Anda di halaman 1dari 8

4

2 METODE

Lokasi dan Waktu Penelitian

Penelitian dilaksanakan mulai bulan Mei 2012 sampai Agustus 2013


yang bertempat di Indonesian Center for Biodiversity and Biotechnology (ICBB),
Cilubang Nagrak, Situgede, Kabupaten Bogor; Laboratorium Biokimia Hasil
Perairan, Departemen Teknologi Hasil Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu
Kelautan; dan Laboratorium Manajemen Mutu, Departemen Ilmu dan Teknologi
Pangan Fakultas Teknologi Pertanian IPB.

Bahan dan Alat

Bahan yang digunakan pada penelitian adalah dua jenis isolat mikroalga
Chlamydomonas sp. ICBB 9113, Chlamydomonas sp. ICBB 9114 dan satu isolat
Synechococcus sp. ICBB 9111. Proses hidrolisis menggunakan enzim komersial
α-amilase dan amiloglukosidase yang dibeli dari PT. Kreatif Energi Indonesia.
Media BG11 digunakan dalam peremajaan dan pada tahap isolasi, selanjutnya
media teknis berdasarkan hasil penelitian terbaik Arisanti (2012) digunakan dalam
tahap kultivasi skala lapang. Komposisi media BG 11 dan media N2P1, N2P2,
N3P3 secara lengkap dapat dilihat pada Lampiran 1.
Alat-alat yang digunakan adalah erlenmeyer, outoclave, shaker,
laminar flow, spektrofotometer MAPADA V1100D, High Performance Liquid
Chromatography (HPLC) Waters 1525EF Binary HPLC Pump, neraca analitik,
aerator, lampu 2000 lux dan akuarium dengan kapasitas 100 liter dengan sumber
cahaya matahari.
Pelaksanaan Penelitian

Penelitian dilakukan dalam 4 tahap. Tahap yang pertama yaitu peremajaan


dan penyediaan stok empat isolat dalam media BG 11. Tahap kedua yaitu
produksi biomassa pada skala lab dan skala lapang dalam media N2P1, N2P2,
dan N3P3. Tahap ketiga adalah pengujian aktivitas enzim α-amilase dan
amiloglukosidase dengan menentukan pH dan suhu optimum. Tahap keempat
adalah proses produksi etanol menggunakan enzim komersial dengan aktivitas
enzim terbaik dari hasil karakterisasi tahap ketiga. Hidrolisat mikroalga yang
dihasilkan setelah proses hidrolisis selanjutnya difermentasi menggunakan
Saccharomyces cerevisiae ICBB 8808.

Peremajaan isolat mikroalga


Tahapan peremajaan diawali dengan mempersiapkan media BG 11.
Sebanyak 2 mL isolat Chlamydomonas sp. ICBB 9113, Chlamydomonas sp.
ICBB 9114 dan satu isolat Synechococcus sp. ICBB 9111 diinokulasikan ke
dalam 50 mL media BG11 dalam botol berukuran ±100 mL. Selanjutnya
dilakukan proses inkubasi selama 3 minggu dengan cara digoyang (shaker).
Proses peremajaan isolat mikroalga dapat dilihat pada Gambar 1.
5

Synechococcus sp. Chlamydomonas sp. Chlamydomonas sp.


ICBB 9111 ICBB 9113 ICBB 9114

Kultivasi pada media BG 11 pada skala lab

Sediaan mikroalga

Gambar 1 Proses peremajaan isolat Synechoccocus sp. dan Chlamydomonas sp.

