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Emopoiesi o Ematopoiesi

Fattori di crescita ematopoietica

Classificati in base al Target:

•Granulocyte colony stimulating factor (G-csf)


•Granulocyte Macrophage colony stimulating factor (GM-csf)
•Macrophage colony stimulating factor (M-csf)
•Erithropoietin (EPO)
•Thrombopoietin (TPO)
•Stem Cell Factor (SCF)
Granulocyte colony stimulating factor (G-csf)
Tipo A: 177 AA
Tipo B: 174 AA
O-glicosilazione
18.6 KD

Il G-CSF è una citochina che controlla l’ematopoiesi, specificamente la maturazione dei


neutrofili. I neutrofili sono coinvolti nella risposta immunitaria alle infezioni e alle lesioni
tessutali. Sono anche una delle componenti cellulari del sistema immunitario che vengono
uccise dalla chemioterapia, a causa dei suoi effetti non specifici sulle cellule che si replicano
attivamente.

Pertanto, la capacità di promuovere il recupero dei neutrofili dopo la chemioterapia è


clinicamente importante. Il G-CSF ricombinante ha dimostrato di essere efficace nel
promuovere il recupero dei neutrofili. Tuttavia, come indicato negli esempi degli usi clinici,
si tratta di una terapia di supporto che non ha attività antitumorale diretta. Quindi,
piuttosto che agire uccidendo o sopprimendo le cellule tumorali, il G-CSF ricombinante
attenua alcuni dei problemi creati dalle terapie antitumorali. Inoltre, i suoi effetti non sono
specificamente mirati all’anormalita’ delle cellule tumorali. Piuttosto, il G-CSF ricombinante
aggiunge la sua azione agli effetti dei G-CSF prodotti naturalmente dall’organismo.
Granulocyte colony stimulating factor (G-CSF) Riconbinanti

Filgrastim
175 AA (metionina N-terminale)
Non glicosilato
Sorgente del gene: bladder carcinoma cell line
E. Coli riconbinante

Lenograstim
174 AA
O-glicosilato
Sorgente del gene: squamous carcinoma cell line
Chinese hamster ovary

Nartograstim
174 AA (cambio in posizioni 1,3,4,5, e 17)
Non glicosilato
E. Coli riconbinante
Filgrastim
(Neupogen)

G-CSF (Granulocyte Colony-Stimulating Factor), fattore di crescita che stimola la


differenziazione, la sopravvivenza e la migrazione dei granulociti. Il G-CSF è una
glicoproteina prodotta da vari tipi cellulari, tra cui macrofagi e cellule endoteliali.
Agisce nel midollo osseo in risposta a segnali infiammatori stimolando la
differenziazione dei precursori dei granulociti neutrofili ed è attivo nella mobilitazione
delle cellule staminali. Una forma di G-CSF ricombinata viene utilizzata in terapia per
contrastare le neutropenie nei pazienti sottoposti a cicli chemioterapici, si tratta del
Filgrastim (fattore metioninico umano ricombinante stimolante le colonie
granulocitarie) prodotto con tecnologia r-DNA in E. Coli (K12).
Neupogen è indicato nel ridurre la durata della neutropenia e l'incidenza della
neutropenia febbrile in pazienti trattati con chemioterapia citotossica standard per
affezioni maligne (con l'eccezione della leucemia mieloide cronica e delle sindromi
mielodisplastiche) e nel ridurre la durata della neutropenia in pazienti sottoposti a
terapia mieloablativa seguita da trapianto di midollo osseo considerati a maggior rischio
di neutropenia severa prolungata.

Neutropenie indotte
•Chemioterapia
•Chemioterapia HIV
•HIV
•Trapianto di midollo osseo
Granulocyte Macrophage colony stimulating factor (GM-csf)
Tipo A: 127 AA
N e O-glicosilazione
14.7 KD

Molgramostim
128 AA
Non glicosilato
Sorgente del gene: human monocyte cell line
E. Coli riconbinante

Sargramostim
127 AA (cambio in posizione 23)
N-glicosilato
Sorgente del gene: Mouse T-lynphoma cell line
Yieast
Eritropoietina e Trombopoietina
L’eritropoietina e la trombopoietina sono
proteine glicosilate facenti parte della
famiglia delle citochine, si legano al
recettore attraverso due siti, ognuno posto
su un monomero, definiti CRH (cytochine
homology receptor) e attivano la
trasduzione del segnale attraverso
dimerizzazione del recettore e
fosforilazione JAK/STAT.

L’eritropoietina é un ormone, prodotto dal


rene, che controlla l’eritropoiesi. Dal 1989
è usata una EPO ricombinante (Epoetina)
per la cura dell’anemia renale cronica.

