Abstract. Probiotics are beneficial microbes to improve microbial balance in the digestive tract.
Isolation of probiotic bacteria aims to obtain the potential probiotic bacteria in mackerel (Rastrelliger
sp.). This research used descriptive methods. The results showed that there were five potential
isolates of probiotic bacteria. Physiological test for identification indicates three bacteria genera
(Micrococcus, Staphylococcus and Bacillus) and one species (Hafnia alvei) which are potential
probiotic bacteria isolated from mackerel.
1
Yulvizar, Isolasi dan Indentifikasi Bakteri ............
saluran pencernaan (Afrianto dan Liviawaty, Pengambilan sampel. Bakteri probiotik diisolasi
2005) dan memberikan pengaruh positif pada organ pencernaan berupa lambung dan
terhadap fisiologi dan kesehatan inangnya. usus ikan kembung segar. Ikan dibedah untuk
Senyawa-senyawa racun yang dihasilkan pada diambil bagian lambung dan usus, lalu
metabolisme bakteri probiotik seperti asam dimasukkan ke dalam larutan fisiologis NaCl
laktat, hidrogen peroksida, bakteriosin yang 0,9% pada pH 2 (Feliatra dan Suryadi, 2004).
bersifat antimikroba dan antibiotik mampu Selanjutnya, lambung dan usus dihancurkan
menekan pertumbuhan bakteri patogen atau dihaluskan dengan menggunakan mortar
(Yulinery et al., 2006). Menurut Kanmani et al. porselen.
(2010), salah satu karakteristik bakteri probiotik
yaitu memiliki ketahanan yang tinggi terhadap Isolasi bakteri. Sampel yang telah dihaluskan,
asam. kemudian dilakukan seri pengenceran. Metode
seri pengenceran yang dilakukan dengan
Mengingat informasi mengenai identifikasi mengambil sebanyak 1 g sampel, dimasukkan
morfologi dan fisiologi dari bakteri yang ke dalam tabung reaksi yang berisi 9 ml
-1
berpotensi sebagai probiotik pada ikan kembung akuades sehingga didapat pengenceran 10 ,
-2
(Rastrelliger sp.) masih sangat terbatas, maka untuk mendapatkan pengenceran 10 dilakukan
-1
perlu dilakukan isolasi bakteri probiotik yang dengan mengambil 1 ml dari pengenceran 10
terdapat pada lambung dan usus ikan tersebut. dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi
9 ml akuades, demikian seterusnya dilakukan
-5 -4
seri pengenceran hingga 10 . Pengenceran 10
-5
BAHAN DAN METODE dan 10 diambil 1 ml kemudian dimasukkan ke
dalam cawan petri yang telah berisi media TSA
Penelitian dilakukan di Laboratorium dan diratakan, lalu diinkubasi dengan posisi
Mikrobiologi Jurusan Biologi Fakultas MIPA cawan terbalik selama 24-48 jam pada
Universitas Syiah Kuala, dari bulan April- temperatur 30ºC (Darmayasa, 2008).
Agustus 2012. Alat yang digunakan adalah
inkubator, autoklaf, erlenmeyer, hotplate, Identifikasi bakteri. Setelah inkubasi selama 48
alumunium foil, lampu bunsen, cawan petri, jam, dilakukan isolasi bakteri dengan metode
timbangan digital, mortar porselen, gelas ukur, goresan kuadran beberapa tahap hingga
tabung reaksi, pipet tetes, mikroskop, kaca diperoleh 1 isolat yang murni. Isolat-isolat yang
objek, jarum ose, kamera digital dan alat tulis. diperoleh kemudian diidentifikasi dengan
berpedoman pada buku Mikrobiologi Dasar
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini dalam Praktek Teknik dan Prosedur Dasar
adalah ikan kembung segar, media TSA Laboratorium (Hadioetomo, 1993), Bergey’s
(Tryptone Soya Agar), media TSIA (Triple Sugar Manual of Determinative Bacteriology (Holt et
TM
Iron Agar), media SIM (Sulfid Indol Motility), al., 1994) dan menggunakan MICROBACT
media MR-VP (Methyl Red dan Voges 24E Gram-Negative Identification System
Proskaurt), media Simmons Citrate, reagen (OXOID) (Oxoid, 2005). Pengamatan morfologi
Kovac, indikator methyl red (merah metil), sel yang meliputi uji pewarnaan Gram, bentuk
bahan untuk uji pewarnaan Gram (kristal violet, sel dan uji motilitas, serta uji sifat fisiologis yaitu
lugol iodine, safranin, alkohol 95% dan uji katalase, uji indol, uji MR-VP, uji Simmons
akuades), NaCl, hidrogen peroksida (H2O2), Citrate, dan uji TSIA.