Produksi biomassa
Produksi biomassa pada skala lapang dilakukan menggunakan akuarium.
Kultivasi dilakukan dengan menggunakan 20% kultur segar mikroalga ke dalam
80 liter media (N2P1, N2P2 dan N3P3) dan menggunakan cahaya matahari
sebagai sumber cahaya dengan suhu berkisar 29-39oC. Synechococcus sp.
ICBB 9111 dikultivasi pada media N2P1, Chlamydomonas sp. ICBB 9113
dikultivasi pada media N2P2, Chlamydomonas sp. ICBB 9114 dikultivasi pada
media N3P3. Pertumbuhan ketiga isolat mikroalga diukur setiap hari berdasarkan
kerapatan optik pada panjang gelombang 620 nm hingga mencapai nilai OD > 0,5
(Arisanti 2012). Nilai OD 0,5 direpresentasikan sebagai nilai kepadatan sel terbaik
pada sintesa makromolekul mikroalga untuk dikultivasi atau dilakukan
pemanenan (Ardiles 2011). Pemanenan dilakukan pada OD 0,5 dengan
menambahkan flokulan Al2(SO4)3 (alumunium sulfat) dengan konsentrasi 0,3 g/L
(desk study). Selanjutnya mikroalga disaring menggunakan kertas saring dan
dikeringkan menggunakan oven pada suhu 80oC selama 12-24 jam. Biomassa
yang diperoleh dikeringkan dengan oven pada suhu 80oC. Biomassa kering
mikroalga, kemudian dianalisis kadar air, kadar abu, kadar gula total, kadar
selulosa dan dilakukan perhitungan rendemen. Produksi biomassa mikroalga
dapat dilihat pada Gambar 2.

Pengujian aktivitas enzim α-amilase dan amiloglukosidase (Bernfeld 1955)


Aktivitas enzim α-amilase dan amiloglukosidase ditentukan menggunakan
metode Bernfeld (1955) menggunakan DNS (3.5-dinitro salicylic acid) dan pati
sebagai substrat. Enzim α-amilase komersial digunakan sebagai sampel enzim.
Satu unit aktivitas enzim α-amilase didefinisikan sebagai jumlah pati yang
terhidrolisis menjadi glukosa selama masa inkubasi 30 menit. Enzim
α-amlilase dan amiloglukosidase diencerkan menggunakan buffer fosfat sitrat
(BSF), kemudian ditambahkan 2 mL soluble starch 2% (b/v) dan diinkubasi pada
pH dan suhu yang bervariasi yaitu (5,5, 6, 6,5, 7) dan (60,70, 80, 90)oC,
sedangkan enzim amiloglukosidase diinkubasi pada pH (4,5, 5, 5,5) dan suhu
(40, 50, 60)oC. Waktu inkubasi dilakukan selama 30 menit. Hasil inkubasi yang
diperoleh diukur gula pereduksinya dengan pereaksi DNS. Satu U/mL enzim
merupakan 1µmol produk yang terbentuk dalam waktu 1 menit.
6

Synechococcus Chlamydomonas Chlamydomonas


sp ICBB 9111 sp. ICBB 9113 sp. ICBB 9114

Kultivasi ke media Kultivasi ke media Kultivasi ke media


teknis (N2P1) teknis (N2P2) teknis (N3P3)

Sediaan mikroalga

Kultivasi pada akuarium

Pemanenan awal stationer (OD 0,5)

Biomassa basah

Pengeringan
 Analisis kadar air
 Analisis kadar abu
 Analisis kadar lemak
Biomassa
 Analisis karbohidrat
kering  Analisis selulosa

Gambar 2 Produksi biomassa mikroalga.

Proses produksi etanol


Proses pembuatan etanol terdiri dari 3 tahap, yaitu likuifikasi, sakarifikasi,
dan fermentasi. Likuifikasi dan Sakarifikasi adalah proses hidrolisis karbohidrat
menjadi gula sederhana menggunakan enzim α-amilase dan amiloglukosidase.
Tahap fermentasi gula sederhana akan dirubah menjadi etanol menggunakan
S. cereviceae ICBB 8808. Pada proses likuifikasi dan sakarifikasi, terlebih dahulu
enzim komersial diuji aktivitas enzim dengan menentukan pH dan suhu
optimumnya.

