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UNIVERSIDAD NACIONAL PEDRO RUIZ GALLO

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS


DEPARTAMENTO ACADÉMICO DE MICROBIOLOGÍA Y
PARASITOLOGÍA

Manual de Prácticas de
Microbiología Industrial

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PRÁCTICA I
BIOSEGURIDAD

La bioseguridad es una doctrina de comportamiento encaminada a lograr actitudes y


conductas que disminuyen el riesgo del trabajador. Es un conjunto de medidas preventivas
destinadas a mantener el control de factores de riesgo laboral, procedente de agentes biológicos,
físicos o químicos, logrando la prevención de impactos nocivos, asegurando que el desarrollo o
producto final de los procedimientos no atenten contra la salud y seguridad de trabajadores,
visitantes y medio ambiente. El conocimiento y la aplicación adecuada de normas de
bioseguridad así como la importancia de estas normas antes, durante y después de cada
práctica es un deber de cada estudiante en el laboratorio donde se esté desenvolviendo.

Todos los establecimientos laborales, incluyendo los laboratorios de análisis,


investigación y demás, necesitan tener una serie de normas para llevar un desempeño seguro y
garantizar resultados exitosos. Las normas generales son:
 El acceso al laboratorio estará limitado solo al personal autorizado.
 El personal que trabaje en el laboratorio debe cumplir a cabalidad las normas de
bioseguridad.
 Toda área debe estar marcada con la respectiva señal de riesgo biológico y su nivel de
contención.
 Al ingresar al laboratorio se debe tener en cuenta el debido porte de la bata manga larga,
abotonada y limpia, así mismo una vez se ingrese se debe colocar los abrigos libros y
demás objetos, en sitios adecuados para evitar un posible accidente y nunca sobre los
bancos o mesas.
 Las puertas y ventanas deben permanecer cerradas durante la sesión de laboratorio para
evitar la contaminación por corrientes de aire.
 Al inicio y término de una práctica se debe limpiar la superficie de trabajo con una
solución desinfectante.
 El laboratorio debe permanecer limpio y ordenado, durante el trabajo o el término del
mismo.
 Se deben lavar las manos al inicio y al término de cada sesión de trabajo, secándolas
posteriormente con toallas de papel.
 Se deberán usar todos los implementos necesarios para la protección según el nivel de
riesgo biológico.
 Durante la práctica no se deben guardar ni consumir alimentos y bebidas.

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 Se debe colocar un calzado adecuado para las prácticas en el laboratorio, así como
mantener las uñas cortas, limpias y sin esmalte.
 Utilizar los equipos según las instrucciones o los procedimientos operativos
estandarizados.
 Realizar el trasporte de materiales o de muestras de manera tal que en caso de caídas no
se produzca salpicadura.
 Todo personal debe poner especial cuidado en evitar el contacto con materiales
potencialmente infecciosos sin la debida protección.
 Los derrames y accidentes deben ser informados inmediatamente el supervisor de
laboratorio.
 Utilizar máscaras faciales si existe el riesgo de salpicaduras o aerosoles.
 Apagar los instrumentos eléctricos antes de manipular las conexiones.

Figura 1.1. Algunos símbolos de bioseguridad presentes en el laboratorio y su significado.

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1. Principios básicos de bioseguridad
El término contención se utiliza para describir métodos seguros para manejar materiales
infecciosos en el ambiente de laboratorio donde son manipulados o conservados. El objetivo de
la contención es reducir o eliminar la exposición de quienes trabajan en laboratorios, de otras
personas y del medio ambiente externo a agentes potencialmente peligrosos.

1.1 Niveles de contención


El elemento más importante de la contención es el cumplimiento estricto de las
prácticas y técnicas microbiológicas de procesamiento de las muestras de laboratorio. Cuando
las prácticas de laboratorio no son suficientes para controlar los riesgos asociados a un agente o
un procedimiento de laboratorio en particular, es necesario aplicar medidas adicionales. Estas
medidas adicionales corresponden a los equipos de seguridad diseñados para la protección del
personal y las prácticas de manejo (barrera primaria), así como el diseño de instalación y
características de ingeniería adecuados (barrera secundaria).
1.2 Barreras primarias
Constituyen la primera línea de defensa cuando se manipulan materiales biológicos,
químicos o físicos. Se considera que las barreras de protección primaria son: equipos de
protección personal (guantes, mascarillas, mandiles); cabinas de seguridad biológica (con
barreras de aire, que permiten que éste fluya en una sola dirección y a una velocidad constante
originando el flujo de aire laminar o flujo con ausencia de turbulencias y con filtros, que
atrapan las partículas contenidas en el flujo de aire); normas de higiene personal;
inmunización (vacunación); desinfección (alcohol, compuestos fenólicos, hipocloritos) y
esterilización (calor húmedo, calor seco) de instrumentos y superficies. Principalmente se busca
la protección del personal presente en un ambiente frente a los agentes infecciosos o productos
químicos de riesgo. Seguridad.
1.3 Barreras secundarias
El diseño y construcción de un laboratorio se conoce como contención o barrera
secundaria, contribuye a la protección del personal del laboratorio así como el que se localiza
fuera del laboratorio y personas de la comunidad en general, frente a posibles escapes
accidentales de agentes infecciosos. Se incluye la localización del laboratorio fuera del área de
tránsito, acceso restringido al personal autorizado con puerta cerrada con llave ( nivel 2) o doble
puerta ( nivel 3), presencia de lavamanos, duchas de emergencia, mesas de trabajo resistentes al
calor moderado, ácidos y álcalis, áreas con la señal de riesgo biológico y su nivel de contención,
tratamiento de residuos o transporte en envases sellados, servicios auxiliares de gas, aire y
eléctrico de fácil acceso.

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2. Clasificación de los agentes biológicos por grupo de riesgo
2.1 Agentes biológicos del grupo 1
Es poco probable que causen enfermedad en los humanos, no se les conoce factores de
virulencia y pueden tener susceptibilidad conocida y estable a los antimicrobianos. Ejemplo:
Escherichia coli K12, Saccharomyces cerevisiae, microorganismos que se utilizan en la
elaboración de quesos, embutidos, entre otros.

2.2 Agentes biológicos del grupo 2


Pueden causar enfermedad en el hombre, es poco probable que se propaguen a la
colectividad y generalmente existe profilaxis o tratamiento eficaz. Algunos de estos agentes
pertenecen a la biota habitual del hombre, siendo capaces de originar una patología infecciosa
de gravedad moderada o limitada. Ejemplo: Staphylococcus epidermidis, Salmonella spp., entre
otros.
2.3 Agentes biológicos del grupo 3
Pueden causar una enfermedad grave en el hombre y presentan un serio peligro para los
trabajadores, con riesgo de que se propaguen a la colectividad; sin embargo, existe
generalmente profilaxis o tratamiento eficaz. Implican patología grave, de difícil y largo
tratamiento, pueden curar con secuelas y ocasionalmente producen la muerte. El mayor y más
frecuente peligro es la infección adquirida a través de aerosoles y por fluidos biológicos.
Ejemplo: Mycobacterium. tuberculosis, Brucella sp., Coxiella burneti, entre otros.
2.4 Agentes biológicos del grupo 4
Son aquéllos que causan una enfermedad grave en el hombre y suponen un serio
peligro para los trabajadores, con muchas probabilidades de que se propaguen a la colectividad
y sin que exista generalmente profilaxis o tratamiento eficaz. Normalmente son
microorganismos de dosis infectiva baja y alta contagiosidad. Ejemplo: virus Ebola, Hantavirus,
etc.

3. Niveles de bioseguridad para los laboratorios


Se consideran cuatro niveles de contención o de seguridad biológica, que consisten en la
combinación, en menor o mayor grado, de los tres elementos de seguridad biológica descritos:
técnicas de laboratorio, equipos de seguridad y diseño arquitectónico de las instalaciones del
laboratorio. Cada combinación está específicamente dirigida al tipo de actividades que se
realizan, las vías de transmisión de los agentes infecciosos y la función o actividad el
laboratorio. De forma general, los cuatro niveles de bioseguridad definen la contención
necesaria para proteger al personal y al ambiente.

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3.1 Nivel de bioseguridad 1
Es el nivel de seguridad requerido para trabajar con agentes biológicos del grupo de
riesgo 1. Es utilizado habitualmente en los laboratorios de prácticas de universidades o centros
de enseñanza donde se emplean microorganismos no patógenos.
3.2 Nivel de bioseguridad 2
Es el nivel obligado para trabajar con agentes del grupo de riesgo 2. Considera personal
especializado para el manejo de éstos microorganismos y corresponde a algunos laboratorios de
microbiología clínica y de control de calidad sanitaria (técnicos de laboratorio, especialistas en
microbiología).
3.3 Nivel de bioseguridad 3
Debe utilizarse cuando se manipulan agentes biológicos del grupo de riesgo 3. El
material biológico sólo puede ser procesado por personal calificado y en una zona con
infraestructura apropiada para el nivel de contención 3, es decir, con aire acondicionado
independiente, sin recirculación de aire, con gradiente de presión, cabinas de bioseguridad, entre
otras características; correspondiendo a algunos laboratorios de microbiología clínica, de
producción de biológicos y de control de calidad sanitaria.
3.4 Nivel de bioseguridad 4
Nivel requerido cuando se procesa con certeza o se sospecha de un agente biológico de
riesgo 4, especialmente patógeno infecto – contagioso, exótico o no, que produce alta
mortalidad y para el que no existe tratamiento o es poco fiable. Este nivel también puede
utilizarse para trabajar con animales de experimentación infectados por microorganismos del
grupo de riesgo 4.

4. Referencias bibliográficas
- Granados, E. & Villaverde C. (1977). Microbiología. España: Editorial Paraninfo.
- Instituto Nacional de Salud. (2002). Manual de bioseguridad para los laboratorios.
Serie de Normas Tècnicas Nº 18 (2 º ed.). Perú
- Perú, Ministerio de Salud. (2001). Buenas Prácticas de Laboratorio. Seminario Taller,
Lambayeque, Perú.

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PRÁCTICA II
MATERIAL Y EQUIPOS DE LABORATORIO

1. Introducción
Las tres fuentes del conocimiento son la observación, la experimentación y el razonamiento.
La experimentación exige menos esfuerzo mental pero más tiempo, es decir más presencia; por
consiguiente se necesita equilibrar la enseñanza con más horas de laboratorio para un buen
aprendizaje. Una buena enseñanza experimental debe fomentar la capacidad de distinguir entre
observar un fenómeno o una reacción, y el poder interpretarlo. La correcta observación le dará
el dominio real sobre la materia. La capacidad de interpretación le proporcionará además la
preparación técnico-científica necesaria para ser un buen investigador.
Es de vital importancia el conocimiento y buen manejo del material y equipo de
laboratorio, sólo así se logrará obtener buenas lecturas lo que permitirá una buena interpretación
de los resultados.

2. Objetivos
2.1 Reconocer el material y equipo utilizados en el laboratorio de Microbiología.
2.2 Aprender a utilizar los equipos en el laboratorio de Microbiología.
2.3 Aprender a esterilizar el material en el laboratorio de Microbiología.

3. Procedimiento
3.1 Reconocimiento de material y equipos utilizados en el laboratorio de Microbiología
3.1.1 Tubos de ensayo
Existe una gran variedad de tubos, pero se prefieren los de vidrio neutro,
paredes gruesas y sin rebordes para facilitar el taponamiento. Para estudios bioquímicos
se usan tubos de 13 X 100 mm. y para diluciones tubos de 16 X 150 mm y de 15 X
125 mm.
3.1.2 Placas de Petri
Están compuestas por dos cristalizadores, de los cuales el más grande hace de
tapa. Se emplean para el aislamiento y cultivo de microorganismos.
3.1.3 Tubos de Smith
Son utilizados para cuantificar el gas producido en los procesos de
fermentación.
3.1.4 Campanas de Durham
Son tubos de vidrio huecos con uno de sus extremos cerrado y dilatado y
permiten detectar la producción de gas en los procesos de fermentación.

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3.1.5 Pipetas serológicas o de medida
Presentan subdivisiones de su capacidad total y se calibran en mL a 20°C. Las marcas
más conocidas son PYREX, NORMAX y CORNING. Las pipetas NORMAX se usan para
trabajos de precisión, son contrastadas individualmente por la Oficina Nacional de Patrones en
Norteamérica y tienen las siglas NBS y el año de control. Por ejemplo, una pipeta NORMAX
serológica de 1 mL de capacidad tiene un error tolerable (ET) de 0,01 (1%), mientras que una
pipeta PIREX del mismo volumen tiene un ET de 0.02 (2%).
Las pipetas serológicas son terminales y con capacidad de 0,1 a 25 mL. Las de mayor uso son:
Pipetas de 10 mL 0,1 mL
Pipetas de 5 mL. 0,1 mL
Pipetas de 1 ml. 0,1 y 0,01 mL
Pipetas de 0.1 mL. 0,1 y 0,001 mL
Pipetas de Dhan de 0,125 0,0125 mL
Pipetas de Dhan de 0,250 0,0250 mL
Pipetas de Bang de 0,2 0,08 y 0,005 ml
Las pipetas graduadas pueden ser terminales, cuando el vaciado del líquido se realiza
hasta la punta de la pipeta y pipetas no terminales cuando el vaciado del líquido se realiza hasta
la última línea de graduación.
3.1.6 Pipetas Pasteur
Son confeccionadas de varillas de vidrio de diámetro de 4 X 20 mm. y de 30 ó 40 cm.
de longitud. La calidad del vidrio debe facilitar el reblandecimiento a la acción directa de la
llama del mechero, para conseguir un estiramiento a la capilaridad deseada. Se emplean para la
toma de pequeños inóculos de siembra.
Modo de emplear la pipeta Pasteur
- La pipeta se sujeta con el pulgar y el dedo medio. Se coloca la punta de la pipeta en el
líquido por medir, bastante profundo, para que se pueda aspirar el volumen necesario sin aire.
Con aspiración suave, se llena el líquido por encima de la marca de calibración. Se cierra la
pieza de la boca con el dedo índice.
- Se seca el exceso del líquido en el exterior de la pipeta con un paño o un papel limpio,
y colocando la punta de la pipeta contra el recipiente, se deja que el nivel del líquido baje hasta
la marca de calibración moviendo con suavidad el índice sobre la pieza de boca. El dedo no
debe retirarse.
- Ahora la pipeta se pasa al recipiente de recepción, colocando su punta contra la pared.
- Se levanta el dedo de la pieza de boca y se deja que la pipeta se vacíe durante el tiempo
necesario. No se debe soplar para hacer salir la última gota al emplear una pipeta volumétrica o
cualquier pipeta calibrada. Es importante que la pipeta se mantenga vertical para que el
vaciamiento sea correcto.

