Artículo Original

Legionelosis Nosocomial, un Problema de Contaminación

Ambiental Biológica Emergente, pero Controlable
Nosocomial legionellosis, a problem of emerging biological pollution, but controllable

Ana María Salazar Bugueño1, María Teresa Ulloa Flores2, Leonor Jofré Morales3, Roberto Olivares Castillo4, Gloria Ruiz Rosello5,
Irene Jemenao Pacheco6, Gerardo Ehrenhaus Vásquez7
1. Ing. Tecnólogo Médico con Mención en Radiología y Física Médica. UCH Ingeniero en Prevención de Riesgos y Medio Ambiente, UTM Candidato a
Doctorado en Gestión Ambiental y Ordenamiento Territorial. U. de Barcelona. Magíster en Salud Pública. Universidad de Chile. Licenciado en Salud
Ocupacional. Universidad de Chile.
2. T.M. M.CS. Programa de Microbiología y Micología, ICBM, Facultad de Medicina. Universidad de Chile.
3. Pediatra infectóloga, Rama de Infectología Sociedad Chilena de Pediatría Laboratorio de Microbiología ISP de Chile. H. Clínico Universidad de Chile.
4. Hospital Clínico Universidad de Chile.
5. E.U. Enfermera, Universidad de Chile, Diplomado en Infecciones Intrahospitalarias Universidad Mayor. H. Clínico Universidad de Chile.
6. E.U. Hospital Clínico Universidad de Chile.
7. Hospital Clínico Universidad de Chile

RESUMEN
La legionelosis está ampliamente reconocida en países desarrollados.
En Chile, actualmente existen las condiciones socio-económicas,
culturales y ambientales que favorecen su desarrollo. Sin embargo,
no existe un estudio sistemático que permita evidenciar la presencia
ambiental y clínica de Legionella, fundamentalmente por la deficien-
cia de elementos de diagnóstico microbiológico.
El objetivo de este estudio fue implementar un laboratorio de diag-
nóstico de Legionella, detectar y cuantificar la presencia de Legionella
ambiental. Las técnicas implementadas fueron: Cultivo de Legionella
de fuentes de agua ambiental (Norma ISO 11731/1998). Técnica que
se utilizó para la investigación de Legionella en fuentes de agua
hospitalaria. Se implementó, además, cultivo y antígeno urinario de
Legionella para diagnóstico de pacientes con neumonía y Reacción
de Polimerasa en Cadena (PCR) múltiple para la identificación de
género y especie de Legionella pneumophila. Se logró además imple-
mentar un sistema de tipificación molecular basado en el gen mip
que permitió comparar cepas aisladas de diversos ambientes.
Se evidenció por primera vez en Chile aislamientos de Legionella
pneumophila ambiental.
(Salazar A, Ulloa M, Jofré L, Olivares R, Ruiz G, Jemenao I, Ehrenhaus G,
2012. Legionelosis Nosocomial, un Problema de Contaminación
Ambiental Biológica Emergente, pero Controlable. Cienc Trab. Oct-Dic;
14 [45]: 216-227).
ABSTRACT
Legionellosis is widely recognized in developed countries. In Chile,
there are currently the socio-economic, cultural and environmental
factors that favor its development. However, there is no systematic
study to assess the environmental and clinical presence of Legionella
mainly by deficiency of microbiological diagnostic elements.
The objective of this study was to implement a diagnostic laboratory
of Legionella, detect and quantify the presence of environmental
Legionella. The techniques were implemented: Cultivation of Legionella
from environmental water sources (ISO 11731/1998). Technique used
for investigation of Legionella in hospital water sources. We imple-
mented further cultivation of Legionella urinary antigen for diagnosis
of patients with pneumonia and Polymerase Chain Reaction (PCR) for
the identification of multiple genus and species of Legionella pneumo-
phila. It also managed to implement a molecular typing system based
on the gene that allowed mip compare strains isolated from various
environments.
It was evidenced for the first time in Chile environmental isolates of
Legionella pneumophila.
Key words: Legionella pneumophila, Legionella pneumo-
nia, nosocomial.

Palabras claves: Legionella pneumophila, legionelosis,

neumonía, nosocomial.

INTRODUCCIÓN
En 1976 se produce el brote que dio a conocer al mundo científico
la Legionella pneumophila.1 Previamente, en 1968 se había produ-
Correspondencia / Correspondence cido un brote de infección respiratoria, sin neumonía ni falleci-
Ana María Salazar B. mientos, en un edificio del Oakland County Health Department de
Av. Independencia 1027 Pontiac (Michigan) que afectó al 95% de las personas que trabajan
Santiago, Chile
en él.2 El impacto mediático y el tiempo que el Center for Diseases
Tel.: 56 2 29786300
Control (CDC) dedicaron a su estudio fueron mucho menores. En
e-mail: anasalazar@med.uchile.cl
Recibido: 25 de Octubre 2012 / Aceptado: 02 Diciembre 2012
1976 la enfermedad incide en excombatientes legionarios alojados