Hidrolisis enzim pada mikroalga


Proses hidrolisis mikroalga menggunakan biomassa kering seberat 2,5 g.
Biomassa kering ditambahkan akuades dengan rasio padatan 5% (b/v) dalam
larutan. Mikroalga yang telah dilarutkan dengan akuades ditambahkan enzim
komersial α-amilase (likuifikasi) pada konsentrasi (0,005; 0,010; 0,020; 0,040;
0,060; 0,010%) (v/v) dan kombinasi α-amilase dengan amiloglukosidase
(sakarifikasi) pada konsentrasi 0,4% (v/v), kemudian dihidrolisis pada pH dan
suhu terbaik pada tahap ketiga. Proses hidrolisis menggunakan enzim α-amilase
7

dilakukan selama 30 menit dan amiloglukosidase selama 55 menit


(Choi et al. 2010). Substrat hasil hidrolisis disaring untuk mendapatkan
hidrolisatnya. Analisis total gula pereduksi dilakukan pada hidrolisat hasil proses
liquifikasi dan sakarifikasi. Tujuannya untuk mengetahui kemampuan enzim
α-amilase dan amiloglukosidase dalam menghidrolisis substrat mikroalga.

Fermentasi
Gula yang telah terbentuk pada proses sakarifikasi kemudian diproses ke
tahap fermentasi menggunakan S. cereviceae ICBB 8808. Isolat S. cereviceae
ICBB 8808 terlebih dahulu diremajakan pada media PDA dan diinkubasi selama
24 jam. Setelah itu isolat ditumbuhkan lagi pada 50 mL media YMGP yang terdiri
dari ekstrak yeast 5 g/L, malt 5 g/L, glukosa 10 g/L dan pepton 5 g/L di dalam
erlenmeyer 200 mL. Inkubasi dilakukan pada suhu 30oC selama 24 jam dengan
shaker berkecepatan 125 rpm (Yanagisawa et al. 2011). Proses fermentasi gula
menjadi etanol dilakukan dengan cara menambahakan kultur cair S.cerevisiae
ICBB 8808 sebanyak 10% dari substrat yang digunakan kemudian diinkubasi
selama 96 jam (Arnata 2009). Setiap 24 jam disampling dan dianalisis total gula
pereduksi dan perubahan pH. Hasil fermentasi dianalisis menggunakan HPLC
untuk mengetahui kadar etanol yang dihasilkan.

Biomassa kering
3 jenis mikroalga 5% (b/v)

Pemanasan 90oC

Enzim α-amilase
0,005%, 0,010%, 0,020%, 0,040%, 0,060%, 0,1% (v/v) (liquifikasi)

Hidrolisis pH dan suhu terbaik


selama 30 menit

Analisis total gula


Hidrolisat pereduksi
1.

Enzim amiloglukosidase 0,40% (v/v) (sakarifikasi)

Hidrolisis pH dan suhu terbaik


selama 55 menit
8

Analisis total gula


Hidrolisat pereduksi
2.

Analisis total gula Fermentasi (96 jam) dengan


pereduksi S. cerevisiae ICBB 8808
Analisis kadar etanol
(HPLC)
Distilasi

Analisis kadar etanol


Etanol (HPLC)
3.

Gambar 3 Proses produksi etanol.

Prosedur Pengujian

Analisis kadar air (AOAC 2007)


Cawan kosong yang akan digunakan dikeringkan terlebih dahulu pada
suhu 105-110oC selama 15 menit atau sampai berat konstan, kemudian
didinginkan dalam desikator selama 30 menit dan ditimbang. Sampel kira-kira
sebanyak 2 gram ditimbang dan diletakkan dalam cawan kemudian dipanaskan
dalam oven selama 3-4 jam pada suhu 105-110oC. Cawan kemudian didinginkan
dalam desikator dan setelah dingin ditimbang kembali. Persentase kadar air (berat
basah) dapat dihitung dengan rumus sebagai berikut:

bobot sampel akhir b


Kadar air
bobot sampel awal a

Analisis kadar karbohidrat luff schrool (AOAC 1984)


