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ANEXOS

Preparación de nanopartículas de plata por extracto de


tallo de garcinia mangostana e investigación de las
propiedades antimicrobianas
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https://doi.org/10.1016/j.biori.2017.11.001Obtenga derechos y contenido


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Abstracto
La síntesis de nanopartículas utilizando el método de la química verde es
un área de investigación intensificada debido a las aplicaciones
prospectivas en nanomedicinas. El propósito de este estudio fue desarrollar
un método fito-asistido simple para la síntesis de nanopartículas de plata
(AgNP) usando extracto acuoso del tallo de Garcinia mangostana como
agente reductor. La formación de AgNPs se confirmó mediante resonancia
de plasmón superficial según lo determinado por espectros UV-visible a
430ºC. Nuevo Méjico. La morfología (SEM), el patrón de difracción (XRD),
el análisis elemental (EDX) y la espectroscopía de absorción visible (UV-
vis) confirmaron la reducción de iones de plata a AgNP con la
caracterización anterior. Los datos de XRD predijeron los picos de
difracción característicos de las fases de plata elemental y la imagen de
SEM mostró nanopartículas esféricas en naturaleza monodispersa. La
evaluación antibacteriana de AgNPs se analizó midiendo la zona
inhibidora.
Palabras clave
AgNPs
Mangostán
Actividad bactericida
Garcinia mangostana
TLC

Introducción
Las nanopartículas de metal están siendo ampliamente utilizadas hoy en
día en los campos de la medicina, la biología, la ciencia de los materiales,
la física y la química. Se ha demostrado que las nanopartículas metálicas
tienen una enorme aplicación en áreas como catálisis, etiquetado biológico,
optoelectrónica ( Prathana, Chandrasekaran, Raichur y Mukerjee, 2011 ),
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eliminación de contaminantes de metales pesados ( Gupta, Srivastava,


Mohan y Sharma, 1997; Gupta, Ali, Saleh, Nayak y Agarwal, 2012; Saleh y
Gupta, 2012 ), contaminantes orgánicos ( Gupta et al., 2012; Rajendran et
al., 2016 ) y colorantes del agua ( Mittal, Mittal, Malviya, Dipika, Y Gupta,
2009, 2010 ). Existe un creciente interés en los AgNP debido a sus
propiedades antimicrobianas únicas ( Choi et al., 2008; Gopinath et al.,
2012).) Los AgNP son materiales significativos que se han estudiado
ampliamente con propiedades eléctricas, ópticas y biológicas y, por lo
tanto, se aplican en catálisis, biodetección, obtención de imágenes,
administración de fármacos, fabricación y especialmente en medicina
( Jain, Huang, El-Sayed y El-Sayed, 2008 ; Nair y Laurencin, 2007 ). La
síntesis de AgNP se estudió ampliamente mediante el empleo de métodos
químicos y físicos, pero el desarrollo de tecnología confiable para producir
nanopartículas es una característica vital de la nanotecnología ( Natarajan,
Selvaraj y Ramachandra, 2010 ). Las nanopartículas se sintetizan por
diversos métodos, como físico, químico y biológico. Los métodos físicos y
químicos son costosos y también producen subproductos peligrosos
( Magudapatty, Gangopadhyayrans, Panigrahi, Nair y Dhara, 2001).) Por el
contrario, la síntesis verde utiliza extractos de plantas que tienen una
atención considerable en la síntesis de nanopartículas con productos
simples, no peligrosos y ecológicos ( Nair y Pradeep, 2007 ).
Los extractos vegetales actúan como agentes reductores y rematantes
para el desarrollo de nanopartículas, son más favorables que otros
procesos biológicos ( Valli y Vaseeharan, 2012 ), por el hecho de que
destruyen el proceso elaborado de cultivo y mantenimiento de la célula, y
también pueden ser ampliado para la síntesis de nanopartículas a gran
escala ( Saxena, Tripathi, Zafar y Singh, 2012 ). Diferentes materiales
vegetales como frutas, cortezas, tallos, cáscaras de frutas, raíces y callos
se han estudiado hasta ahora para la síntesis de nanopartículas de plata,
oro, platino y titanio en varios tamaños y formas ( Gopinath et al., 2012 ).
Garcinia mangostana Linn, pertenece a la familia Clusiacea / Guttiferae. Es
una planta tropical generalmente conocida como mangostán que se origina
en el sudeste asiático. La planta es rica en xantonas y se sabe que
contiene una gran variedad de polisacáridos naturales ( Bennett y Lee,
1989 ). Los compuestos de xantona tienen actividad antibacteriana
antiinflamatoria, antioxidante, antiproliferativa, antiplamodial y potente
( Pedraza-Chaverri, Reyes-Fermin, Nolasco-Amaya, Orozco-Ibarra y
Medina, 2009 ). El compuesto principal se reconoció mediante el uso de la