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en el hotel Bellevue-Stratford de Filadelfia; afectó aproximada-
mente a 221 individuos y fallecieron 34 de ellos.3
Desde el brote de Filadelfia hasta la década del 90, la enfermedad
del legionario ha sido causa, relativamente frecuente, de brotes de
neumonía en la comunidad4-8, en hoteles, y en hospitales.9
Legionella: hábitat
La Legionella es una bacteria ambiental; su hábitat natural o
reservorio primario son las aguas superficiales, como lagos y ríos.
Se encuentra plantónicamente en bajas concentraciones, al inte-
rior de protozoos o formando parte de biofilm.10,11 No se ha
aislado desde fuentes de agua salada. La dificultad para obtener el
crecimiento de Legionella en medios de cultivo, contrasta con su
ubicuidad en el medio acuático natural. La Legionella obtiene
nutrientes en su hábitat natural aportados por otros microorga-
nismos, como amebas, protozoos ciliados y otros. En el caso de
los sistemas artificiales como cañerías, acumuladores e interiores
de las torres de refrigeración, se encuentra formando parte de las
biopelículas que recubren las superficies. Las amebas y otros
protozoos se consideran hospedadores naturales y amplificadores
de Legionella spp.12,13
Las especies del género Legionella crecen bien a temperatura entre
20 y 50ºC y su temperatura óptima de desarrollo fluctúa entre 35
y 38ºC. Estas temperaturas son frecuentes en las instalaciones y
dispositivos, que en los últimos años han tenido una amplia
expansión en la sociedad. Por debajo de 20ºC permanece latente, y
muere por encima de los 60ºC. Entre los factores que favorecen su
desarrollo y multiplicación, además de la temperatura del agua, se
encuentra: la presencia de materia orgánica e inorgánica, presencia
de otros microorganismos, presencia de biofilm (el cual le permite
protegerse de los agentes biocidas), y el estancamiento del agua,
que le proporciona el tiempo necesario para replicarse.14
La Legionella es resistente a la cloración normal de los sistemas de
agua; así, desde su nicho natural en las aguas superficiales y a
través de la red de distribución pública puede pasar a colonizar los
sistemas de suministro de agua de la población, e incorporarse a
los circuitos de agua sanitaria fría y caliente y depósitos de edifi-
cios y viviendas, que pueden convertirse en reservorios secunda-
rios en los cuales sobrevive y se amplifica.15
Transmisión de Legionella al hombre
La transmisión de Legionella al hombre está asociada a diversos
sistemas que utilizan agua y que son capaces de producir aerosoles
(Tabla 1).16 Entre los sistemas más reconocidos están las torres de
refrigeración y condensadores de evaporación. Esta vía de disemi-
nación tiene especial importancia en los brotes de Legionelosis
comunitaria y en los casos esporádicos. En las torres de refrigera-
ción se puede producir una gran amplificación de Legionella y una
notable producción de aerosoles contaminados, si el manteni-
miento y la limpieza son insuficientes, en especial en aquellas que
funcionan de manera discontinua o irregular y mantienen agua
estancada durante largos períodos de tiempo. La diseminación
puede ser muy elevada al poner en marcha una torre que ha estado
inactiva durante semanas y no se ha limpiado antes de entrar en
servicio.
En general, los aerosoles de las torres de refrigeración pueden
transmitir la infección dentro de un área geográfica limitada de
unos 200 m., pero en determinadas circunstancias, como vientos y
corrientes de aire favorables, los aerosoles transportadores de
Legionella pueden alcanzar de 1,6 a 3,2 kms. Además, los sistemas
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y conductos de aire acondicionado pueden aspirar y distribuir
aerosoles procedentes de torres de refrigeración o de condensa-
dores de evaporación, situados en zonas próximas.17 Las bañeras
de hidromasaje y las saunas pueden ser un buen amplificador del
microorganismo y también un eficaz diseminador al producir
aerosoles. Los aerosoles procedentes de fuentes ornamentales
también pueden transmitir la infección. Los humidificadores
también pueden arrastrar partículas microbianas si el agua usada
para llenar el depósito está colonizada por Legionella. Los nebuli-
zadores producen aerosoles con partículas de tamaño uniforme, y
pueden diseminar Legionella si el agua usada está colonizada.
También han sido implicados otros equipos de terapia respiratoria,
como las bolsas de uso manual para la resucitación y los respira-
dores de presión positiva intermitente. Ninguno de los dos cuenta
con depósito de agua; sin embargo, el agua usada para limpiar los
tubos y componentes puede haber producido la colonización de
algún elemento.
Tabla 1.
Equipos de riesgo para Legionella..
a) Instalaciones con mayor probabilidad de proliferación y dispersión de Legionella:
i) Torres de refrigeración y condensadores evaporativos.
ii) Sistemas de agua caliente sanitaria con acumulador y circuito de retorno.
iii) Sistemas de agua climatizada con agitación constante y recirculación a través de
chorros de alta velocidad o la inyección de aire (spas, jacuzzis, piscinas, vasos o ba-
ñeras terapéuticas, bañeras de hidromasaje, tratamientos con chorros a presión,
otras).
iv) Centrales humidificadoras industriales.
b) Instalaciones con menor probabilidad de proliferación y dispersión de Legionella:
i) Sistemas de instalación interior de agua fría de consumo humano (tuberías, depó-
sitos, aljibes), cisternas o depósitos móviles y agua caliente sanitaria sin circuito de
retorno.
ii) Equipos de enfriamiento evaporativo que pulvericen agua.
iii) Humectadores.
iv) Fuentes ornamentales.
v) Sistemas de riego por aspersión en el medio urbano.
vi) Sistemas de agua contra incendios.
vii) Elementos de refrigeración por aerosolización, al aire libre.
viii) Otros aparatos que acumulen agua y puedan producir aerosoles.
c) Instalaciones de riesgo en terapia respiratoria:
i) Equipos de terapia respiratoria.
ii) Respiradores.
iii) Nebulizadores.
iv) Otros equipos médicos en contacto con las vías respiratorias.
Legionelosis
Se reconocen dos formas clínico-epidemiológicas de la infec-
ción por Legionella: la fiebre de Pontiac (forma no neumónica), la
cual es clínicamente similar a la influenza (flu-like), no está
asociada a neumonía, es auto-limitada, generalmente los pacientes
se restablecen espontáneamente entre 3-5 días sin tratamiento. La
literatura señala que podría ser una reacción al antígeno inhalado
y no a la acción de las bacterias propiamente tal.
La otra forma es la neumonía por Legionella pneumophila; se
caracteriza por un período de incubación de 2 a 10 días, y algunos
síntomas más frecuentes que presentan los pacientes son: vómitos,
diarrea, dolor abdominal, compromiso de conciencia, cefalea,
fiebre alta, tos no productiva, escalofríos, hemoptisis en 1/3 de los
pacientes, falla renal, frecuente hiponatremia e hipofosfatemia,
mialgia, anorexia. La radiografía de tórax frecuentemente incluye
217
Artículo Original | Salazar Ana María, et al.
la imagen típica de neumonía con un rápido progreso a infiltrado
inflamatorio, con compromiso básicamente en los lóbulos basales
y derrame pleural, en un 25% de los pacientes se observan absce-
sos.18
Epidemiológicamente, los casos de Legionelosis se caracterizan
porque: se presenta con mayor frecuencia en hombres que en
mujeres. Se presentan con mayor prevalencia en los meses cálidos.
Las personas más susceptibles son: personas mayores de 50 años.
Fumadores (tabaquismo), con deficiencia inmunológica. Enfermos
de diabetes, cáncer y enfermedades pulmonares.
Desde el punto de vista epidemiológico, la Legionella se presenta
como casos aislados o brotes, a su vez estos pueden ser de la
comunidad, nosocomiales o legionelosis del viajero. Los brotes de
legionelosis son muy publicitados por la prensa. Son más
frecuentes en el verano y a inicios de otoño, pero los casos
aislados pueden ocurrir durante todo el año. La letalidad fluctúa
de 5 a 30%. Se debe sospechar de legionelosis en los casos de
neumonía vinculados a datos epidemiológicos como: un viaje
reciente, hospitalización, asistencia a reuniones e inmunosupre-
sión, entre otros. La bacteria muere rápidamente.
Legionelosis nosocomial: es un caso que pasa los 10 días ante-
riores a la fecha de inicio de síntomas en un hospital. Los hospi-
tales en general disponen de redes de agua sanitaria complejas y
además torres de refrigeración. A pesar que ambos sistemas se han
asociado con Legionelosis, en los últimos años la mayoría de los
casos esporádicos o epidémicos se han relacionado con el agua
sanitaria, ya que la mayoría de ellas está colonizada con la
bacteria, entre un 12 a 85% .19-21
Por otra parte, en el hospital se concentra población susceptible a
este con diferentes grados de inmunosupresión, como transplan-
tados, SIDA, tratamiento prolongado con corticoides, mayores de
65 años, enfermedades crónicas de base, especialmente pulmonar,
diabetes, insuficiencia cardiaca; y, a nivel pediátrico, recién
nacidos conectados a ventilación mecánica e inmunosuprimidos.22,23
Esto que aumenta la posibilidad de presentación de formas graves
y mortalidad elevada y, en general, mayor costo asociado en el
manejo. Los pacientes hospitalizados son además más susceptibles
a infecciones debidas a serogrupos distintos de Legionella pneu-
