Memorias del XIV Congreso de Bioenergética y

Biomembranas. Sociedad Mexicana de Bioquímica A.C.

13 al 18 noviembre 2005; Oaxaca, Oaxaca.

CARACTERIZACIÓN FUNCIONAL DE LA PROTEÍNA EscN DEL SISTEMA

DE SECRECIÓN DE FACTORES DE VIRULENCIA DE Escherichia coli
ENTEROPATÓGENA
Andrade Torres, A., Espinosa Sánchez, N., Pérez Hernández, G†. y González-
Pedrajo, B.
Departamento de Genética Molecular, Instituto de Fisiología Celular, UNAM.
Ap. Postal 70-243, 04510 México, D.F. Tel: (5255) 5622-5965. Fax: (5255)
5622-5611. bpedrajo@ifc.unam.mx †Laboratorio de Fisicoquímica de Proteínas,
Departamento de Bioquímica, Facultad de Medicina, UNAM. Tel: (5255) 5623-
2275. gperez@bq.unam.mx

RESUMEN
Los sistemas de secreción tipo tres (SSTT) son utilizados por diferentes
bacterias patógenas Gram-negativas para introducir proteínas directamente
hasta el citosol eucarionte. Un componente general e indispensable en todos
los SSTT es una ATPasa, similar a la subunidad β de la F1 ATP sintasa. En el
presente trabajo, caracterizamos la actividad de ATPasa de la proteína EscN
del SSTT de Escherichia coli enteropatógena (EPEC), utilizando una versión
recombinante de EscN con una etiqueta de histidinas en el extremo amino
terminal. A su vez, evaluamos los cambios conformacionales por unión de
nucleótido siguiendo los espectros de emisión de fluorescencia de los residuos
de tirosina de EscN titulando con ATP y ADP. Los porcentajes de estructura
secundaria de la enzima se determinaron mediante dicroísmo circular.
Esperamos que el estudio detallado de esta enzima y sus interacciones nos
permita entender el mecanismo de acoplamiento de la energía de unión e
hidrólisis de ATP de EscN con el proceso de secreción de proteínas vía SSTT.