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3.1.7 Buretas
Son tubos largos de vidrio con una llave de descarga en uno de sus extremos o bien con
un tubo corto de jebe que termina en un pico de vidrio. Las más comunes son de 50 mL y están
graduadas al décimo de mL. Las buretas se emplean para descargar distintas cantidades de
líquidos o soluciones y se las usa mayormente en las titulaciones volumétricas.
Modo de usar la bureta
- La bureta limpia y vacía se mantiene en posición vertical mediante un soporte adecuado.
- Se enjuaga la bureta con el mismo líquido que se va a descargar.
- Se llena la bureta con el líquido hasta un poco más arriba de la graduación y se descarga
el líquido de modo que la parte inferior del menisco coincida con el comienzo de la graduación
y el pico de la bureta debe quedar completamente lleno de solución.
- Al efectuar las lecturas con la bureta, el ojo debe estar al nivel del menisco para evitar
errores.
- Después de su uso las pipetas se deben lavar con agua destilada y cubrir con un tubo de
ensayo corto, invertido para preservarlas del polvo, o también pueden colocarse en el soporte
con las puntas hacia arriba.
- Las llaves de vidrio de las buretas se lubrican con grasa, vaselina pura o mezclada con
cera y resina. La lubricación adecuada de la llave evita que se pegue o endurezca.
3.1.8 Matraces
Son recipientes volumétricos muy útiles en la preparación y almacenamiento de
soluciones, colorantes, reactivos, medios de cultivo, etc. Su forma y tamaño son muy variables.
- Matraces cónicos (Erlenmeyers): Se utilizan para hervir soluciones cuando hay que
reducir a un mínimo la evaporación; son útiles para las titulaciones. En Microbiología sirven
para la preparación de medios de cultivo. Es necesario emplear una tela de asbesto o una tela de
alambre cuando se realiza el calentamiento evitando así el contacto directo entre el matraz y la
llama.
- Matraces de fondo redondo: Estos matraces soportan mejor el calor directo sobre el
mechero. Para calentar solventes orgánicos, o para manipulaciones muy prolongadas, es
preferible emplear matraces con cuello esmerilado que pueden recibir los condensadores
correspondientes y permiten un cierre mucho más hermético que los tapones de caucho o de
corcho.
- Matraces aforados o fiolas: Idénticos a los matraces erlenmeyer. Están calibrados a
medidas exactas mediante un aforo en la parte media del cuello del recipiente en el que se indica
la medida. Se emplean para la preparación de reactivos y de soluciones buffer.
- Matraces kitasato: Son matraces que además de la boca tienen una tabulación corta
lateral para hacer vacío. Se utilizan como complemento del equipo de filtración (esterilización
en frío).

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3.1.9 Espátulas de Drigalsky
Se confeccionan a partir de las pipetas Pasteur. La fracción recta y horizontal facilita la
siembra y aislamiento de bacterias por diseminación.
3.1.10 Probetas
Recipientes cilíndricos con base para la estabilidad. Pueden estar graduadas y tener
capacidad de 10 mL hasta 2 000 mL. Las más utilizadas son las de 100, 250, 500 y 1000 mL.
3.1.11 Beacker o vasos de precipitación
Recipientes cilíndricos y cortos, con una depresión en el margen de la boca. El vidrio
debe ser necesariamente resistente al calor. Existen desde 1 mL hasta 4 000 mL de capacidad.
3.1.12 Varillas de vidrio macizo
Fragmentos de 30 a 60 cm, que sirven para la confección de agitadores o baguetas. Las
varillas cortas de 20 cm pueden utilizarse como mangos para las asas de siembra.
3.1.13 Frascos reactivos
Frascos de vidrio de paredes gruesas, transparentes o de color ámbar. Son cilíndricos,
tienen cuello estrecho y tapones de cristal esmerilado (algunos con tapas especiales para facilitar
su vaciado y su tamaño varía de 25 mL a 1000 mL). En los frascos pequeños se pueden
almacenar HCl, H2SO4, CCl4, etc. En los frascos grandes se pueden almacenar reactivos
desinfectantes u otros reactivos.
3.1.14 Frascos goteros
Tienen una capacidad de 50 mL, pueden ser de vidrio claro o ámbar, y sus tapones son
ranurados para que su contenido salga gota a gota cuando se inclinan. Se pueden utilizar para
colorantes o para indicadores.
3.1.15 Picetas
Son botellas plásticas de color blanco con una especie de caño que al presionar el frasco
permite que el líquido salga con fuerza. Se utilizan para lavar láminas portaobjetos con
tinciones.
3.1.16 Portaobjetos y cubreobjetos
Los portaobjetos son láminas de vidrio transparente de forma rectangular y de mínimo
grosor. Los cubreobjetos son finísimas laminillas de mucho menor tamaño que los portaobjetos
y pueden ser de forma rectangular, cuadrada o circular. Ambos son material indispensable para
la observación microscópica de las bacterias u otros organismos.
3.1.17 Jarra de Brewer
Denominada también campana de anaerobiosis, está constituida por una tapa de
baquelita en cuya parte inferior presenta una canastilla conteniendo granos de paladio. El cuerpo
es un cilindro de vidrio en cuyo interior se colocan los tubos o placas de Petri. La jarra es
cerrada herméticamente mediante una abrazadera de metal.

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3.1.18 Asas de siembra
Con mango de vidrio o de metal aislante del calor y un alambre o aguja de micrón
resistente a elevadas temperaturas. Se usan en la siembra y trasplante de bacterias y hongos.
3.1.19 Mangos de Kolle
Vástagos de metal con una cubierta aislante del calor y en el extremo proximal, una
tuerca para insertar el alambre de platino o micrón en el asa de siembra. Pueden ser
reemplazados por mangos de vidrio.
3.1.20 Alambres de platino en aro y en punta
Pueden ser acoplados a los mangos de Kolle.
3.1.21 Canastillas o cestos de metal
Las mejores son de aluminio. Favorecen el almacenamiento de tubos de prueba en
medidas conocidas, sin riesgo de roturas.
3.1.22 Gradillas
Permiten una mayor estabilidad a los tubos de ensayo, evitando accidentes.
3.1.23 Soportes universales
Con tenazas y aros de metal, para asegurar cuellos y bases de matraces, beackers, etc.
Son de metal de preferencia de fierro y son muy buenos soportes de recipientes sometidos al
calentamiento.
3.1.24 Trípodes
Son de metal, de preferencia de fierro. Muy buenos soportes de recipientes sometidos al
calentamiento. De variada altura y diámetro.
3.1.25 Rejilla o malla metálica
Malla de alambre galvanizado, resistente a la corrosión a elevadas temperaturas. Se
coloca sobre el trípode.
3.1.26 Mecheros
- Mechero de alcohol: Constituido de un recipiente de vidrio borosilicato y una tapa de
metal por donde se introduce la mecha.
- Mechero Bunsen: Funciona a gas. Es uno de los instrumentos más útiles en el
laboratorio. Fue inventado por el alemán Robert Bunsen en 1866. Existen diferentes tipos de
mecheros, algunos tienen regulación de gas y otros no. Los que se usan en laboratorio son
simples, no regulan el gas, y queman gas propano.
3.1.27 Autoclave
Consta de una caldera de acero o de cobre batido estañado interiormente, protegida por
una camisa metálica de cobre; quedando formado de paredes dobles. En su base está instalada la
fuente calórica (gas o electricidad). A una distancia del fondo del recipiente, está la placa
cribosa para apoyo del material y para la salida del vapor; en la parte superior se halla la tapa
que es pesada (de bronce fundido) en cuyo borde interno está adaptado un arandel de caucho

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para el cierre hermético del aparato. Los tornillos o bulones en el margen superior refuerzan el
cierre, evitándose el escape del vapor. Presenta además, un manómetro (que marca las libras de
presión), una válvula de seguridad, un termómetro y una llave o espita (para la salida del aire y
vapor al empezar a hervir el agua).
El vapor de agua se aplica en una cámara cerrada en la que existe un generador de
vapor; cuando éste se produce, desplaza el aire, que sale por un orificio que se cierra en el
momento en que ya sale vapor. Posteriormente se consigue la presión deseada, teniendo en
cuenta que el vapor a 1 atm. de presión corresponde a 121°C de temperatura. Esta
temperatura, aplicada durante 15 o 20 minutos, ó una temperatura de 134 °C durante 7 minutos
destruye todas las formas vegetativas y esporuladas.
El autoclave requiere de indicadores, que comprueben que en el interior del recipiente
se han dado las condiciones deseadas de temperatura y tiempo. Los indicadores de esterilización
más usados son productos químicos (que cambian de color según los niveles alcanzados) y
esporas de ciertas bacterias.
3.1.28 Horno Pasteur
Es un aparato muy utilizado en la esterilización por calor seco. Es cilíndrico, de metal,
de triple pared; la intermedia más corta que las otras dos, quedando formada por dos cajas
paralelas (concéntricas) que se comunican por la parte superior. La parte inferior del cilindro
hace fondo. Las paredes son metálicas y revestidas de planchas de asbesto al igual que la puerta.
Por los lados o al fondo, entre las paredes media y externa se halla un colector de mechero
múltiple o juego de resistencia (fuente calorífica).
3.1.29 Espectrofotómetro
Es un instrumento que permite medir la intensidad de la luz transmitida y se utiliza
mucho en análisis bioquímicos. Las sustancias disueltas tienen determinados colores porque
absorben ciertas longitudes de onda de luz y dejan pasar otras. Ejemplo: La hemoglobina tiene
color rojo porque absorbe los colores complementarios del rojo, es decir las longitudes de onda
más cortas del azul y el verde.
3.1.30 Potenciómetro
Es un aparato utilizado para medir el pH de soluciones buffer, fluidos biológicos,
medios de cultivo, etc.
3.1.31 Contador de colonias
Lo más difícil en la determinación de una colonia es el conteo en las placas de Petri. El
contador de colonias soluciona este problema convirtiéndose en un auxiliar indispensable para
todo laboratorio microbiológico y además no ocasiona problemas con su mecanismo de conteo.

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3.1.32 Refrigeradoras y congeladoras
Son incubadoras de temperaturas frías. Se requieren para almacenar medios de cultivo,
sueros y reactivos especiales. Las congeladoras se requieren para almacenamiento más
prolongado de sueros, enzimas, etc.
Deben localizarse lejos de los hornos de aire caliente, de radiadores de tuberías de agua
caliente.
3.1.33 Estufas de cultivo
Sirven para realizar el proceso de incubación, que brinda una temperatura adecuada para
que los microorganismos permanezcan viables y se desarrollen. Existen dos métodos de
incubación:
 Incubación por calor seco: Se realiza en incubadoras e incluso en hornos. Las
incubadoras y los hornos se basan en los mismos principios y la diferencia entre éstos radica en
la temperatura que puede obtenerse en su interior. Usualmente se denomina horno al aparato
que es capaz de soportar temperaturas de 100 °C ó más. El más conocido es el horno Pasteur.
 Incubación por calor húmedo (baño María): El llamado baño María presenta un
dispositivo enrollable que es sumergido en el agua y la calienta. La fuente de calor es por medio
de una corriente de convección, lo que permite que el agua se caliente en forma más uniforme.
3.1.34 Microscopio óptico
La Microbiología se ha podido desarrollar a partir de la aparición y progreso del
microscopio. Podemos encontrar un microscopio simple que no es más que una lente biconvexa,
o un microscopio compuesto, que emplea dos sistemas de lentes separadas, consiguiendo con
ello mayor aumento.
Los microscopios se clasifican básicamente en dos grupos en función del tipo de luz
utilizada y amplificación: microscopio de luz óptica y microscopio electrónico. El microscopio
mediante el cual la amplificación de la imagen se obtiene por un sistema de lentes ópticas,
corresponde a los microscopios de luz. El microscopio mediante el cual la amplificación de la
imagen se hace a través de un haz de electrones en lugar de ondas luminosas corresponde al
microscopio electrónico.
Los diversos componentes del microscopio óptico pueden ser agrupados en cuatro
sistemas:
a) Sistema de soporte: Pie, bastidor, revólver portaobjetivos, platina.
b) Sistema de aumento : Objetivos, oculares
c) Sistema de iluminación: Fuente luminosa, espejo, condensador, diafragma, filtros.
d) Sistema de ajuste: Tornillo macrométrico, tornillo micrométrico, condensador, elevador
del diafragma iris, reguladores de la platina mecánica, tornillos para centrar el condensador.

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a) Sistema de aumento
La amplificación de la imagen en un microscopio óptico se obtiene mediante dos
sistemas de lentes convergentes. Un primer sistema de lentes situados en el extremo inferior del
tubo del microscopio, justo por encima de la muestra que se halla sobre la platina, se denominan
objetivos y forman la imagen real del objeto que se está observando. El poder de aumento de
cada uno de ellos es indicado por un número grabado ejemplo: 40 indica un aumento del
objetivo de 40 veces.
El segundo sistema de lentes que se sitúa en el extremo superior del tubo del
microscopio, está más alejado de la muestra y más próximo al ojo humano. Son los oculares y
se encargan de ampliar la imagen real formada por el objetivo originando una imagen virtual
que es la que percibe el ojo humano. La amplificación del ocular suele venir indicada en la parte
superior del lente ocular o en la lateral.
b) Poder de aumento del microscopio
Se calcula multiplicando el aumento del objetivo por el del ocular. Por ejemplo si se
emplea un objetivo que tiene 45 de aumento y un ocular con 10 de aumento, el poder de
aumento del microscopio será de 450.
c) Poder de resolución del microscopio
Es la distancia entre dos estructuras de un espécimen en la cual todavía se pueden
observar como estructuras separadas en la imagen amplificada. La resolución se define como el
espacio de máxima aproximación entre dos puntos en el que aún se pueden observar con
claridad como dos entidades independientes y si se les acerca un poco más, ya no se distinguen,
y se les ve como un solo punto.
El poder de resolución está sujeto a la longitud de onda (λ) del espectro de luz visible y
a la propiedad de las lentes conocidas como la abertura numérica (AN). El límite del poder de
resolución de un microscopio es aproximadamente igual a 0.61 λ/AN que para un microscopio
óptico es alrededor de 200 nm. A menor longitud de onda de luz y mayor la AN de las lentes,
será mejor el poder de resolución del microscopio

d) Abertura numérica de un objetivo


Depende del índice de refracción (N) del medio que llena el espacio entre el espécimen
y la parte frontal del objetivo, y del ángulo (μ) de los rayos de luz mas oblicuos que pueden
entrar al objetivo. Usando una lente con mayor abertura numérica, se obtiene mayor poder de
resolución. AN = N x Sen μ/2
El aire tiene un índice de refracción de 1, que limita la resolución que se puede obtener,
pero se puede incrementar la abertura numérica colocando aceite de inmersión entre el
especímen y el objetivo, aumentando así el poder de resolución del microscopio.