La principale funzione della


trombopoietina è la regolazione della
megacariocitopoiesi e la produzione di
piastrine.
Lega il recettore c-Mpl.
Anemia. Below-normal amount of red blood cells (RBC’s). Red blood cells contain
hemoglobin, a substance that carries oxygen through the body. The body uses iron
molecules to build hemoglobin. When RBC levels decrease,
the body has to work harder to move oxygen.
The extra demands on the body can cause fatigue, a feeling of very little energy that
keeps people from performing normal activities.
People with cancer often have anemia, caused by either the activity of the cancer or
by cancer treatments.

Erythropoietin: A protein (natural substance found in the body) that makes red
blood cells. It is produced by the kidneys and carried through the bloodstream.

Epoetin: A human recombinant (made by scientists in a lab instead of produced by


the body) form of erythropoietin. It has been used since 1989 to treat anemia of
chronic renal (kidney) failure. Since then, research has explored if epoetin is a good
treatment for people with cancer who have anemia.
Eritropoietina
Nativa:
Glicoproteina (3 N-linked e 2 O-linked) 34 KD
165 AA; 2 ponti disolfuro;
Altamente glicosilata (metà del peso molecolare)
Glicosilazione indispensabile per l’azione biologica.
Azione molto specifica di stimolazione proliferazione di globuli rossi

Ricombinante:
Eritropoietina Alfa (Epoetin Alpha) in USA e Giappone
Eritropoietina Beta in Europa e Giappone
Sono identiche a quella umana (cambia solo il grado di glicosilazione)

The guidelines focus on the use of epoetin in these situations only:


• Anemia caused by the activity of the cancer
• Anemia caused by chemotherapy or radiation therapy
• Anemia caused by bone marrow failure (called myelodysplasia or aplastic anemia)
La struttura secondaria, composta da

- 4 -eliche
- 2 β-foglietti
S-S
- 2 ponti S-S (Cys34–Cys188, Cys56–Cys60)
Leu108
è stata inizialmente predetta in base ai 193
aa che compongono struttura primaria della
proteina.

Dai dati ottenuti con esperimenti di


mutagenesi è stato possibile ipotizzare una
Lys140
mappa dei siti di legame dell’EPO al suo
Arg14
3 recettore.
Ser146 Arg14
Asn147
Gly151
Lys152
Srg103
Ser104
La proteina contiene 5 siti di glicosilazione:

- 3 N-linked (Asp51,65,110)
S-S
Struttura EPO prevista da studi
- 1 O-linked (Ser153)
sulla struttura primaria

D.Wen et al. – Eritrhropoietin Structure-Function Relationships (1994) – JBC


Residui importanti per l’attività fisiologica dell‘EPO

sono stati evidenziati mediante tecniche di


mutagenesi sito specifiche.

Paragonando l’attività della proteina WT con


quella delle proteine portanti mutazioni è stato
possibile evidenziare gli AA importanti per
l’attività biologica.

In generale tutte le mutazioni a carico di questi


AA hanno provocato una sensibile riduzione
dell‘attività.

D.Wen et al. – Eritrhropoietin Structure-Function Relationships (1994) – JBC


Loop B-C
Residui importanti per l’attività
Loop A-B
biologica
dell'EPO (-elica)
S-S
Leu108 Arg14 (A)

Arg103 (C)

Ser104 (C)

Leu108 (C-D)

Lys140 Arg14
Lys140 (D)
Arg103
Arg14 Ser104
3 Arg143 (D)
Ser146
Asn147

Lys152 Ser146 (D)


Loop C-D

Asp147 (D)
Struttura EPO da cristallografia N terminale
C terminale
Lys152 (D)

J.C.Cheetham et al. – NMR structure of human erythropoietin and a comparison with its receptor bound
conformation. (1998) – Nat Struct Biol
EPO e recettore
EPO Tipo di EPOR
(-elica) legame (EPObp)
Arg14* (A) Idrogeno Leu33 (2)
Ionico Glu62 (2)
Idrogeno Ser91 (2)
Arg103 (C)
Idrogeno Ala88 (2)
Ionico Asp89 (2)
Ser104 (C) Idrogeno Ser92 (2)
Leu108 (C-D) Idrofobico Phe93 (2)
Lys140 (D) Ionico Asp61 (1)
Arg143 (D) Ionico Glu60 (1)
Phe93 (1)
Ser146 (D) Idrogeno
His114 (1)
Phe93 (1)
Asp147 (D) Idrogeno
His114 (1)
Struttura EPO – EPOR(dimero)
Lys152 (D) Idrogeno Trp51 (1)
K.Hill et al. – Efficiency of signalling through cytokine receptors depends critically on receptor orientation
(1998) – NATURE
Erytropoietin Mimetic Peptide 1 (EMP 1)

Ottenuto mediante phage display

In forma attiva è un dimero,il


monomero è costituito da 20 aa e
presenta un ponte disolfuro
(Cys6,Cys15).

