OȚINEREA DE CULTURI STARTER DE BACTERII ȘI

DROJDII; ANALIZE PROBIOTICE ȘI EFECT KILLER

Autori: Neculai Bogdan, Mareș Andrei, Pristvu Mircea

Universitatea de Științe Agronomice și Medicină Veterinară București, Facultatea de

Biotehnologii, Bd. Mărăşti, nr. 59, 011464 București, România

Email-ul autorului: bogdan.neculai24@yhaoo.com

Cuvinte cheie: Bacterii, Drojdii, Killer;

Abstract:
Viitorul este inevitabil , iar schimbările sunt necesare. Microbiologia reprezintă una
dintre cheiile evoluției, așa cum probioticele , organisme vii, sunt benefice asupra sănătății
gazdei, dar și drojdiile ce dezvoltă toxine ce pot îmbunătății calitatea produselor din industria
alimentară.
Lucrarea noasră pune accent pe mai multe analize în ceeea ce privește proprietățile
bacteriilor și drojdiilor în vederea posibilității obținerii unei culturi starter. Analizele nostre se
vor baza pe mai multe teste : izolare de drojdii(de pe fructe de pădure) și bacterii(din
Kombucha),activitatea microbiană a drojdiilor, , testarea rezistenței tulpinilor la factorul killer,
testarea efectului killer a tulpinei de interes asupra unei tulpini sensibile, toleranța la pH scăzut
și toleranța la săruri biliare.

1|Page
INTRODUCERE & Makower(1963) ,care au descries cum
tulpinile pot f i clasificate în unul dintre cele
Ca și cultură starter înțelegem o cultură trei tipuri de fenotip, și anume killer,
de microorganisme special selecționată în sensibilă și neutru. Atunci cand celulele
vederea obținerii unor rezultate superioare în killer și cele sensibile cresc împreuna pe
industria alimentară, cum ar fi durata de același mediu, o mare propoție este
depozitare, criteriile de fezabilitate distrusă. Celulele neutre fie distrug celulele
economică și eficacitatea tehnologică sensibile , fie sunt distruse de celulele cu
(Mayo, 2006) efect killer. Agentul eliberat de către
Probioticele sunt utilizate în general ca și celulele killer , care este răspunzător pentru
suplimente alimentare ce îmbunătățesc și moartea celulelor sensibile a fost numit
echilibrează microflora intestinală a gazdei. factorul killer. Studiile au demonstrate că
Efecte benefice au fost raportate la mai această toxină este un compus proteic , ce
multe tipuri de animale(păsaări,bovine etc), depinde de condiții specific de pH,
cum ar fi o creșterea mai rapidă a temperatură și aerare(Jacob & Wollman,
animalului, producție de lapte și de ouă mai 1959). Utilizarea tulpinilor de drojdie , ce
mari. Probiotice folosite la animale prezintă efect killer are multiple beneficii;
Carnobacterium, Tetragenococcus, în eneologie previne contaminarea și duce
Vagococcus, Weissella, Lactobacillus, la obținerea unui produs de calitate
Bifidobacterium, Bacillus, Streptococcus, superioră(Fleet și Heard,1993 & Zagorct
Pediococcus, Enterococcus și drojdii cum ar ,2001).
fi Saccharomyces cerevisiae și
Saccharomyces boulardii(Fuller,1992 & MATERIALE ȘI METOD
Ahmed, 2003). Acestea se pot găsi în
diferite habitate cum ar fi sol, ape, tractul Pentru a realiza experimentele propuse,
gastro-intestinul uman și animal , dar și în s-au utilizat probe de bacterii provenite din
mâncare și produse fermentate (Holzapfel et Kombucha și drojdii izolate de pe fructe de
al., 2001; Zacharof and Lovitt, 2012). pădure autohtone, iar ca materiale utilizate
Efectul killer în drojdii, Saccharomyces în realizarea experimentelor, s-au folosit:
cerevisiae , a fost descoperit de către Bevan apă distilată, anse sterile, eprubete,