TM
kapas, MICROBACT 24E Gram-Negative
Identification System (OXOID), reagent indole, Morfologi Sel
VP I, VP II, Nitrate A, Nitrate B, TDA dan
mineral oil. a. Pewarnaan Gram. Kaca objek dibersihkan
dengan alkohol dan dilewatkan beberapa kali
Prosedur Penelitian pada nyala api bunsen, kemudian diambil isolat
bakteri dengan jarum ose secara aseptik dan
Sterilisasi alat dan bahan. Semua alat dan dioleskan pada kaca objek. Isolat bakteri
bahan yang akan digunakan disterilkan dengan kemudian ditetesi ungu violet dan dibiarkan
autoklaf pada temperatur 121ºC pada tekanan selama 1 menit, selanjutnya dicuci dengan air
uap 15 lb/in2 selama 15 menit (Marlina, 2008). mengalir dan dianginkan hingga kering. Isolat
2
Biospecies Vol. 6 No.2, Juli 2013, hal. 1-7.
bakteri kemudian ditetesi lagi dengan larutan positif ditandai dengan terbentuknya lapisan
iodine dan dibiarkan selama 1 menit, kemudian berwarna merah di bagian atas biakan
dicuci dengan air mengalir dan dianginkan (Hadioetomo, 1993).
hingga kering. Selanjutnya isolat bakteri ditetesi
alkohol 95% selama 30 detik, kemudian dialiri d. Uji MR. Diambil satu koloni terpisah dengan
air dan dianginkan hingga kering. Isolat bakteri menggunakan jarum ose, kemudian diinokulasi
kemudian ditetesi safranin selama 30 detik dan ke dalam media MR-VP dan diinkubasi selama
dicuci dengan air mengalir, dikeringkan dengan 24 jam pada suhu 37ºC. Pada uji MR,
kertas penghisap dan dikering anginkan, ditambahkan 3-4 tetes indikator merah metil. Uji
kemudian dilakukan pengamatan dengan positif ditandai dengan perubahan warna
menggunakan mikroskop. Bakteri gram positif medium menjadi merah, artinya terbentuk asam
ditandai dengan warna ungu yang menunjukkan (Hadioetomo, 1993).
bahwa bakteri tersebut mampu mengikat warna
kristal violet, sedangkan bakteri gram negatif e. Uji Simmons Citrate. Diambil satu koloni
ditandai dengan warna merah muda yang terpisah dengan menggunakan jarum ose dan
menunjukkan bahwa bakteri tersebut tidak diinokulasikan pada media Simmons Citrate lalu
mampu mengikat warna kristal violet dan hanya diinkubasi pada temperatur 37ºC selama 24
terwarnai oleh safranin (pewarna tandingan) jam. Diamati adanya perubahan warna pada
(Hadioetomo, 1993). medium biakan (Hadioetomo, 1993). Uji positif
ditandai dengan berubahnya warna medium
b. Bentuk sel. Bakteri yang tumbuh kemudian menjadi biru (Sudarsono, 2008).