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e) Aceite de inmersión
Sobre el preparado que se va a observar se coloca una gotita de aceite de cedro y luego
se desciende el objetivo hasta tocar la gota, de tal manera que el medio entre el objetivo y el
punto objeto es el aceite. Este tiene un índice de refraccción de 1,5, lo que aumenta
considerablemente la abertura numérica. La observación de algas, hongos y protozoos se puede
hacer con los objetivos secos, en los que el aire ocupa el espacio entre el espécimen y el
objetivo, pero para observar las bacterias con suficiente detalle se requiere el uso de un objetivo
de inmersión de aceite.
f) Iluminación
La iluminación es esencial para aprovechar adecuadamente los aumentos y la resolución
de un microscopio. La luz procederá de la fuente de iluminación que se situará en la parte más
baja del microscopio. Dicha luz penetrará en el condensador y éste llegará al objetivo que lo
amplificará, así pues deberá llegar un cono de luz muy grande para que su amplificación sea
mayor. Este tamaño de cono de luz que llega al objetivo se podrá controlar con el diafragma
situado inmediatamente debajo del dispositivo condensador. Si, por ejemplo, el diafragma
estuviera completamente abierto, se perdería contraste y nitidez.
Si se utiliza el objetivo de inmersión, la distancia de trabajo es muy pequeña y, en estos casos,
hay que abrir más el diafragma para facilitar una mayor amplificación que aumente el máximo
poder de resolución.

3.2 Manejo de los equipos en el laboratorio de Microbiología


3.2.1 Microscopio
- Obtener una muestra de sarro dentario con asa bacteriológica estéril.
- Homogenizar la muestra en solución salina fisiológica estéril (1 gota) sobre una lámina
porta – objetos.
- Cubrir el preparado con laminilla. Tiene Ud. un preparado en fresco para examen directo.
- Enfoque y observe al microscopio con objetivos de: 3,5 X, 10 X y 40X.
3.2.2 Horno Pasteur
- Colocar en el horno el material a esterilizar debidamente acondicionado.
- Cerrar la puerta y encender la fuente calorífica.
- Graduar la temperatura del horno a 180 °C y mantener el material por espacio de 2 horas.
Precauciones en el manejo
 No abrir la puerta del horno mientras la temperatura en su interior se mantenga elevada. Un
cambio brusco de la temperatura puede causar destrozos del material de vidrio.
 Cuidar de no elevar excesivamente la temperatura; de ésta manera se evitará la
carbonización del papel y tapones de algodón.

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 No colocar materiales que pueden ser destruidos por la temperatura como delantales,
guantes de goma, etc.
3.2.3 Autoclave
- Depositar agua en la caldera hasta unos centímetros de la parrilla.
- Colocar el material a esterilizar en la canastilla.
- Cerrar la tapa y asegurar el cierre ajustando los tornillos o mariposas tomando de dos en
dos tornillos diagonalmente opuestos.
- Dejar abierta la espita.
- Encender la fuente de calor.
- Cerrar la espita cuando se produzca un flujo de vapor continuo.
- Observar el manómetro y mantener la presión en 15 libras mediante el control de la
temperatura (121 °C) durante 15 a 20 minutos.
- Iniciar la cuenta del tiempo en el momento que se consigue la temperatura y la presión
deseada.
- Apagar el sistema de calefacción, después del tiempo de esterilización.
- Dejar enfriar hasta que el manómetro marque cero.
- Abrir la espita para que salga el exceso de vapor de agua.
- Aflojar los tornillos y levantar la tapa poniéndose detrás del aparato para evitar que los
vapores lleguen a la cara del operador.
Precauciones en el manejo:
 Para evitar la pérdida de material por ebullición se recomienda no llenar los recipientes.
 No colocar los materiales muy juntos. Es preferible dejar espacios libres para favorecer la
circulación del vapor.
 No bajar la presión abriendo la espita. Esta medida puede ocasionar pérdida de material
y ruptura de los recipientes de vidrio por el cambio brusco de la presión.
3.2.4 Estufa
- Colocar en la estufa el material a incubar: placas de Petri o tubos de ensayo con el
medio de cultivo inoculado.
- Cerrar la puerta y encender la fuente calorífica.
- Graduar la temperatura deseada y mantener el material en incubación durante 24, 48
horas o más tiempo si es requerido.
3.2.5 Baño María
- Colocar la cantidad de agua suficiente en la canastilla del equipo.
- Encender la fuente calorífica.
- Graduar la temperatura deseada.
- Colocar dentro del agua el material a calentar y mantenerlo durante el tiempo
deseado.

16
3.3 Esterilización del material de uso en el laboratorio de Microbiología
3.3.1 Placas de Petri
 Empaquetar las placas de Petri conteniendo material contaminado o de descarte y
esterilizar en autoclave a 121 ° C durante 20 minutos.
 Eliminar los restos de agar y lavar las placas de Petri con detergente, enjuagar y
dejar secar.
 Envolver con papel y asegurar con pabilo.
 Esterilizar en el horno a 180° C durante 2 horas.
3.3.2 Tubos de ensayo
 En una canastilla o un depósito que los sostenga depositar los tubos que contengan
material contaminado o de descarte.
 Esterilizar en el autoclave a l21 °C durante 20 minutos.
 Eliminar los restos de agar y lavar los tubos de ensayo con detergente, enjuagar y
dejar secar.
 Taponar los tubos con algodón no graso, de modo que el tapón ajuste perfectamente
y facilite su uso posterior.
 Envolver con papel. De preferencia formar grupos de seis tubos, envolver y
asegurar con pabilo.
 Esterilizar en el horno a 180° C durante 2 horas.
3.3.3 Matraces
 Esterilizar en autoclave los matraces que contienen medios de cultivo recién
preparados o cultivos de descarte.
 Eliminar los restos de agar, lavar con detergente, enjuagar y dejar secar.
 Colocar tapones de algodón no graso, de modo que el tapón ajuste perfectamente y
facilite su uso posterior.
 Esterilizar en el horno a 180° C durante 2 horas.
3.3.4 Pipetas
 Colocar un tapón de algodón ligeramente ajustado en el orificio superior de las
pipetas.
 Envolver con tiras de papel de 3 cm, de modo que cubran totalmente las pipetas.
 Esterilizar en el horno a 180 ºC durante 2 horas.

17
4 Anexo

a b

c d

Figura 2.1 Equipos de uso en microbiología, a. Autoclave, b. Estufa c. Horno,


d. Espectrofotómetro

18
a b

c d

e f

Figura 2.2 Equipos de uso en Microbiología, a. Potenciómetro, b. Refrigeradora,


c. Microscopio binocular, d. Contador de colonias, e. Microscopio monocular, f. Baño
maría.

19
5. Referencias bibliográficas
- Granados, E. & Villaverde C. (1997). Microbiología. España: Editorial Paraninfo.
- Mendo, M. (1999).Instrumentación de Laboratorio. Lima, Perú: Editorial Científica
Mundi E.I.R.L.

20
PRÁCTICA III
OBSERVACIÓN DE BACTERIAS

1. Introducción
Leewenhoek realizó observaciones de microorganismos hacia fines del siglo XVII; hasta
entonces sólo se podía especular de la existencia de agentes infecciosos más pequeños que lo
que el ojo humano podía distinguir. Desde ese momento el microscopio óptico se ha
transformado en una herramienta muy importante en la determinación y clasificación
microbiana. Muchos agentes microbianos pueden ser identificados en forma confiable con sólo
unas pocas coloraciones y un microscopio básico. La coloración de Gram aún es el método
individual más eficiente y económico para el diagnóstico rápido y precoz de un tipo bacteriano.

2. Objetivos
a. Reconocer la morfología de las bacterias.
b. Adquirir destreza en la obtención de un frotis.
c. Describir las técnicas de coloración simple y compuesta.
d. Adquirir destreza en la tinción de Gram

3. Procedimiento
a. Obtención de un frotis
El frotis constituye la extensión y fijación de la muestra sobre una lámina portaobjetos
limpia y desengrasada.
 Extensión: Se coloca en el centro de una lámina portaobjetos una gota del cultivo
líquido. Si el cultivo fuera sólido, se coloca previamente una gota de solución salina o agua
destilada sobre la lámina portaobjetos y sobre ella se emulsiona una pequeña porción de una
colonia tomada con el asa de Kolle. En ambos casos se extiende la muestra formando una capa
delgada y uniforme procurando no llegar al borde o extremo de la lámina.
 Fijación: Tiene por objeto adherir el extendido al portaobjeto y evitar que sea
arrastrado durante el lavado. Se puede fijar el frotis por el calor suave del mechero.

21
A c

Figura 3.1 Tecnica para la obtención de un frotis .a) flamear el ansa microbiologica. b) colocar
una gota de solucion salina esteril en una lámina portaobjetos c) tomar una colonia de la placa
de Petri. c), d) realizar una emulsión , luego extender la muestra sobre la lamina y fijar la
muestra al calor .

b. Coloración simple
Es aquella en la cual se usa un solo colorante. Ejemplo: azul de metileno, fucsina, safranina, etc.
Procedimiento:
 En una lámina portaobjetos realizar el frotis de la muestra.
 Agregar al frotis unas gotas de colorante azul de metileno y dejar actuar durante 3 a 5
minutos.
 Lavar el frotis a chorro de agua.
 Secar el frotis a temperatura ambiente o al calor suave del mechero.
 Observar al microscopio y esquematizar.

c. Coloración compuesta: Técnica de Gram


Coloración compuesta es aquella que utiliza más de un colorante. La más común es la
tinción de Gram, donde las bacterias se tiñen con cristal violeta de genciana, que al mezclarse
con el lugol forma un complejo que es retenido y no es eliminado por el alcohol acetona en las
bacterias Gram positivas, sucediendo lo contrario en las Gram negativas.

22
Procedimiento:
 En una lámina portaobjetos limpia colocar una gota de cultivo o muestra y realizar el
frotis.
 Cubrir el frotis con violeta de genciana y dejar actuar durante 3 minutos.
 Lavar a chorro de agua, cubrir luego con lugol y dejar actuar durante 1 minuto.
 Lavar a chorro de agua y decolorar rápidamente con alcohol acetona.
 Lavar y cubrir el extendido con safranina y dejar actuar durante 30 a 60 segundos.
 Lavar a chorro de agua y secar a temperatura ambiente o al calor suave del mechero.
 Observar al microscopio utilizando objetivo de inmersión.
 Comparar y esquematizar.

Figura 3.2 Técnica de tinción de Gram

23
4. Anexo

Reactivos para la tinción de Gram

A) Violeta de Genciana de Hucker


Violeta de Genciana ......................................................................... 2,0 g
Soluc. A
Alcohol etílico ............................................................................... 20,0 mL
Oxalato de amonio ......................................................................... 0,8 g
Soluc. B
Agua destilada ............................................................................... 80,0 mL

B) Solución de safranina
Safranina ...................................................................................... 0,25 g
Alcohol etílico .............................................................................. 10,0 mL
Agua destilada ............................................................................. 100,0 mL

C) Solución de lugol
Yodo .............................................................................................. 1,0 g
Yoduro de potasio ......................................................................... 2,0 g
Agua destilada.............................................................................. 300,0 mL

D) Alcohol acetona
Alcohol de 95° ............................................................................... 70,0 mL.
Acetona .......................................................................................... 30,0 mL

5. Referencias bibliográficas
- Granados, E. y Villaverde C. (1998). Microbiología. España: Editorial Paraninfo.
- Madigan, M., Martinko, J. y Parker, J. (2004). Brock. Biología de los Microorganismos (10ª
ed.) Madrid, España: Parson Educación, S.A.

24
PRÁCTICA IV
MEDIOS DE CULTIVO

1. Introducción
Medio de cultivo es un sustrato que permite el desarrollo y multiplicación de los
microorganismos por un tiempo prudencial y a una temperatura adecuada. Todo medio de
cultivo debe contener una fuente de carbono y de nitrógeno, debe presentar un equilibrio
ácido – base (pH) y debe estar libre de microorganismos contaminantes (esterilizado en
autoclave a 121 °C, 15 libras de presión, por 15 a 20 minutos.

1.1 Clases de medios de cultivo según su naturaleza


1.1.1 Naturales
a. Origen animal: Leche, huevos.
b. Origen vegetal: Papas.

1.1.2 Artificiales: Son aquellos que tienen una composición química conocida y constante
ejemplo Agar Tripticasa soya.

1.2 Clases de medios de cultivo según su utilidad


1.2.1 Medios comunes: Permiten el desarrollo de una gran variedad de microorganismos.
Entre ellos están el caldo común, agar común, caldo nutritivo y agar nutritivo.

Caldo común (g/L)


Peptona 10,0
NaCl 5,0
Agua destilada csp 1000 mL
pH 7,0

Agar común (g/L)


Peptona 10,0
NaCl 5,0
Agar 15,0
Agua destilada csp 1000 mL
pH 7.0

25
Caldo nutritivo (g/L)
Peptona 10,0
NaCl 5 ,0
Extracto de carne 3,0
Agua destilada csp 1000 mL
pH 7,0

Agar nutritivo (g/L)


Peptona 10,0
NaCl 5,0
Agar 15,0
Extracto de carne 3,0
Agua destilada csp 1000 mL
pH 7,0

1.2.2 Medios especiales


a. Medios mejorados o enriquecidos: Son aquellos a los que se les agrega fluidos
orgánicos como sangre, yema de huevo, suero, etc.
Agar sangre
Agar común fluidificado y enfriado a 45 °C 95 mL
Sangre citratada 5 mL

b. Medios selectivos o de aislamiento: Facilitan el desarrollo de un determinado grupo


de microorganismos e inhiben a otros acompañantes. Ejemplo: agar Chapman, agar azida de
sodio.
Agar Chapman (g/L)
Peptona 10,0
Extracto de carne 1,0
NaCl 75,0
Manitol 10,0
Agar 15,0
Agua destilada csp 1000 mL
Rojo de fenol 2,5 ml (pH 6.8 amarillo, pH 8.4 rojo)
pH 7,4

26
c. Medios selectivos diferenciales: Son semejantes a los de aislamiento pero contienen
un sustrato definido y un indicador de pH. Permiten el desarrollo de un determinado grupo de
microorganismos y a la vez los diferencian según la utilización del sustrato. Ejemplo:
Agar Mac Conkey, Agar SS.

Agar Mac Conkey (g/L)


Peptona 17,0
Peptona proteosa 3,0
Lactosa 10,0
Sales biliares 1,5
Cristal violeta 0,001
NaCl 5,0
Agar 15,0
Agua destilada csp 1000 mL
Rojo neutro 0,03 (pH 6.8 rojo, pH 8 incoloro)
pH 7,1

d. Medios diferenciales: Permiten poner de manifiesto alguna propiedad bioquímica


de los microorganismos. Tienen un sustrato definido y un indicador de pH. Ejemplo: Agar TSI,
Agar LIA.