2|Page
micropipetă,soluție Lugol, amestec alcool- Tulpina de colecție, ATCC 8739 de E. coli ,
acetonă, fuxină, stativ, plăci Petri, este însămânțată prin metoda în pânză( în
microscop, lamă Thoma, lamă, lamelă, gazon) pe mediu MRS. Din tulpinile izolate
tubușoare Durham, pahare Erlenmayer, este preluat câte 5 µL , din S1, S2, S3 și
tuburi Eppendorf. adăugat pe placă, împreună cu o probă de
tatraciclină ; placa este pusă la incubare la
Pentru drojdii s-a examinat în primul temperatura de 37 °C. Dacă se formează
rând caracteristicile culturii, apoi preparatul halouri = inhibiție.
proaspăt, urmând a fi trecută în colecție , în Sensibilitatea la antibiotice a
eprubetă pe mediu înlcinat. Proba folosită probioticelor - Însămânțarea se va realiza
Methschnikowia(MUCL), iar mediul folosit pe MRS agar, unde se adugă antibiotice ,
este YPG. Moldamin(MOL),Penicilină (PEN), Pamecil
(Pam) și incubare la 37 °C timp de 24 h.
Fig.1 Probă drojfdie
MUCL
Testarea bacteriocinelor -
Bacteriocinele reprezintă proteine de
dimensiuni mici cu efect de bactericid cu
Pentru bacterii a fost folosită o bacterie
efect asupra speciilor înrudite.
microaerofilă ( se dezvoltă la nivel scăzut de
oxigen) F1. Pentru acest experiment se Metoda se bazează pe centrifugarea a 5
utilizează metoda incorporării pe mediu mL de probă, în tubușor eppendorf , la 5.000
MRS agar , de asemenea și colorație gram . rpm timp de 10 min. Următoarea etapă este
cea de verificare a pH-ului deținut de
supernatant și neutrlizarea cu NaOH 40%
( inactivarea acizilor organici și aducerea la
pH neutru).

Se însămânțează câte 3 µL de
Fig.2 Probă bacterie lactică F1
supernantant , din fiecare tulpină în placă cu
mediu MRS, slab agarizat 1%, și se lasă la
Determinarea activității antimicrobiene -
uscat. Se adaugă o tulpină sensibilă S.

3|Page
thermophilus , 1 mL . Perioadă de incubare
24h la temp de 37 °C .
DROJDII
Activitatea antibacteriană – Acest
experiment se realizează prin însamânțarea
în linie a unei tulpini de drojdie pe placă
(drojdia noastră CA2) pentru a elibera
compuși bioactivi. Timp 72h la temp de 24
°C.
Testarea rezistenței tulpinilor de anliză
la factorul Killer - Caracterul killer
reprezintă o toxină eliberată de anumite
drojdii , care se atașeză la alte tupini ce nu
eliberează acestă toxină.
Tulpinile 9744 C, 1070/C, X208, D585 C
sunt de tip K1, mai precis tulpini de
Saccharomyces cerevisiae; tulpinile 17/17 și
9MR4 sunt de tip K2 , tulpini de interes
industrial. Tulpina de interes este
însămânțată prin inundare și prin preluare de
surplus. Folosim tehnica inundării, 1mL
probă CA2. Timp 72 h și
27 °C.
 Dacă tulpina de interes este sensibilă,
acesta formează un halou în jurul
tulpinii Killer, tulpina fiind distrusă.
 Dacă tulpina de interes nu formează
halou , înseamnă că este neutră , de o
culoare alb-albastruie.
 Dacă tulpina este sensibilă este de un
albastru intens ,înseamnă că tulpina
de interes prezintă compuși ce
omoară tulpina sensibilă.
Testarea efectului killer a tulpinei de
interes asupra unei tulpini sensibile - Se
introduce o tulpina sensibilă prin tehnica
inundării ,17/17, întru-un mediu special
pentru caracterul Killer, fromat din extract
de drojdii 1%, peptonă 1%, glucoză 2%, apă
2% și albastru de metilen 0,03%; totul se
dizolvă in tampon citrat-fosfat pH=4,8
(soluția A de ac. citric 0,1M- se câtărește
21,01 g/L și soluția B de fosfat disodic 0,1
M – se cântărește 135,61 g/L ; sol A 53,8
mL + 46,2 mL=100 mL).

Fig.3 Analiză factor

Killer

Fig.4 Tetare efect killer

asupra unei tulpini de interes

4|Page
BACTERII REZULTATE ȘI DISCUȚII

Toleranța la săruri biliare - Se 1. Examinarea caracterelor de

cultură- tulpina Metschnikowia și
utilizează mediul MRS Broth , 10 mL.
bacteriei lactice
Soluție stoc 30%, cu un volum inițial de
Momentul apariției- 30 h; gradul de
Săruri biliare 1,10 mL (Ci*Vi=Cf*Vf ).
creștere – excesiv,aspectul traseului- gros
Rezistența la săruri biliare se determină prin și umed. Celulele au formă sferică si
spectofotometrie sau prin UFC transparentă.
(T0...T1...T2......T24). Dacă densitatea
optică crește cu 0,3 , atunci ea prezintă
toleranță.