diamati bentuk selnya secara mikroskopik pada
kaca preparat sehingga dapat diketahui f. Uji TSIA. Diambil sebagian kecil koloni bakteri
bentuknya (kokus, batang atau spiral). dengan menggunakan ose dan diinokulasikan
pada media TSIA, kemudian dilakukan dengan
Sifat fisiologi cara menusuk tegak lurus pada bagian butt
(tusuk) dan cara zig zag pada bagian slant
a. Uji katalase. Diletakkan 2 tetes H2O2 pada (miring). Diinkubasi pada temperatur 37ºC
kaca objek yang bersih. Isolat bakteri diambil selama 24 jam. Diamati perubahan warna
menggunakan jarum ose, kemudian medium yang terjadi. Apabila bagian slant
dipindahkan ke atas kaca objek dan berwarna merah dan butt berwarna kuning
dicampurkan. Uji positif ditandai dengan maka bakteri mampu memfermentasi glukosa,
terbentuknya gelembung-gelembung oksigen sedangkan apabila bagian slant dan butt
yang menunjukkan bahwa organisme yang keduanya berwarna kuning maka bakteri
bersangkutan menghasilkan enzim katalase mampu memfermentasi sukrosa dan laktosa
yang mengubah hidrogen peroksida menjadi air (Yusuf, 2009).
dan oksigen (Hadioetomo, 1993).
Parameter penelitian
b. Uji motilitas. Isolat bakteri ditusukkan ke
dalam media SIM semi padat pada tabung Adapun parameter dari penelitian ini meliputi (i)
reaksi menggunakan jarum ose tusuk steril. jumlah isolat; (ii) morfologi sel yaitu sifat
Kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu pewarnaan Gram, bentuk dan motilitas dari
37ºC. Uji positif ditandai dengan pertumbuhan isolat bakteri; dan (iii) sifat fisiologis dari isolat
bakteri yang menyebar, maka bakteri tersebut bakteri yang berpotensi sebagai bakteri probiotik
bergerak (motil) dan bila pertumbuhan bakteri pada ikan kembung (Rastrelliger sp.).
tidak menyebar hanya berupa satu garis, maka
bakteri tersebut tidak bergerak (non motil) HASIL DAN PEMBAHASAN
(Sudarsono, 2008).
Uji fisiologis
c. Uji Indol. Diambil satu koloni terpisah dengan
menggunakan jarum ose, kemudian diinokulasi Uji fisiologis merupakan tahapan lanjutan yang
ke dalam media SIM dan diinkubasi selama 24 diperlukan untuk mengidentifikasi suatu bakteri
jam pada suhu 37ºC. Setelah inkubasi (Darmayasa et al., 2008). Uji fisiologis yang
ditambahkan 10-12 tetes reagen Kovac. Uji
3
Yulvizar, Isolasi dan Indentifikasi Bakteri ............
dilakukan dalam penelitian ini meliputi uji negatif (80%). Menurut Hadioetomo (1993),
katalase, uji indol, uji MR, uji Simmons Citrate media sitrat simmons merupakan salah satu
dan uji TSIA. medium yang digunakan untuk menguji
kemampuan bakteri dalam menggunakan sitrat
Berdasarkan Tabel 3.1, isolat LUI-01, LUI-02, sebagai satu-satunya sumber karbon yang
LUI-03 dan LUI-04 menunjukkan katalase yang digunakan. Bila bakteri mampu tumbuh dengan
positif (80%) dan isolat LUI-05 menunjukkan menggunakan sitrat sebagai satu-satunya
katalase yang negatif (20%). Dari data tersebut sumber karbon maka akan terlihat perubahan
hanya empat isolat bakteri yang menghasilkan warna pada media tumbuh bakteri pada
enzim katalase. Menurut Lay (1994), uji katalase permukaan agar miring akan menjadi warna
digunakan untuk mengetahui adanya enzim biru.
katalase pada isolat bakteri. Katalase
merupakan enzim yang dapat mengkatalisis Tabel 3.1 Uji fisiologis lima isolat bakteri yang
penguraian hidrogen peroksida (H2O2) menjadi berpotensi sebagai probiotik
air dan O2. Hidrogen peroksida bersifat toksis
Isolat
terhadap sel bakteri karena bahan ini mampu No Jenis Uji LUI- LUI- LUI- LUI- LUI-
menonaktifkan enzim dalam sel dan sangat 01 02 03 04 05
berbahaya bagi sel bakteri itu sendiri. Uji ini 1 Uji + + + + -
sangat penting dilakukan untuk mengetahui sifat Katalase
dari suatu bakteri terhadap kebutuhan oksigen. 2 Uji Indol - - - - -
3 Uji MR - - - - -
Hasil uji indol menunjukkan bahwa lima isolat 4 Uji - - + - -
bakteri memberikan nilai negatif (100%) yang Simmons
berarti tidak ada isolat bakteri yang dapat Citrate
membentuk indol. Indol merupakan senyawa 5 Uji TSIA m/k k/k k/k k/k m/k
Keterangan:
yang mengandung nitrogen yang terbentuk
+ : Terjadi reaksi
sebagai hasil pemecahan amino tryphosphat. - : Tidak terjadi reaksi
Pentingnya uji indol ini adalah karena hanya m/k : Slant merah/butt kuning
beberapa jenis bakteri saja yang dapat k/k : Slant kuning/butt kuning
membentuk indol dan produk ini dapat diuji
sehingga dapat digunakan sebagai identifikasi.
