm e sacarose 560mOsm) e a expressão de proteína total foi analisada através da

técnica de Western Blotting.

 49

B
Valores Densitométricos Arbitrários

3.0
2.5 * *
2.0
(CFTR/Beta-Actina)

1.8

1.2

0.6

0.0
VP
l

V1

V2

V1

V2

2
tr

+V

+V
C

V1

V1
Antagonistas Antagonistas + AVP

Figura 17. Resultado do RT-PCR semiquantitativo da ação do AVP sobre a expressão do CFTR em células
MDCK-I. (A) Gel de agarose representativo do experimento de RT-PCR onde foram amplificados tanto o
CFTR (297pb) quanto a β-actina (482pb). (B) Gráfico representando as médias das razões entre os valores
densitométricos obtidos para o CFTR pela β-actina correspondente (n=4, p< 0,05).
.

A proteína total do CFTR aumentou nos tratamentos com os meios

hipertônicos quando comparados com o grupo controle (n=5-8, p < 0,01), exceto no caso do

meio hipertônico de uréia (tanto em 480 mOsm quanto em 560 mOsm) (Figura 16). Os

aumentos da expressão da proteína para células tratadas com meios de 480 mOsm foram de

1,49 (±0,18) e 1,55 (±0,23) para NaCl e sacarose, respectivamente, em relação. Para as células

tratadas com meios de 560mOsm, os aumentos foram de 2,04 (±0,54) e 2,05 (±1,03) para

NaCl e sacarose, respectivamente, também em relação ao controle. Todos os resultados foram

normalizados com a expressão do gene GAPDH (figura 18).

 50

A GFP-CFTR

GAPDH

Ctrl NaCl Ureia Sac NaCl Ureia Sac

480 mOsm 560 mOsm

B
Valores Densitométricos Arbitrários

4
*
*
(GFP-CFTR/GAPDH)

3
* *
2

0
Ctrl NaCl Ureia Sac NaCl Ureia Sac

480 mOsm 560 mOsm

Figura 18. Western Blotting do GFP-CFTR. (A) Figura representativa das bandas na membrana de PVDF.
(B) Gráfico representativo da média dos valores densitométricos relativos obtidos para as bandas do GFP-
CFTR normalizados com o GAPDH em relação ao grupo controle (n=5-8, p < 0,01).

5.6 Análise da expressão de GFP-CFTR na membrana plasmática por microscopia

confocal

A fim de verificar se o aumento da expressão da proteína do CFTR estava

ocorrendo na membrana plasmática, as células MDCK GFP-CFTR tratadas com os meios

hipertônicos nas concentrações de 480 e 560 mOsm foram submetidas à microscopia

confocal.

A microscopia confocal mostrou que o GFP-CFTR na membrana plasmática

aumentou no tratamento com todos os tipos de meios hipertônicos, ou seja, a co-localização

do GFP e do WGA foram maiores nas células tratadas do que nas células não tratadas (Ctrl)

(n=4, p<0,001) (figura 19). Os aumentos para as células tratadas com meios hipertônicos de
 51

480 mOsm, em relação ao controle, foram de 0,62 (±0,11); 0,79 (±0,16) e 0,61 (±0,12) para

NaCl, ureia e sacarose, respectivamente. Para o tratamento com meios hipertônicos de 560

mOsm, os aumentos em relação ao controle foram de 0,70 (±0,18); 0,54 (±0,18) e 0,64

(±1,44) para NaCl, ureia e sacarose, respectivamente.

A
Ctrl

NaCl 480

Ureia 480
GFP-CFTR
WGA (membrana)
Sac 480 DAPI (núcleo)

NaCl 560

Ureia 560

Sac 560

B
2.5
na membrana plasmática

*
2.0
* * * *
% de GFP-CFTR

*
1.5

1.0

0.5

0.0
Ctrl NaCl Ureia Sac NaCl Ureia Sac

480 mOsm 560 mOsm

Figura 19. Microscopia confocal do GFP-CFTR co-localizado com GWA, demonstrando a co-localização e
o aumento de GFP-CFTR na membrama. (A) Imagem representativa da microscopia confocal. (B) Gráfico
representativo dos valores das intensidades das fluorescências em relação ao controle (n=4, p<0,001)
 52

5.7 Análise da expressão da proteína GFP-CFTR por biotinilização de superfície

Para confirmar os resultados obtidos na microscopia confocal, foi feita uma

biotinilização de superfície das células MDCK GFP-CFTR tratadas com meio hipertônico.

Uma vez que os meios hipertônicos demonstraram os mesmos resultados na microscopia

confocal tanto na concentração de 480 mOsm quanto na de 560 mOsm, as células foram

tratadas apenas na concentração de 480 mOsm. A expressão das proteínas de membrana foi

normalizada com a expressão de proteínas totais. Isso demonstra o quanto da proteína total

está expressa na membrana.

Assim como na microscopia confocal, houve um aumento significativamente

estatístico da expressão da proteína do CFTR na membrana tanto com o meio de NaCl ( n=5,

p<0,05) quanto para o meio de ureia (n=5, p<0,05). Porém, neste caso, células tratadas com o

meio de sacarose não foram significativamente diferentes do controle (figura 20). Para o

tratamento com meio de NaCl, o aumento em relação ao controle foi de 1,58(±0,34) e para o

tratamento com o meio de ureia o aumento foi de 1,24 (±0,34).

A
A
(Proteína de Membrana/Proteína Total)

B
Valores Densitométricos Arbitrários

3.0 *
2.5 *
2.0

1.5

1.0

0.5

0.0
Ctrl NaCl Ureia Sac
480 mOsm
Figura 20. Análise da biotinilização de superfície demonstrando a razão da expressão de proteína de
membrana pela proteína total. (A) Imagem representativa das bandas da proteína total e de membrana de
GFP-CFTR. (B) Gráfico representativo da relação dos valores densitométricos arbitrários de GFP-CFTR de
membrana sobre GFP-CFTR total (n=5, p<0,05)
 53

6. DISCUSSÃO

Pacientes com mutações no gene que codifica o canal de cloreto CFTR

apresentam o quadro conhecido como fibrose cística, caracterizada por anormalidades em

vários órgãos. Os principais órgãos afetados são pulmões, intestino e pâncreas (RIORDAN et

al., 1989). Os rins expressam abundantemente CFTR ao longo do néfron (CRAWFORD et

al., 1991; MORALES et al., 1996) e ele participa do fluxo de secreção de cloreto nos rins e

também funciona como um regulador de outras condutâncias no epitélio renal (DJELID et al.,

1999; SCHWIEBERT et al.,1999). Talvez esta função regulatória seja a principal função do

CFTR no rim tendo em vista que sua condutividade é muito baixa (6-10pS) (BERGER et al.,

1991). Além disso, o fato de que pacientes com fibrose cística não apresentam disfunções

renais importantes nos leva a crer que os outros canais de cloreto expressos ao longo do

néfron – os canais da família ClC, por exemplo – compensam a falta de atividade do CFTR

quando este está mutado.