Prinsip analisis karbohidrat yaitu glukosa hasil hidrolisis karbohidrat akan
mereduksi larutan luff, Cu2O dalam luff yang direduksi menjadi Cu2O sampai
berwarna merah bata. Kelebihan atau sisa Cu2O dititrasi secara iodometri.
Selanjutnya larutan Luff schrool dibuat dengan cara melarutkan CuSO45H2O
sebanyak 25 g ke dalam 50 mL air suling, 50 gram asam sitrat dilarutkan dalam
50 mL air suling dan 388 gram Na2CO210H2O dilarutkan ke dalam 400 mL
air suling. Larutan asam sitrat ditambahkan sedikit demi sedikit pada larutan
soda. Campuran ditambahkan larutan terusi (CuSO45H2O) dan diencerkan hingga
100 mL ke dalam labu ukur kemudian dimasukkan 2 g sampel kering dan
ditambahkan 200 mL HCl 3% serta batu didih. Selanjutnya labu erlenmeyer
dipasang pada pendingin tegak dan dihidrolisis selama 3 jam. Larutan kemudian
didinginkan dan dinetralkan dengan NaOH dan indikator fenolftalin. Larutan
dimasukkan ke dalam labu ukur 500 mL, ditambahkan dengan air suling sampai
pada tanda tera kemudian disaring. Sebanyak 10 mL larutan dipipet ke dalam
labu erlenmeyer 250 mL dan ditambahkan larutan luff 25 mL serta 15 mL air
suling, sedangkan untuk pembuatan blanko dibuat larutan tanpa menambahkan
9

sampel selanjutnya dianalisis. Larutan yang ada dalam labu erlenmeyer dipasang
pada pendingin balik dan dididihkan selama 10 menit setelah itu larutan tersebut
langsung didinginkan pada air akuades yang mengalir. Selanjutnya ditambahkan
larutan Ki 30% dan 25 mL H2SO4 25% ke dalam larutan yang telah didinginkan.
Proses selanjutnya larutan dititrasi sampai reaksi terhenti kemudian dititrasi lagi
dengan larutan Na2S2O3 sampai larutan berwarna biru muda. Kadar karbohidrat
dapat dihitung berdasarkan rumus:

P
Kadar karbohidrat
g

P
adar pati
g

Keterangan:
0,9 = Faktor pembanding berat molekul satu unit gula dalam molekul pati
G = Glukosa setara dengan mL Na2S2O3 yang dipergunakan untuk titrasi
(mg) setelah gula diperhitungkan
P = Pengenceran
g = Bobot sampel (mg)

Kadar ADF (Van Soest 1963)


Sampel dimasukan ke dalam gelas piala 500 mL, kemudian ditambahkan
50 mL larutan ADS. Larutan ADS terdiri atas H2SO4, Cethyle trimethyl
ammonium bromidel (CTAB). Selanjutnya sampel dipanaskan selama 1 jam
di atas penangas listrik. Sampel yang telah dipanaskan dicuci dengan aseton dan
air panas, lalu disaring menggunakan pompa vakum dan dimasukkan ke dalam
filter glass. Sampel yang telah disaring lalu dicuci dengan aseton dan air panas.
Sampel yang berada dalam filter glass ditimbang masing-masing sebagai (a) dan
(b). Sampel (a) dan (b) dikeringkan menggunakan oven pada suhu 105oC selama
30 menit dan didinginkan dengan desikator dan ditimbang sebagai (c). Kadar
ADF dihitung dengan rumus:

c b
Kadar
a
Keterangan:
a = bobot sampel (g)
b = bobot filter glass (g)
c = residu ADF

Kadar selulosa (Van Soest 1963)


Residu ADF sebagai (c) yang berada di dalam filter glass diletakkan di atas
nampan yang berisi air setinggi 1 cm, kemudian ditambahkan H2SO4 72% setinggi
¾ bagian filter glass dan didiamkan selama 3 jam, lalu diaduk perlahan-lahan.
Sampel selanjutnya dicuci dengan aseton dan air panas kemudian disaring
menggunakan pompa vakum dan dimasukkan kedalam filter glass. Sampel yang
telah disaring kemudian dicuci dengan aseton dan air panas, kemudian
dikeringkan menggunakan oven pada suhu 105oC selama 3 jam dan didinginkan
dengan desikator selama 1 jam dan ditimbang sebagai (d). Kadar selulosa
dihitung dengan rumus:
10

d c
Kadar selulosa
a
Keterangan:
a = bobot sampel (g)
c = bobot filter glass dan residu ADF awal (g)
d = bobot filter glass dan residu ADF setelah dioven (g)