Tabel 3.1. menunjukkan bahwa isolat LUI-01
Berdasarkan Tabel 3.1, hasil pengamatan dari dan LUI-05 mampu memfermentasikan glukosa
uji methyl red (MR) ini menunjukkan bahwa (40%), sedangkan isolat LUI-02, LUI-03 dan
semua isolat bakteri tidak dapat mengoksidasi LUI-04 mampu memfermentasikan laktosa dan
glukosa yang berarti menunjukkan hasil negatif sukrosa (60%). Berdasarkan pengamatan, tidak
(100%). Menurut Sudarsono (2008), uji merah terdapat isolat yang memiliki enzim desulfurase
metil (methyl red test) bertujuan untuk yang berfungsi untuk memecah sistein dan
mengetahui kemampuan bakteri untuk menghasilkan gas yang ditandai dengan
mengoksidasi glukosa dengan memproduksi terbentuknya endapan berwarna hitam pada
asam dengan konsentrasi tinggi sebagai hasil dasar media. Menurut Sudarsono (2008), media
akhirnya. Jika media MR-VP akan menjadi TSIA mengandung tiga macam gula yaitu
merah setelah ditambahkan merah metil glukosa, laktosa, atau sukrosa. Uji TSIA ini
menunjukkan bahwa hasil uji positif, sedangkan bertujuan untuk mengetahui kemampuan dari
jika media tetap berwarna kuning menunjukkan suatu bakteri dalam memfermentasi gula untuk
hasil uji negatif. menghasilkan asam atau gas. Warna merah
pada agar menunjukkan reaksi basa,
Selanjutnya pada Tabel 3.1 juga dapat dilihat sedangkan warna kuning menunjukkan reaksi
bahwa hanya isolat LUI-03 yang mampu asam. Warna merah pada permukaan agar dan
menggunakan sitrat sebagai satu-satunya kuning di bagian bawah agar menunjukkan
sumber karbon pada uji Simmons Citrate dan bahwa terjadinya fermentasi glukosa. Warna
mengubah warna medium menjadi biru yang kuning pada bagian permukaan dan bawah
berarti positif (20%) dan isolat LUI-01, LUI-02, tabung menunjukkan terjadinya fermentasi
LUI-04 dan LUI-05 menunjukkan hasil yang laktosa dan sukrosa.
4
Biospecies Vol. 6 No.2, Juli 2013, hal. 1-7.
Identifikasi isolat
2. LUI-03 (Genus Staphylococcus)
Identifikasi genus dari suatu bakteri memerlukan
karakter-karakter utama dari bakteri yaitu Bakteri yang mendekati genus ini memiliki ciri-
morfologi sel (bentuk sel dan susunan sel), uji ciri morfologi yaitu gram positif, bentuk sel bulat
biokimia dan tipe fermentasi (Suryani et al., dan motil. Bentuk koloni bundar, tepian koloni
2010). Isolat yang berpotensi sebagai probiotik licin, elevasi koloni timbul dan warna koloni putih
pada hasil penelitian ini diperoleh lima isolat susu. Katalase positif, indol negatif, uji MR
bakteri dengan tiga jenis genera dan satu negatif, uji sitrat positif dan TSIA memiliki warna
spesies bakteri yang memilki kesamaan genus permukaan dan bawah kuning. Menurut Holt et
pada penelitian-penelitian sebelumnya. Pada al. (1994) bakteri Staphylococcus sp. gram
penelitian ikan laut diperoleh isolat-isolat yang positif, motilitas berubah-ubah, kebanyakan
berpotensi sebagai probiotik yaitu gram positif motil, koloni biasanya buram, warna koloni putih
(Bacillus, Lactococcus, Micrococcus, susu atau krem. Bakteri ini memiliki katalase
Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus, positif dan oksidase negatif, sering mengubah
Streptococcus, Weisslla) dan gram negatif nitrit menjadi nitrat, mampu memfermentasi
(Aeromonas, Alteromonas, Photorhodobac- laktosa dan sukrosa, tumbuh optimum pada
terium, Pseudomonas, Vibrio) (Marzouk et al., temperatur 37ºC. Beberapa spesies ada yang
2008). Empat jenis genus yang didapat dari patogen pada manusia dan hewan.