O achado de que pacientes com fibrose cística possuem a capacidade de

concentração urinária diminuída pode sugerir que o CFTR esteja envolvido nos mecanismos

de concentração urinária como regulador de outras condutâncias (DONCKERWOLCKE et

al., 1992). O canal de potássio ROMK retroalimenta o transportador tríplice NKCC e este, por

sua vez, é responsável pela formação da hipertonicidade medular. A falta de atividade do

CFTR na fibrose cística poderia deixar de regular ROMK, o que diminuiria a atividade deste

último canal e comprometeria a retroalimentação do NKCC e, consequentemente, a formação

da hipertonicidade medular.

O hormônio arginina vasopressina (AVP) promove a reabsorção de água nos

túbulos renais distais devido à inserção de aquaporinas, como foi demonstrado por Agre e

colaboradores (1993). Este evento aumenta a permeabilidade das células do ducto coletor à

água permitindo, assim, que ela seja reabsorvida neste segmento. A AVP também é capaz de
 54

aumentar a expressão e a atividade de UT, aumentando a reabsorção de ureia para o interstício

medular renal. A ureia é responsável por 50% da hipertonicidade medular e sua recirculação é

necessária para a manutenção da hipertonicidade medular. Os transportadores tríplices

(NKCC2) também são modulados positivamente pela AVP e estes também são responsáveis

pela formação da hipertonicidade medular. O hormônio AVP, então, modula os mecanismos

de formação e manutenção da hipertonicidade medular para que a concentração urinária seja

possível.

Este presente trabalho teve o intuito de verificar se fatores envolvidos com o

processo de concentração urinária podem estar envolvidos com a modulação do canal CFTR

nos rins. Já foi demonstrado que a AVP é capaz de modular positivamente a expressão de

RNAm do CFTR (MORALES et. al, 2001).

Demonstramos que em células de epitélio renal distal canino da linhagem

MDCK-I o hormônio AVP aumenta a expressão de RNAm de CFTR através de seu

receptor V2, sugerindo uma importante participação deste receptor na modulação do gene

do canal CFTR. Este receptor é expresso ao longo do néfron e é por ele que a AVP exerce

sua ação antidiurética. O receptor V1 está presente na vasculatura e no glomérulo renais e é

através dele que há a ação vasopressora da AVP (MUTIG et al., 2007).

Com o intuito de verificar se essa modulação do RNAm observada envolvia

processos de regulação transcricionais foram realizados estudos em células MDCK-I

transfectadas com plasmídeos contendo o promotor do gene CFTR ligado ao gene repórter

luciferase. Nossos resultados sugerem que a modulação da expressão do CFTR através da

ação do AVP em células MDCK-I poderia ser através do estímulo da região promotora

deste gene. No entanto, os efeitos da regulação pós-transcricional deste hormônio sobre o

CFTR não foram avaliados neste estudo.

 55

Para avaliar se a modulação observada do RNAm do CFTR pelo AVP em

células MDCK-I era também capaz de modificar a expressão deste canal na membrana

celular, a técnica de Western Blotting foi realizada. Houve aumento da expressão da

proteína do CFTR. Esta variação na expressão pode ter sido induzida pelo aumento da

expressão de RNAm observado anteriormente pela técnica de RT-PCR, mas não

descartando a possibilidade de processos de regulação pós-transcricionais sobre este canal.

Outros hormônios envolvidos na regulação do FEC são capazes de regular o

transporte iônico nos rins e cólon como aldosterona e fator atrial natriurético GROTJOHANN
et al, 1999; CORIC et al., 2004; NOVAIRA et al., 2006). Esses hormônios e até mesmo o
hormônio tireoidiano também regulam a expressão de canais de cloreto no tecido renal
(MORALES et al., 2001; JENTSCH et al., 2002; ORNELLAS et al., 2002) e na parte distal
do intestino (NOVAIRA et al., 2006; SCHROEDER et al., 2000; ESTEVEZ et al., 2001).
A linhagem estável de células MDCK transfectadas com GFP-CFTR

mostraram-se um bom modelo para estudar a expressão de CFTR na membrana

plasmática. As células MDCK-II, que foram utilizadas para o estabelecimento desta

linhagem, são originárias de túbulo proximal canino. O túbulo proximal expressa pouco

CFTR na membrana, sua principal localização neste segmento do néfron é citoplasmática

onde está localizado em organelas intracelulares ao longo das vias endocíticas e secretórias

deste túbulo (BRADBURY, 1999). Quando transfectadas, as células MDCK-II passam a

expressar CFTR em abundância, tornando possível a avaliação da translocação do CFTR

para a membrana. Além disso, a marcação do gene do CFTR com o do GFP facilita a

técnica de microscopia confocal, permitindo a visualização do CFTR no comprimento de

onda da fluorescência verde.

Na microscopia confocal, a colocalização do CFTR com a membrana

plasmática mostra que há aumento deste canal na membrana quando as células são

expostas a meios hipertônicos. Os resultados da biotinilização de superfície foram

 56

consistentes com os resultados da microscopia confocal. Exceto pelo fato de que, na

biotinilização, as células tratadas com meio hipertônico de sacarose (480 mOsm) não

foram significativamente diferentes das células controle. Este resultado conflitante pode ter

ocorrido devido à diferente acurácia entre as técnicas. A biotinilização de superfície tem

mais acurácia, mostrando apenas as proteínas que estão na superfície celular. Já na

microscopia confocal, a coloração de membrana com WGA pode ficar espessa e quando a

colocalização é feita as proteínas perto da membrana são colocalizadas e a expressão do

CFTR pode ser superestimada. Por essa razão, decidimos usar ambas as técnicas. Na

biotinilização, foram utilizados apenas meios hipertônicos de 480 mOsm, uma vez que na

microscopia confocal os resultados foram similares independentemente da osmolaridade

do meio.