Total gula pereduksi metode DNS (Miller 1959)


Prinsip metode ini adalah dalam suasana alkali gula pereduksi akan
mereduksi asam 3,5 – dinitrolisilat (DNS) membentuk senyawa yang dapat diukur
absorbansinya pada panjang gelombang 550 nm.

1. Penyiapan pereaksi DNS


Pereaksi DNS dibuat dengan melarutkan 10,6 g asam 3,5 dinitrolisilat dan
19,8 NaOH ke dalam 1416 mL akuades, selanjutnya ditambahkan 306 g Na-K
Tatrat, 7,6 g fenol yang dicairkan pada suhu 50oC dan 8,3 g Na-Metabisulfit.
Larutan ini diaduk rata, kemudian 3 mL larutan ini dititrasi dengan HCl 0,1 N
dengan indikator fenolftalein. Jumlah titran berkisar 5 – 6 mL. Jika kurang dari itu
harus ditambahkan 2 g NaOH untuk setiap ml kekurangan HCl 0,1 N.

2. Penentuan kurva standar


Kurva standar dibuat dengan mengukur mengetahui nilai gula pereduksi
pada glukosa pada selang 0,2 – 0,5 mg/L. Kemudian nilai gula pereduksi dicari
dengan metode DNS. Hasil yang didapatkan diplotkan dalam grafik secara linear.

3. Penetapan total gula pereduksi


Pengujian gula pereduksi menggunakan kurva standar DNS adalah sebagai
berikut: 1 mL sampel dimasukkan ke dalam tabung reaksi, kemudian ditambahkan
3 mL pereaksi DNS. Larutan tersebut ditempatkan dalam air mendidih selama 5
menit. Larutan dibiarkan sampai dingin pada suhu ruang. Absorbansi diukur pada
panjang gelombang 550 nm.

Kadar Etanol
Pengukuran kadar etanol sampel dilakukan menggunakan HPLC
(High Performance Liquid Chromatography). Waters 1525EF Binary HPLC
Pump dengan spesifikasi sebagai berikut:
 Fase gerak : H2SO4 0,008 N
 Kolom : Aminex® HPX-87H, 300 mm x 7,8 mm
 Detektor : Reactive Index
 Kecepatan aliran : 1 mL/min
 Volume injeksi : 20 µL
 Suhu kolom : 35 oC
 Back Pressure : 1176 psi
11

Analisis Data

Proses hidrolisis
Data yang diperoleh dari hasil penelitian dianalisis menggunakan
rancangan acak lengkap (RAL). Perlakuan yang digunakan berupa perbedaan
konsentrasi enzim α-amilase pada proses likuifikasi serta kombinasi enzim
α-amilase dan amiloglukosidase pada tahap sakarifikasi dengan 2 ulangan.
Pengaruh perlakuan terhadap faktor respon kemudian dianalisis menggunakan
Analysis of Variance (ANOVA) (Steel dan Torrie 1991).

Yij µ + αi + βj + εij
Keterangan:
Yij : nilai pengamatan pada perlakuan jenis pelarut ke-i dan ulangan ke-j
µ : rataan umum
αi : pengaruh perlakuan jenis pelarut ke-i
βj : pengaruh ulangan ke-j
εij : pengaruh galat percobaan dari perlakuan jenis pelarut ke-i dan ulangan
ke-j
i : perlakuan jenis pelarut ke-i
j : ulangan ke-j

Berdasarkan Analysis of Variance (ANOVA), perlakuan perbedaan


konsentrasi yang memberikan pengaruh nyata (P<0,05) pada nilai total gula
pereduksi ketiga jenis mikroalga kemudian diuji lanjut dengan Duncan Multiple
Range Test (DMRT) menggunakan software SPSS 13,0.