INTRODUCCIÓN
Escherichia coli enteropatógena (EPEC), es una bacteria Gram-negativa capaz
de adherirse a la superficie del epitelio intestinal humano provocando severos
cuadros de diarrea. En una primera etapa infecciosa EPEC destruye las
microvellosidades de los enterocitos. Posteriormente, utiliza una estructura
macromolecular de transporte de proteínas denominada sistema de secreción
tipo tres (SSTT), como una “jeringa molecular” para “inyectar” o translocar
diferentes proteínas efectoras al citoplasma de la célula hospedera. La
secreción de dichos factores de virulencia promueve la acumulación de actina
en la célula eucarionte, lo que altera la organización del citoesqueleto e induce
la formación de una estructura llamada pedestal. A este fenotipo característico
generado por EPEC se le conoce como lesión A/E o de "adherencia y
esfacelamiento" (1). Además, la infección por EPEC también conlleva
alteraciones en diferentes vías de transducción de señales, afectando diversas
funciones celulares del enterocito (2).
En EPEC, todos los genes necesarios para formar la lesión A/E se localizan
enuna isla de patogenicidad cromosomal de 35.6 kb denominada LEE (de sus
siglas en inglés locus of enterocyte effacement), que contiene 41 marcos de
lectura abiertos, organizados en 5 operones. En LEE se encuentran los genes
esc que codifican para las proteínas que forman el SSTT, así como los genes
que codifican para las proteínas efectoras que son secretadas y para sus
respectivas chaperonas, para las proteínas involucradas en la adherencia
íntima, para reguladores transcripcionales, y para algunas proteínas cuya
función aún se desconoce (3).
Además de su papel en la patogénesis, un SSTT también es utilizado para la
exportación de proteínas durante la biosíntesis flagelar (4). El aparato de
exportación flagelar está constituido por diez proteínas que se encuentran
conservadas en el sistema de secreción de factores de virulencia, y el
ensamblaje de ambas estructuras (el flagelo y el “inyectosoma”), requiere de la
energía de hidrólisis del ATP. Durante la biogénesis del flagelo, la ATPasa FliI
aporta la energía necesaria para la exportación de las proteínas flagelares (5).
En EPEC se sugiere que la proteína EscN cumple con dicha función para la
secreción de efectores, ya que presenta una alta similitud tanto a FliI (58% de
identidad), como a la subunidad catalítica β de la ATP sintasa de E. coli (39%),
así como con otras ATPasas de sistemas homólogos de secreción de factores
de virulencia en Salmonella y Yersinia (6,7).
Por otro lado, en el sistema flagelar se ha reportado que la proteína FliH forma
un complejo con FliI inhibiendo su actividad hidrolítica de ATPasa (8). En la isla
de patogenicidad LEE encontramos que el marco de lectura abierto orf5
codifica para una proteína con 18% de identidad a la proteína FliH de
Thermotoga maritima, lo que sugiere que el producto de orf5 puede ser el
regulador de la actividad de ATPasa en EPEC, y que el mecanismo de
regulación pudiera ser el mismo en ambos sistemas. Recientemente, Pallen et
al. (2005), establecieron una predicción semejante para Orf5, a través de un
análisis bioinformático del LEE de E. coli enterohemorrágica (EHEC) mediante
Psi-Blast (9).
Por otra parte, tanto la ATPasa flagelar, como algunas ATPasas de los
sistemas de virulencia participan en diversas interacciones proteína-proteína,
ya sea con otros componentes del SSTT, o con las proteínas efectoras que se
translocan y sus chaperonas (10, 11, 12, 13); lo que sugiere que estas enzimas
pueden también estar involucradas en el reconocimiento y dirección (“docking”)
de las proteínas a ser secretadas.
En los últimos años se ha logrado un gran avance en el entendimiento general
de la formación del SSTT y se sabe que la función de la ATPasa es
indispensable para el ensamblaje del sistema secretor y por lo tanto, para el
establecimiento de la infección. Sin embargo, se desconoce el mecanismo
mediante el que se da el acoplamiento energético en el evento de
translocación, así como el papel funcional de la mayoría de las proteínas del
aparato secretor. En este sentido, estamos interesados en determinar el papel
específico de EscN en la secreción y en discernir el mecanismo de regulación