Toleranța la pH scăzut – Pentru această

etapăvom folosi o cultură proaspătă (16h) 5
mL ,proba S1. 1mL este centrifugat la 6000
Fig.5 caracterele tulpinii MUCL
rpm, timp de 5 minute, urmând ca
Celulele bacteriei F1 s-au colorat roz-violet
sendimentul să i se aduge 1 mL NaCl
astfel, bacteriile se încadrează tipul
(0,9%) și se face o a doua centrifugare tot la
bacteriilor Gram +.
6000 rpm timp de 5 minute >>>
resuspendare finală în 0,9% NaCl. Tampon
PBS suplimentar cu 3 g/L pepsină format
din :NaCl 8g, KCl 0,2 g, Fosfat disodic 1,44
g și fosfat monopotasic 0,24 g – pentru 1 mL
de probă , cu pH final de 2,5(autovlavare).
Se sterili prin filtrare pepsina (soluție stoc
10%). Ci*Vi=Cf*Vf Vi= 0,46. Finalul
Fig.6 Bacterii lactice –tulpina F1,
acestei metode se va termina utilizând
colorație gram-microscop
tehnica în gazon , înainte fiind realizate 5
diluții.

5|Page

2. Determinarea amtimicrobiene a
bacteriilor lactice
Se observă în jurul antibioticului
halourile formate, ceea ce indică că tulpina
de interes este sensibilă la antibioticul
folosit.
Fig. 8 Sensibilitatea la antibiotice
4. Determinarea bateriocinelor-
Rezultatele obtinute la această metodă nu
sunt cele dorite.
5. Activitatea microbiană a drojdiilor
Tulpina CA2 nu prezintă activitate
antimicrobiană, deoarece nu s-a format
halou în jurul tulpinii.

Fig.7 Determinarea amtimicrobiene a

bacteriilor lactice
Fig.9 Activitate microbină- drojdii

3. Sensibilitatea la antibiotice a
probioticelor 6. Testarea tulpinilor la factorul

Antibiotic Halou Killer – această metodă nu a descurs

favorabil și rezultatele nu sunt cele
Moldamin 2,4 cm
dorite
Penicilină 3,7 cm
7. Testarea efectului killer a tulpinii
Pamecil 2,5 cm
de interes asupra unei tulpini
Tabel 1 – dimensiuni halou
sensibile – de asemenea acest

6|Page
 experiment nu a avut rezultate dorite. Timp Diluție UFC
T0 10-1 18*10
T0 10-5 354*106

Tabel. 2 - UFC

Fig. 10 Factor kille

Fig.11 Efectul killer

8. Toleranța la săruri biliare

Citirea la spectofotometru din proba inițială
S1 DO600nm a fost 0,408ș dupa 4 ore, la a Fig.12 Teoleranță pH –

doua citire rezultatul a fost 1,245, ceea ce UFC

înseamnă că DO a crescut cu peste 0,3. În

concluzie proba S1 are toleranță la săruri REFERINȚE

biliare. 1. Fuller, R. (Ed.), 1992. Probiotics:

9. Toleranța la pH scăzut The Scientific Basis. Chapman and

Hall, London;
2. JACOB, F. & WOLLMAN,
E.(1959). Colicins and other

7|Page
 bacteriocins. In Bacteriophages. Ed. Food Microbiology, Volume 18,
by M. H. Adams. New York: Issue 4, Pages 441-451, (2001).
Interscience Publishers Inc; 8. Mohammed Salim Ammor , Baltasar
3. Holzapfel, W.H., Haberer, P., Mayo (2006). Selection criteria for
Geisen, R., Björkroth, J., Schillinger, lactic acid bacteria to be used as
U., 2001. Taxonomy and important functional starter cultures in dry
features of probiotic microorganisms sausage production: An update.
in food and nutrition. Am. J. Clin. Instituto de Productos Lácteos de
Nutr. 73 (Suppl.), 365S–373S. Asturias (CSIC), Carretera de
4. García-Hernández, Y., Rodríguez, InWesto s/n, 33300 Villaviciosa,
Z., Brandão, L.R., Rosa, C.A., Asturias, Spain.
Nicoli, J.R., Elías, A., PérezSánchez,
T., Boucourt, R., Halaihel, N., 2012.
Identification and in vitro screening
of avian yeast for use as probiotic.
Res. Vet. Sci. 93, 798–802.
5. Ahmed, F.E., 2003. Genetically
modified probiotics in foods. Trends
Biotechnol. 21, 491–497.
6. . FLEET, G.H. AND HEARD, G.M.
Yeasts: growth during fermentation
In: Wine Microbiology and
Biotechnology, Harwood Academic
Publishers, Chur, Switzerland,
pp.27–55. (1993).
7. . ZAGORCT. , A. MARÁZ, N.
CADEZ, K.POVHE JEMEC, G.
PÉTER, M. RESNIK, J. NEMANIČ,
P. RASPOR, Indigenous wine killer
yeasts and their application as a
starter culture in wine fermentation,

8|Page