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técnica de cromatografía en capa fina (TLC). La síntesis verde de AgNPs


evaluados en base a las perspectivas de la química verde, medio solvente,
agente reductor y surtido de sustancias no tóxicas para los AgNP
( Raveendran, Fu y Wallen, 2003)) Principalmente, los AgNP se usaron
como bactericida. Las nanopartículas de plata se han utilizado
recientemente en muchos productos de consumo como jabón, pasta de
dientes y calcetines debido a sus propiedades antibacterianas
( Rajeshkumar, 2016 ).
Basado en este enfoque, el presente estudio tiene como objetivo sintetizar
nanopartículas de plata por una ruta biológica verde, utilizando un extracto
derivado de tallo de mangostán, y la caracterización de las nanopartículas
sintetizadas utilizando espectroscopía UV-visible (UV-vis), microscopio
electrónico de barrido (SEM) , espectroscopia de rayos X de energía
dispersiva (EDX), difracción de rayos X (XRD) y análisis de espectroscopía
infrarroja de transformada de Fourier (FT-IR). Además, las nanopartículas
de plata así producidas se prueban para determinar su actividad
bactericida.
materiales y métodos
Productos químicos
Todos los productos químicos utilizados para la síntesis [nitrato de plata
(AgNO 3 ), bromuro de potasio (KBr)], eran de grado analítico de Merck
Limited, Mumbai, India. Agar Nutriente, Caldo Nutriente, Agar Agar, Agar
Muller Hinton (MHA) adquirido de Himedia Laboratories, Mumbai,
India. Las soluciones acuosas se prepararon con agua destilada triple.
Preparación de extracto de tallo
El tallo sano y fresco de Garcinia mangostana ( Fig. 1 ) fue recolectado en
Courtallam, Tamil Nadu, India. Los tallos finos se recogieron y se lavaron
cuidadosamente con agua desionizada varias veces para eliminar las
partículas de polvo y luego se secaron al aire para eliminar la humedad
residual y se cortaron en trozos pequeños y se almacenaron en un
recipiente hermético. 30 g de tallo en un matraz de fondo redondo con
100 ml de agua desionizada y se calentó a reflujo durante media hora, se
enfrió a temperatura ambiente y se filtró con papel de filtro Whatman n. ° 1.

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Figura 1 . Planta y tallo frescos y saludables de Garcina mangostana .
Análisis cualitativo de fitoquímicos secundarios
Los extractos de tallo de la parte de la planta se evaluaron para el cribado
preliminar de fitoquímicos secundarios como alcaloides, quinonas,
cumarina, flavonoides, esteroides, alcaloides, fenol y azúcar / glucósidos
siguiendo los métodos informados con modificaciones menores.
Identificación de mangostin en el extracto crudo
El extracto de mangostina obtenido por el método de extracción en frío se
disolvió en metanol. Fue descubierto en la placa de cromatografía de capa
delgada (TLC) utilizando tubos capilares. La mangostina estándar también
se observó equivalente al extracto crudo en la placa de TLC. Luego, la TLC
pateada se mantuvo en el tanque en desarrollo que contenía la fase móvil
para desarrollarse. Luego, después del movimiento de la fase móvil cerca
del extremo de la placa (fase estacionaria), se eliminó y se secó. A
continuación, el reactivo de visualización, reactivo modificado de ácido
sulfúrico de vainillina se extendió sobre la placa, que luego se dejó secar al
aire y luego se mantuvo sobre la placa caliente para el desarrollo de las
manchas. Se usó tolueno y metanol como el sistema solvente en la
proporción de 8: 2
Retencionfactor(RF)=distanciaviajadoporsustancia disolutadistanciaviajadoporsolvente