de su actividad enzimática, para poder entender el cómo se cataliza, dirige y
regula la translocación de los sustratos, y el cómo ocurre el acoplamiento entre
la hidrólisis de ATP y la secreción. En este trabajo se presenta la
caracterización bioquímica de la ATPasa EscN, así como los avances que
hemos realizado en el estudio de su mecanismo de regulación.
MATERIALES Y MÉTODOS
Clonación. El gen escN se amplificó mediante PCR a partir de DNA
cromosomal de la cepa silvestre EPEC E2348/69, y se clonó como un
fragmento NdeI/BamHI dentro del sitio de clonación múltiple del plásmido
pET19b. Para producir la proteína recombinante con una secuencia de 10
histidinas en el extremo amino terminal, el plásmido resultante pAEescN
(pET19b-escN) se transformó en la cepa de E. coli BL21 (DE3) pLysS (BDP),
para su expresión.
Purificación de His-EscN. El cultivo de células BDP-pAEescN se creció en
medio Luria Broth (LB) con ampicilina (100 µg ml-1) a 30 °C, en agitación
constante. Al alcanzar una DO600 de 0.6 se indujo la sobrexpresión de escN
con IPTG (a una concentración final de 0.1 mM), y se continuó la incubación
por 4 h más. El cultivo se centrifugó y la pastilla se resuspendió en
amortiguador de unión (BB) (20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 500 mM NaCl). Las
células se rompieron por sonicación y el lisado se centrifugó (38,000 g 20 min)
para desechar las membranas y las células intactas. El sobrenadante se
ultracentrifugó (145,000 g 60 min), y se descartó la pastilla. El sobrenadante se
sometió a una cromatografía de afinidad por níquel, en una columna con 3 ml
de la resina Ni-NTA-agarosa (Qiagen) preequilibrada con amortiguador BB. La
columna se lavó exhaustivamente con 60 ml de amortiguador BB conteniendo
60 mM de imidazol, y la proteína recombinante se eluyó con un gradiente de
100-600 mM de imidazol en el mismo amortiguador. La pureza de la proteína
se verificó por electroforesis en geles de poliacrilamida al 15 % en presencia de
SDS (SDS-PAGE).
Actividad enzimática. La actividad de ATPasa de His-EscN se cuantificó
mediante una modificación del método de verde de malaquita (11). La enzima
se incubó en el siguiente amortiguador: 50 mM HEPES pH 8.0, 30 mM KCl, 30
mM NH4Cl, 1 mM DTT, 5 mM Mg[acetato]2 y 5 mg ml-1 BSA, en presencia de 4
mM ATP. A diferentes tiempos la reacción se detiene en presencia de ácido
cítrico. El fosfato inorgánico liberado por la reacción de ATPasa, acoplado a
molibdato, se determinó colorimétricamente.
Preparación de antisuero policlonal de conejo para EscN. Dos conejos
fueron inmunizados vía subcutánea en tres ocasiones diferentes con
preparaciones frescas de His-EscN purificada (~200-400 µg). Como control se
tomó una muestra de suero antes de la primera inmunización. Después del
sangrado a blanco de los conejos, el suero se separó del paquete celular por
centrifugación y se conservó en alícuotas a -70°C. La inmunodetección se
realizó con 1.2 µg de proteína purificada y transferida a una membrana de
nitrocelulosa (a través de un Western Blot), utilizando los reactivos de
detección por quimioluminiscencia de ECLTM (Amersham Biosciences).
Dicroísmo Circular (DC). El espectro de DC de His-EscN se obtuvo a 25 ºC en
amortiguador TNED (Tris-HCl 50mM pH 8.0, NaCl 100 mM, EDTA 0.1mM y
DTT 1mM). El intervalo de longitud de onda del espectro fue de 200 a 250 nm
en una celda de 0.1 cm.
Actividad de unión. La unión de ATP y ADP por parte de His-EscN se verificó
con ensayos de titulación siguiendo el cambio de fluorescencia de las 13
tirosinas intrínsecas de EscN. Para los ensayos se utilizaron 100 µg de His-
EscN en amortiguador TNED. La longitud de onda (λ) de excitación fue de 275
nm.
Modelos Estructurales. Los modelos estructurales de la proteína EscN se
generaron a partir de la secuencia de aminoácidos con el procedimiento
ROSETTA del Dr. Baker y colaboradores en el servidor web
http://depts.wshington.edu/bakerpg/decoys. Se obtuvieron seis modelos con
todos los átomos. El análisis de estructura secundaria se realizó con el
diccionario de estructura secundaria DSSP. La semejanza estructural entre los
modelos y entre proteínas homólogas se determinó evaluando la raíz de la
desviación cuadrática media de las posiciones de pares de átomos de los
carbones alfa del esqueleto polipeptídico con el algoritmo ProFit.