Os resultados do Western Blotting mostraram que a expressão do CFTR

aumentou com o tratamento com os meios hipertônicos, exceto com o tratamento com o

meio hipertônico de ureia. Estes resultados são consistentes com estudos em peixes e aves

que demonstrou o aumento da expressão da proteína do CFTR em altas concentrações

extracelulares de cloreto de sódio, mas não com altas concentrações extracelulares de ureia

(ERNST et. al, 1994; SINGER et. al, 1998). Isto sugere que o aumento da expressão de

proteína do CFTR pode estar relacionado com o controle do volume celular já que a ureia

consegue passar pela membrana plasmática através de transportadores de ureia não

afetando o seu volume. Outros dados publicados mostram que meios hipertônicos de NaCl

e manitol, mas não o de ureia, induzem ao aumento da expressão de transportadores

(BOWEN et. al, 1992).

É proposto, então, neste estudo, que a expressão do canal de cloreto CFTR seja

modulada pelo AVP e por meios hipertônicos, sugerindo sua importância fisiológica na

manutenção da hipertonicidade medular e, conseqüentemente, da regulação do VFEC. Essa

 57

hipótese fica bastante respaldada se lembramos que esse canal é capaz não somente de

participar do fluxo transepitelial de cloreto, mas ainda de regular outras condutâncias iônicas

em diferentes epitélios (SCHWIEBERT et al,.1995; MALL et al., 1996; STUTTS et al.,

1995). Com esse trabalho, portanto, esperamos estar contribuindo para o entendimento da

função fisiológica do CFTR no epitélio renal.

 58

7. CONCLUSÕES

O hormônio AVP modula positivamente o canal de cloreto CFTR, aumentando a

expressão de sua proteína e de seu RNAm. Esta modulação é feita a partir do estímulo da

região promotora e com a participação do receptor V2.

O choque hiperosmótico causado nas células também foi capaz de modular

positivamente a expressão do CFTR. A hipertonicidade provocou o aumento da expressão de

proteína do CFTR tanto total quanto presente na membrana plasmática.

 59

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ABRAHAN, E.H.; OKUNIEFF, P.; SCALA, S.; VOS, P.; OOSTERVELD, M. J. S.;
CHEN, A. Y.; SHRIVASTAV, B. Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator
and adenosine triphosphate. Science. 275(5304), p. 1324-1326, fev. 1997.

AGRE, P.; PRESTON, G. M.; SMITH, B. L.; JUNG, J. S.; RAINA, S.; MOON, C.;
GUGGINO, W. B.; NIELSEN, S. Aquaporin CHIP: the archetypal molecular water
channel. Am. J. Physiol. 265(4), p. F463-F476, out. 1993.

AGUILAR-BYRAN, L.; CLEMENT, J. P.; GONZALEZ, G.; KUNJILWAR, K.;

BABENKO, A.; BRYAN, J. Toward understanding the assembly and structure of
KATP channels. Physiol Rev. 78(1), p. 227–245, jan.1998.

AIRES, M. Visão morfofuncional do rim. In: Fisiologia (Ed. By M.Aires), Rio de

Janeiro: Guanabara Koogan, p. 679-692. 2008.

AMES, G. F. L.; MIMURA, C. S.; SHYAMALA, V. Bacterial periplasmic permeases

belong to a family of transport proteins operating from Escherichia coli to human:
traffic ATPases. FEMS Microbiol. Rev. 6(4), p. 429-446, ago. 1990.

ANDERSON, M. P.; BERGER, H. A.; RICH, D. P.; GREGORY, R. J.; SMITH, A. E.;
WELSH, M. J. Nucleosides triphosphates are required to open the CFTR chloride
channel. Cell. 67(4), p. 775-784, nov. 1991a.

ANDERSON, M. P.; GREGORY, R. J.; THOMPSON, S.; SOUZA, D. W.; PAUL, S.;
MULLIGAN, R. C.; SMITH, A. E.; WELSH, M. J. Demonstration that CFTR is a
chloride channel by alteration of its anion selectivity. Science. 253(5016), p. 202-205,
jul. 1991b.

AZUMA K. K.; BALKOVETZ, D. F,. MAGYAR, C. E.; LESCALE-MATYS, L.;

ZHANG, Y.; CHAMBREY, R.; WARNOCK, D. G.; MCDONOUGH, A. A. Renal
Na+/H+ exchanger isoforms and their regulation by thyroid hormone. Am. J. Physiol.
270(2), p. C585–C592, fev. 1996.

BERDIEV, B. K.; QADRI, Y. J.; BENOS, D. J. Assessment of the CFTR and ENaC
association. Mol. Biosyst. 5(2), p. 123-127, fev. 2009.

BERGER, H. A.; ANDERSON, M. P.; GREGORY, R. J.; THOMPSON, S.;

HOWARD, P. W.; MAURER, R. A.; MULLIGAN, R.; SMITH, A. E.; WELSH, M. J.
 60

Identification and regulation of the cystic fibrosis transmembrane conductance

regulator-generated chloride channel. J. Clin. Invest. 88(4), p. 1422-1431, out. 1991.
BIRN, H. & CHRISTENSEN, E. I. Renal albumin absorption in physiology and
pathology. Kidney Int. 69(3), p. 440–449, fev. 2006.

BIRNBAUMER, M. Vasopressin receptors. Trends Endocrinol. Metab. 11(10), p. 406-

410, dez. 2000.

BOAT, T. F.; WELSH, M. J.; BEAUDET, A. L. Cystic fibrosis. in: The metabolic basis
of inherited disease. Edited by Scriver CR, Beaudet AL, Sly Ws & Valle D.McGraw-
Hill. p. 2649-2680. 1989.

BOURQUE, C. W., OLIET, S. H.; RICHARD, D. Osmoreceptors, osmoreception and

osmoregulation. Front. Neuroendocrinol. 15(3), p. 231-274, set. 1994.

BOURQUE, C. W. & OLIET, S.H. Osmoreceptors in the central nervous system. Annu.
Rev. Physiol. 59, p. 601-619. 1997.

BOWEN, J. W. Regulation of Na(+)-K(+)-ATPase expression in cultured renal cells by

incubation in hypertonic medium. Am. J. Physiol. 262(4), p. C845-C853, abr. 1992.