Preparación de nanopartículas de plata


Las nanopartículas se sintetizaron por concentración conocida de G.
mangostana caldo se interactuó con 1 mM de nitrato de plata. Para la
reducción de iones de plata, 15 ml de extracto de tallo componen hasta
100 ml de volumen en un matraz Erlenmeyer de 250 ml. El matraz se
incubó en un agitador rotatorio a una velocidad de 150 rpm durante un
tiempo deseado a temperatura ambiente para el desarrollo de

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nanopartículas de plata. La solución reducida se centrifugó usando REMI a


5000 rpm durante 30 minutos para obtener un sobrenadante
transparente. El sobrenadante se descartó y la partícula obtenida se
centrifugó con agua repetidamente para obtener nanopartículas puras.
Caracterización de nanopartículas de Ag
La solución de nanopartículas así obtenida se purificó mediante
centrifugación repetida a 20,000 rpm durante 30 minutos seguido de
redispersión del sedimento en agua destilada. Los espectros UV-vis se
registraron como una función del tiempo de reacción en un
espectrofotómetro Perkin Elmer UV-Vis operado a una resolución de 1 El
análisis espectral UV-visible nm se llevó a cabo usando el
espectrofotómetro Perkin Elmer Lambda 25. Las nanopartículas de plata
bioreducidas se caracterizaron por revelar su estructura mediante la
técnica de difracción de rayos X. El patrón XRD se registró utilizando el
instrumento PANALÍTICO X'PERT polvo X 'Celerator modelo
difractómetro. El resultado obtenido fue comparado y confirmado con el
software incorporado correspondiente a la reflexión de Bragg. La
morfología de la superficie y el tamaño de las nanopartículas se estudiaron
mediante un microscopio electrónico de barrido FEI QUANTA FEG 200.
Los constituyentes de la muestra se obtuvieron a partir de la
espectroscopía de rayos X Energy Dispersive.

Estudios bactericidas jhoana


Las cepas bacterianas utilizadas fueron Escherichia coli y Bacillus subtilis.Las
cepas se obtuvieron del Departamento de Microbiología, Sri Paramakalyani
College, Alwarkurichi, Tamil Nadu. Los cultivos madre se mantuvieron a
4 ° C en pendientes de agar nutriente. Los cultivos para experimentos se
prepararon transfiriendo un bucle lleno de células de los cultivos madre a
tubos de ensayo de Mueller Hinton Broth (MHB) para bacterias. Los
cultivos se incubaron durante 24 ha temperatura ambiente. Método de
difusión de pozos de agar ( Nwokem, Asgbaji, Kagbu y Ekanem, 2010))
para la susceptibilidad bactericida se llevó a cabo de acuerdo con el
método estándar para evaluar la presencia de actividad antibacteriana de
la nanopartícula de plata sintetizada. La concentración de la nanopartícula
utilizada en el experimento fue de 20, 40, 60 y 80 μL. Un pozo de
aproximadamente 6 mm de diámetro se hizo asépticamente usando un
instrumento de punción de gel. Las placas se limpiaron con cepas
gramnegativas y positivas, como E. coli , Klebsiella planticola y B.

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subtilis.Luego, las placas se incubaron a 37 ° C durante 24 h. La actividad


antibacteriana se evaluó midiendo el diámetro de la zona de inhibición
alrededor del pozo.
Resultados y discusión
Se realizaron análisis cualitativos de fitoquímicos para el extracto de tallo
de G. mangostana . Las nanopartículas de Ag biosintetizados a partir del
extracto se caracterizaron mediante el uso de técnicas espectroscópicas y
microscópicas tales como UV-vis, XRD y SEM-EDX, Los AGNPS usando
vástago extracto asistida de G. mangostana muestra una buena actividad
antimicrobiana contra patógenos clínicamente importantes.
Identificación de compuestos
El extracto bruto de las diferentes extracciones producidas se sometió a
TLC. Para analizar la presencia de mangostina, se confirmó por
comparación con la mangostina estándar en placas 60F254 de gel de sílice
prerrevestidas mostradas en la Fig. 2 . El tolueno y el metanol en la
proporción de 8: 2 sirven como fase móvil. La placa desarrollada se
visualizó mediante visualización de reactivo reactivo de ácido sulfúrico de
vanillina. Se encontró que el crudo de los diferentes procedimientos de
extracción tenía mangostin, que se conformó con referencia al
estándar. El valor de R fde mangostin se calcula usando la fórmula y se
predice como 0,5.