Mediante NMR e raggi X sono stati


individuati i siti di legame:

1) Interazioni idrofobiche tra Tyr4, Phe8,


Trp13 dell’EMP1 e due Phe del
recettore
2)Legami idrogeno di Gly9, Pro10 e
Leu11 con la Thr151 del recettore.

J.Goldberg et al.- Erythropoietin Mimetics Derived from Solution Phase Combinatorial Libraries (2002)-J Am Chem Soc.
La tasca idrofobica del
recettore è costituita
da due fanilalanina
(Phe93,Phe205) e una
metionina (Met150).

Il legami idrogeno
sono fatti da una
treonina (Thr151).

La metionina è
importante per il
legame con EMP1
mentre non risulta
esserlo per l’EPO.

S.A. Middleton et al.- Shared and Unique Determinants of the Erythropoietin (EPO) Receptor Are Important
for Binding EPO and EPO Mimetic Peptide (1999) –The Journal of Biological Chemistry.
Ricerca di agonisti dell’EPO
mediante librerie combinatoriali

La struttura generale (2) ha 3 sostituenti:

R¹ → per fare l’interazione idrofobica

R² →per i legami idrogeno

R³ →spacer dicarbosillico rigido

La molecola è simmetrica in quanto deve


legare entrambi i monomeri del recettore
per attivarlo.

J.Goldberg et al.- Erythropoietin Mimetics Derived from Solution


Phase Combinatorial Libraries (2002)-J Am Chem Soc.
Le molecole con maggiore attività in
posizione R² hanno come sostituente
N-α-CBZ-lisina metil estere (B10).

Lo spacer dicarbosillico (R³) può


essere sia lineare che ciclico, in
quanto l’attività è influenzata
principalmente dalla sua lunghezza.

Il sostituente R¹ può essere di diversi


tipi, tutti accomunati dalla presenza
di un gruppo aromatico.

J.Goldberg et al.- Erythropoietin Mimetics Derived from Solution Phase Combinatorial Libraries (2002)-J
Am Chem Soc.
ESA (Erythropoietic Stimulating Agents)

Tutti i farmaci stimolanti le cellule eritroidi immature vengono definiti come ESA
(Erythropoietic Stimulating Agents).

Nel corso degli anni novanta erano disponibili in Italia due tipi di eritropoietina
ricombinante: l'EPO α (nome commerciale in Italia Eprex) e l'EPO β (NeoRecormon),
praticamente identiche all'EPO umana. Erano composte da 165 aminoacidi, con una
struttura glucidica leggermente diversa tra loro e la somministrazione poteva essere sia
endovenosa sia sottocutanea, con una frequenza che poteva variare da 1 a 3 volte alla
settimana.
ESA di seconda generazione

L'EPO δ (Dynepo), simile alle precedenti è stata commercializzata in altri paesi


mentre non è mai entrata in commercio in Italia.

Darbepoetina α (Aranesp)

Nel 2001 la FDA (Food and Drug Adminstration) statunitense ha acconsentito


alla commercializzazione di una molecola eritropietinica modificata nella sua
componente glucidica, arricchita di residui di acido sialico che ne hanno
prolungato l'emivita sia nella somministrazione endovenosa sia in quella
sottocutanea. Questa molecola è nota come Darbepoetina α (Aranesp). Il suo
impiego ha consentito di ridurre la frequenza delle somministrazioni a una volta
ogni una o due settimane semplificando la vita del paziente con malattia renale.
ESA di terza generazione

C.E.R.A. (Continuous Erytropoiethin Receptors Activator)


Metossipolietinglicole Epoetina β (Mircera)

Pazienti con insufficienza renale e costretti all'emodialisi.

La struttura proteica è sempre analoga a quella umana, molto diversa la componente


glucidica e il numero di residui di acido sialico è più elevato.
Queste modifiche nella parte non proteica hanno consentito di allungare l'emivita del
farmaco a 135 ore se somministrata per via endovenosa e a 139 ore se somministrata per
via sottocutanea. Nei pazienti mai trattati in precedenza con E.S.A. si parte con una
somministrazione ogni 2 settimane: una volta raggiunti i livelli di Emoglobina targets (Hb
11 - 12 g/dL) si passa alla somministrazione mensile. Nei pazienti già trattati con altri
E.S.A. e passati in Mircera la somministrazione è mensile. Va segnalato come l'impiego di
tutti i farmaci E.S.A. nei pazienti nefropatici non ha lo scopo di normalizzare i valori di
Emoglobinemia, ma di raggiungere un target considerato ottimale compreso tra 11 e 12
g/dL. Si è visto infatti che morbilità e mortalità aumentano in modo esponenziale tanto
più ci si allontana verso il basso e verso l'alto da questi valori considerati ottimali.
Dal 2008 è assurto agli onori delle cronache sportive perché utilizzato da alcuni ciclisti
come doping.