RESULTADOS
Purificación de EscN. Al separar las fracciones celulares durante la
purificación de His-EscN, ésta se encontró casi en su totalidad en la fracción
insoluble. Sin embargo, aproximadamente 10% de la proteína recombinante
permanece soluble (carril 2 y 7 de la Fig. 1), por lo que His-EscN se logró
purificar a partir de esta fracción mediante una cromatografía de afinidad por
níquel (Fig. 1). His-EscN muestra un peso molecular aparente de ~45 kDa en
SDS-PAGE, consistente con el peso predicho a partir de su secuencia primaria
de 48.8 kDa. La proteína muestra una pureza aproximada del 95% (con una
proteína contaminante de mayor peso molecular) y el rendimiento obtenido fue
de ~0.9 mg por cada 300 ml de cultivo.
La proteína His-EscN se utilizó para producir anticuerpos policlonales α-EscN
(Fig. 2). Los anticuerpos obtenidos serán utilizados posteriormente para
identificar posibles interacciones entre EscN y diferentes componentes del
SSTT de EPEC.

Fig.1. Purificación de EscN. 15% SDS-PAGE teñido con azul de Coomassie.

Carriles: 1, fracción insoluble obtenida después de la sonicación y centrifugación; 2,
fracción soluble utilizada en la purificación; 3, fracción no unida a la columna; 4, 5 y
6 fracciones de elución 150, 200 y 300 mM de imidazol respectivamente; 7,
inmunodetección de His-EscN en la fracción soluble con anticuerpo anti-histidinas
(Pierce) (α-His 1:10 000).

Fig. 2. Desarrollo de anticuerpos policlonales. En

ambos carriles 1.2 µg de His-EscN purificada.
Carril: 1, inmunodetección con el suero pre-
inmune (1:10 000); 2, inmunodetección con el
suero α-EscN (1:10 000).
EscN posee actividad de ATPasa. La caracterización de la actividad de
ATPasa de His-EscN se muestra en la figura 3. La actividad específica
calculada es de 0.26 µmolas de Pi hidrolizado min-1 mg-1 de proteína, similar a
la reportada para FliI (ATPasa flagelar) y para InvC (SSTT de Salmonella) de
0.2 y 0.25 µmolas de Pi hidrolizado min-1 mg-1 de proteína, respectivamente.
Adicionalmente, también se observó la actividad de ATPasa de EscN in situ en
un gel de poliacrilamida nativo incubado con ATP y Mg+2 y con una posterior
tinción con verde malaquita (dato no mostrado).
Para determinar si la actividad enzimática de EscN se ve afectada por la
formación de complejos cooperativos al aumentar su concentración,
analizamos la hidrólisis de ATP a diferentes concentraciones de enzima, en
una condición de ATP saturante (4 mM) (Fig. 3B). A las concentraciones
utilizadas de proteína (hasta 5 µg) la actividad de ATPasa es lineal y no se
observa un comportamiento de saturación.
Mediante cinéticas de actividad de ATPasa de His-EscN (Fig. 3C), calculamos
una Vmax de 0.64 µmolas de Pi hidrolizado min-1 mg-1 de proteína y una Km de
0.50 mM.

Fig. 3. Actividad ATPasa de EscN. Se utilizó

His-EscN purificada incubando con 4 mM
ATP y 5mM de Mg[acetato]2 a 37ºC . (A)
Hidrólisis de ATP en el curso del tiempo. (B)
Actividad dependiente de la concentración
de His-EscN. (C) Concentración de sustrato
requerida para la saturación de la enzima,
actividad ATPasa expresada como µmolas
Pi min-1mg-1 de EscN