BRADBURY, N. A. Intracellular CFTR: localization and function. Physiol. Rev. 79(1),

p. S175–S191, jan. 1999.

BRENNER, B.M. Anatomy of the kidney. In: The Kidney (Ed. By B.M.Brenner),
Philadelphia: Saunders, p. 25-80. 2007.

BRIEL, M.; GREGER, R.; KUNZELMAN, K. Cl- transport by cystic fibrosis

transmembrane conductance regulator (CFTR) contributes to the inhibition of epithelial
Na+ channels (EnaCs) in Xenopus oocytes coexpressing CFTR and EnaC. Journal of
Physiology. 508(3), p. 825-836, maio. 1998.

BROWNSTEIN, M. J.; RUSSEL, J. T. ; GAINER, H. Synthesis, transport, and release

of posterior pituitary hormones. Science. 207(4429), p. 373–378, jan. 1980.

CHANG, E. B.; BOOKSTEIN C.; VAANDRAGER, A.; DEJONGE, H. R.; BUSE, J.;
MUSCH, M. W. Cystic fibrosis transmembrane regulator mRNA expression relative to
ion-nutrient transport in spontaneously differentiating human intestinal CaCo-2
epithelial cells. J. Lab. Clin. Med. 118(4), p. 377-381, out. 1991.
 61

CHEN, T. Y.; HWANG, T. C. CLC-0 and CFTR: chloride channels evolved from
transporters. Physiol Rev. 88(2), p. 351-387, abr. 2008.

CHENG, S. H.; RICH, D. P.; MARSHALL, J.; GREGORY, R. J.; WELSH, M. J.;
SMITH, A. E. Phosphorylation of the R domain by cAMP-dependent protein kinase
regulates the CFTR chloride channel. Cell. 66(5), p. 1027-1036, set. 1991.

CHENG, J.; MOYER, B. D.; MILEWSKI, M.; LOFFING, J.; IKEDA, M.; MICKLE, J.
E.; CUTTING, G. R.; LI, M.; STANTON, B. A.; GUGGINO, W. B. Golgi-associated
PDZ domain protein modulates cystic fibrosis transmembrane regulator plasma
membrane expression. J Biol Chem. 277(5), p. 3520-529, fev. 2002.

CHRISTENSEN, E. I.; BIRN, H. Megalin and cubilin: multifunctional endocytic

receptors. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3(4), p. 256–266, abr. 2002.

CORIC, T.; HERNANDEZ, N.; ALVAREZ, D. L. R.; SHAO, D.; WANG, T.;
CANESSA, C. M. Expression of ENaC and serum- and glucocorticoidinduced kinase 1
in the rat intestinal epithelium. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 286 (4), p.
G663–G670, abr. 2004

COWLEY, A. W. Jr. & ROMAN, R. J. The role of the kidney in hypertension. JAMA.
275(20), p. 1581-1589, maio. 1996.

CRAWFORD, I.; MALONEY, P. C.; ZEITLIN, P. L.; GUGGINO, W. B.; HYDE, S.

C.; TURLEY, H.; GATTER, K. C.; HARRIS, A.; HIGGINS, C. F.
Immunocytochemical localization of the cystic fibrosis gene product CFTR. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA. 88(20), p. 9262-9666, out. 1991.

DE ANDRADE PINTO, A. C.; BARBOSA, C. M. L., ORNELLAS, D. S.; NOVAIRA,

H. J.; DE SOUZA-MENEZES, J.; ORTIGA-CARVALHO, T. M.; FONG, P.;
MORALES, M.M. Thyroid hormones stimulate renal expression of CFTR. Cell.
Physiol. Biochem. 20(1-4), p. 83–90. 2007.

DEAN, M. & ALLIKMETS, R. Evolution of ATP-binding cassette transporter genes.

Curr. Opin. Genet. Dev. 5(6), p. 779–785, dez. 1995.

DEELEY, R. G. & COLE, S. P. Substrate recognition and transport by multidrug

resistance protein 1 (ABCC1). FEBS Lett. 580(4), p. 1103–1111, fev. 2006.
 62

DENTON, D. A.; MCKINLEY, M. J.; WEISINGER, R. S. Hypothalamic integration of

body fluid regulation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93(14), p. 7397-7404, jul. 1996.

DEVIDAS, S. & GUGGINO, W. B. The cystic fibrosis transmembrane conductance

regulator and ATP. Curr. Opin. in Cell Biol.. 9(4), p. 547-552, ago. 1994.

DEVUYST, O.; BURROW, C. R.; SCHWIEBERT, E. M.; GUGGINO, W. B.;

WILSON, P. D. Developmental regulation of CFTR expression during human
nephrogenesis. Am. J. Physiol. 271(3), p. F723–F735, set. 1996.

DJELID, S.; FAY, M.; CLUZEAUD, F.; SOUMARMOM, A. T.; BONVALET, J. P.;
FARMAN, N.; CHABAUD, M. B. Vasopressin stimulates long-term net chloride
secretion in cortical collecting duct cells. FEBS Lett. 460(3), p. 533-538, nov. 1999.

DONCKERWOLCKE, R. A.; VAN DIEMEN-STEENVOORDE, R.; VAN DER

LAAG, J.; KOOMANS, H. A.; BOER, W. H. Impaired diluting segment chloride
reabsorption in patients with cystic fibrosis. Child Nephrol. Urol. 12(4): 186-191. 1992.

DU, K.; SHARMA, M.; LUKACS, G. L. The DeltaF508 cystic fibrosis mutation
impairs domain-domain interactions and arrests post-translational folding of CFTR.
Nature Struct. Mol. Biol. 12(1), p. 17–25, jan. 2005.

ESTEVEZ, R.; BOETTGER, T.; STEIN, V.; BIRKENHAGER, R.; OTTO, E.;
HILDEBRANDT, F.; JENTSCH, T. J. Barttin is a Cl− channel beta-subunit crucial for
renal Cl− reabsorption and inner ear K+ secretion. Nature 414(6863), p. 558–561, nov.
2001.

ERNST, S. A.; CRAWFORD, K. M.; POST, M. A.; COHN, J. A. Salt stress increases
abundance and glycosylation of CFTR localized at apical surfaces of salt gland
secretory cells. Am. J. Physiol. 267(4), p. C990-1001, out. 1994.