Agar LIA (Agar lisina hierro) (g/L)


Peptona 5,0
Extracto de Levadura 3,0
Dextrosa 1,0
Lisina 10,0
Cítrato amónico férrico 0, 5
Tiosulfato de sodio 0, 04
Púrpura de bromocresol 0, 02
Agar 15 g
Agua 1 000 mL
pH 6,7

27
1.3 Clases de medios según su consistencia
1.3.1 Líquidos
1.3.2 Sólidos: Son aquellos que tienen un solidificante llamado agar que es un
polisacárido extraído de las algas marinas pardas y tiene la propiedad de licuarse a
80 – 100 °C y de solidificarse a 40 °C. Así mismo, el agar no es degradado por las
bacterias.
1.3.3 Semisólidos: Son aquellos que contienen entre 0,3 a 0,5 % de agar.

2. Objetivos
2.1 Diferenciar los medios de cultivo de mayor uso en el laboratorio de Microbiología.
2.2 Adquirir destreza en la preparación y esterilización de medios de cultivo.

3. Procedimiento
3.1 Preparación y esterilización de medios de cultivo
a. Pesar cada uno de los componentes del medio de cultivo, llevarlos hacia un matraz y
adicionar la cantidad de agua destilada requerida.
b. Disolver en Baño María.
c. Enfriar y ajustar el pH según convenga.
d. Colocar un tapón de algodón en el extremo superior del matraz, cubrirlo con papel y
asegurar con pabilo.
e. Esterilizar en autoclave a 121 °C, 15 libras de presión durante 15 minutos.

3.2 Metodología para servir medios de cultivo


a. Fluidificar los medios sólidos al calor, enfriar a 50 °C y frente a la llama del mechero servir
en placas de Petri, en tubos o en viales previamente esterilizados. Dejar solidificar. En el caso
de los tubos y viales, colocar sobre una superficie inclinada.
b. Servir los medios líquidos en tubos o en viales previamente esterilizados.

3.3 Control de esterilidad de los medios de cultivo servidos


a. Acondicionar los medios de cultivo servidos e incubar durante 24 horas a 30 °C.
b. Observar y descartar los medios que presenten desarrollo de algún microorganismo
(contaminante).

28
Adicionar los ingredientes
en el matraz.

Agua destilada Llevar el medio a Llevar el medio de Servir los medios Llevar a control de
autoclave cultivo a control de a placas esterilidad
esterilidad.

Adicionar los ingredientes


en el matraz.

Agua destilada Homogenizar Servir el Los tubos son Los tubos son Los tubos son
el medio de medio de colocados en una llevados a inclinados y llevados
cultivo cultivo gradia y son autoclave a control de
taponados con esterilidad.
algodón

Figura 4.1 Metodología para preparar, esterilizar, servir y controlar medios de cultivo sólidos y
líquidos

4. Referencias bibliográficas
- Granados, E. y Villaverde C. (1998). Microbiología. España: Editorial Paraninfo.
- Madigan, M., Martinko, J. y Parker, J. (2004). Brock. Biología de los Microorganismos (10ª
ed.) Madrid, España: Parson Educación, S.A.

29
PRÁCTICA V
SIEMBRA Y AISLAMIENTO DE BACTERIAS
1. Introducción
Sembrar es la acción de poner una bacteria en contacto con un medio adecuado o sustrato
que permita el desarrollo de colonias. Los objetivos de la siembra pueden ser para aislamiento y
para trasplante.
La siembra para aislamiento se realiza cuando se desea estudiar la muestra. Por lo común
ésta presenta una mezcla de bacterias por lo que es preciso separar (aislar) los microorganismos.
Generalmente se utiliza la técnica de agotamiento en superficie sólida o aislamiento en estría
simple. Cuando se desea contar el número de bacterias se utiliza la técnica de placa vertida. La
siembra para trasplante ocurre cuando el material motivo de estudio contiene una sola especie
microbiana (cepa). También se denomina “repique”. El objetivo es el mantenimiento del
microorganismo conocido cambiándolo a un nuevo medio de cultivo.
La siembra por trasplante puede ser:
 De un medio sólido a otro medio sólido
 De un medio sólido a un medio líquido
 De un medio líquido a otro medio líquido
 De un medio líquido a un medio sólido

2. Objetivos
- Realizar una siembra por agotamiento en superficie sólida o aislamiento en estría simple.
- Realizar una siembra por difusión en placa o placa vertida
- Obtener un cultivo puro de bacterias

3. Procedimiento
3.1 Siembra por agotamiento en superficie sólida o aislamiento en estría simple
Se realiza para obtener colonias individuales de bacterias a partir de una muestra biológica.
 Tomar una alícuota de la muestra (inóculo) y depositarla en uno de los extremos
superiores de la placa de Petri que contiene medio de cultivo agar nutritivo previamente servido
y controlado.
 Realizar movimientos en zig – zag (estrías) muy juntos en el primer tercio de la placa
para agotar el inóculo. Posteriormente realizar estrías muy separadas de un extremo a otro lado
de la placa no tomando nuevo inóculo ni levantando el asa hasta concluida la siembra en toda la
placa.
 Incubar a 37 ºC (o la temperatura requerida por la bacteria) durante 24 horas.

30
Figura 5.1 Siembra por la tecnica de agotamiento y estria.

3.2 Siembra por difusión en placa o placa vertida


Se utiliza para realizar el recuento total de bacterias de una muestra biológica.
 Depositar 0,1 mL (0,5 mL, 1 mL)) de la muestra sobre la superficie de una placa de
Petri estéril y vacía.
 Agregar 10 mL de agar nutritivo licuado y enfriado a 45 – 50 °C.
 Homogenizar por movimientos de rotación de la placa de Petri para la dispersión de
microorganismos en forma más o menos homogénea, hasta la solidificación.
 Incubar a 37 ºC durante 24 horas.
 Realizar el recuento de colonias.

3.3 Obtención de un cultivo puro de bacterias


a. Tratamiento de la muestra
Para estudiar las bacterias se necesita poder cultivarlas en condiciones de laboratorio
y por lo tanto inicialmente deben ser aisladas. Por ello, se debe disponer de muestras biológicas
que pueden ser de varios tipos:
a.1 Muestras que contienen abundante número y tipo de microorganismos en las que
previamente se deben realizar diluciones en solución salina fisiológica estéril. Ejemplo suelo.
a.2 Muestras que no contienen suficiente cantidad del microorganismo que se desea
investigar, por lo que previamente se deben enriquecer para incrementar el número del
microorganismo requerido y disminuir el de los contaminantes. Ejemplo leche.
a.3 Muestras que naturalmente no presentan bacterias (incluyendo el microorganismo
investigado y los contaminantes) y que se siembran sin ningún pre-tratamiento. Ejemplos
sangre,

31
b. Aislamiento primario
Una vez que la muestra ha recibido o no tratamiento se procede al aislamiento
primario a través de la siembra en placa de Petri mediante la técnica de estría en la superficie de
medios enriquecidos (agar sangre), medios selectivos (agar Chapman) o medios selectivos
diferenciales (agar Mac Conkey). Después de un periodo de incubación de 24 horas (puede
variar en función del microorganismo), se observarán las colonias de bacterias (masas
constituidas por millones de bacterias que se aprecian a simple vista y que han sido originadas a
partir de una célula). Se observará el tamaño y el aspecto de cada colonia que generalmente son
constantes para cada género y especie bacteriana, por lo que se les utiliza como característica
diferencial. A continuación se realizará una tinción de Gram para determinar la morfología y
reacción tintorial de las bacterias constituyentes de la colonia.

Figura 5.2 Aislamiento primario: observe las colonias bacterianas debidamente aisladas sobre
el medio de cultivo.

32
c. Aislamiento secundario
En caso que la morfología y reacción a la tinción de Gram de las células bacterianas
coincidan con el microorganismo que se desea investigar se realiza el aislamiento secundario a
través de una siembra para trasplante o transferencia de una pequeña porción de la colonia hacia
un tubo con medio de cultivo inclinado que permitirá el desarrollo bacteriano o cultivo puro
bacteriano (población de bacterias que procede de una célula) y que a su vez puede ser
mantenido e identificado merced a sus propiedades culturales y fisiológicas.

4. Referencias bibliográficas
- Perú, Ministerio de Salud (2001). Manual de análisis Microbiológico de alimentos.
Lima, Perú: Dirección General de Salud Ambiental
- Madigan, M., Martinko, J. & Parker, J. (2004). Brock. Biología de los Microorganismos
(10ª ed.) Madrid, España: Pearson Educación, S.A.

33
PRÁCTICA VI
IDENTIFICACION DE BACTERIAS

1. Introducción
Una vez obtenido un cultivo puro de una bacteria se debe realizar la identificación del
género y en el mejor de los casos de la especie. Las pruebas de identificación comienzan con el
estudio morfológico de la colonia, estudio morfológico de las células, motilidad, prueba de
catalasa, citocromo oxidasa, prueba de oxidación fermentación, metabolismo de carbohidratos,
metabolismo de compuestos nitrogenados, y muchas otras pruebas según la bacteria que va a ser
identificada.

2. Objetivos
2.1 Caracterizar morfológicamente las colonias bacterianas.
2.2 Caracterizar morfológicamente las células bacterianas.
2.3 Realizar e interpretar la prueba de catalasa.
2.4 Realizar e interpretar la prueba de oxidación-fermentación
2.5 Realizar e interpretar pruebas para investigar el metabolismo de los carbohidratos y
compuestos nitrogenados

3. Procedimiento

3.1.1 Estudio morfológico de las colonias bacterianas


Determinar el tamaño, forma, borde, elevación, consistencia, aspecto y color de la colonia
bacteriana.
a) Tamaño: Pequeño, mediano, grande y muy grande o extendida en forma de velo,
invadiendo toda la superficie del medio.
b) Forma: Puntiforme, circular, rizoide, filamentosa, irregular, fusiforme.
c) Bordes: Enteros, ondulados, filamentosos, rizoides, lobulados, espiculados.
d) Elevación: Plana, convexa, umbilicada, acuminada, plano-convexa, papilada.
e) Aspecto: Pulverulenta, granulosa, acuosa, brillante, transparente.
f) Color: Pigmentada, no pigmentada.

34
Forma Elevación

Figura 6.1 Distintas formas, bordes y elevación de colonias bacterianas.

3.2 Prueba de catalasa


La catalasa es una enzima que cataliza la descomposición del peróxido de hidrógeno en
agua y oxígeno. Se encuentra presente en la mayoría de los microorganismos aerobios y
anaerobios facultativos excluyendo a los estreptococos.
Técnica del porta objetos: En una lámina portaobjetos depositar una colonia bacteriana
procedente de un cultivo joven y añadir dos gotas de agua oxigenada de 30 volúmenes.
Interpretación: La prueba se considera positiva cuando se produce una efervescencia
rápida con desprendimiento de burbujas. La enzima catalasa convierte el peróxido de hidrógeno
en agua y oxigeno molecular.
2 H202 = 2 H20 + 02

35
Figura 6.2 Reacción positiva en la prueba de la catalasa.

Tabla 6.1 Prueba de catalasa en algunas bacterias Gram positivas


Reacción
Morfología
Catalasa Gram
Staphylacoccus + +
Micrococcus + +
Cocos
Streptococcus - +
Enterococcus - +
Bacilos Bacillus + +
esporulados Clostridium - +
Listeria + +
Bacilos no
Corynebacterium + +
esporulados
Erysipelotrix - +

3.3 Estudio morfológico de las células bacterianas


Realizar un frotis de una pequeña porción de la colonia y una tinción de Gram para
determinar la morfología celular y reacción a la tinción de Gram de las células bacterianas.

36
3.4 Prueba de oxidación fermentación
Determina el tipo de metabolismo, oxidativo o fermentativo, que utilizan las bacterias al
desarrollar sobre un hidrato de carbono. En la vía oxidativa, el aceptor final de electrones es el
oxígeno, por consiguiente el proceso es aerobio y produce poca acidez. Es la vía fermentativa, el
aceptor final de electrones es un compuesto orgánico procedente de la misma vía, por
consiguiente el proceso es anaerobio y se origina mucha acidez.
La acidez se detecta por la presencia de un indicador de pH. Las bacterias oxidativas
producen ácido en la zona de contacto con el aire pero no en profundidad, las bacterias
fermentativas producen mucho ácido en todo el tubo.
Técnica: Sembrar por picadura en dos tubos con medio Hugh-Leifson (0/F). Cubrir uno de
los tubos con vaselina o aceite de parafina estéril. Incubar a 37 ª C por 24 horas, aunque a veces
es necesario una incubación de hasta 14 días.
Interpretación: Si la vía es oxidativa, sólo el tubo que no tiene vaselina vira ligeramente en
la parte superior al amarillo y más tarde se extenderá por todo el tubo, pero nunca con
producción de gas. Si la vía es fermentativa, se observará un viraje intenso al amarillo que se
inicia en la parte inferior de los dos tubos con o sin producción de gas.
Utilización: Se usa para diferenciar Staphylococcus O (+) F (+) de Micrococcus O (+) F (-).

3.5 Metabolismo de carbohidratos


Investigar la fermentación de lactosa, sacarosa y glucosa (agar TSI), formación de acidez
(medio RMVP), utilización del citrato como fuente de carbono y energía (medio citrato de
Simmons) e hidrólisis del almidón (agar almidón).

3.6 Metabolismo de compuestos nitrogenados


Investigar la descarboxilación de la lisina (agar LIA) y formación de indol (caldo
peptonado)

37
AGAR TSI
(Agar triple azúcar de hierro) – (color del medio: anaranjado-rojizo)

1. Composición
Extracto de carne 3,0 g
Extracto de levadura 3,0 g
Peptona 15 g
Peptona proteasa 5,0 g
Lactosa 10 g
Sacarosa 10 g
Glucosa 1,0 g
Sulfato ferroso (FeSO4) 0.2 g
Cloruro de sodio 5,0 g
Tiosulfato de sodio (Na2S2O3) 0,3 g
Agar 15 g
Rojo de fenol 0.024 (indicador:6.8 amarillo;7,4 rojo)
Agua csp 1 litro
pH 7,4

2. Fundamento
Este medio se utiliza para la identificación de enterobacterias según su capacidad para
metabolizar o no los carbohidratos, con o sin formación de sulfuro de hidrógeno (H2S) y gas.
Cuando el microorganismo metaboliza los carbohidratos produce acidez que hace virar el
indicador rojo de fenol a un color amarillo. La fermentación de la glucosa se lee al fondo del
tubo (amarillo), la fermentación de la sacarosa en la parte intermedia del tubo (amarillo) y la
fermentación de la lactosa se lee en la parte superior del tubo (amarillo).
Cuando el microorganismo no metaboliza los carbohidratos, utiliza las proteínas que
alcalinizan el medio por la formación de aminas y el indicador rojo de fenol vira a un color rojo
acentuado, debido a que la pequeña cantidad de glucosa (0.1%) se consume rápidamente en la
superficie y luego se realcaliniza por el ataque de la peptona (lactosa negativo).
En la producción de sulfuro de hidrógeno, el microorganismo reduce el tiosulfato de sodio
hasta hidrógeno sulfurado (o sulfuro de hidrógeno) y éste se une al fierro (del FeSO4) formando
un compuesto negro: sulfuro de fierro. Se observa entonces un precipitado negro en cualquier
parte del tubo, especialmente en el fondo.
En la formación de CO2 e H2 durante la fermentación de los carbohidratos: el agar se
rompe o se forman cavidades con aire en el medio de cultivo.