penelitian Feliatra dan Suryadi (2004) yaitu
genus Lactococcus, Carnoacterium, 3. LUI-04 (Genus Bacillus)
Staphylococcus, Bacillus, Eubacterium,
Pseudomonas, Lactobacillus, Micrococcus, dan Bakteri yang mendekati genus ini memilki ciri-
Bifidobacterium. Penelitian Ghosh et al. (2007) ciri morfologi yaitu gram positif, bentuk sel bulat,
mendapatkan empat jenis genus yaitu batang dan motil. Bentuk koloni bundar, tepian
Pseudomonas, Aeromonas, Edwardsiella dan koloni berombak, elevasi koloni cembung dan
Bacillus. Berikut tiga genus dan satu spesies warna koloni kuning atau krem. Katalase positif,
isolat yang ditemukan pada lambung dan usus indol negatif, uji MR negatif, uji sitrat negatif dan
ikan kembung (Rastrelliger sp.) adalah: TSIA memiliki warna permukaan dan bawah
kuning. Menurut Holt et al. (1994) bakteri
1. LUI-01 dan LUI-02 (Genus Micrococcus) Bacillus sp. gram positif, motil dengan flagel
peritrik. Endospora oval, kadang-kadang bundar
Bakteri yang mendekati genus ini memiliki ciri- atau silinder dan sangat resisten pada kondisi
ciri morfologi yaitu gram positif, bentuk sel bulat yang tidak menguntungkan. Warna koloni putih
dan non motil. Bentuk koloni bundar, tepian susu sampai kekuningan dengan tepian
koloni licin, elevasi koloni pada LUI-01 cembung berombak. Bakteri ini bersifat aerobik. Katalase
dan LUI-02 timbul, warna koloni pada LUI-01 dan oksidase positif. Indol negatif dan mampu
coklat kemerahan dan LUI-02 krem. Katalase memfermentasi glukosa serta laktosa dan
positif, indol negatif, uji MR negatif, uji sitrat sukrosa. Tersebar luas pada bermacam-macam
negatif dan TSIA pada LUI-01 memiliki warna habitat dan sedikit spesies yang patogen. Suhu
permukaan merah dan bawah kuning, tumbuh optimum pada 28ºC-35ºC.
sedangkan LUI-02 memiliki warna permukaan
dan bawah kuning. Menurut Holt et al. (1994) 4. LUI-05 (Spesies Hafnia alvei)
bakteri Micrococcus sp. gram positif, jarang
motil dan kebanyakan non motil, koloni Bakteri ini memiliki ciri-ciri morfologi yaitu gram
berwarna kekuningan sampai merah, tumbuh negatif, bentuk sel bulat dan non motil. Bentuk
pada media yang sederhana, katalase positif, koloni bundar, tepian koloni licin, elevasi koloni
indol negatif, pada uji TSIA ada yang mampu timbul dan warna koloni krem. Katalase negatif,
memfermentasi glukosa dan ada yang mampu indol negatif, uji MR negatif, uji sitrat negatif dan
memfermentasi laktosa dan sukrosa, tumbuh TSIA memiliki warna permukaan merah dan
optimum pada suhu 25ºC-37ºC. bawah kuning. Proses identifikasi pada bakteri
TM
ini menggunakan MICROBACT 24E Gram-
Negative Identification System (OXOID).
5
Yulvizar, Isolasi dan Indentifikasi Bakteri ............
6
Biospecies Vol. 6 No.2, Juli 2013, hal. 1-7.