FAHRENHOLZ, F.; JURZAK, M.; GERSTBERGER, R.; HAASE, W. Renal and

central vasopressin receptors: immunocytochemical localization. Ann. NY Acad. Sci.
689, p. 194-206, jul. 1993.

FONG, P. & JENTSCH, T. J. Molecular basis of epithelial Cl- channels. J. Membr.

Biol. 144(3), p. 189-197, abr. 1995.

FRANCIOLINI, F. & PETRIS, A. Chloride channels of biological membranes.

Biochim. Biophys. Acta. 1031(2), p. 247-259, maio. 1990.
 63

FULMER, S. B.; SCHWIEBERT, E. M.; MORALES, M. M.; GUGGINO, W. B.;

CUTTING, G. R. Two cystic fibrosis transmembrane conductance regulator mutations
have different effects on both pulmonary phenotype and regulation of outwardly
rectified chloride currents. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92(15), p. 6832–6836, jul.
1995.

GADSBY, D. C. & NAIRN, A. C. Control of CFTR channel gating by phosphorylation

and nucleotide hydrolysis. Physiol. Rev. 70 (1), p.S77-S107, jan. 1999.

GADSBY, D. C.; VERGANI, P.; CSANÁDY, L. The ABC protein turned chloride
channel whose failure causes cystic fibrosis. Nature. 440(7083), p. 477-483, mar. 2006.

GARCÍA, N. H.; RAMSEY, C. R.; KNOX, F. G. Understanding the role of paracellular

transport in the proximal tubule. News Physiol. Sci. 13, p. 38-43, 1998.

GIMÉNEZ, I. & FORBUSH, B. Short-term stimulation of the renal Na-K-Cl

cotransporter (NKCC2) by vasopressin involves phosphorylation and membrane
translocation of the protein. J. Biol. Chem. 278(29), p. 26946-26951, jul. 2003.

GÖGELEIN, H. Chloride channels in epithelia. Biochim Biophys Acta. 947(3), p. 521–

547, out. 1988.

GREGER, R. Ion transport mechanism in thick ascending limb of Henle’s loop of

mammalian nephron. Physiol. Reviews. 65(3), p. 760-797, jul. 1985.

GREGER, R. Physiology of renal sodium transport. Am. J. Med. Sci. 319(1), p. 51-62,
jan. 2000.

GREGORY, R. J.; CHENG, S. H.; RICH, D. P.; MARSHALL, J.; PAUL, S.; HEHIR,
K.; OSTEDGAARD, L.; KLINGER, K. W.; WELSH, M. J.; SMITH, A. E. Expression
and characterization of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.
Nature. 347(6291), p. 382-386, set. 1990.

GROTJOHANN, I.; SCHULZKE, J. D.; FROMM, M. Electrogenic Na+ transport in rat

late distal colon by natural and synthetic glucocorticosteroids. Am. J. Physiol. 276(2), p.
G491-G498, fev. 1999.
 64

HAMLYN, J. M. & BLAUSTEIN, M. P. Sodium chloride, extracellular fluid volume,

and blood pressure regulation. Am. J. Physiol. 251(4), p. F563-F575, out. 1986.

HATTON, G. I. Emerging concepts of structure-function dynamics in adult brain: the

hypothalamo-neurohypophysial system. Prog. Neurobiol. 34(6), p. 437-504. 1990.

HIGGINS, C. F. ABC transporters: from microorganisms to man. Annu. Rev. Cell.

Biol. 8, p. 67–113. 1992.

HIKI, K.; D'ANDREA, R. J., FURZE, J.; CRAWFORD. J.; WOOLLATT, E.;
SUTHERLAND, G. R.; VADAS, M. A.; GAMBLE, J. R. Cloning, characterization,
and chromosomal location of a novel human K+-Cl- cotransporter. J. Biol. Chem.
274(15), p. 10661-10667, abr. 1999.

HUSTED, R. F.; VOLK, K. A.; SIGMUND, R. D.; STROKES, J. B. Anion secretion by

the inner medullary collecting duct. Evidence for involvement of the cystic fibrosis
transmembrane conductance regulator. J. Clin. Invest. 95(2), p. 644-650, fev. 1995.

HYDE, S. C.; EMSLEY, P.; HARTSHORN, M. J.; MIMMACK, M. M.; GILEADI, U.;
PEARCE, S. R.; GALLAGHER, M. P.; GILL, D. R.; HUBBARD, R. E.; HIGGINS,
C.F. Structural model of ATP-binding proteins associated with cystic fibrosis, multidrug
resistance and bacterial transport. Nature. 346(6282), p. 362-365, jul. 1990.

INAGAKI, N.; GONOI, T.; CLAMENT, J. P.; NAMBA, N.; INAZAWA, J.;
GONZALEZ, G.; AGUILAR-BYRAN, L.; SEINO, S.; BRYAN, J. Reconstitution of
IKATP: an inward rectifier subunit plus the sulfonylurea receptor. Science. 270(5239),
p. 1166–1170, nov. 1995.

ISMAILOV, I. I.; WAYDA, A.; JOVOV, M. S.; BEADIEV, B. K.; FULLER, C. M.;
DIDMAN, J. R.; KOETZEL, M.; BENOS, D. J. Regulation of epithelial sodium
channels by the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Journal of
Biological Chemistry. 271(9), p. 4725-4732, mar. 1996.

ISMAILOV, I. I.; BERDIEV, B. K.; SHLYONSKY, V. G.; FULLER, C. M.; PRAT,

A. G.; JOVOV, B.; CANTIELLO, H. F.; AUSIELLO, D. A.; BENOS, D. J. Role of
actin in regulation of epithelial sodium channels by CFTR. American Journal of
Physiology. 272 (4), p. C10077-C1086, abr. 1997.

JACOBSON, H. R. & RECTOR, F. C. Jr. Renal regulation of extracellular fluid

composition. Kidney Int. 38(4) 569 –761, out. 1990.
 65

JENTSCH, T. J.; STEIN, V.; WEINREICH, F.; ZDEBIK, A. A. Molecular structure

and physiological function of chloride channels. Physiol. Rev. 82(2), p. 503–568, abr.
2002.

JENTSCH, T. J. Chloride transport in the kidney: lessons from human disease and
knockout mice. J. Am. Soc. Nephrol. 16(6), p. 1549-1561, jun. 2005.

