Secuenciar una molécula de ADN consiste en determinar en qué orden se disponen los cuatro
nucleótidos (A, T, C y G) que componen la molécula.
El primer método diseñado para secuenciar el ADN fue desarrollado por Allan Maxam y
Walter Gilbert en 1977. Es un método químico que somete la molécula de DNA a distintos
métodos de ruptura. Este método es bastante laborioso y ha sido sustituido por métodos
enzimáticos que se pueden llevar a cabo de forma automatizada.
- Corte de las purinas. Las purinas adenina y guanina se metilan con dimetil sulfato
(DMS). Después, la reacción es tratada en condiciones alcalinas; la molécula de ADN se
fragmenta en purinas metiladas. Como resultado, se obtiene una serie de bandas oscuras
que corresponden a las guaninas y bandas claras que corresponden a las adeninas.
- Corte de adeninas. Esta reacción es una variación de la anterior. Las purinas metiladas
se tratan inicialmente con un ácido diluido. Esto favorece el corte de las adeninas
metiladas. Después de un tratamiento alcalino las guaninas también son cortadas. Este
tratamiento genera una serie de bandas oscuras y claras que también corresponden a las
adeninas, y las guaninas, respectivamente.
- Corte de pirimidinas. Esta reacción utiliza el reactivo hidracina, que corta las bases
citosina y timina.
- Corte de citosina. La presencia de NaCl 2M inhibe la reacción de hidracina con tiamina,
y el tratamiento posterior con piperidina, produce solamente fragmentos que terminan en
citosina.
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Fue diseñado por Fred Sanger en 1977. También se conoce como método didesoxi o
secuenciación por terminación de la cadena. Es un método enzimático que permite
determinar la secuencia del molde a medida que se sintetiza su hebra complementaria. Se
necesitan los siguientes componentes:
PROCEDIMIENTO
La secuenciación se lleva a cabo en cuatro tubos. Cada tubo contiene el molde, el cebador,
los cuatro desoxirribonucleótidos trifosfato (dNTP), la polimerasa y un ddNTP distinto en
cada caso.
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2. Se sustituye la ADN polimerasa por la Taq-polimerasa. De este modo es posible
automatizar el proceso como si se tratara de una PCR. En cada ciclo aumenta de forma
exponencial el número de fragmentos generados, cada uno marcado con una molécula
fluorescente que emite luz de distinto color, en función del ddNTP terminal.
(secuenciación cíclica).
3. La separación de los fragmentos se realiza mediante electroforesis capilar, que es más
rápida que la electroforesis en gel. El color de esta fluorescencia determina de qué
nucleótido se trata. El gráfico resultante se denomina electroferograma, en el que se
observan picos de diversos colores. Cada color indica qué nucleótido ocupa cada
posición en la molécula de ADN o su secuencia.
1.4. PIROSECUENCIACIÓN
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secuenciación. Una vez ligados los adaptadores, se ligan a las beads (esferas que contienen
el complementario a uno de los adaptadores en su superficie), por un método de dilución
límite, de modo de obtener un único fragmento unido a una esfera. Se busca, entonces,
obtener en cada bead un único fragmento de ADN, el mismo es amplificado mediante PCR
en emulsión.
1. Métodos indirectos
El ARN se convierte primero a cADN con la enzima transcriptasa reversa y luego se usa el
fragmento obtenido como templado para la reacción de secuenciación. En realidad, este
método determina la secuencia de una molécula de ADN a partir de la cual se infiere la
secuencia de la molécula de ARN. Este método indirecto es uno de los más comunes para la
secuenciación de ARN porque tiene todas las ventajas de la secuenciación de ADN.
2. Métodos directos
Estos métodos se utilizan para secuenciar la molécula de ARN cuando es complicado utilizar
el método indirecto. Esto suele suceder con ARNs muy pequeños, o con estructuras
secundarias extensas (ribosomales, transferencia). Todas estas técnicas requieren de que el
ARN este en forma pura.
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los enlaces fosfodiéster. Se utiliza un gel de acrilamida para separar los fragmentos
de estos tres tipos de ruptura, lo que permite determinar el orden de las guaninas,
adeninas y pirimidinas de una molécula de ARN ribosomal. A diferencia del método
enzimático, en el que se puede usar un iniciador marcado para generar los fragmentos
que serán secuenciados, el método químico requiere que la molécula de ARN sea
marcada directamente.