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Figura 2 . Mangostin, el compuesto principal aislado del tallo de Garcina
mangostana(compuesto a - estándar y b - aislado).

Los metabolitos secundarios presentes en el extracto se predijeron en


la Tabla 1 .
Tabla 1 . Análisis cualitativo de fitoquímicos secundarios.

S. No Prueba Presencia ausencia


1 Quinones Presencia
2 Cumarina Ausencia
3 Flavonoides Presencia
4 Esteroides Presencia
5 Alcaloides Ausencia
6 Fenoles Presencia

Observación visual y espectroscopía UV-visible


Se han contratado numerosos enfoques para obtener una mejor síntesis de
nanopartículas de plata tales como métodos químicos y
biológicos. Últimamente, la síntesis de nanopartículas de plata utilizando
extractos de plantas se hizo más popular ( Li et al., 2007; Song y Kim,

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2009 ). Chandran, Chaudhary, Pasricha, Ahmad y Sastry


(2006) sintetizaron nanopartículas de plata utilizando el extracto de Aloe
vera a las 24 h de incubación. De manera similar, en el presente estudio
las nanopartículas de plata se sintetizaron utilizando el extracto de tallo
de G. mangostana . Curiosamente, las nanopartículas de plata se
sintetizaron rápidamente dentro de los 30 min del período de
incubación. La solución acuosa de nitrato de plata se convirtió al color
marrón en 30 min, con la adición de extracto de tallo que se muestra en
(Fig. 3 ). La intensidad del color marrón aumentó en proporción directa al
período de incubación. La reacción se completó dentro de las 24 h. La
mejora de las nanopartículas de plata se controló constantemente por
inspección visual midiendo con análisis espectral UV-visible. Puede ser
debido a la excitación de resonancia de plasmón superficial efecto (SPR) y
la reducción de AgNO 3 ( Mulvaney, 1996 ). La solución de control
AgNO 3 (sin extracto de tallo) no mostró cambio de color. El pico de
absorción característico a 420 nm en el espectro UV-vis confirmó la
formación de nanopartículas de plata y el ensanchamiento del pico indicó
que las partículas se polidispersaban ( figura 4 ).

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Figura 3 . Identificación visual del desarrollo de nanopartículas de plata de
color amarillo pálido a marrón.

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Figura 4 . Espectros de absorción UV-visible de nanopartículas de plata
sintetizadas que muestran la superficie del pico de resonancia de Plasmon
a 430 nm.

Análisis de XRD
La naturaleza cristalina de las nanopartículas de plata se confirmó
mediante el análisis del patrón de XRD como se muestra en ( Fig. 5 ). Los
picos de difracción distintivos en los valores de 2 theta de 38.15, 44.30,
64.53 y 76.96 grados se pueden indexar a los planos de reflexión (1 1 1),
(2 0 0), (2 2 0) y (3 1 1) de la cara centrada estructura cúbica de
plata. Además de los picos de Bragg representativos de nanocristales de
plata, también se observaron picos adicionales. Estos picos se deben a los
compuestos orgánicos que están presentes en el extracto y responsables
de la reducción de los iones de plata y la estabilización de las
nanopartículas resultantes.

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Figura 5 . Difracción de rayos X de nanopartículas de plata mediadas por
vástago.

Análisis morfológico con rayos X de energía dispersiva


El análisis SEM se usa para visualizar el tamaño y la forma de las
nanopartículas. Micrografías SEM de nanopartículas de plata se dan en
( Fig. 6 ) con diferentes aumentos. La absorción de Ag NPs muestra el pico
ancho que representa que las partículas estaban en naturaleza
monodispersa. En esto, los metabolitos secundarios presentes en la planta
también desempeñan un papel vital en los cambios morfológicos. Entre los
metabolitos secundarios, la capsaicina, este fue el principal compuesto
presente en el extracto de hojas de G. mangostana involucrado en la parte
de síntesis. Las partículas se agregan entre sí y la imagen se tomó
después de 24-48 h, este resultado similar fue discutido por Veerasamy et
al. (2011). Sin embargo, las partículas agregadas pueden deberse a
enlaces cruzados. El tamaño de partícula obtenido a partir de imágenes
SEM está bien correlacionado con el tamaño de partícula determinado a
partir de XRD usando según la fórmula Scherrer y el promedio de las
nanopartículas sintetizadas estaba en el intervalo de 15-20 nm.