mophila serogrupo 1 y otras especies como L. micdadei, L. boze-
manii y L. dumoffii.23
Figura1.
Equipo de filtración en línea (Millipore modelo Microfyl), con membrana de poro de 0,45 um (Millipore).
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Control de Legionella
Dado que Legionella es ubicua en las fuentes de agua, el control se
ha centrado en medidas que tienden a reducir la carga bacteriana
a través de medidas y normativa para el manejo de estos sistemas.
En Europa (especialmente en España), EE.UU. y Australia existen
numerosas normativas.24-31 Estas, en general, se relacionan con el
diseño de instalaciones adecuadas y el mantenimiento correcto de
las mismas. Uno de los puntos críticos es el uso de desinfectantes,
ya sea puntual o continuo para mantener bajos niveles de la
bacteria.
Si bien es cierto que la Legionelosis está ampliamente reconocida
en países desarrollados, en Chile, actualmente, existen las condi-
ciones socio-económicas, culturales y ambientales que favorecen
su desarrollo. Sin embargo, no existe un estudio sistemático que
permita evidenciar la presencia ambiental y clínica de Legionella,
fundamentalmente por la deficiencia de elementos de diagnóstico
microbiológico; por lo tanto, este estudio constituye el primer paso
para llevarnos en el futuro, a adoptar medidas de prevención
primaria que, si bien es cierto no erradican totalmente los casos,
ayudarán a evitar brotes de magnitud.
OBJETIVOS
Objetivo general
• Implementar técnicas de laboratorio tradicionales y moleculares
para el estudio de Legionella ambiental.
Objetivos específicos
• Implementar técnicas de laboratorio de microbiología para el
estudio de Legionella ambiental.
• Implementar técnicas de laboratorio de microbiología para el
estudio de Legionella clínica
• Implementar una técnica de Reacción en Cadena de la
Polimerasa (PCR) múltiple: para la identificación de género y
especie de Legionella pneumophila.
• Detectar y cuantificar Legionella intrahospitalaria.
• Tipificar Molecularmente Cepas Clínicas y Ambientales de
Legionella pneumophila.
Ciencia & Trabajo
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METODOLOGÍA
Implementación de técnicas de laboratorio de microbio-
logía para el estudio de Legionella ambiental
El cultivo de Legionella de fuentes de agua ambiental se realizó
según la Norma ISO 11731/1998.32 Para la implementación de esta
técnica se recurrió a tomar muestras de aguas de torres de refrige-
ración.
El procedimiento de muestreo y ensayo de Legionella pneumo-
phila, consistió en:
Toma de la muestra: Las muestras se recogieron en frascos estériles
con cierre hermético y embalajes adecuados para evitar roturas
durante el transporte, protegidas de la luz y a temperatura
ambiente. Cada muestra se acompañó de una hoja de registro de
su toma.
Torre de refrigeración: se procedió a:
• Recoger agua de la parte baja de la torre, y restos de lodo o
materia orgánica.
• Rascar posibles incrustaciones de la pared.
• Tomar un 1 litro de muestra.
Concentración de las muestras de agua
Las muestras fueron concentradas mediante filtración. Se utilizó
un equipo de filtración en línea (Millipore modelo Microfyl), con
membrana de poro de 0,45 um (Millipore). (Figura 1).
Cultivo de la muestra
De la muestra tratada con ácido, tratada con calor y sin tratar se
sembraron 100 ul en agar GVPC (Polimixina B Vancomicina,
Glicina y Anisomicina. Oxoid, UK), diseminando con rastrillo para
recuento de colonias. Se incubó en aerobiosis a 35°C.
En este medio, Legionella puede crecer a partir de las 48 hrs. de
incubación. Se emite un informe de cultivo negativo después de
revisión periódica, hasta 10 días de incubación a 37°C.
Detección de Legionella
A las 48 horas de incubación, se revisaron las placas de GVPC,
bajo lupa estereoscópica, en busca de colonias sospechosas con
características de Legionella.
Características de la colonia. Color: azulado o verdoso. Tamaño:
pequeña a mediana. Forma: convexa. Textura: esmerilada (aspecto
de “vidrio molido”). Adherencia de la colonia. Iridiscencia.
Autofluorescencia.
Características microscópicas. (Figura 2) Tinción de Gram. Bacilos
Gram (-) finos y polimorfos.
Figura 2.
Tinción de Gram de una cepa de Legionella pneumophila. 100x. Lab. MTU.
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Identificación presuntiva:
Toda colonia sospechosa fue traspasada a agar BCYE sin antibióticos
y en Agar sangre, para evaluar su dependencia a la cisteína. Si la
colonia crece sólo en BCYE y no crece en agar sangre, se consideró
posible Legionella y se procedió a la identificación.
Identificación confirmatoria:
La cepa sospechosa, con dependencia de L-cisteína, fue identificada
de forma definitiva mediante serología.
Serología mediante técnica de Aglutinación con partículas de látex
(kit Legionella Oxoid):
En una tarjeta de reacción de Látex (6 círculos), se coloca una gota
de buffer de reacción en 5 de los 6 círculos. En cada uno de los
círculos se agrega un reactivo correspondiente a: reactivo para
Legionella pneumophila sg. 1, Legionella pneumophila sg. 2-14,
Legionella spp, control positivo y control negativo. La colonia sospe-
chosa se emulsiona en cada círculo con los reactivos correspon-
dientes. Se mezcla por agitación durante dos minutos y se observa la
presencia de aglutinación.
Recuento de Legionella
Cálculo de la concentración de Legionella spp: Se obtuvo el recuento
de Legionella spp en UFC/ml, a partir del cultivo primario en GVPC
aplicando la siguiente fórmula:
Nº de colonias en la placa x volumen del concentrado (ml) Volumen
inoculado en la siembra (ml) x Volumen filtrado (ml).
Para obtener el recuento en UFC/l (Norma ISO 11731/1998), se debe
multiplicar el recuento en UFC/ml por 1000.
Determinación sensibilidad analítica del proceso de filtración: Se deter-
minó la sensibilidad analítica del proceso de filtración, la cual corres-
ponde como la mínima cantidad de Legionella que puede ser detectada,
desde el concentrado de agua obtenido posteriormente una vez reali-
zado el proceso de filtración y cultivo explicitado anteriormente.
Implementar técnicas de laboratorio de microbiología para
el estudio de Legionella clínica.
Cultivo de Legionella desde muestras clínicas de pacientes con
neumonía.
Las muestras para el cultivo de Legionella correspondieron a mues-
tras de expectoración contaminadas con Legionella pneumophila
ATCC 33152. Las muestras se disgregaron mediante agitación con
vortex, y luego una porción fue sometida a tratamiento ácido, otra
porción a tratamiento con calor y una tercera porción permaneció sin
tratamiento.
• Tratamiento ácido: En un vial de vidrio estéril tapa rosca se coloca
100 μl de muestra, se le agrega 900 μl de buffer ácido y se incuba
a T° ambiente 5 minutos.
• Tratamiento por calor: Se depositaron 200 ul de la muestra, en un
tubo Eppendorff de 0.5 m Legionella. Se sometió a 50 °C por 30
minutos en un Termociclador (Thermo. Minicycler, modelo
PTC-150).
• Sin tratamiento: una tercera porción de la muestra se mantiene sin
tratar.
Siembra
• Se sembró 200 μl de la muestra tratada con ácido en agar BCYE
(reactivos Oxoid,UK) y agar GVPC (reactivos Oxoid, UK).
• Se sembró 200 μl de la muestra tratada con calor en agar BCYE
(reactivos Oxoid, UK) y agar GVPC (reactivos Oxoid, UK).
219
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• Se sembró 200 ul directamente de la muestra sin tratar en agar
BCYE (reactivos Oxoid, UK) y agar GVPC (reactivos Oxoid, UK).
La siembra se realizó depositando la muestra en cada placa de agar
BCYE y GVPC, se espera que seque y se disemina para obtener
colonias aisladas, se incuba a 35-37 °C en estufa de cultivo en
atmósfera húmeda (solución no saturada de Sulfato de cobre
pentahidratado más agua destilada).
Las placas se incuban en atmósfera húmeda a 36 °C durante 10
días y son examinadas al partir de los dos días y luego diaria-
mente, bajo la lupa para buscar colonias sospechosas.
Control de calidad
• La implementación de las técnicas de aislamiento, identificación
de Legionella, se realizaron con la cepa Legionella pneumophila
serogrupo 1 ATCC 33152.
• Para el cultivo de Legionella se implementaron los siguientes
medios de cultivo Agar BCYE con y sin cisteína, agar GVPC,
agar sangre. Las placas se prepararon en nuestro laboratorio
semanalmente y se realizó control de calidad (prueba de esteri-
lidad y desempeño con la cepa de referencia Legionella pneumo-
phila serogrupo 1 ATCC 33152).
Detección de antígeno urinario
Para la implementación del antígeno urinario para Legionella se
prepararon orinas contaminadas con la cepa de referencia
Legionella pneumophila serogrupo 1 ATCC 33152. En todos los
casos se procesó la orina hirviéndola durante 5 minutos y centri-
fugándola a 3.000 rpm durante 15 minutos. La determinación se
realizó según las instrucciones del fabricante.
Implementación de una Reacción en Cadena de la
Polimerasa (PCR) múltiple: para la identificación de
género y especie de Legionella pneumophila
La implementación de esta técnica se realizó con la cepa Legionella
pneumophila serogrupo 1 ATCC 33152 adquirida en EE.UU. y una
colección de otras Legionella spp cepas cedidas gentilmente por el
Dr. Osuna y el Dr. Mendoza Granada España y cepas de Legionella
aisladas en nuestro laboratorio de agua de torres de refrigeración.
Preparación del ADN blanco
A partir de colonias de Legionella pneumophila serogrupo 1 ATCC