Dicroísmo circular. Determinamos la estructura secundaria de His-EscN al

deconvolucionar los datos de DC con el software CDpro, del que se dedujo que
el estado plegado de la proteína presenta un contenido de estructura
secundaria de 20.9 % de α hélices, 42.5 % de láminas β y 37.6 % de estructura
no regular. Contenido típico de una proteína globular α/β.
Caracterización de la unión de nucleótido a EscN. Para diferentes proteínas
que unen ATP, adicionalmente a la energía de hidrólisis, se ha demostrado que
la energía de unión del nucleótido favorece cambios conformacionales
discretos que contribuyen a otro tipo de reacciones, como por ejemplo, la
cooperatividad catalítica en la ATP-sintasa. Dado que la energética que
involucra la unión de nucleótidos (ligando) a una proteína está directamente
relacionada con la afinidad de los mismos, realizamos titulaciones al equilibrio
del ATP y ADP con His-EscN, siguiendo la emisión de fluorescencia de sus
residuos de tirosina.
EscN cuenta con un solo residuo de triptofano y aparentemente éste se
encuentra expuesto al solvente, ya que su espectro de emisión al excitar a una
λ de 295 nm (longitud de onda a la cual emiten fluorescencia los Trp) se obtuvo
una baja señal de fluorescencia. Además, al probar diferentes lotes de His-
EscN observamos que la proteína contaminante que se copurifica interfiere de
manera significativa con la señal de fluorescencia del triptofano.
Los espectros de emisión de His-EscN obtenidos al excitar a una λ de 275 nm
(longitud de onda a la cual emiten fluorescencia las tirosinas), aunque definen
mejor la señal de fluorescencia intrínseca de la proteína, los aminoácidos
aromáticos de la proteína copurificada, participan en la fluorescencia total. Los
siguientes resultados aparentes se obtuvieron siguiendo la señal de las
tirosinas.
Observamos que a una concentración de 1 mM de ATP ó ADP se obtiene un
apagamiento cercano al 98% de la fluorescencia intrínseca de His-EscN (Fig.
4). Este experimento sugiere que el cambio en la señal se debe principalmente
a cambios conformacionales que ocurren por la unión de nucleótido en el sitio
activo, como se ha ilustrado para otras ATPasas. Por otra parte, la magnitud de
apagamiento de la señal de fluorescencia a 306 nm (máximo de emisión para
una proteína que sólo contiene tirosinas), muestra que la señal de la proteína
copurificada no participa en la unión de nucleótido.
Para el análisis de las constantes de unión aparente los datos de las
titulaciones con ATP o ADP se ajustaron con un modelo de sitios de unión
independientes (Tabla 1).

Fig. 4. Apagamiento de la fluorescencia intrínseca de His-EscN titulando con

ATP y ADP. En ambos casos fueron utilizados 100 µg de proteína purificada
en amortiguador TNED.
 ATP ADP
n* 1 1
Kdap (µM) 120 80
∆Gap (kcal mol-1) - 5.66 - 5.41

Tabla. 1. Constantes de disociación y energética de asociación aparente de

EscN con ATP y ADP. * n es la estequiometría de unión.

Modelos Estructurales. Para un mejor entendimiento de la función de EscN a

nivel molecular, se obtuvieron 6 modelos con el algoritmo ROSETTA. En una
representación gráfica de las coordenadas de los modelos, las diferencias se
dan principalmente en la zona del amino terminal, en los primeros 50 residuos.
Con la comparación de secuencias de EscN observamos que el amino terminal
no presenta similitud con las secuencias de otras ATPasas descritas. Es
importante destacar que cuando no existe una secuencia similar, ROSETTA
realiza una predicción de novo a partir de librerías de rotámeros y sometiendo a
pasos de minimización de energía. Sin embargo, se ha reportado que tal
procedimiento suele no ser suficiente para obtener un modelo adecuado, por lo
que se requiere un refinamiento adicional. No obstante, al comparar con las
estructuras reportadas de la subunidad β de la ATP sintasa, existe una buena
predicción del sitio de unión de ATP, que está de acuerdo con los resultados
experimentales descritos anteriormente. Un mejor refinamiento del modelo nos
dará pauta para poder establecer posibles relaciones estructura-función de
EscN.

Referencias
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13. Thomas, J. Stafford, G.P. and Hughes, C. (2004) PNAS 101:3945-3950.

Agradecimientos
Agradecemos el apoyo brindado por el Dr. Georges Dreyfus y por todos los
integrantes de su laboratorio, en particular por la ayuda técnica de la QFB
Teresa Ballado y el Q Javier de la Mora; así como la ayuda del Dr. Diego
González-Halphen en la elaboración de los modelos estructurales. El trabajo de
investigación que se realiza en el laboratorio cuenta con el apoyo financiero de
los donativos P46551-Q de CONACyT e IN217105 de la DGAPA.