La elución isocrática se lleva a cabo con un único disolvente (o una mezcla de disolventes
fija). Si un disolvente no permite una elución suficientemente rápida de todos los componentes,
se puede usar una elución gradiente. En este caso, se van añadiendo cantidades crecientes del
disolvente B al disolvente A, produciendo un gradiente continuo.
Figura 1. Las moléculas del disolvente y las moléculas del soluto compiten entre sí en su reacción
con los puntos activos de la fase estacionaria. Cuanto mayor es la fuerza del eluyente, más
fácilmente se desplaza el soluto.
Isocrática
separación
En gradiente
gases disueltos, ya que estos pueden provocar serios problemas por formación de
Cromatograf
ía de afinidad
La
fijación de ligandos. Los ligandos de afinidad son moléculas poliméricas que sirven de
soporte porque
Estos ligandos se
esta última se clasifica en ligandos específicos (anticuerpos) y generales (como las lecitinas).
Cuando las
que contiene ligando libre. Después se introduce una nueva fase móvil que se desactiva,
generalmente
se
necesita un cambio en el pH, la fuerza iónica o la polaridad, debido a que estas condiciones
modifican
las características de los sitios activos, la finalidad de este proceso es hacer fluir a la
proteína para
matográfica.
proteínas afines a la columna, para ello, emplea sistemas de baja presión, columnas cortas y un
campo
. Cromatografía de afinidad
Este tipo de cromatografía utiliza interacciones altamente específicas entre un tipo de moléculas
de soluto y una segunda molécula unida covalentemente (inmovilizada) a la fase estacionaria. Por
ejemplo, la molécula inmovilizada podría ser un anticuerpo específico para un proteína particular.
Cuando una mezcla cruda que contiene miles de proteínas se pasa a través de una columna, sólo
una proteína reacciona con el anticuerpo que está unido a la columna. Después de lavar todos los
Las interacciones entre las moléculas del ligando y blanco pueden ser el resultado de
interacciones hidrofóbicas o interacciones electrostáticas, fuerzas de van der Waals y/o puentes
de hidrógeno.
La purificación por afinidad requiere un ligando bioespecífico que puede ser unido
específica de enlace hacia las moléculas blanco, y después de lavar el material no unido, la unión
entre la molécula blanco y el ligando debe ser reversible y permitir que las moléculas blanco sean
removidas en forma activa. Cualquier componente puede ser usado como un ligando para
¸ Ác. Nucleico- secuencia base complementaria, histonas, polimerasa de ácidos nucleicos, proteína
de unión al DNA.
¸ Iones metálicos- proteínas de fusión poli (his), proteínas nativas con histidina,
La matriz. Es un soporte inerte al cual un ligando puede ser directa o indirectamente acoplado.
¸ los grupos hidroxilo en los residuos de azúcar pueden servir para unirse a un ligando,
¸ la estructura de poro abierta asegura una capacidad de unión alta, aún para biomoléculas
La selección del ligando para cromatografía de afinidad está influenciado por dos factores:
El ligando debe presentar una afinidad de unión específica y reversible para la sustancia blanco y
debe tener grupos químicamente modificables que permitan ser unidos a la matriz sin destruir su
capacidad de unión.
Brazo espaciador. El sitio de unión de una proteína blanco a menudo se localizan dentro de la
columna puede exhibir una capacidad de unión baja debido a interferencias estéricas, por
circunstancias un brazo espaciador se pone entre la matriz y el ligando para facilitar la unión
específica. El brazo espaciador puede ser diseñado para máximar la unión específica.
Referencias
http://www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/met/Cromatografia.pdf
http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/M.Cromatogrficos_6700.pdf
http://www4.ujaen.es/~mjayora/docencia_archivos/Quimica%20analitica%20ambiental/Tema6.p
df