38
3. Técnica
 Sembrar por puntura y estría en la superficie de un tubo conteniendo medio TSI.
 Incubar a 37 °C durante 24 horas.
 Realizar la lectura correspondiente.

4. Lectura

rojo rojo
amarillo
negro
amarillo amarillo
amarillo

A/A K/A K/A


amarillo todo el tubo amarillo en el fondo del tubo amarillo en el fondo del tubo
y rojo en la parte superior y rojo en la parte superior

Gas (+) Gas (-) Gas (-)


H2S (-) H2S (-) H2S (+)
glucosa (+) glucosa (+) glucosa (+)
lactosa (+) lactosa (-) lactosa (-)
sacarosa (+) sacarosa (-) sacarosa (-)

A B C

39
Medio MRVP
(Rojo de Metilo – Voges Proskauer)

1. Composición (g/L)
Polipeptona 7,0
Glucosa 5,0
Fosfato dipotásico 5,0
Agua csp 1000 mL
Indicador rojo de metilo pH 4,5 = Rojo
pH 6,3 = Amarillo
pH 6,9

2. Fundamento
Este medio permite realizar la prueba del Rojo de Metilo y de Voges Proskauer. La prueba
de rojo de metilo detecta la formación de ácidos (láctico, acético, fórmico) por fermentación
ácido mixto de la glucosa. Dado que son muchas las especies de enterobacterias que pueden
producir cantidades suficientes de ácidos detectables con el indicador rojo de metilo durante las
fases iniciales de la incubación, sólo se consideran rojo de metilo positivos aquellos organismos
que pueden mantener el pH bajo después de una incubación prolongada de 48 horas.
3. Técnica
 Inocular un tubo conteniendo caldo MRVP.
 Incubar a 37 ° C durante 48 horas.
 Adicionar cinco gotas del reactivo rojo de metilo y mezclar.
4. Lectura
El desarrollo de un color rojo estable indica que la producción de ácido es suficiente como
para bajar el pH a menos de 4.4 y es una prueba positiva. Dado que otros organismos pueden
producir cantidades menores de ácido es posible el desarrollo de un color naranja intermedio
entre el amarillo y el rojo. Ésta es una prueba negativa al igual que cuando el tubo se torna
amarillo.

40
MEDIO CITRATO DE SIMMONS

1. Composición (g/L)
Fosfato amónico 1,0
Citrato sódico 2,0
Cloruro sódico 5,0
Fosfato bipotásico 1,0
Indicador azul de bromotimol 0,08
pH 6 = amarillo, pH  7.6 = azul
Sulfato magnésico 0.20
Agar 15
Agua csp 1000 mL
pH 6.9
2. Fundamento
Este medio permite investigar si el microorganismo es capaz de utilizar el citrato como
fuente de carbono y energía. En caso positivo el citrato es oxidado y se forman carbonatos y
bicarbonatos (C02 se junta con el sodio). Simultáneamente los microorganismos utilizan el
fosfato amónico como fuente de nitrógeno y liberan amoníaco. La presencia de carbonatos,
bicarbonatos y amoníaco alcaliniza el medio y el indicador azul de bromotimol vira al azul.
3. Técnica
 Sembrar por el método de estría un tubo conteniendo agar citrato inclinado.
 Incubar a 37 ° C durante 24 horas.
 Observar el cambio de coloración del medio de cultivo y/o el crecimiento de la bacteria.
4. Lectura
En caso positivo se observará el medio de cultivo de color azul. Algunas veces la bacteria
utiliza el citrato pero no produce alcalinidad suficiente como para hacer virar el indicador,
observándose crecimiento de la bacteria pero no cambio del color del medio de cultivo. Se
recomienda incubar 24 horas adicionales. En caso negativo no se observará crecimiento de la
bacteria y el medio permanecerá de color verde.

41
MEDIO AGAR ALMIDÓN

1. Composición (g/L)
Agar nutritivo 100 mL
Almidón 1.0

2. Fundamento
El almidón es un polímero complejo que reacciona con el lugol (yodo) formando un
complejo de color azul. Cuando las bacterias hidrolizan el almidón a moléculas más simples
como la maltosa y glucosa, éstas ya no reaccionan con el lugol y no se forma una coloración
azul.

3. Técnica
 Sembrar por el método de estría un tubo conteniendo agar almidón inclinado.
 Incubar a 37 ° C durante 24 horas.
 Adicionar dos gotas de lugol.
 Observar la presencia o no de una coloración azul.

4. Lectura
En una hidrólisis positiva del almidón, después de adicionar el lugol no se observará coloración
alguna. Por el contrario, en una hidrólisis negativa después de adicionar el lugol se observará
una coloración azul.

42
AGAR LIA
(Agar Lisina Hierro)

1. Composición (g/L)
Peptona 5,0
Extracto de levadura 3,0
Dextrosa 1,0
Lisina 10,0
Cítrato amónico férrico 0, 5
Tiosulfato de sodio 0,04
Púrpura de bromocresol 0,02
Agar 15,0
Agua 1 litro
pH 6.7

2. Fundamento
Este medio permite evidenciar la descarboxilación de la lisina y la formación de ácido
sulfhidrico (H2S).
 Para que se lleve a cabo la descarboxilación tiene que existir acidez (pH inferior a 6,0)
por lo que es necesario que el microorganismo primero fermente la glucosa (solo debe
utilizarse este medio para fermentadores de la glucosa). Posteriormente la lisina es
descarboxilada hasta la amina cadaverina que produce un viraje del indicador hacia el color
violeta (K / K).
 La producción de H2S se evidencia por la coloración negra debido al sulfuro de fierro
formado.
 Algunos microorganismos no descarboxilan la lisina pero si la desaniman hasta un
cetoácido el cual da un color anaranjado en presencia de las sales férricas y un color rojizo bajo
la influencia del oxígeno en la parte inclinada superficial del medio de cultivo (R / A).
 Los microorganismos que no descarboxilan la lisina pero fermentan la glucosa producen
un viraje al amarillo de la totalidad del medio de cultivo (A / A).

3. Técnica
 Sembrar por puntura y estría en superficie en un tubo conteniendo medio LIA
 Incubar a 37 °C durante 24 horas.
 Realizar la lectura correspondiente.

43
4. Lectura

Negro
Violeta
Rojo
Violeta Amarillo
Amarillo Amarillo

K/K R/A K/A A/A

LIA (-)
LIA (+)

44
MEDIO CALDO PEPTONADO
1. Composición (g/L)
Peptona 10,0
Na Cl 3,0
H2O csp 1000
pH 7,0
Reactivo de Kovac : Alcohol amílico o isoamílico puro 150
p – dimetilaminobenzaldehido 10
HCl concentrado 50
2. Fundamento
Este medio permite investigar la presencia de indol como producto de la hidrólisis del
aminoacido triptófano presente en la peptona. Los microorganismos que producen la enzima
triptofanasa hidrolizan y desaniman el triptófano con producción de indol, ácido pirúvico y
amoniaco. El indol forma un complejo de color rojo cuando reacciona con el grupo aldehido
del p – dimetilaminobenzaldehido (Reactivo de Kovac)
3. Técnica
 Inocular el caldo peptonado con el microorganismo en estudio.
 Incubar a 37 °C durante 24 horas.
 Agregar por la pared del tubo cinco gotas del reactivo Kovac.
4. Lectura
Observar la formación de un anillo coloreado en la zona de reacción (color rojo) = Indol (+)

45
Tabla 6.2. Reacción a ciertas pruebas bioquímicas claves para la diferenciación de bacterias
entéricas
Lisina Gas (glucosa)
Géneros H2S Indol Rojo de descarb. Citrato Lactosa
metilo
Escherichia - + + d - + +
Enterobacter - - + + + + +
Shigella - +/- + - - - -
Salmonella + - + + +/- + -
Klebsiella - - - + + + +
Citrobacter +/- - + - + + d
Proteus +/- +/- + - D +/- -

4. Referencias bibliográficas
- Carreño, C. (2010). Manual de Prácticas de Microbiología Industrial. Lambayeque,
Perú.
- MERCK (2005). Curso Taller de Actualización teórico-prácrtico. Técnicas Microbiológicas de
Análisis de Aguas y Alimentos. Piura, Perú.
- Perú, Ministerio de Salud (2001). Manual de análisis Microbiológico de alimentos.
Lima, Perú: Dirección General de Salud Ambiental
- Doyle, M., Beuchat, L. & Montville T. (1997). Microbiología de los alimentos.
Fundamentos y Fronteras. España: Editorial Acribia, S.A.
- Madigan, M., Martinko, J. & Parker, J. (2004). Brock. Biología de los Microorganismos
(10ª ed.) Madrid, España: Pearson Educación, S.A.

46
PRÁCTICA VII
RECONOCIMIENTO DE HONGOS:
MOHOS Y LEVADURAS

1. Introducción
Los hongos son organismos heterótrofos, eucariotas que pueden ser unicelulares (levaduras)
o pluricelulares (mohos). Entre las levaduras la más reconocida es Saccharomyces cerevisiae y
entre los mohos los géneros Aspergillus y Penicillium.

1.1. Género Aspergillus


Reino Fungi
Phyllum Ascomycota
Clase Euascomycetes
Orden Eurotiales
Familia Tricomaceae
Género Aspergillus

Para identificar a los hongos del género Aspergillus se les cultiva en medio Czapek durante
8 días y se observa la pigmentación de las colonias, longitud de los conidióforos, forma de la
vesícula, presencia de métulas y posición de las fiálides.
El género Aspergillus se caracteriza por presentar:
- Conidióforos que terminan en vesículas dilatadas.
- Fiálides o estructuras en forma de botella que originan a las conidias.
- Conidias dispuestas en cadena.
- En algunas especies se presentan las métulas o estructuras de soporte de las fiálides y
las células de Hülle o estructuras hialinas de función desconocida.

1.1.1 Aspergillus niger


a. Características macroscópicas: Las colonias son lanosas y blancas en un inicio y
posteriormente son negras. En el reverso presentan un color crema o gamuza.
b. Características microscópicas: Las vesículas son esféricas cubiertas en su totalidad
por las métulas, fiálides y conidias.
- Biseriado: Métulas grandes y fiálides pequeñas.
- Conidias lisas en un inicio y posteriormente rugosas.

47
1.1.2 Aspergillus terreus
a. Características macroscópicas: Las colonias son aterciopeladas de color canela –
beige o marrón y posteriormente se tornan granulosas con un exudado color ámbar. En el
reverso presentan matices amarillos y marrones.
b. Características microscópicas: Las vesículas tienen forma de cúpula cubiertas solo
en el tercio superior por la métulas, fiálides y conididas.
- Biseriado: Métulas y fiálides.
- Conidias elípticas y lisas.

a b

Figura 7.1 Aspergillus terreus, a. Colonias en medio de cultivo, b. Observación microscópica.

1.1.3 Aspergillus fumigatus


a. Características macroscópicas: Las colonias son vellosas y blancas en un inicio y
posteriormente se tornan aterciopeladas o granulosas, color azul verdoso, gris verdoso o verde
esmeralda. En el reverso presentan un color blanco o crema.
b. Características microscópicas: Las vesículas tienen forma de cúpula, cubiertas en
su mitad superior o dos tercios de su superficie por las fiálides.
- Uniseriado: Fiálides.
- Conidias globulosas y equinuladas.

48
a b

Figura 7.2 Aspergillus fumigatus, a. Colonia en medio de cultivo, b. Observación microscópica.

1.1.4 Aspergillus clavatus


a. Características macroscópicas: Las colonias tienen aspecto de fieltro y color verde
azulado o verde petróleo. En el reverso presentan tonalidades marrones.
b. Características microscópicas: Las vesículas son claviformes y alargadas.
- Uniseriado: Fiálides.

a b

Figura 7.3 Aspergillus clavatus, a. Colonias en medio de cultivo, b. Observación microscópica

1.1.5 Aspergillus flavus


a. Características macroscópicas: Las colonias son aterciopeladas de color amarillo,
verdoso, marrón o verde amarillento. En el reverso presentan un color dorado a marrón rojizo.
b. Características microscópicas: Las vesículas están cubiertas totalmente por las
métulas, fiálides y conidas.
- Uniseriado o biseriado: Fiálides o métulas y fiálides.

49
a b

Figura 7.4 Aspergillus flavus, a. Colonia en medio de cultivo, b. Observación microscópica.

1.2 Género Penicillium


Reino Fungi
Phyllum Ascomycota
Clase Euascomycetes
Orden Eurotiales
Familia Tricomaceae
Género Penicillium

Para identificar a los hongos del género Penicillium se les cultiva en PDA (Agar papa
dextrosa) durante 7 días y se observa la morfología y color de las estructuras microscópicas.
El género Penicilliun se caracteriza por presentar:
- Conidióforos ramificados, distinguiéndose ramas y métulas.
- Métulas son las penúltimas ramas que sostienen a las fiálides.
- Todas las células entre las métulas y el conidióforo principal (estipe) son denominadas
ramas. El patrón de ramificación puedes ser simple, con una ramificación, con dos
ramificaciones o con tres a más ramificaciones. Las colonias son de color verde con
aspecto pulverulento fino.

50
2 Objetivos
2.1 Diferenciar macroscópicamente levaduras y mohos
2.2 Diferenciar microscópicamente levaduras y mohos
2.3 Diferencias macroscópicamente Aspergillus y Penicillium
2.4 Diferenciar microscópicamente Aspergillus y Penicillium

3 Procedimiento
1.1 Características macroscópicas de levaduras y mohos
Levaduras: Las colonias se asemejan a las de las bacterias pero son más grandes,
cremosas, mucosas, brillantes, de consistencia muy pastosa y a veces rugosa
Mohos: Las colonias son irregulares. Pueden ser algodonosas, aterciopeladas,
filamentosas, secas y presentar diferentes coloraciones.

a b

Figura 7.5 Colonias en medios de cultivo a. Levaduras, b. Mohos


.