JENTSCH, T. J. ClC chloride channels and transporters: from genes to protein structure,
pathology and physiology. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 43(1), p.3–36, jan. 2008.

JOURET, F.; BERNARD, A.; HERMANS, C.; DOM, G.; TERRYN, S.; LEAL, T.;
LEBECQUE, P.; CASSIMAN, J. J.; SCHOLTE, B. J.; DE JONGE, H. R.; COURTOY,
P. J.; DEVUYST, O. Cystic fibrosis is associated with a defect in apical receptor-
mediated endocytosis in mouse and human kidney. J. Am. Soc. Nephrol. 18(3), p. 707–
718, mar. 2007.

JOURET, F. & DEVUYST, O. CFTR and defective endocytosis: new insights in the
renal phenotype of cystic fibrosis. Pflugers Arch. 457(6), p. 1227-1236, abr. 2008.

KATSURA, T.; GUSTAFSON, C. E.; AUSIELLO, D. A.; BROWN, D. Protein kinase

A phosphorylation is involved in regulated exocytosis of aquaporin-2 in transfected
LLC-PK1 cells. Am. J. Physiol. 272 (6), p. F817-22, jun. 1997.

KATZ, A. I.; EMMANOUEL, D. S.; LINDHEIMER, M. D. Thyroid hormone and the

kidney. Nephron. 15(3-5), p. 223–249. 1975.

KJAER, A. Vasopressin as a neuroendocrine regulator of anterior pituitary hormone

secretion. Acta Endocrinol. 129(6), p. 489-496, dez. 1993.

KRASNOV, K. V.; TZETIS, M.; CHENG, J.; GUGGINO, W. B.; CUTTING, G. R.

Localization studies of rare missense mutations in cystic fibrosis transmembrane
conductance regulator (CFTR) facilitate interpretation of genotype-phenotype
relationships. Hum. Mutat. 29(11), p. 1364-1372, nov. 2008.

KREMER, S. G.; ZENG, W.; SRIDHARA, S.; SKORECKI, K. Multiple signaling

pathways for Cl- dependent depolarization of mesangial cells: role of Ca2+, PKC and G
proteins. Am. J. Physiol. 262(4), p. F668- F678, abr. 1992.

KUNZELMAN, K.; KISER, G.; SCHREIBER, R.; RIORDAN, J. R. Inhibition of

epithelial sodium currents by intracellular domains of the cystic fibrosis transmembrane
conductance regulator. FEBS Letters. 400(3), p. 341-344, jan. 1997.
 66

KUNZELMAN, K.; SCHREIBER, R.; BOUCHEROT, A. Mechanisms of the inhibition

of epithelial Na+ channels by CFTR and purinergic stimulation. Kidney Int. 60(2), p.
455–461, ago. 2001.

LETZ, B. & KORBMACHER, C. cAMP stimulates CFTR-like Cl- channels and

inhibits amiloride-sensitive Na+ channels in mouse CCD cells. Am. J. Physiol. 272(2),
p. C657-C666, fev. 1997.

LOLAIT, S. J.; O’CARROL, A. M.; MCBRIDE, O. W.; KONIG, M.; MOREL, A.;
BROWNSTEIN, M. J. Cloning and characterization of a vasopressin V2 receptor and
possible link to nephrogenic diabetes insipidus. Nature. 357(6376), p. 336-9, 1992.

LU, M.; LENG, Q.; EGAN, M. E.; CAPLAN, M. J.; BOULPAEP, E. L.; GIEBISCH,
G. H.; HEBERT, S. C. CFTR is required for PKA-regulated ATP sensitivity of Kir1.1
potassium channels in mouse kidney. J. Clin. Invest. 116(3), p. 797-807, 2006.

MACKNIGHT, A. D. C. & LEAF, A. Regulation of cellular volume. Physiol. Rev.

57(3), p. 510–573, jul. 1977.

MALL, M.; HIPPER, A.; GREGER, R.; KUNZELMAN, K. Wild type but not delta
F508 CFTR inhibits Na+ conductance when coexpressed in Xenopus oocytes. FEBS
Letters. 381(1-2), p. 47-52, fev. 1996.

MARPLES, D.; KNEPPER, M. A.; CHRISTENSEN, E. I.; NIELSEN, S. Redistribution

of aquaporin-2 water channels induced by vasopressin in rat kidney inner medullary
collecting duct. Am. J. Physiol. 269 (3), p. C655-C664, set. 1995.

MAYER, G. An update on the relationship between the kidney, salt and hypertension.
Wien. Med. Wochenschr. 158(13-14), p. 365-369. 2008.

McNICHOLAS, C. M.; GUGGINO, W. B.; SCHWIEBERT, E. M.; HEBERT, S. C.;

GIEBISCH, G.; EGAN, M. E. Sensitivity of a renal K+ channel (ROMK2) to the
inhibitory sulfonylurea compound glibenclamide is enhanced by coexpression with the
ATP-binding cassette transporter cystic fibrosis transmembrane regulator. Proc. Natl.
Acad. Sci. U.S.A. 93(15), p. 8083–8088, jul. 1996.

MOESTRUP, S. K.; KOZYRAKI, R.; KRISTIANSEN, M.; KAYSEN, J. H.;

RASMUSSEN, H. H.; BRAULT, D.; PONTILLON, F.; GODA, F. O.;
CHRISTENSEN, E. I.; HAMMOND, T. G.; VERROUST, P. J. The intrinsic factor-
vitamin B12 receptor and target of teratogenic antibodies is a megalin-binding
 67

peripheral membrane protein with homology to developmental proteins. J. Biol. Chem.

273(9), p. 5235–5242, fev. 1998.

MOHAMED, A.; FERGUSON, D.; SEIBERT, F. S.; CAI, H. M.; KARTNER, N.;
GRINSTEIN, S.; RIORDAN, J. R.; LUKACS, G. L. Functional expression and apical
localization of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in MDCK-I
cells. Biochem. J. 322(1), p. 259-265, fev. 1997.

MORALES, M. M.; CARROLL, T. P.; MORITA, T.; SCHWIEBERT, E. M.;

DEVUYST, O.; WILSON, P. D.; LOPES, A. G.; STANTON, B. A.; DIETZ, H. C.;
CUTTING, G. R.; GUGGINO, W. B. Both the wild type and a functional isoform of
CFTR are expressed in kidney. Am. J. Physiol. 270(6), p. F1038-F1048, jun. 1996.