33152 cultivadas ON y otras especies de Legionella spp, se preparó
una suspensión de 200 ul de la cepa en agua bidestilada estéril, a
una concentración de 1x 108 ufc/ml (Mc. Farland 0,5. Densimat
bioMerieux), posteriormente:
• Se calentó a 100 °C por 10 minutos en termociclador.
• Se centrifugó a 130000 rpm y se utilizó el sobrenadarte como
ADN blanco.
Identificación de género Legionella
• Se amplificó un segmento de 386-bp del gen 16S rRNA (base 451
a 837) de Legionella pneumophila ATCC 33152, los cebadores
usados fueron los descritos por Jonas y cols. (33).
• Forward JFP (5'-AGG GTT GAT AGG TTA AGA GC) localizado
en la posición 451 a 470 y Reverse JRP (5'-CCA ACA GCT AGT
TGA CAT CG) complementario a la posición 836 a 817.
Identificación de especie Legionella pneumophila
Se amplificó un segmento de ADN que codifica para una región de
185 bp del gen mip de Legionella pneumophila ATCC 33152, los
cebadores usados fueron descritos por Wellinghausen N y cols.34
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- Lp-mip-PT69 (5'-GCA TTG GTG CCG ATT TGG) y Lp-mip-PT70
(5'-G[CT]T TTG CCA TCA AAT CTT TCT GAA).
La Mezcla de reacción para PCR 1 x PCR buffer 10 x 5 μl MgCl 25
mM6 μl Mezcla dNTP 2,5 mM1 μl Cebador JFP1 μl 1 μl Cebador
JRP Cebador PT 691 μl Cebador PT 701 μl Enzima Taq polimerasa
0.2 μl (1U) Muestra DNA 1 μl H20 bidestilada 34.8 μl Volumen
Total50 μl.
Programa de amplificación: Termociclador (Thermo Minicycler,
modelo PTC-150) 1 ciclo a 95 ºC por 5 min. 40 ciclos de:
Denaturación 95 ºC por 30 seg. “Anniling” 54 °C x 30 seg
Extensión 74 °C x 60 seg 1 ciclo final de 74 ºC por 10 min.
Visualización de las Secuencias Amplificadas
Electroforesis en gel de agarosa 1,5%. 18 μl del producto de la
amplificación fueron mezclados con 5 μl de buffer de carga 6 x
(Gibco Bethesda Research Laboratorios) y se cargaron en los poci-
llos de geles de agarosa al 1,5% en buffer TAE 1x con bromuro de
etidio (5 μl por 100 μl de agarosa), se sometieron a electroforesis a
100 volts por 30 minutos en cámara de electroforesis horizontal
(Labnet modelo Minigel Migration Tank, Gel X). El tamaño de las
secuencias amplificadas fue estimado por comparación con un
DNA “ladder” de 100 bp (Gibco Bethesda Research Laboratories)
corridos en condiciones similares.
Los genes fueron observados en transluminador (Espectroline,
modelo TVC-312R) y fotografiados en el sistema de captura Kodak
(Sistema EDAS 290, software Kodak 1D 3.6). Figura 3.
Figura 3.
Electroforesis de PCR de secuencias amplificadas de Legionella (género, 386
bp y especie de Legionela pneumophila. 285bp). Carril 1 DNA ladder 100 bp,
carril 2 y 3 Legionella pneumophila ATCC 33152, carril 4 y 5 Legionella Torre
de enfriamiento, carril 6 PCR múltiple de Legionella Torre de enfriamiento.
Determinación de la especificidad analítica
Para verificar la especificidad de la amplificación de la técnica de
PCR con los cebadores para género Legionella y especie Legionella
pneumophila, se realizaron pruebas de PCR con otras especies del
género Legionella (proporcionadas gentilmente por la empresa
VIRCELL SA, España) y otras especies bacterianas agentes etiológicos
de neumonias (provenientes del cepario de nuestro laboratorio).
Las bacterias ensayadas fueron: Legionella pneumophila serogrupo 1
ATCC 33152, Legionella lomgbeachae, Legionella micdadei, Legionella
jordanis, Legionella germanii, Legionella guillermondii, Legionella
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dumofii, Mycoplasma pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa,
Streptococcus pneumoniae, Moraxella catarrhalis, Haemophilus
influenzae.
Vigilancia ambiental intrahospitalaria de Legionella
Se investigó la presencia de Legionella pneumophila, y su hospe-
dero natural Acanthamoeba spp en el Hospital Clínico J.J. Aguirre
de la Universidad de Chile.
Plan de muestreo ambiental
Se elaboró un plan de muestreo ambiental considerando los puntos
críticos del sistema de aguas sanitarias intrahospitalaria fría y
caliente, y torres de refrigeración del Hospital Clínico de la
Universidad de Chile. Se consideraron pautas internacionales.
Para estimar el número de muestras a tomar se consideró el
número de camas del hospital, que es de 605, y, según las normas
internacionales, para hospitales de 500 camas se utiliza un mínimo
de 20 muestras.
Los puntos de donde se recolectaron las muestras consideran los
equipos de riesgo según las normas internacionales. Cualquier
fuente de agua que es aerosolizada debe ser considerada como una
potencial forma de transmisión de Legionella pneumophila. Según
el U.S. Department of Health and Human Services de Centers for
Disease Control and Prevention, los lugares apropiados para tomar
muestras en establecimientos de cuidados de la salud, y que
estaban disponibles para este estudio, son: lugares de salida del
agua —especialmente aquellos cerca o en las salas de pacientes—:
grifos o duchas —y humidificadores— para oxígeno, agua usada
para equipos de terapias respiratorias.30
Muestras microbiológicas
Se estudió un total de 109 muestras de fuentes de sistemas de agua
fría, sistema centralizado de agua caliente y de equipos de terapia
del Hospital Clínico José Joaquín Aguirre. 48 muestras durante
2005-2006 HCUCH y 61 muestras de junio a noviembre del año
2008. Se recolectaron muestras del hospital en tres oportuni-
dades.
Se tomaron en julio 2005 14 muestras correspondientes a las
fuentes de agua externas del hospital, tanto los estanques de agua
en la azotea de las distintas áreas del hospital y los reservorios a
nivel del suelo. Tabla 2. Durante el 2006 se muestreó las fuentes de
agua en interior del hospital, se recolectaron 34 muestras en
diversos servicios ubicados en distintos pisos del Hospital (Tabla 3).
Tabla 2.
Lugares de muestreo durante 2005. Estanques de agua del Hospital.
N° Servicio Lugar y Tipo de Muestra
1 Exterior Sala Bombas E1 Despiche
2 Exterior Sala Bombas E2 Despiche
3 Exterior Sala Bombas Despiche D1
4 Exterior Sala Bombas Despiche D2
5 Exterior Terraza Estanque B
6 Exterior Terraza Estanque CB
7 Exterior Terraza Sector D
8 Exterior Terraza Estanque Sector E
9 Exterior Terraza Sector E
10 Exterior Sistema de Rebalsa Sector A
11 Exterior Estanque General Sector AB
12 Exterior Estanque Grande Sector A
13 Exterior Estanque Agua Fría Sector DE
14 Exterior Estanque General Subsuelo Sector AB
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Tabla 3.
Lugares de muestreo durante 2006. Fuentes de agua interior del Hospital.
N° Servicio Lugar y Tipo de Muestra
1 Lab. Clínico Subterráneo. Ducha personal Lab. Micro
2 Lab. Clínico Subterráneo. Agua Llave Lavamanos Lab. Micro
3 Lab. Clínico Subterráneo. Ducha Emergencia
4 Lab. Terapia Celular Subterráneo. Agua Destilada Estanque Plástico
5 Unidad de Fórmulas Subterráneo Sala preparación Mamaderas
Enterales y Lácteas Agua llave
6 Unidad Preparación de Subterráneo. Agua Estéril
Productos Farmacéuticos
UPFE
7 Sala Lavado Vajillas Subterráneo. Llave Alimentación
8 Unidad de Preparados Subterráneo. Farmacia
Oncológicos
9 Lab. Terapia Celular Estanque Agua Destilada (contra muestra 4)
10 Medicina Física Subterráneo Agua Piscina Hidromasaje (grande)
11 Medicina Física Subterráneo Agua Piscina Hidromasaje (Manos)
12 Medicina Física Subterráneo Agua Piscina Hidromasaje (Pies)
13 Medicina Física Subterráneo Agua Hidrocolector
(preparación Compresas)
14 Pediatría 4° Piso: Lavamanos Pediatría Interna Sala E511
15 Pediatría 4° Piso: Ventilador Mecánico
16 Pediatría 4° Piso: Humidificador
17 Pediatría 4° Piso: Agua Mamaderas
18 Pediatría 4° Piso: Ducha Baño Personal
19 Odontología 1er Piso: Bidón Agua Destilada Equipo
20 Odontología 1er Piso: Agua Destilada Equipo Odontología 500 cc
21 Odontología Manguera Equipo Odontología 600 cc
22 Odontología Vaso Paciente Equipo Odontología
23 Odontología Equipo Ultrasonido 320 cc
24 Odontología Lavamanos
25 Oftalmología Sala Procedimientos
26 Oftalmología Sala Revelado Lavamanos
27 Oftalmología Sala Cirugía Menor Lavamanos
28 Oftalmología Sala Enfermería Hospitalizados
Oftalmología Lavamanos
29 Oftalmología Agua Bidestilada Sala Enfermería
30 Calderas Caldera alimentación cocina
31 Calderas Caldera calefacción central
32 Calderas Estanque agua caliente centralizada
33 Calderas Caldera esterilización
34 Calderas Boiler Medicina física
Durante el año 2007 no se pudo continuar el estudio por razones
ajenas a nuestra voluntad. Finalmente durante el 2008 se estu-
diaron 61 muestras en total, 31 muestras de junio a agosto 2008 y
30 muestras durante el período septiembre-noviembre 2008 (Tabla
4). De cada piso del hospital se eligió un servicio y se tomaron 5 a
8 muestras en él.
Cada muestra consistió en un litro de agua y la detección de
Legionella pneumophila se realizó según la norma ISO 11731/1998
tal como se describió anteriormente.
Tipificación Molecular de Cepas Clínicas y Ambientales
de Legionella pneumophila
La tipificación de las cepas aisladas se realizó gracias a la implemen-
tación de una técnica PCR- secuenciación que reemplaza las dos
técnicas propuestas en el proyecto original. En la actualidad corres-
ponde a una de las dos técnicas de referencia en EWGLI (European
Working Group for Legionella Infections).35 Por esta razón en este
estudio se implementó esta técnica en nuestro laboratorio.
221
Artículo Original | Salazar Ana María, et al.