4.2 Características microscópicas de levaduras y mohos


Levaduras: Están formadas por células esféricas u ovaladas, algunas de las cuales pueden
estar gemando.
Mohos: Están formados por estructuras tubulares, filamentosas, denominadas hifas, que
pueden presentar septas (hifas septadas) o carecer de ellas (hifas cenocíticas).

51
a b

c d

Figura 7.6 Características diferenciales de mohos y levaduras. a y b. Células levaduriformes


c. Hifa cenocítica d. Hifa septada.

52
4.3 Características macroscópicas diferenciales de los géneros Aspergillus y Penicillium

a b

Figura 7.7 Colonias en medio de cultivo, a. Aspergillus niger, b. Penicillium sp.

3.4 Características microscópicas diferenciales de los géneros Aspergillus y Penicillium

a b

Figura 7.8 Observaciones microscópicas, a. Aspergilluis niger, b. Penicllium sp.

53
Figura 7.9 Características microscópicas del género Aspergillus

Figura 7.10 Características microscópicas del género Penicillium

5. Referencias bibliográficas
- Carreño, C. (2010). Manual de Prácticas de Microbiología Industrial. Lambayeque,
Perú.
- Madigan, M., Martinko, J. y Parker, J. (2004). Brock. Biología de los Microorganismos (10ª
ed.) Madrid, España: Parson Educación, S.A.
- Muntañola, M. (1999). Guía de los Hongos Microscópicos. Barcelona, España:
Ediciones Omega, S.A.

54
PRÁCTICA VIII
RECONOCIMIENTO DE LAS ETAPAS DE UN PROCESO
DE FERMENTACIÓN INDUSTRIAL

Un proceso de fermentación típico es aquel que se lleva a cabo en un recipiente llamado


fermentador o biorreactor, en el que determinados sustratos que componen el medio de cultivo
son transformados por acción microbiana en metabolitos y biomasa (producto). En el esquema
general de un proceso de fermentación existen cuatro etapas diferenciadas: propagación de
cultivos, fermentación, operaciones y procesos de separación y purificación de los productos
(recuperación de producto) y tratamiento de los residuos.

1. Propagación de cultivos
La propagación de cultivos se realiza en laboratorio y comienza con un tubo de ensayo que
contiene un cultivo reciente de un microorganismo o un tubo liofilizado o congelado, donde se
conserva el microorganismo de interés obtenido comercialmente. En ambos casos el proceso,
comprende aislamiento, selección, mantenimiento y mejoramiento de los microorganismos de
interés industrial.

Los microorganismos que se utilizan en un proceso, pueden ser obtenidos por aislamiento a
partir de fuentes naturales o de una colección de cultivos .La fuente de todos los
microorganismos industriales es el ambiente natural (suelo, agua), animales y plantas enfermas,
alimentos de fermentaciones naturales (vino, pan, queso) y materiales en descomposición. A
nivel industrial, en general, cada firma posee su propia colección de organismos, muchos de los
cuales han sido mejorados a través de técnicas clásicas de mutación o de ingeniería genética En
el mundo existe un gran número de colecciones depositarias de cultivos como American Type
Culture Collection (ATCC), USA y la Colecciòn Española de cultivos tipo (CECT) las cuales
mantienen bacterias, levaduras, algas, actinomycetos, mohos, protozoos, virus y líneas celulares.

Elegida la fuente de aislamiento, las posibilidades de éxito dependen de la técnica utilizada,


siendo las alternativas: a) aislamiento directo b) enriquecimiento de la muestra con o sin
pretratamiento. Una vez efectuado el aislamiento de los microorganismos se procede al
“screening” primario que es una selección cualitativa para detectar si el microorganismo
produce o no un compuesto. Por ejemplo, seleccionar microorganismos productores de ácidos
orgánicos, enzimas, antibióticos por la presencia de halos transparentes o de zonas de

55
inhibición de crecimiento, respetivamente. Se prosigue con el “screening" secundario, que es
una selección cuantitativa para valorar la producción y productividad industrial. Por ejemplo,
determinar el espectro antimicrobiano, la concentración de ácidos orgánicos o de enzimas
producidas.

Después de la selección de microorganismos industriales es preciso mantenerlos y


conservarlos. El mantenimiento es por cortos períodos de tiempo (días) y la conservación por
largos períodos de tiempo (años), a través de diferentes técnicas que corresponden a la
desecación, congelación y liofilización.

En general los organismos aislados de la naturaleza producen metabolitos de interés


industrial en concentraciones muy bajas, por lo tanto se hace necesario incrementar estos
rendimientos, para lograr una mayor rentabilidad de los procesos. Una forma de mejorar el
rendimiento es mediante la optimización del medio de cultivo y de las condiciones de
operación, pero está limitado por la capacidad de síntesis máxima del producto deseado que
tiene el organismo. La otra posibilidad es el mejoramiento genético de la cepa por selección
natural de variantes, mutación inducida y recombinación genética. La productividad potencial
de un organismo es controlada por su genoma, pudiendo ser modificado para incrementar los
rendimientos. Con el organismo modificado se reexaminan las condiciones de cultivo para
lograr nuevamente la máxima productividad.

Finalmente, se procede a la propagación de los cultivos o inóculos, teniendo como material


de partida los microorganismos seleccionados y en el mejor de los casos mejorados, debiendo
aumentar la cantidad de los mismos mediante sucesivos pasajes en frascos de volúmenes
crecientes, que son generalmente operados en agitadores (5 a 100 mL y entre 100 a 10 000 mL
respectivamente)

2. Fermentación
Un proceso típico de fermentación comienza con la formulación y esterilización del medio
de cultivo así como la esterilización del equipo (tanque de inóculo o prefermentador y
fermentador de producción). El inóculo propagado sucesivamente en matraces se siembra en el
tanque de inóculo o prefermentador que puede tener un volumen de 10 L a 1 000 L, según la
escala industrial posterior. Del tanque de inóculo se siembra al fermentador industrial o de
producción cuyo volumen varía de acuerdo al producto a obtener y a su concentración y está
comprendido entre 1000 a 100 000 L. En algunos casos especiales, como la producción de
proteína microbiana, los tanques de fermentación pueden llegar hasta 1 000 000 L.

56
El tamaño de inóculo generalmente es de 1 a 10 % del volumen total del medio. Si es
inferior a esta proporción se puede prolongar el periodo de latencia, lo que incrementará el
periodo de fermentación. Se considera 5 a 10 % para hongos y actinomicetos y 0,1 a 3,0 % para
bacterias, a excepción de los actinomicetos.

3. Operaciones y procesos de separación y purificación de los productos


Estas etapas comprenden en forma general y sucesivamente: a) separación de insolubles
por filtración, centrifugación o decantación; b) separaciones primarias por extracción,
absorción, adsorción, ultrafiltración; c) purificación por extracción líquido – líquido o
extracción a dos fases acuosas, o cromatografía de afinidad, y finalmente d) aislamiento
del producto.

4. Tratamiento de residuos
Si bien no tiene una relación directa con el producto, que es la razón de ser la industria de
fermentación, representa una etapa imprescindible, porque es fundamental controlar la calidad y
cantidad de residuos que salen de la fábrica y que son enviados generalmente a un curso de
agua, sea un canal, arroyo, un río o al mar.

57
Procesos y
Propagación operaciones de Tratamiento
Fermentación
de los cultivos separación y de residuos
purificación

Separación

Residuos

Esterilización Purificación

Tratamiento

Preparación de Producto
medios

Materias
primas

 Aislamiento
 Selección
 Mantenimiento
 Mejoramiento
 Propagación o
multiplicación de
cultivos

Figura 8.1 Esquema general de un proceso de fermentación o bioproceso.

58
5. Referencias bibliográficas

Dorán, P. (1995). Principios de Ingeniería de los Bioprocesos. España: Editorial Acribia.

Ertola, R., Yantorn, O. & Mignon, C. (1994). Microbiología Industrial. Argentina.

Madigan M., Martinko, J. & Parker, J. (2004). Brock. Biología de los Microorganismos.
10 a ed. Madrid: Pearson Educación, S.A.

59
PRÁCTICA IX
AISLAMIENTO, SELECCIÓN Y MANTENIMIENTO DE
CULTIVOS LÁCTICOS TERMÓFILOS:
Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus y Streptococcus thermophilus

1. Introducción
Los cultivos lácticos iniciadores, fermentos o starters son microorganismos seleccionados
que se emplean en la industria de alimentos fermentados. Según la temperatura óptima de
crecimiento, los cultivos lácticos comerciales pueden ser termófilos y mesófilos y según su
composición pueden ser fermentos de cepa única, múltiples y mixtos.
Los cultivos lácticos termófilos contienen bacterias cuya temperatura óptima de
crecimiento está entre 40 a 45 ºC. Son utilizados para la elaboración de yogurt y quesos duros y
están constituidos por Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus, Streptococcus thermophilus,
Lactobacillus helveticus y L. lactis. El yogurt es un producto lácteo fermentado que resulta del
crecimiento de Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus y Streptococcus thermophilus en leche
concentrada (por evaporación o por adición de sólidos).
Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus es un bacilo Gram positivo, largo, no móvil, que
produce ácido D (-) láctico. Fermenta fructosa, galactosa, glucosa y lactosa, pero no maltosa y
sacarosa. Requiere 11 a 15 aminoácidos, según las cepas y acidifica la leche más lentamente
que los estreptococos, pero generalmente más intensamente gracias a una mayor resistencia al
pH ácido (hasta pH 3,5) y a una concentración más elevada de ácido láctico (máximo 27 g/L).
Streptococcus thermophilus es un coco Gram positivo, esférico, agrupado en pares o en
cadenas, homofermentativo y produce ácido L (+) láctico a partir de glucosa, fructosa, lactosa y
sacarosa. Se distingue básicamente por su crecimiento termófilo con un óptimo de 42 a 43 ºC y
termorresistencia a 60 ºC durante 30 minutos.
Los estreptococos y lactobacilos transforman 20 a 30 % de la lactosa de la leche en ácido
láctico. La lactosa es hidrolizada a través de una B – D – galactosidasa en D – glucosa y B – D
galactosa. A continuación, la D – glucosa es trasformada en ácido pirúvico y después en ácido
láctico, mientras que la galactosa es excretada y se acumula progresivamente en la leche, porque
no es utilizada por los microorganismos del yogurt.
Durante la fermentación del yogurt (42 a 45 ºC) se mantiene un equilibrio entre la
población de estreptococos y lactobacilos y un favorable efecto sinérgico entre los dos
gérmenes, ya que su crecimiento conjunto es más rápido que el crecimiento en un cultivo puro
de cada uno de ellos. El estreptococo utiliza péptidos y aminoácidos (valina) liberados a partir
de las proteínas de la leche por los lactobacilos y a su vez, el crecimiento de éstos es estimulado

60
por compuestos producidos por los estreptococos como ácido fórmico, anhídrido carbónico y
ácido pirúvico.
Los criterios de caracterización y selección de las bacterias lácticas termófilas utilizadas en
la elaboración del yogurt se basan en cuatro propiedades que se determinan después de su
cultivo en leche: acidificación a temperatura elevada, acidificación a baja temperatura,
producción de acetaldehído y viscosidad del medio de cultivo. La medida de la producción de
ácido láctico a 44 ºC, durante la fase de crecimiento exponencial, caracteriza la actividad
acidificante en la fermentación del yogurt. El control de la producción de ácido láctico a
temperaturas entre 4 a 12 ºC después del crecimiento exponencial, durante 24 días, permite
predecir los fenómenos de post – acidificación, durante la comercialización del producto. La
cantidad de acetaldehído producido representa una buena forma de apreciar el efecto de una
bacteria sobre el aroma del yogurt, ya que el acetaldehído es el componente mayoritario en este
aroma. Finalmente, la medida de la viscosidad de la leche por determinación de las fuerzas de
cizallamiento, permite conocer directamente la contribución de una bacteria a la viscosidad del
producto final.
La elaboración de yogurt a pequeña escala permite comprobar las propiedades tecnológicas
de las mezclas de bacterias previamente seleccionadas en laboratorio. El análisis organoléptico
de los productos obtenidos a escala industrial aporta información suplementaria sobre las
aptitudes de las mezclas de cepas, en lo que respecta a su contribución al aroma y viscosidad del
producto final. Una vez seleccionadas las bacterias lácticas, éstas son conservadas y
comercializadas en diversas formas, cada una de las cuales presenta ventajas y desventajas.

a) Cultivos líquidos frescos o estárter líquidos


Para su obtención se requiere de leche en polvo desnatada, reconstituida (10 a 12 %
extracto seco magro, E.S.M.), esterilizada en autoclave a 15 libras de presión durante 10 a 15
minutos e incubada a 30 ºC durante 1 semana para comprobar su esterilidad. Tras la inoculación
(1 a 2 %) la leche es incubada a 30 ºC durante 16 a 18 horas o a 42 ºC durante 3 horas a 4
horas. Después, el cultivo coagulado es refrigerado y cuando la acidez del cultivo refrigerado es
de aproximadamente 0,85 % de ácido láctico se tiene la garantía que durante 1 semana se
mantendrá su actividad y la relación cocos: bacilos (1:1), recomendándose realizar como
máximo 15 a 20 resiembras. Este tipo de estárter se conoce en la industria láctica como cultivos
de reserva de trabajo. Su principal desventaja consiste en su corto periodo de conservación,
debido al posterior desarrollo de acidez y contacto de las células con el medio ácido, lo que resta
actividad al cultivo.