MORALES, M. M.; CAPELLA, M. A. M.; LOPES, A. G. Structure and function of the

cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Braz. J. Med. Biol. Res. 32(8), p.
1021-1102, ago. 1999.

MORALES, M. M.; FALKENSTEIN, D.; LOPES, A. G. The cystic fibrosis

transmembrane regulator (CFTR) in the kidney. An. Acad. Bras. Cienc. 72(3), p. 399-
406, maio. 2000.

MORALES, M. M.; NASCIMENTO, D. S.; CAPELLA, M. A.; LOPES, A. G.;

GUGGINO, W. B. Arginine vasopressin regulates CFTR and ClC-2 mRNA expression
in rat kidney cortex and medulla. Pflugers Arch. 443(2), p. 202-211, nov. 2001.

MUTIG, K.; PALIEGE, A; KAHL, T.; JÖNS, T.; MÜLLER-ESTERL, W.;

BACHMANN, S. Vasopressin V2 receptor expression along rat, mouse, and human
renal epithelia with focus on TAL. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 293, p F1166–F1177,
jul. 2007.

NORSK, P. Role of arginine vasopressin in the regulation of extracellular fluid volume.

Med. Sci. Sports Exerc. 28 (10), p. S36-S41, out. 1996.

NOVAIRA, H. J.; ORNELLAS, D. S.; ORTIGA-CARVALHO, T. M.; ZHANG, X. M.;

SOUZA-MENEZES, J.; GUGGINO, S. E.; GUGGINO, W. B.; MORALES, M. M.
Atrial natriuretic peptide modulates cystic fibrosis transmembrane conductance
regulator chloride channel expression in rat proximal colon and human intestinal
epithelial cells. J. Endocrinol. 189(1), p. 155-165, abr. 2006.
 68

NYENGAARD, J. R. & BENDTSEN, T. F. Glomerular number and size in relation to

age, kidney weight, and body surface in normal man. Anat Rec. 232(2), p.194-201, fev.
1992.

OLDFIELD, B. J.; BICKNELLA, R. J.; MCALLENA, R. M.; WEISINGERA, R. S.;

MCKINLEY, M. J. Intravenous hypertonic saline induces Fos immunoreactivity in
neurons throughout the lamina terminalis. Brain Res. 561(1), p. 151–156, out. 1991.

OMURA, T.; NABEKURA, J.; AKAIKE, N. Intracellular pathways of V(1) and V(2)
receptors activated by arginine vasopressin in rat hippocampal neurons. J. Biol. Chem.
274(46), p. 32762-32770, nov. 1999.

ORNELLAS, D. S.; NASCIMENTO, D. S.; CHRISTOPH, D. H.; GUGGINO, W.

B.;MORALES, M. M. Aldosterone and high-NaCl diet modulate ClC-2 chloride
channel gene expression in rat kidney. Pflugers Arch. 444(1-2), p. 193–201, maio. 2002.

PLANELLES, G. Chloride transport in the renal proximal tubule. Pflugers Arch.

448(6), p. 561-570, set. 2004.

PONCET, V.; TAUC, M.; BIDET, M.; POUJEOL, P. Chloride channels in apical
membrane of primary cultures of rabbit distal bright convoluted tubule. Am. J. Physiol.
266(4), p. F543-F53, 1994.

QUINTON, P. M. What is good about cystic fibrosis? Curr. Biol. 4(8), p. 742-743, ago.
1994.

REISIN, I. L.; PRAT, A. G.; ABRAHAM, E. H.; AMARA, J. F.; GREGORY, R. J.;
AUSIELLO, D. A. The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator is a dual
ATP and chloride channel. J. Biol. Chem., 269(32), p. 20584-20591, ago. 1994.

REPKE, K. R.; MEGGES, R.; WEILAND, J.; SCHON, R. Location and properties of
the digitalis receptor site in Na+/K(+)-ATPase. FEBS Lett. 13; 359 (2-3), p. 107-109,
fev. 1994.

RIORDAN, J. M.; ROMMENS, J. M.; KEREM, B. S.; ALON, N.; ROZMAHEL, R.;
GRZELVAK, Z.; ZEILENSKI, J.; LOK, S.; PLAVSIC, N.; CHOU, L. Identification of
the cystic fibrosis gene: cloning and characterization of complementary DNA. Science.
245(4925), p. 1066-1073, set. 1989.
 69

ROCHA, A. S. & KUDO, L. H. Factors governing sodium and chloride transport across
the inner medullary collecting duct. Kidney Int. 38(4), p. 654–667, out. 1990.

RUKNUDIN, A.; SCHULZE, D. H.; SULLIVAN, S. K.; LEDERER, W. J.;

WELLING, P. A. Novel subunit composition of a renal epithelial KATP channel. J.
Biol. Chem. 273(23), p. 14165–14171, jun. 1998.

SCHLONDORFF, D. The glomerular mesangial cell: an expanding role for a

specialized pericyte. FASEB J. 1(4), p. 272-281, out, 1987. SCHOR, N.; ICHIKAWA,
I.; BRENNER, B. M. Mechanisms of action of various hormones and vasoactive
substances on glomerular ultrafiltration in the rat. Kidney Int. 20(4), p. 442-451, out.
1981.

SCHOR, N.; ICHIKAWA, I.; BRENNER, B. M. Mechanisms of action of various

hormones and vasoactive substances on glomerular ultrafiltration in the rat. Kidney Int.
20(4), p. 442-451, out. 1981.

SCHROEDER, B. C.; WALDEGGER, S.; FEHR, S.; BLEICH, M.; WARTH, R.;
GREGER, R.; JENTSCH, T. J. A constitutively open potassium channel formed by
KCNQ1 and KCNE3. Nature 403(6766), p. 196–199, jan. 2000.

SCHUMANN, G. B. & CRISMAN, L. G. Cerebrospinal fluid cytopathology. Clin. Lab.

Med. 5(2), p. 275-302. 1985.

SCHWIEBERT, E. M.; EGAN, M. E.; HWANG, T-H.; FULMER, S. B.; ALLEN, S.

S.; CUTTING, G. R.; GUGGINO, W. B. CFTR regulates outwardly rectifying chloride
channels through an autocrine mechanism involving ATP. Cell. 81(7), p. 1063-1073,
jun. 1995.

