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Metodologia de análise Hidroximetilfurfural (HMF)

O HMF é determinado após clarificação das amostras com os reagentes de


Carrez (I e II) e adição de bissulfito de sódio (AOAC Método Oficial 980.23;
ZAPPALLÁ et al., 2005).

As soluções utilizadas na análise de hidroximetilfurfural são:


a) Solução de Carrez (I): 15 g de K4Fe(CN)6.3H2O foram solubilizadas em 100
mLde água deionizada;
b) Solução Carrez (II): 30 g Zn(CH3COO)2.2H2O foram dissolvidas em 100 mL
de água deionizada;
c) Solução de bissulfito de sódio 0,2% (m/v): 0,20 g de NaHSO 3 foram
solubilizadas em 100 mL de H2O. Esta solução foi preparada no momento da
análise.

Determinação:
Na determinação de HMF nas amostras de méis são pesadas 5 g de cada
amostra em um béquer e depois transferidas para um balão volumétrico de
50 mL. Em seguida acrescenta 25 mL de água, 0,5 mL da solução de Carrez I e
0,5 mL da solução de Carrez II. A solução resultante é homogeneizada e aferida
para 50 mL com água deionizada e finalmente filtrada em papel de filtro
Whatman nº 1. Os primeiros 10 mL do filtrado são desprezados.
O HMF foi determinado nos méis por espectrofotometria utilizando quatro tubos
de ensaios: No primeiro tubo, foram adicionados 5 mL da solução filtrada e 5 mL
da solução de bissulfito de sódio 0,2% (m/v), sendo este tubo considerado como
referência. Nos demais são adicionados 5mL do filtrado e 5 mL de água
deionizada, sendo denominadas de soluções teste.
As absorbâncias são determinadas nos comprimentos de ondas 284 e 336 nm
em um espectrofotômetro UV-VIS e então aplicadas na seguinte fórmula:

(𝐴284 − 𝐴336 ) × 14,97 × 5


𝐻𝑀𝐹(𝑚𝑔⁄100 𝑔 𝑑𝑒 𝑚𝑒𝑙 ) =
𝑔 𝑑𝑒 𝑎𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎

De acordo com Brasil (2000) é considerado como parâmetros de qualidade o mel


que tenha no máximo 60 mg/kg de HMF, sendo que para Codex (2001) os teores
podem atingir no máximo 80 mg/kg em regiões tropicais.

Metodologia de análise Atividade diastásica


Este método utiliza a leitura em espectrofotômetro, através da descoloração de
uma solução de amido, iodo e mel em condições controladas. Quanto mais
rápida a descoloração, maior a atividade diastásica da amostra, expressa
emunidade da escala de Gothe ou Schade por grama de mel. A unidade Gothe
é definida como a quantidade de enzima capaz de converter 0,01 g de amido em
1,0 h a 40 °C.

As soluções usadas para se executar o método são:


a) Solução padrão de iodo: Em um balão volumétrico dissolver 2,2 g de iodeto
de potássio e em seguida acrescentar à solução 0,88 g de iodo resublimado. O
balão volumétrico deve ser aferido para 100 mL com água deionizada.
b) Solução “trabalho” de iodo (0,02 M): Um volume de 29,41 mL da solução (a)
é diluída com água deionizada até o volume de 50 mL (preparado no momento
da análise).
c) Solução tampão de acetato de sódio 1,59 M (pH 5,3): Em um balão
volumétrico de 500 mL foi dissolver 87 g de NaOAc.3H2O em 400 mL de água,
e em seguida será adicionado 10,5 mL de ácido acético (HOAc). Aferir para 500
mL. Ajustar o pH para 5,3 com ácido cético, conservado sob refrigeração a 5 ºC.
d) Solução de cloreto de sódio 0,1 M.
e) Solução de amido 1% (m/v): suspender 1 g de amido em 70 mL de água. A
suspensão obtida deve ser aquecida a 70 ºC, sob agitação constante, e
posteriormente aferida para 100 mL com água deionizada.

Determinação da atividade diastásica na solução de amostra de mel:


Pesar 5 g de mel e em seguida misturar com 20 mL de água deionizada.
O pH da solução deve ser corrigido (se necessário) para 5,3 com NaOH e então
aferida para 50 mL.
Em um tudo de ensaio adicionar 5mL da solução de mel, 500 μL do
tampão acetato, 500 μL da solução de cloreto de sódio 0,1 M, 150 μL de solução
de iodo 0,02 M e 9,6 mL de água deionizada. É essencial que a solução de mel
esteja tamponada antes do contato com o cloreto de sódio, pois em pH abaixo
de 4 a atividade diastásica é inibida.
Por fim adicionar 250 μL da solução de amido 1% (m/v) e cronometrado o
tempo, agitando-se a solução até a completa homogeneização. A absorbância
da solução é medida imediatamente a 660 nm no espectrofotômetro. Água
deionizada é utilizada como branco.
Durante o procedimento de leitura, o tubo com a solução permanece em banho-
maria a 40 °C ± 1 °C.
Realizar leituras periódicas de absorbância, conforme a Tabela 1 retornando
sempre o tubo ao banho-maria, atéatingir um valor inferior a absorbância de
0,235. Atingindo esse valor, a contagem do tempo no cronômetro é interrompida,
sendo o tempo transcorrido registrado e calculado na fórmula a atividade
diastásica.

Tabela 1: Valores de absorbância e intervalos de tempo para leitura, conforme


Bogdanov (2002)

Quantificação da atividade diastásica na solução de mel


A quantificação da atividade diastásica é realizada através de cálculo. A qual se
encontra através do tempo em que se alcança a absorbância inferior a 0,235. O
tempo alcançado é divido por 300 para obter a atividade de diástase (DN).

DN = 300
tx
tx = tempo de reação em minutos
De acordo com a legislação vigente estabelecida pelo Ministério da Agricultura
e do Abastecimento (BRASIL, 2000) o valor mínimo da atividade diastásica no
mel é de 8na escala de Göthe e os méis com baixo conteúdo enzimático deverão
ter no mínimo uma atividade diastásica correspondente a 3 da escala de Göthe,
sempre que o conteúdo de hidroximetilfurfural não exceda a 15 mg/kg.