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Figura 6 . La micrografía SEM de nanopartículas de plata con barra de
escala corresponde a 400 y 500 nm.
La técnica de rayos X de energía dispersiva se indizó para verificar la
presencia del elemento involucrado en el desarrollo de nanopartículas que
se muestra en la Fig. 7 . También mostró algunos pequeños picos junto
con el elemento específico como C y O. El pico observado alrededor de
3 keV se predijo claramente en la figura y la energía de unión de AgL que
prueba la confirmación de plata pura debido a la resonancia de plasmón
superficial ( Kalimuthu, Babu, Venketraman, Bilal y Gurunathan, 2008 ).

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Figura 7 . Perfil EDX de las nanopartículas de plata sintetizadas.

Estudios bactericidas
La síntesis biológica del método tradicional del metal sa y el uso de
extractos vegetales tiene una nueva conciencia para el control de la
enfermedad, además de ser segura y no tener efectos fito-tóxicos
( Gardea-Torresdey et al., 2003 ). Se encontró que las nanopartículas de
plata que usan plantas medicinales son altamente tóxicas contra diferentes
bacterias patógenas de especies seleccionadas. Se realizó un ensayo de
difusión de pozos para evaluar la eficacia antibacteriana de los AgNP
contra E. coli, K. planticola y B. subtilis . Los resultados para el ensayo de
difusión de pozos se muestran en la ( Figura 8 ) que representa la zona de
inhibiciones alrededor del pocillo, inoculada con diferentes suspensiones
de Ag NP. Cuando se compara con B. subtilis y K. planticola E. colifue más
eficaz porque las bacterias gram negativas presentan una pared celular
más débil debido a un menor contenido de peptidoglucanos en
comparación con las bacterias gram positivas ( Chaloupka, Malam y
Seifalian, 2010 ).

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Figura 8 . Actividad bactericida de nanopartículas de plata contra
patógenos clínicos. (a) K. planticola , (b) E. coli y (c) B. subtilis .
La plata metálica, las nanopartículas de plata y las sales de plata poco
solubles liberaron los iones de plata cuando entraron en contacto con el
agua. Estos iones fueron agentes bioquímicamente activos ( Brett,
2006 ). Debe destacarse que esos iones de plata reaccionarán con sales
poco solubles, que precipitan o permanecen en dispersión coloidal y
también experimentarán complejación con proteínas y otras biomoléculas
si se liberaran en los medios. Las interacciones de los iones libres de plata
del nitrato de plata con las enzimas vitales de las bacterias proporcionan
actividad antibacteriana debido a los compuestos fitoquímicos,
particularmente al mangostán, el compuesto principal que desempeña un
papel vital. Además, la actividad se produce debido a la destrucción de la

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pared celular y al daño del ADN ( Jones y Hoek, 2010).) Al parecer, la


formación de especies reactivas de oxígeno en presencia de plata depende
del tipo de célula implicada ( Greulich et al., 2011; Luther, Koehler,
Diendorf, Epple y Dringen, 2011 ). Por lo tanto, había diferentes
posibilidades para que la plata distrajera el sistema biológico.
Conclusión
El tallo de G. mangostana se utilizó con éxito para el procedimiento rápido y
simple para la síntesis de nanopartículas de plata. Esta nanopartícula fito-
asistida era uniforme, cristalina, esférica y monodispersa con un tamaño
medio de partícula de 30 nm. El fitoquímico, el mangostán en este extracto
puede ser responsable de la reducción de los iones de plata y la
estabilización de las nanopartículas. Se puede aplicar una excelente
actividad bactericida a una amplia gama de materiales para diversas
nanoestructuras ramificadas, que pueden servir como componentes
potenciales en la nanomedicina, especialmente cuando desempeña un
papel vital en las propiedades de curación de heridas. Estos tienen varias
ventajas tales como costo efectivo, compatibilidad para medicamentos y
administración de medicamentos en una escala de producción comercial

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