SCHWIEBERT, E. M.; MORALES, M. M.; DEVIDAS, S.; EGAN, M. E.; GUGGINO,

W. B. Chloride channel and chloride conductance regulator domains of CFTR, the
cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
95(5), p. 2674-2679, mar. 1998.

SCHWIEBERT, E. M.; BENOS, D. J.; EGAN, M. E.; STUTTS, M. J.; GUGGINO, W.

B. CFTR is a Conductance Regulator as well as a Chloride Channel. Phys. Rev. 79(1),1,
p. S-144-S-166, jan. 1999.

SEGAL, A. S.; GEIBEL, J.; BOULPAEP, E. L. A chloride channel in the basolateral

membrane of rabbit proximal tubule. J. Am. Soc. Nephrol. 4, p. 879-881. 1993.
 70

SHAHRARA S.; DRVOTA, V.; SYLVEN, C. Organ specific expression of thyroid

hormone receptor mRNA and protein in different human tissues. Biol. Pharm. Bull.
22(10), p. 1027–1033, out. 1999.

SHAYAKUL, C.; CRAIG P. SMITH,1 HARALD S. MACKENZIE, WEN-SEN LEE,1

DENNIS BROWN, AND MATTHIAS A. HEDIGER1 Long-term regulation of urea
transporter expression by vasopressin in Brattleboro rats. Am. J. Physiol. Renal Physiol.
278(4), p. F620-F627, abr. 2000.

SHEPPARD, D. N. & WELSH, M. J. Structure and function of the CFTR chloride

channel. Physiol. Rev. 79 (1), p. S23-S45, jan. 1999.

SINDIC, A.; CHANG, M. H.; MOUNT, D. B.; ROMERO, M. F. Renal physiology of

SLC26 anion exchangers. Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. 16(5), p. 484-490, set. 2007.

SINGER, T. D.; TUCKER, S. J.; MARSHALL, W. S.; HIGGINS, C. F. A divergent

CFTR homologue: highly regulated salt transport in the euryhaline teleost F.
heteroclitus. Am. J. Physiol. 274(3), p.C715-C723, mar. 1998.

SINGH, A. K.; VENGLARICK, C. J.; BRIDGES, R. J. Development of chloride

channels modulators. Kidney Int.48(4), p. 985-993, out. 1995.

SOUZA-MENEZES, J.; MORALES, M. M.; TUKAYE, D. N.; GUGGINO, S. E.;

GUGGINO, W. B. Absence of ClC5 in knockout mice leads to glycosuria, impaired
renal glucose handling and low proximal tubule GLUT2 protein expression. Cell.
Physiol .Biochem. 20(5), p. 455–464. 2007.

SOUZA-MENEZES, J.; TUKAYE, D. N.; NOVAIRA, H. J.; GUGGINO, W. B.;

MORALES, M. M. Small nuclear RNAs U11 and U12 modulate expression of TNR-
CFTR mRNA in mammalian kidneys. Cell. Physiol. Biochem. 22(1-4), p. 93–100.
2008.

SOUZA-MENEZES, J. & MORALES, M. M.; CFTR structure and function: is there a

role in the kidney? Biophys. Rev. 1, p. 3–12, jan. 2009.

STANTON, B. A. Characterization of apical and basolateral membrane conductance of

rat inner medullary collecting duct. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 256: F862-F868,
1989.
 71

STENVINKEL, P.; HJELTE, L.; ALVAN, G.; HEDMAN, A.; HULTMAN, E.;
STRANDVIK, B. Decreased renal clearance of sodium in cystic fibrosis. Acta Paediatr.
Scand. 80(2), p. 194-198, fev. 1991.

STEWART, G. S.; Sarah L. King, Elizabeth A. Potter, and Craig P. Smith. Acute
regulation of mUT-A3 urea transporter expressed in a MDCK cell line. Am. J. Physiol.
Renal. Physiol. 292(4), p. F1157-F1163, abr. 2007.

STRANGE, K.; EMMA, F.; JACKSON, P. S. Cellular and molecular physiology of

volume-sensitive anion channels. Am. J. Physiol. 270(3), p. C711-C730, mar. 1996.

STRICKER, E. M. & VERBALIS, J.G. Water intake and body fluids. Fundamental
Neuroscience. 1111-1126, 1999.

STUTTS, M. J.; CANESSA, C. M.; OLSEN, J. C.; HAMRICK, M.; COHN, J. A.;
ROSSIER, B. C.; BOUCHER, R. C. CFTR as a cAMP-dependent regulator of sodium
channels. Science. 269(5225), p. 847-850, ago. 1995.

TABCHARANI, J. A.; LOW, W.; ELIE, D.; HANRAHAN, J. W. Low-conductance

chloride channel activated by cAMP in the epithelial cell line T84. FEBS Lett. 270(1-2),
p. 157-164, set. 1990.

TERRY, J. The major electrolytes: sodium, potassium, and chloride. J. Intraven. Nurs.
17(5), p. 240-247, set-out. 1994.

VASILIOU, V.; VASILIOU, K.; NEBERT, D. W. Human ATP-binding cassette (ABC)

transporter family. Hum. Genomics. 3(3), p. 281-90, abr. 2009.

VOISIN, D. L. & BOURQUE, C. W. Integration of sodium and osmosensory signals in

vasopressin neurons. Trends Neurosci. 25(4), p. 199-205, abr. 2002.

WANG, W.; HEBERT, S. C.; GIEBISCH, G. Renal K+ channels: structure and

function. Annu. Rev. Physiol. 59, p. 413–436. 1997

WANG, W. Regulation of the ROMK channel: interaction of the ROMK with associate
proteins. Am J Physiol. 277(6), p. F826-F831. 1999.

WELKER, P.; BÖHLICK, A.; MUTING, K.; SALANOVA, M.; KAHL, T.;
SCHLÜTER, H.; BLOTTNER, D.; PONCE-CORIA, J.; Gamba, G.; BACHMANN, S.
 72

Renal Na+-K+-Cl– cotransporter activity and vasopressin-induced trafficking are lipid

raft-dependent. Am J Physiol Renal Physiol. 295(3):F789-802, 2008.

ZHANG, X. M.; WANG, X. T.; YUE, H.; LEUNG, S. W.; THIBODEAU, P. H.;
THOMAS, P. J.; GUGGINO, S. E. Organic solutes rescue the functional defect in delta
F508 cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. J. Biol. Chem. 278: 51232-
51242, 2003.
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