Se puede conseguir una conservación más prolongada de cultivos líquidos utilizando


leche Litmus esterilizada en autoclave e incubada durante 1 semana para comprobar su

61
esterilidad. Después de la siembra se incuba a 42 ºC durante 12 horas y se almacena en
refrigeración. Estos cultivos solo tienen que ser reactivados una vez cada 3 semanas y son
conocidos como cultivos de reserva.

b) Cultivos liofilizados (no concentrados)


El estárter se cultiva en leche en polvo desnatada, reconstituida, esterilizada en
autoclave con un porcentaje de inoculación de 2 % y se incuba a 42 ºC durante 4 horas.
Después, se mantiene a 5 ºC durante 18 horas y posteriormente se distribuye en alícuotas de 2 a
3 mL en viales de vidrio estériles. Los viales se congelan a – 40 ºC durante 2 a 3 horas,
después son liofilizados durante 36 horas, cerrados al vacío, sellados y se mantienen a 5 ºC
hasta su utilización.
Para la activación de los cultivos liofilizados se vierte el contenido del vial en
250 mL de leche en polvo desnatada, reconstituida, esterilizada en autoclave y se incuba a 42 ºC
durante 12 a 15 horas. Para lograr una actividad total se realizan una a dos siembras en el
mismo medio con una tasa de inoculación de 2 % y una incubaciòn a 42 ºC durante 4 horas.
Como desventaja, los cultivos liofilizados presentan largas fases de latencia, siendo preciso la
resiembra como mínimo dos veces para lograr cultivos líquidos activos, de allí que para la
producción de los cultivos finales se utilice el sistema de Siembra a gran escala (sistema 1), ya
que de otro modo se precisa una gran cantidad de cultivo deshidratado y largos periodos de
incubación.

c) Cultivos congelados (no concentrados)


El estárter es congelado en forma rápida a temperaturas de – 40 a – 45 ºC, pudiendo
mantenerse así por 3 a 8 meses. Las unidades deben ser descongeladas y propagadas una vez
previa a su utilización a nivel industrial. Como desventaja se puede señalar que las posibilidades
de transporte a bajas temperaturas se ven limitadas desde el punto de vista económico.

d) Cultivos congelados o liofilizados concentrados de inoculación directa


En el mercado existen cultivos congelados o liofilizados concentrados, fácilmente
utilizables para la inoculación directa de los cultivos estarter definitvos (sistema 2) o
alternativamente, para la inoculación directa de la leche en el caso de fábricas de yogurt a
pequeña escala, En ambos casos, aunque el tiempo de producción puede verse incrementado en
1 o 2 horas, se consigue un importante ahorro, al eliminar la necesidad de personal
especializado en el manejo de cultivos estarter.

Los cultivos congelados o liofilizados concentrados vienen en presentaciones listas


para su uso que no necesitan activación previa y que son destinadas para volúmenes desde 10

62
hasta miles de litros. Además de contener proporciones determinadas de Lactobacillus
delbrueckii ssp. bulgaricus y S. thermophilus se suplementan con otros microorganismos como
Lactobacillus acidophilus.

Cuadro 8.1. Recuento de microorganismos viables en algunos cultivos estárter del yogurt

Tipo de cultivo o método de Recuento de microorganismos


conservación viables
Líquido 3 – 5 x 108/mL
Liofilizado 2 – 3 x 109/g
Concentrado liofilizado 4 – 6 x 1010/g
Congelado en nitrógeno líquido 2 x 109/mL
Fuente: Tamine & Robinson, 1991

2. Objetivos

2.1 Aislar e identificar Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus y Streptococcus


thermophilus.
2.2 Caracterizar y seleccionar Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus y Streptococcus
thermophilus según la acidificación de la leche a 44 ºC.
2.3 Mantener Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus y Streptococcus thermophilus
como cultivos de reserva de trabajo.
2.4 Obtener y mantener adecuadamente un cultivo estárter líquido (cultivo de reserva de
trabajo) de yogurt.

3. Procedimiento
3.1 Aislamiento e identificación de Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus y
Streptococcus thermophilus
a. Muestra
Leche fresca, yogurt natural.
b. Pretratamiento de la muestra
Para el aislamiento de S. thermophilus calentar la leche a 60 ºC, durante 30
minutos.
c. Enriquecimiento
 Homogenizar la muestra de leche.
 Sembrar 1 mL de cada una de las muestras en tubos con 9 mL de caldo
MRS.

63
 Incubar los tubos a 30 °C en una atmósfera de 5 a 8 % de CO2 durante 24
horas (Jarra de Brewer).

d. Aislamiento
 Tomar una asada de la muestra de leche enriquecida y sembrar mediante la
técnica de agotamiento y estría sobre agar Rogosa (placas de Petri).
 Incubar en jarra de Brewer a 30 °C, por 24 horas.
 Seleccionar las colonias brillantes, convexas, de 1 a 2 mm de diámetro
(Lactobacilos) y las colonias puntiformes (Estreptococos). Realizar tinción de
Gram para observar la morfología bacteriana y reacción a la tinción de Gram.
 Subcultivar en viales conteniendo agar Rogosa inclinado, para obtener
cultivos puros y proceder a su identificación.

e. Identificación
 Prueba de catalasa.
 Crecimiento a 45 °C (caldo MRS).
 Crecimiento a 10 ºC (caldo MRS).
 Crecimiento en 2 y 4 % NaCl (caldo MRS- NaCl).
 Acidez a partir de maltosa, sacarosa, manitol, glucosa, lactosa (tubos con
caldo MRS - carbohidrato).
 Termoresistencia (caldo MRS).

64
Cuadro 9.1. Características diferenciales de Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus

Termófilos Termófilo Mesófilos Termófilos


bulgaricus helveticus lactis plantarum casei acidophilus fermentii
45 ºC + + + (+)(-) (+)(- + +
)
NaCl 2 % - - + + + + +
60 ºC x - + + - - - -
90´
Maltosa - + + + + + +
Sacarosa - - + + + + -
Manitol - - - + + - -
Fuente: Holt et al. (1994)

Cuadro 9.2. Características diferenciales de Streptococcus thermophilus

S. termophilus L. lactis ssp. lactis


45 ºC + (+)(-)
10 ºC - +
NaCl 2 % (+)(-) +
NaCl 4 % - +
Glucosa (acidez) +
Lactosa (acidez) + +
Sacarosa (acidez) +
Maltosa (acidez) - +
60 ºC x 30´ + -
Fuente: Holt et al. (1994)

3.2 Caracterización y selección de Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus y


Streptococcus thermophilus según la acidificación de la leche a 44 ºC
 Obtener una suspensión de células en solución salina estéril de cada una de las bacterias
aisladas e identificadas y cultivadas en agar Rogosa durante 24 horas. Estandarizar la
concentración celular con el tubo 3 del Nefelómetro de Mc Farland. Tambièn se puede
sembrar cada bacteria en caldo MRS, a 30 ºC por 24 horas
 Sembrar 2 mL de cada suspensión celular o de caldo MRS cultivado, en un matraz
conteniendo 98 mL de leche en polvo desnatada, reconstituida (10 – 12 % ESM),

65
esterilizada en autoclave a 15 libras durante 10 minutos e incubada a 30 ºC durante 24
horas para comprobar su esterilidad (leche tratada).
 Incubar los matraces a 44 °C durante 6 horas.
 Determinar el porcentaje de acidez expresada en ácido láctico, utilizando el método
Acidimétrico de Mann, a las 0 y 6 horas después de la inoculación. Tomar 10 mL del
contenido de cada matraz, agregar tres gotas de una solución alcohólica de fenoltaleína 1
% y titular con NaOH 0,1N, hasta que aparezca un color ligeramente rosado persistente.
Cada mililitro de NaOH 0,1N gastado en la titulación equivale a 0,009 de ácido láctico.
Ejemplo de cálculo de porcentaje de acidez: Suponer que para titular 50 mL de caldo
fermentado se gastaron 10 mL de NaOH 0,1N

 Seleccionar las bacterias que presentan el mayor porcentaje de acidez titulable. S.


thermophilus produce en la leche 0,7 a 0,8 % de ácido láctico. Algunas cepas llegan
hasta 1,0 %. Por su parte, L. delbrueckii ssp. bulgaricus produce hasta 1,7 % de ácido
láctico en leche.

3.3 Mantenimiento de L. delbrueckii ssp. bulgaricus y Streptococcus thermophilus


como cultivos de reserva de trabajo

Independientemente, obtener una suspensión de L. delbrueckii ssp. bulgaricus y


Streptococcus thermophilus y estandarizar su concentración celular con el tubo 3 del
nefelómetro de Mc Farland. A continuación, tomar 2 mL de cada una de las suspensiones e
inocularlos independientemente en matraces con 100 mL de leche tratada. Incubar a 42 ºC
durante 4 horas. Mantener en refrigeración a 8 ºC y subcultivar semanalmente.

3.4 Obtención y mantenimiento de un cultivo iniciador líquido de yogurt (cultivo de


reserva de trabajo)

 Sembrar 1,0 mL de Streptococcus thermophilus y 1,0 mL de Lactobacillus


delbrueckii ssp. bulgaricus (proporción 1:1), haciendo un total de 2 mL, en un
matraz con 100 mL de leche tratada.
 Incubar a 42 ºC durante 4 horas.
 Determinar el porcentaje de acidez titulable (debe ser de 0,85 %).
 Mantener en refrigeración y resembrar semanalmente.

66
1 mL Lactobacilos

9 mL
caldo
MRS

30 ºC con 5 a 8 % de
ENRIQUECIMIENTO

CO2, 24 horas
Muestra: Calentar la leche a 60 °C
Leche fresca durante 30 minutos

9 mL
caldo
Pretratamiento MRS
de la muestra para
estreptococos

1 mL Estreptococos

Figura 9.1 Pretratamiento y enriquecimiento de la muestra.

Lactobacilos Lactobacilos

Incubar en jarra
de Brewer a 30 °C
por 24 horas
AISLAMIENTO

Subcultivar
en Agar
Tinción de Gram Rogosa

Tomar una asada


y sembrar en
agar Rogosa.

Estreptococos
Estreptococos

Figura 9.2 Aislamiento de Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus y Streptococcus thermophilus.

67
L. delbrueckii
Lactobacilos ssp. bulgaricus
Resultados

Maltosa -
45 °C -

IDENTIFICACIÓN NaCl 2 % -
Maltosa - 45 °C – NaCl 2 %

Resultados

Maltosa -
45 °C +
NaCl 4 % -
Maltosa - 45 °C – NaCl 4 %
S. thermophilus
Estreptococos

Figura 9. 3 Identificación de Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus y Streptococcus thermophilus.

2 mL

5 mL

L. delbrueckii
ssp. bulgaricus

Tubo 3 del 98 mL de leche tratada: % de acidez: 3 gotas de


Suspensión 44 °C por 6 horas
nefelómetro fenolftaleína y titular con
NaOH 0.1N

5 mL

S. thermophilus
2 mL

Figura 9.4 Caracterización y selección de Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus y


Streptococcus thermophilus.

68
2 mL

L. delbrueckii
ssp. bulgaricus
CRT
L. delbrueckii ssp.
Tubo 3 del 98 mL de leche tratada: bulgaricus
Suspensión
nefelómetro 42 °C por 4 horas

S. thermophilus
2 mL
CRT
S. thermophilus

Figura 9.5 Obtención de cultivos de reserva de trabajo (CRT).

CRT
L. delbrueckii ssp.
bulgaricus
1 mL

Incubar a 42 °C
por 4 horas

Cultivo iniciador
líquido de yogurt
(CRT mixto)
1 mL
CRT
S. thermophilus

Figura 9.6 Obtención y mantenimiento de un cultivo iniciador líquido de yogurt (CRT


mixto).

69
4. Anexos

4.1 Agar Rogosa (g/L)


Peptona l0,0
Extracto de levadura 5,0
Glucosa 20,0
K H2 PO4 6,0
Citrato amónico 2,0
Tween 80* 1,0
Acetato de sodio** 15,0
Sulfato de manganeso* 0,120
Sulfato de hierro* 0,034
Sulfato de magnesio* 0,575
Agar agar 15,0
Agua destilada csp 1L
pH 5,5**
No autoclavar
**Selectividad para Lactobacillus
*Factores de crecimiento para Lactobacillus

4.2 Caldo MRS: Man, Rogosa, Sharpe (g/L)


Peptona 10,0
Estracto de levadura 5,0
Extracto de carne 10,0
Glucosa 20,0
K H2 PO4 2,0
Tween 80* 1,0
Citrato biamónico 2,0
Acetato de sodio* 5,0
Sulfato de manganeso* 0,05
Sulfato de magnesio* 0,02
Agua destilada csp 1000 mL
pH 6,5
*Factores de crecimiento para Lactobacillus

70
Cuadro 9.3. Características de algunas especies de Lactobacillus

ADN Acido
Especie Peptidoglicano Hábitat
(%) láctico
L. delbrueckii ssp. delbrueckii 49-51 Lys –Asp D vegetales
L. delbrueckii ssp. bulgaricus 49-51 Lys –Asp D yogur, queso
L. delbrueckii ssp. lactis 49-51 Lys –Asp D queso
I
L. acidophilus 34-37 Lys –Asp DL boca, vagina
L. gasseri 33-35 Lys –Asp DL boca, vagina
L. helveticus 38-40 Lys –Asp DL queso
L. casei ssp. casei 45-47 Lys –Asp L rumen
L. casei ssp. pseudoplantarun 45-47 Lys –Asp DL queso, forraje
L. casei ssp. tolerans 45-47 Lys –Asp L boca, vagina
II L. casei ssp. rhamnousus 45-47 Lys –Asp L tracto intestinal
L. sake, Lb. curvatus 42-44 Lys –Asp DL vegetales
L. bavaricus 42-44 Lys –Asp L vegetales
L. plantarum 44-46 meso – DAP DL vegetales, queso
L. bifermentans 44-46 Lys –Asp DL queso
L. brevis 45-47 Lys –Asp DL vegetales, queso
L. buchneri 44-46 Lys –Asp DL vegetales, queso
L. kefir 40-42 Lys –Asp DL kefir
III L. reuteri 40-42 Lys –Asp DL tracto intestinal
L. fermentii 52-54 Orn – D Asp DL vegetales, queso
L. confusus 45-47 Lys –Ala DL vegetales
L. viridescens 45-47 Lys – Ala – Ser DL productos cárnicos
L. Sanfrancisco 36-38 Lys – Ala DL pan, panettone
Fuente: Leveau y Bouix (2000)

a. Homofermentativos obligatorios
 Fermentación de pentosas y gluconato (-).
 Células largas, rectas,a menudo en empalizadas.
 Hasta 18 g/litro ácido D (–) láctico .

b. Homofermentativos facultativos
 Fermentación de pentosas y gluconato (+) (heterofermentativa).
 Células cortas a menudo ordenadas en filamentos.
 Poco ácido láctico 3 a 13 g/L (DL ó L+).

71
c. Heterofermentativos
 Fermentación de pentosas: ácido láctico y acético.
 Células cortas y separadas.
 Débil producción ácido láctico 5 g/L (DL).