Tabla 4. Tabla 5.
Lugares de muestreo durante 2008. Fuentes de agua interior del Hospital Cepas tipificadas en base al gen mip.
Detección de Legionella pneumophila. Número de Muestra Clasificación Cepa
5º piso, sector E: Pediatría 2º piso, sector D: Intermedio clínico 2 Ambiental TD
E509 UTI, lavamanos, agua fría D205, humidificador cama 1 3 Paciente P. S. L
E511 Intermedio, lavamanos agua fría D205, lavamanos agua fría 4 Control Legionella longbeache
Baño pacientes, ducha agua caliente D205, lavamanos agua caliente 8 Paciente P2HR
Baño pacientes, ducha agua fría Sala lavado de materiales, lavamanos 9 Control Legionella pneumophila ATCC 33152
E509, humidificador cama 3 Baño enfermera, lavamanos agua fría 10 Control Legionella micdadei
4º piso, sector B: Gastroenterología Baño enfermera, lavamanos agua caliente 11 Paciente P3JD
B405, lavamanos agua fría 1er piso, todos los sectores: Lavamanos de 12 Ambiental M4
Lava-chatas fría los baños 15 Control Legionella bonzemani
Baño pacientes B406, lavamanos agua Baño pacientes damas sector A 17 Control Legionella jordanis
caliente Baño público damas sector B 18 Control Legionella micdadei
Baño paciente B406, lavamanos agua fría Baño damas personal de cobranza sector C 22 Ambiental M2
Baño pacientes B406, ducha agua fría Baño público varones sector D, agua fría 19 Paciente P5LG
Baño pacientes B406, ducha agua caliente Baño visitas damas sector D 20 Control Streptococcus pneumoniae
B407, humidificador cama 1 Baño público damas sector D 21 Control Haemophilus Influenzae
3 piso, sector B: Traumatología Baño público mixto sector E, agua caliente
Baño pacientes B359, lavamanos agua Baño público mixto sector E, agua fría Partidores: Se diseñaron 3 pares de partidores dirigidos contra
caliente sitios de unión ribosomal o ORF y el sitio PPiasa del gen mip para
Baño pacientes B359, lavamanos agua fría amplificar productos de 661 a 715 pb. Estos partidores requieren
Baño pacientes B359, ducha agua fría redundancia para considerar la variación del tercer sitio del
Baño pacientes B359, ducha agua caliente codón.
Lava-chatas caliente De los 3 pares de partidores que fueron utilizados, 2 fueron dise-
ñados para la amplificación y uno para la secuenciación (Tabla 6).
Este esquema de clasificación se basa en la amplificación por PCR
Tabla 6.
y secuenciación del gen mip de aproximadamente 700 pares de
Partidores utilizados en el esquema de tipificación del gen mip.
bases (Figura 4), que permite discriminar entre especies y, lo más *( ): Sitios con mezclas de bases en la secuencia de los partidores usando
relevante, intraespecies. nomenclatura IUB.
En el presente estudio se implementó el uso del gen mip para desa-
Nombre Secuencia
rrollar un esquema de tipificación basado en la secuenciación de
Legmip_f 5’-GGG (AG)AT T(ACG)T TTA TGA AGA TGA (AG)A(CT) TGG-3´
distintas cepas de Legionella obtenidas de pacientes y del ambiente.
5’-GGG RAT TVT TTA TGA AGA TGA RAY
TGG -3´
Cepas de Legionella tipificadas Legmip_r 5’-TC(AG) TT(ATCG) GG(ATG) CC(ATG) AT(ATCG) GG(ATCG)*
Las cepas señaladas en la Tabla 5 fueron tipificadas, correspon- CC(ATG) CC- 3´
dientes a cepas ambientales, cepas clínicas y cepas control. Dentro 5’-TCR TTN GGD CCD ATN GGN CCD CC -
de éstas últimas, se utilizaron cepas de referencia de Legionella 3´
pneumophila y de otras especies para controlar el esquema de Legmip_fs 5’-TTT ATG AAG ATG A(AG)A (CT)TG GTC (AG)CT GC-3´
clasificación. También se usaron cepas de otras especies bacte- 5’-TTT ATG AAG ATG ARA YTG GTC RCT
rianas que codifican análogos de mip, capaces de causar cuadros GC-3´
similares, para verificar la especificad de la PCR.

PCR del gen mip
Extracción de DNA: La extracción de DNA se realizó a partir de las
cepas que fueron sembradas en Agar GVPC por 48 horas, las cuales
fueron diluidas en agua dd, hasta alcanzar una densidad de Mc
Farland 0.5 y hervidas a 100 °C por 15 minutos. Luego fueron
centrifugadas a 3 minutos por 13.000 R.P.M. El DNA blanco fue
obtenido del sobrenadante.
Mezcal PCR 1X: Buffer 10 mM5 ul; MgCl2 1.5 mM 3 μl; dDNTP
200 μM 1 μl; Partidores 20 pmol 1 μl; DNA100 ng1 Taq DNA
Polimerasa 2 U0.4
Condiciones de la Amplificación: Predenaturación 96 ºC x 3`, 35
ciclos de Denaturación 94 ºC x 1`, Alineamiento 58 ºC x 2` y
Elongación 72 ºC x 2`. Extensión Final 72 ºCx 5`.

Figura 4.
Contexto genómico del gen mip

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 Artículo Original | Legionelosis Nosocomial, un Problema de Contaminación Ambiental Biológica Emergente, pero Controlable
Análisis de los productos de PCR: 15 μl del volumen total de reac-
ción de PCR fue analizado por electroforesis en gel de agarosa 2%
marcado con 1 μg/ml con bromuro de etidio y fotografiado bajo luz
ultravioleta.
Purificación de los productos de PCR: Los productos de amplifica-
ción de PCR fueron purificados usando PCR purification KIT (Clean
Up, Wizard) de acuerdo al protocolo señalado por el fabricante.
Secuenciación de los productos de PCR: Los productos amplifi-
cados de PCR fueron secuenciados usando directamente el primer
forward Legmip_fs por el método de Sanger con el kit Big Dye
Terminator Cycle Sequencing Reaction 1.1 (Applied Biosystems) en
un secuenciador automático (ABI 310; Applied Biosystems).
Análisis de las secuencias: Este esquema de clasificación basado
en la secuenciación fue descrito por primera vez por el Dr. Rod
Ratcliff, de Infectious Disease Laboratories, Institute of Medical and
Veterinary Science, Adelaide, Australia. Las secuencias obtenidas
fueron comparadas con la base de datos del gen mip, el cual
contiene un completo set disponible de secuencias con control de
calidad.
Se realizaron “closet matches” comparando los resultado de las
secuencias de DNA del gen mip obtenidos en el laboratorio con la
base de datos disponibles en www.ewgli.org.
RESULTADOS
El desarrollo de esta investigación permitió la Implementación de
técnicas de laboratorio de microbiología para el estudio de
Legionella ambiental según la norma lnternacional, la cual fue
utilizada para el logro del objetivo de vigilancia de Legionella
intrahospitalaria.
Se implementaron las técnicas tradicionales de microbiología, para
el estudio de Legionella clínica: cultivo, detección de antígeno
urinario par diagnóstico de sospecha clínica de legionelosis.
Se Implementó una técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa
(PCR) múltiple: para la identificación de género y especie de
Legionella pneumophila con buena especificidad y sensibilidad
utilizada en el logro del objetivo4.
Vigilancia de Legionella intrahospitalaria
Se investigó la presencia de Legionella pneumophila, y su hospe-
dero natural Acanthamoeba spp en el Hospital Clínico J. J. Aguirre
de la Universidad de Chile.
Se estudió un total de 14 muestras de estanques de agua y 34 mues-
tras de distintos servicios del hospital durante 2005 y 2006, encon-
trándose presencia de Legionella en 3 muestras y Acanthomoeba spp
en 4 muestras. Tabla 7.
Las muestras de agua positivas para Legionella se encontraron en
recuentos que no constituyen riesgo para la población.
Tabla 7.
Resultados de Legionella y Acanthomoeba en 48 muestras de agua estu-
diadas durante 2005-2006.
Legionella Acanthomoeba
Muestras Positivas 3 6
Muestras Negativas 45 42
Total 48 48
Ciencia & Trabajo | AÑO 14 | NÚMERO 45 | OCTUBRE / DICIEMBRE 2012 | www.cienciaytrabajo.cl | 216/227
En el año 2008, se estudió un total de 61 muestras de distintos
servicios del hospital durante dos periodos y no se encontró
presencia de Legionella, ni su hospedero natural Acanthamoebas
en ninguna de ellas.
Tipificación Molecular de Cepas Clínicas y Ambientales
de Legionella pneumophila
A partir del protocolo previamente descrito para la PCR del gen mip
de Legionella, la Figura 4 muestra los resultados obtenidos.
Figura 4.
Electroforesis de producto de PCR de algunas de las muestras clínicas y
ambientales para el gen mip.
1. Lader 100 bp.
2. H2O dd.
3. Legionella pneumophila ATCC
4. S. L (Cepa paciente)
5. M4 (Cepa ambiental)
6. S. pneumoniae
7. J. D (cepa paciente)
8. H. influenzae
9. T.D (Cepa ambiental)
Una vez secuenciados los productos positivos de PCR se realizaron
alineamientos de las secuencias de las distintas cepas en estudio con
las secuencias de referencia. Figura 5.
Posteriormente se obtuvieron árboles filogenéticos con cada una de
las secuencias en estudio. Figura 6.
A continuación se realizaron nuevos alineamientos de las secuencias
de las cepas en estudio con las secuencias similares de la base de
datos de Legionella y se obtuvo el porcentaje de similitud de cada
una de las secuencias. Figura 7.
Finalmente se presentan en la Tabla 8 los resultados de la tipificación
de todas las cepas estudiadas.
Esta metodología nos permitió tipificar distintas cepas del género
Legionella obtenidas de muestras de pacientes y ambientales, de
acuerdo a este esquema de clasificación. Para ello, en cada cepa se
obtuvo la secuencia del gen mip por PCR y secuenciación y se iden-
tificó a nivel de cepa a través del porcentaje de identidad obtenido
del alineamiento con las secuencias de referencia disponibles en la
base de datos de Legionella (www.ewgli.org.). El PCR es específico
para la especie ya que no se obtuvieron productos amplificados con
cepas de otros géneros.
223
Artículo Original | Salazar Ana María, et al.

Figura 5.
Alineamiento de una de la secuencia de P1 (userseq., primeras 60 bases).

0 10 20 30 40 50 |---------|---------|---------|------
---|---------|--------- Legionella pneumophila_Phil1
TTAGCTACAGACAAGGATAAGTTGTCTTATAGCATTGGTGCCGATTTGGGGAAGAATT
Legionella beliardensis TTAAGCAGTGACATGGATAAATTATCTTACAGTATTGGTGCTGATT-
TAGGACGAAATTTT Legionella waltersii CTTGCTACTGACAATGATAAATTATCATACAGT-
ATTGGTGCGGATTTAGGTAAAAACTTC Legionella rowbothamii TTAGTTACAGATAAAGA-
CAAATTGTCTTACAGTATTGGTGCTGATTTAGGGAAAAATTTT Legionella longbeachae_sg1
CTTACTACGGACAAAGATAAATTATCTTATAGTATTGGTGCTGATTTAGGAAAAAACTTT
Legionella adelaidensis TTAACCACTGAAATGGATAAATTGTCTTATAGCATAGGTACA-
GATTTGGGCAAAAATTTT Legionella londiniensis CTGGATAGCGATATTGATAAGCTTTCG-
TACAGCATTGGCATTGATCTTGGAAAAAATTTT Legionella oakridgensis TTAACTACG-
GACACAGACAAGCTGTCTTACAGTATTGGTATTGATCTTGGCAAAAATTTT Legionella
jamestowniensis TTAAATAGCGACATGGATAAACTGTCTTACAGTATTGGTGCTGATTTAGG-
TAAAAATTTT Legionella feeleii_sg1 TTAAATAGTGACATGGATAAGTTGTCTTATAGCAT-
TGGCGCTGATTTAGGTAAGAATTTT Legionella maceachernii TTGGCTACAGACACA-
GAAAAACTTTCTTACAGTATTGGCGCTGATTTAGGTAAGAATTTT Legionella rubrilucens
TTAAACACCGATATTGACAAGTTGTCTTACAGTATTGGTGCTGATTTAGGCAAAAACTTT
Legionella birminghamensis CTCTCTACTGACATGGATAAATTATCCTACAGTATTGGCGCT-
GATTTGGGTAAAAATTTC Legionella wadsworthii CTTGTTACGGATAAGGATAAATTATCT-
TACAGTATTGGTGCTGATTTAGGAAAAAACTTC Legionella bozemanii_sg1 CTTGTTACGGA-
TAAAGATAAATTATCTTATAGTATTGGTGCTGATTTAGGGAAAAACTTC Legionella steigerwaltii
CTTGTTACGGATAAAGATAAGTTATCTTATAGTATTGGTGCTGATTTAGGAAAAAACTTC
Legionella moravica TTACCTACAGACAAAGATAAATTGTCTTACAGTATTGGTGCTGATT-
TAGGAAAGAATTTC Legionella spiritensis_sg1 TTAAATACGGATACCGATAAATTGTCT-
TATAGTATTGGGGCTGATTTAGGTAAAAACTTC Legionella brunensis TTAAATAGTGACAT-
GGATAAGCTGTCTTACAGTATTGGCGCTGATTTAGGTAAAAACTTT Legionella israelensis
TTGAATACGGATGTAGAAAAATTATCCTACAGTATTGGAGCTGATCTTGGTAAAAATTTC
Legionella lansingensis TTAAATAGCGACACGGATAAGCTGTCTTATAGTATCGGTGCTGACT-
TGGGTAAAAATTTT Legionella gratiana CTTGCTACAGACAAAGATAAGTTATCTTATAG-
TATTGGTGCTGATTTAGGAAAAAACTTT Legionella nautarum TTATCTACTGATACGGA-
TAAGCTGTCTTACAGCATCGGAGCGGATTTAGGTAAGAACTTC Legionella shakespearei
TTACCTACAGACAAAGATAAATTGTCTTACAGTATTGGTGCTGATTTAGGAAAAAATTTCLegionellacincinnatiensis
CTTACTACGGACAAAGATAAATTATCTTATAGTATTGGTGCTGATTTAGGAAAAAACTTT Le-
gionellagresilensisTTAAGCAGTGACATGGACAAACTATCTTATAGTATTGGTGCTGATTTAGGACGGAATTTT
Legionella pneumophila_892076 TTAGCTACAGACAAGGATAAGTTGTCTTATAG-
CATTGGTGCCGATTTGGGGAAGAATTTT Legionella pneumophila_sg_7 TTAGCTA-
C A G A C A A G G ATA A G T T G T C T TATA G C AT T G G T G C C G AT T T G G G G A A G A AT T T T
Legionella pneumophila_Knox TTAGCTACAGACAAGGATAAGTTGTCTTATAGCATTGGT-
GCCGATTTGGGGAAGAATTTT Legionella pneumophila_sg_8 TTAGCTACAGACAAGGA-
TAAGTTGTCTTATAGCATTGGTGCCGATTTGGGGAAGAATTTT userseq. TTAGC-
TACMGACAAGGATAAGTTGTCTTATAGCATTGGTGCCGATTTGGGGAAGAATTTT

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 Artículo Original | Legionelosis Nosocomial, un Problema de Contaminación Ambiental Biológica Emergente, pero Controlable

Figura 6. Tabla 8.
Árbol filogenético análisis de neighbour-joining para el alineamiento Resultados de los alineamientos de las distintas cepas de Legionella en
de la secuencia de P1. estudio en base al gen mip.
L. pneumophila_Phil-1 Número Clasificación Nombre Clasificación según Ewgli % identidad
L. pneumophila_69-2076 de Muestras
userseq
2 Ambiental T D LEGIONELLA
L. pneumophila_Knox
L. pneumophila_sg-7 pneumophila_sg7 99.63
L. pneumophila_sg-8 3 Paciente P.S. L LEGIONELLA
L. moravica pneumophila_91-033 99.64
L. shakespearei
L. waltersii 4 Control LEGIONELLA LEGIONELLA
L. rowbothamii longbeache longbeachae_sg1 95.32
L. longbeachae_sg-1 8 Paciente P.H.R LEGIONELLA
L. cincinnatiensis
L. gratiana
pneumophila_Knox 99.27
L. wadsworthii 9 Control Legionella LEGIONELLA
L. bozemanii_sg1 pneumophila pneumophila_Phil-1 99.82
L. steigerwaltii
ATCC
L. adelaidensis
L.londiniensis 10 Control Legionella LEGIONELLA
L.oakridgensis micdadei longbeachae_sg1 100
L. israelensis 11 Paciente P.J.D. LEGIONELLA
L. beliardensis
L.gresilensis pneumophila_Phil-1 99.82
L. birminghamensis 12 Ambiental M4 LEGIONELLA
L. jamestowniensis pneumophila_Phil-1 99.82
L.brunensis
L. lansingensis
15 Control Legionella LEGIONELLA
L. feeleii_sg1 Bozemanni bozemanii sg1 74.55
L. maceachernii 17 Control Legionella LEGIONELLA
L.nautarum
jordanis jordanis 99.64
L. rubrilucens
L.spiritensis_sg8 18 Control Legionella LEGIONELLA
0,01 micdadei micdadei 99.13
22 Ambiental M2 LEGIONELLA
Figura 7. pneumophila_Phil-1 95.80
Alineamiento de las secuencias más similares a la secuencia de P. J. D. 19 Paciente P.L.G L. pneumophila_Phil-1 90.13
(userq., primeros 60 nucleótidos). 20 Control S. pneumoniae - -
0 10 20 30 40 50 |---------|---------|---------|------ 21 Control H. Influenzae - -
---|---------|--------- LEGIONELLAgratiana
CTTGCTACAGACAAAGATAAGTTATCTTATAGTATTGGTGCTGATTTAGGAAAAAACTTT
LEGIONELLAshakespearei TTACCTACAGACAAAGATAAATTGTCTTACAGTATTGGT- mostrando este esquema así su capacidad de discriminar entre
GCTGATTTAGGAAAAAATTTC LEGIONELLAmoravica TTACCTACAGACAAAGATAAAT-
TGTCTTACAGTATTGGTGCTGATTTAGGAAAGAATTTC LEGIONELLApneumophila_sg_8 especies de Legionella.
TTAGCTACAGACAAGGATAAGTTGTCTTATAGCATTGGTGCCGATTTGGGGAAGAATTTT En definitiva, el esquema de secuenciación basado en el gen mip
LEGIONELLApneumophila_sg_7 TTAGCTACAGACAAGGATAAGTTGTCTTATAG-
CATTGGTGCCGATTTGGGGAAGAATTTT LEGIONELLApneumophila_Knox TTAGC- para Legionella nos permitió realizar exitosamente la clasificación
TACAGACAAGGATAAGTTGTCTTATAGCATTGGTGCCGATTTGGGGAAGAATTTT de cepas tanto clínicas como ambientales. Este esquema de clasifi-
LEGIONELLApneumophila_Phil1 TTAGCTACAGACAAGGATAAGTTGTCTTATAGCAT-
TGGTGCCGATTTGGGGAAGAATTTT LEGIONELLApneumophila_892076 TTAGCTACA- cación es técnicamente simple para laboratorios con capacidad y
GACAAGGATAAGTTGTCTTATAGCATTGGTGCCGATTTGGGGAAGAATTTT userseq equipamiento adecuado y permitió clasificar especie del género
Legionella hasta nivel de cepas y subtipo.
Se determinó que todas las cepas pertenecen a la especie Legionella La técnica utilizada para evaluar la presencia de Legionella pneu-
pneumophila, tipificándose exitosamente tanto cepas clínicas como mophila en las fuentes de agua detecta esta bacteria a concentra-
ambientales. Entre las cepas clínicas se confirmó la especie Legionella ciones mayores a 100 UFC/l. Por otro lado, los resultados para la
pneumophila, dentro de las cuales dos cepas fueron subtipificadas presencia de Legionella pneumophila dan una señal alentadora en
como Legionella pneumophila philadelphia 1, una cepa como cuanto a la calidad de las aguas del hospital y a la baja o mínima
Legionella pneumophila knox y otra cepa como Legionella pneumo- posibilidad para quienes asisten y se atienden en él de contraer
phila 91-033. legionelosis nosocomial.
Entre las cepas ambientales, se confirmó la especie Legionella
pneumophila y una de ellas fue subtipificada como cepa de Discusión
Legionella pneumophila serogrupo 7 y dos cepas fueron subtipifi- Numerosas publicaciones han documentado que los pacientes con
cadas como Legionella pneumophila philadelphia 1. legionelosis nosocomial han sido infectados a través de aerosoles,
Las cepas control fueron coincidentes con los resultados esperados, generados principalmente por duchas, equipos de terapia respira-
excepto para una cepa, la cual dio como resultado una Legionella toria, equipos de hidroterapia, humidificadores de aire ambiental,
longbeachae serogrupo1 con un 100% de identidad, cuando la entre otros.
cepa estaba identificada previamente como una Legionella En este contexto, los hospitales merecen la mayor preocupación
micdadei. Este ensayo fue realizado en duplicado para confirmar para minimizar los riesgos de infecciones asociadas a las condi-
el resultado. Sospechamos que existió un error de rotulación, ciones ambientales. Así, aunque la legionelosis es una infección

Ciencia & Trabajo | AÑO 14 | NÚMERO 45 | OCTUBRE / DICIEMBRE 2012 | www.cienciaytrabajo.cl | 216/227 225
Artículo Original | Salazar Ana María, et al.
respiratoria, las medidas de control se relacionan directamente con
la calidad del agua dado que corresponde a su reservorio.
A pesar de que existe numerosa legislación y normativa sobre el
tema en el extranjero, aún persisten numerosas controversias. Sin
embargo, existe consenso en que legionelosis es una infección
prevenible.
Una de las estrategias preventivas corresponde a la prevención
primaria, en la cual el hospital basa su vigilancia en el diagnóstico
cuidadoso de todos los casos de neumonía nosocomial y/o en el
cultivo rutinario de muestras de agua de sus instalaciones. Los
cultivos de rutina han emergido como una estrategia efectiva para
la prevención de enfermedad de legionellosis intrahospitalaria.
Por otro lado, si la colonización del agua con Legionella es regis-
trada, aumenta el índice de sospecha clínica como causa de
neumonía nosocomial por este agente, aumentando la vigilancia
clínica. Aunque el CDC recomienda realizar cultivo ambiental sólo
en caso de la presencia de al menos dos casos de legionellosis
nosocomial, varios estudios han documentado que cuando las
fuentes de agua están colonizadas existe una mayor probabilidad
de que se presentes casos y/o brotes de Legionella. Además, argu-
mentan que en aquellos hospitales en los cuales no se investiga la
colonización de legionellosis intrahospitalaria probablemente se
den casos de neumonía nosocomial, que son atribuidas a otros
agentes o quedan sin causa etiológica conocida. Así en Pittsburgh
PA: Allegheny County y Maryland USA, Cataluña en España,
Francia y Dinamarca se ha adoptado la rutina de cultivo ambiental
de legionellosis. Complementada además con la vigilancia médica
activa de casos de legionellosis nosocomial y un buen laboratorio
con técnicas microbiológicas apropiadas, permiten un mejor cono-
cimiento del problema. Legionella se encuentra en nuestro medio,
estudios inmunológicos realizados en Santiago en adultos y en
niños han revelado cifras de seroprevalencia similares a las de
226 216/227 | www.cienciaytrabajo.cl | AÑO 14 | NÚMERO 45 | OCTUBRE / DICIEMBRE 2012 |
países en que las neumonías por este agente causal tienen impor-
tancia significativa.
La implementación de técnicas de laboratorio tradicional y molecular
nos permitió abordar, por primera vez en Chile, el diagnóstico de
Legionella tanto ambiental como clínico. Se ha puesto a punto una
técnica de reacción de polimerasa en cadena múltiple, que permite
tipificar simultáneamente las cepas a nivel de género y especie
El desarrollo de este estudio permitió logros en diversos ámbitos:
1. Prevención salud laboral: Desarrollar metodologías de preven-
ción y erradicación sencillas y eficaces.
2. Clínico: Mejorar la sospecha diagnóstica de neumonía.
3. Microbiológico: La implementación de técnicas de laboratorio
permitirá abordar el diagnóstico de Legionella y complementar
el diagnóstico etiológico.
El estudio realizado en dos periodos de tiempo en diversas fuentes
de agua intrahospitalaria del Hospital Clínico José Joaquín Aguirre
permitió evidenciar Legionella pneumophila solo en 3 de 109
muestras estudiadas y, además, en recuento muy bajo que no es
considerado de riesgo, y sólo en el primer periodo; en el segundo
periodo estudiado, correspondiente al 2008, no se detectó
Legionella. Sin embargo, se sabe que la portación de estos micro-
organismos es dinámica y justifica revisar o implementar un
sistema de control de tratamiento de las aguas intrahospitalarias.
En los últimos años, Chile ha comenzado la construcción de edificios
inteligentes y la implementación de sistemas tanto de agua sanitaria
caliente como de acondicionamiento de aire centralizados en los
edificios antiguos. Lo que incorpora por esta razón un agente de
riesgo biológico ocupacional, desconociéndose la magnitud real de su
exposición; por lo tanto, lograr su cuantificación y determinar el
posible impacto de ésta en un área determinada servirá de base para
enfrentar el potencial riesgo de este agente en otros ámbitos.
Ciencia & Trabajo
 Artículo Original | Legionelosis Nosocomial, un Problema de Contaminación Ambiental Biológica Emergente, pero Controlable
REFERENCIAS
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N Engl J Med. 1977; 297:1189-1197.
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