Cuadro 9.4. Bacterias àcido – lácticas y especies predominantes utilizadas en los productos
lácteos fermentados.
Productos Especies utilizadas*
Mantequilla fermentada L. lactis lactis, L. lactis cremoris, L. lactis lactis var. diacetylactis,
Tradicional Leuconostoc cremoris
Recombinante L. helveticus
Yogurt
Tradicional S. thermophilus, L. delbrueckii ssp. bulgaricus
Bioyogurt S. thermophilus, L. delbrueckii ssp. bulgaricus, L. acidophilus
Biogarde S. thermophilus, L. acidophilus, Bifidobacterium bifidum
Yakult L. casei
Leche acidófila L. lactis lactis, L. lactis cremoris, L. lactis lactis var. diacetylactis,
Leuconostoc., L. acidophilus
Kéfir L. lactis lactis, L. lactis cremoris, L. casei, L. caucasicus, Sach. kefir
Koumis L. acidophilus, L. delbrueckii ssp. bulgaricus, levaduras
Leben Lactococcus, Lactobacillus
Queso fresco
Quark L. lactis lactis, L. lactis cremoris
Cottage L. lactis lactis, L. lactis cremoris
Camembert y Brie L. lactis lactis, L. lactis cremoris, P. camemberii
Roquefort o azul Cultivo láctico, P. roqueforii o caseicolum
Queso semicurado
Muenster L. lactis lactis, L. lactis cremoris
Stilton L. lactis lactis, L. lactis cremoris, Leuconostoc ssp.
Queso madurado
Cheddar L. lactis lactis, L. lactis cremoris
Gouda/Edam L. lactis lactis, L. lactis cremoris, L. lactis lactis var. diacetylactis,
Leuconostoc ssp.
Emmenthal S. thermophilus, L. delbrueckii ssp. bulgaricus, L. helveticus,
Propionibacterium spp.
Parmesano L. lactis lactis, L. lactis cremoris, S. thermophilus, L. delbrueckii ssp.
bulgaricus
Mozzarella L. lactis lactis, S. thermophilus, L. delbrueckii ssp. bulgaricus
Fuente: Lee, 1996

72
5. Referencias bibliográficas

Fonseca, L. & Larrea, C. (2006). Efecto de la concentración de melaza e inóculo mixto de


Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus y Streptococcus thermophilus en la
elaboración de ensilado de jurel (Trachurus picturatus murphyi). Tesis de
Licenciatura. Lambayeque, Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo.
Leveau, J. & Bouix, M. (2000). Microbiología Industrial. Los microorganismos de interés
industrial. España: Editorial Acribia, S.A.
Marguet, E. & Vallejo, M. (2007). Curso Internacional:Biotecnología de Bacterias
AcidoLácticas. Su importancia en procesos Industriales. Universidad Nacional Mayor
de San Marcos, 23 al 28 de abril de 2007, Lima
Servicio Nacional de Adiestamiento en Trabjo Industrial, SENATI, (1999) Elaboración de
yogurt Líquido, Batido y Aflanado. Lima: Artes Gráficas del IPACE.
Tamine, A. & Robinson, R. (1991). Yogurt: Ciencia y Tecnología. España: Editorial Acribia
S.A.

73
PRACTICA X
RECUPERACIÓN DE PRODUCTO EXTRACELULAR:
Leuconostoc mesenteroides ssp. mesenteroides
PRODUCTOR DE EXOPOLISACARIDO DEXTRANO

1. Introducción
El término recuperación (dowstream processing) es un término colectivo, para todos las
etapas que se requieren para recuperar (separar, extraer y purificar) productos útiles de un
proceso industrial. En muchos casos la primera etapa del final de una fermentación, es la
separación de los sólidos del líquido, que casi siempre es acuoso. El propio microorganismo
puede ser el producto final deseado; sin embargo, en la mayor parte de los procesos a gran
escala el producto deseado es un metabolito que está presente intracelularmente (ácidos
nucleicos, vitaminas) o extracelularmente (aminoácidos, ácido cítrico, alcohol, antibióticos).

Para la separación de las partículas o separación de la biomasa celular y los componentes


solubles del sobrenadante del cultivo existen varios métodos que incluyen la floculación,
flotación, filtración y centrifugación. Si el metabolito que se va a aislar es intracelular, éste debe
ser liberado de las células antes de proceder a la siguiente etapa. Para la desintegración de los
microorganismos se pueden utilizar métodos químicos (uso de álcalis, solventes orgánicos,
detergentes, cloruro de sodio), métodos biológicos (lisis enzimática) y métodos físicos
(ultrasonido, congelación y descongelación, acción mecánica). Una vez que el metabolito ha
sido separado de las células, la selección de etapas adicionales de purificación dependerá del
producto deseado. Los métodos de aislamiento permiten separar y en su caso purificar el
producto de interés e incluyen la cromatografía, extracción, cristalización, precipitación y
desecación.

Leuconostoc mesenteroides es una bacteria Gram positiva, con un porcentaje de G+C


en su ADN, que se encuentra entre 37 a 41 %. Son cocos dispuestos en pares o en cadenas más
o menos cortas, heterofermentativos con producción de ácido D (-) láctico, etanol y CO2, son
mesófilos con desarrollo óptimo a 28 °C. Leuconostoc mesenteroides ssp. mesenteroides se
caracteriza porque utiliza citrato y sintetiza el polisacárido dextrano, pero no produce
acetoína ni diacetilo.

74
El dextrano es una goma soluble en agua que se utiliza ampliamente como espesante,
gelificante, agente de suspensión y coloide protector en distintos productos de consumo
humano. Este polisacárido muestra características propias aplicables en productos alimenticios
como estabilizador de jarabes azucarados, helados, dulces y clínicamente como expansor del
plasma sanguíneo. Leuconostoc mesenteroides ssp. mesenteroides es una bacteria constituyente
de la microbiota del jugo de la caña de azúcar que procede de la molienda en las empresas
azucareras y es la subespecie de mayor interés industrial como productor de dextrano.

2. Objetivos
2.1 Aislar e identificar Leuconostoc mesenteroides ssp. mesenteroides.
2.2 Recuperar el dextrano producido.
2.3 Seleccionar Leuconostoc mesenteroides ssp. mesenteroides según el dextrano
producido.
2.4 Mantener adecuadamente Leuconostoc mesenteroides ssp. mesenteroides productor
de dextrano.

3. Procedimiento
3.1 Aislamiento e identificación de Leuconostoc mesenteroides ssp. mesenteroides
a. Muestra
Jugo Crusher o jugo primario de la molienda de caña de azúcar (también se puede
utilizar jugo mezclado y jugo residual).

b. Procesamiento de la muestra
Realizar diluciones de la muestra en solución salina estéril hasta 10-2.

c. Aislamiento de Leuconostoc
 Tomar una alícuota de la dilución 10-2 y sembrarla mediante la técnica de
agotamiento y estría sobre agar hipersacarosado (placas de Petri)
 Incubar en aerobiosis a 30 °C durante 48 horas.
 Seleccionar cuatro colonias puntiformes que al estar rodeadas de dextrano
presentan tamaño grande (0,5 a 3,0 cm de diámetro), forma circular, bordes
enteros, elevación convexa, consistencia gomosa, aspecto opaco, y son
incoloras.
 Cultivar las colonias seleccionadas hacia una placa conteniendo agar
hipersacarosado modificado. Incubar en aerobiosis a 30 ºC por 24 horas.

75
d. Identificación de Leuconostoc mesenteroides ssp. mesenteroides
Para identificar la especie y subespecie, utilizar las colonias desarrolladas sobre
agar hipersacarosado modificado y tomar en cuenta la morfología y fisiología celular.
Para determinar la morfología observar las colonias características sin dextrano:
puntiformes, 0.5 a 1 mm de diámetro, bordes enteros, lisas, brillantes, incoloras. Realizar una
tinción de Gram y reconocer la morfología celular: cocos Gram positivos, dispuestos en pares y
en cadenas cortas sin formas esporuladas. Para determinar la fisiología realizar las pruebas de
catalasa (negativo), la fermentación de carbohidratos (Glucosa: acidez +, gas +; Arabinosa
(acidez +); Fructosa, sucrosa o trehalosa (acidez +) y formación de dextrano a partir de sacarosa
(+). Subcultivar la especie identificada en dos viales, uno conteniendo agar hipersacarosado y
otro con agar hipersacarosado modificado.

Cuadro 10.1. Características diferenciales de Leuconostoc mesenteroides

Leuconostoc mesenteroides
ssp. ssp. ssp.
cremoris dextranicum mesenteroides
Arabinosa - - +
Fructosa, sucrosa o trehalosa - + +
Formación de Dextrano a partir de sucrosa - + +
Fuente: Holt et al. (1994)

3.1 Selección de Leuconostoc mesenteroides ssp. mesenteroides según el dextrano


producido
a. Obtención de inóculo
 Tomar una asada de las colonias de Leuconostoc mesenteroides ssp.
mesenteroides desasrrolladas en agar hipersacarosado y sembrarla mediante la
técnica de agotamiento y estría sobre agar hipersacarosado (placas de Petri)
 Incubar a 30 °C durante 48 horas.
 Seleccionar las tres colonias con dextrano que presenten el mayor diámetro.
b. Producción de dextrano
 Transferir las tres colonias seleccionadas hacia un matraz de 250 mL
conteniendo 40 mL de caldo hipersacarosado. Para lograrlo, con el asa
micológica cortar el disco de agar de aproximadamente 0,5 cm de diámetro
que contiene integramente a cada una de las colonias seleccionadas.
 Incubar a 30 °C durante 72 horas para permitir la producción y acumulación de
dextrano.

76
c. Recuperación del producto dextrano
 Verter el caldo hipersacarosado fermentado en un vaso de precipitación y
adicionar lentamente 30 mL de metanol absoluto, agitando constantemente con
movimientos rotatorios.
 Dejar en reposo 5 horas o centrifugar a 2 000 rpm durante 5 minutos.
 Filtrar el caldo fermentado y llevar el dextrano precipitado a estufa a 40 °C
durante 48 hasta alcanzar peso constante.
 Seleccionar la cepa de L. mesenteroides ssp. mesenteroides que alcanze el
mayor peso en dextrano seco.

3.2 Mantenimiento de Leuconostoc mesenteroides ssp. mesenteroides productoras de


dextrano
Cultivar Leuconostoc mesenteroides ssp. mesenteroides en viales con agar
hipersacarosado e hipersacarosado modificado. Incubar a 30 °C y mantener en
refrigeración.

77
Diluciones
De la dilución
hasta 10-2
10-2 sembrar
por técnica de
agotamiento y
estría

Jugo crusher 10-1 10-2


Agar Hipersacarosado (AH)

30 ºC/48
horas en
aerobiosis
Tinción de
Gram

Subcultivar
30 ºC/48
horas en
aerobiosis

Agar hipersacarosado Seleccionar colonias que al


modificado (AHM) estar rodeadas de dextrano
presentan tamaño grande

(AHM) (AH)

30ºC / 24 horas

L. mesenteroides
ssp. mesenteroides
Caldo Arabinosa Arabinosa +

Figura 10.1. Aislamiento e identificación de Leuconostoc mesenteroides ssp. mesenteroides.

78
OBTENCIÓN DE INÓCULO

Subcultivar
(AH) por
agotamiento
y estría

30 ºC/48
horas

L. mesenteroides Agar hipersacarosado


PRODUCCIÓN DE DEXTRANO

30 ºC/72 h

Sembrar en 40 mL de Cortar tres discos de


caldo hipersacarosado agar con colonias

Agregar 30 mL
de metanol
RECUPERACIÓN DEL DEXRRANO

absoluto

Filtrar

Llevar el dextrano
precipitado a estufa a Pesar el dextrano
Reposar 5 horas
40 ºC (peso constante)

Figura 10. 2 Obtención de inóculo, producción y recuperación de dextrano.

79
Figura 10.3 Dextrano producido por diferentes cepas de L. mesenteroides ssp. mesenteroides.

80
4. Anexo

4.1 Agar hipersacarosado (g/L)


Extracto de levadura 5,0
Triptona 10,0
Citrato sódico 1,0
Glucosa 5,0
Gelatina 2,5
Sacarosa 100,0
Agar 15,0
Agua destilada csp 1L
pH 7
A 100 mL de agar hipersacarosado adicionar asépticamente 0,75
mL de una solución estéril al 1 % de azida de sodio.

4.2 Agar hipersacarosado modificado (g/L)


Extracto de levadura 5,0
Triptona 10,0
Citrato sódico 1,0
Glucosa 5,0
Gelatina 2,5
Agar 15,0
Agua destilada csp 1L
pH 7

4.3 Caldo hipersacarosado (g/L)


Extracto de levadura 5,0
Triptona 10,0
Citrato sódico 1,0
Glucosa 5,0
Gelatina 2,5
Sacarosa 100,0
Agua destilada csp 1L
pH 7

81
5. Referencias bibliográficas

Gastelo, E. & Ortiz, J. (2005). Niveles de contaminación por Leuconostoc mesenteroides y


Leuconostoc dextranicum en el proceso de elaboración del azúcar de caña. Empresa
agroindustrial Tumán, S.A. 2002. Tesis de Licenciatura. Lambayeque, Universidad
Nacional Pedro Ruiz Gallo.

León, E. & Soplapuco, C. (2007). Efecto de la concentración de sacarosa contenida en el


extracto de vainas de algarrobo (Prosopis pallida) en la producción de exopolímeros por
cepas nativas de Xanthomonas campestris y Leuconostoc mesenteroides ssp.
mesenteroides. Tesis de Licenciatura. Lambayeque, Universidad Nacional Pedro Ruiz
Gallo.

Velásquez, M. (2005). Leuconostoc mesenteroides productores de dextrano aisladas del jugo


de caña de cooperativas de producción azucarera. Chiclayo. Enero, Marzo.2002. Tesis
de Licenciatura. Lambayeque, Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo.

82
PRÁCTICA XI
BACTERIAS ACÉTICAS PRODUCTORAS DE VINAGRE:
ACETOBACTER Y GLUCONOBACTER

1. Introducción
La actividad metabólica microbiana no tiene siempre como consecuencia la proliferación
celular. Si se considera la actividad metabólica de un cultivo microbiano a lo largo de toda la
curva de crecimiento se diferencian aquellos procesos metabólicos asociados al crecimiento
celular (metabolismo primario), de aquellos que tienen lugar en la fase estacionaria, una vez que
ha cesado el crecimiento de la biomasa (metabolismo secundario). Como resultado, se
producen diferentes tipos de compuestos, metabolitos primarios y secundarios.
Los metabolitos primarios son moléculas de bajo peso molecular que intervienen bien como
productos finales o intermediarios en las distintas rutas anabólicas y catabólicas y se forman
durante la fase primaria del crecimiento microbiano. Los más importantes desde el punto de
vista industrial son alcoholes (etanol), aminoácidos (ácido glutámico, lisina, treonina), ácidos
orgánicos (láctico, acético, propiónico, succínico, fumárico, málico, tartárico, cítrico,
glucorónico), polioles (glicerol, manitol), polisacáridos (xantano, dextrano), azúcares (fructosa,
sorbosa) y vitaminas (riboflavina B2, cianocobalamina B12).
Las bacterias acéticas son microorganismos bacilares o pleomórficos Gram negativos
(Gram positivos en cultivos viejos) y estrictamente aerobios. Se distribuyen en los géneros
Acetobacter y Gluconobacter según tengan o no capacidad de oxidar el acetato (presencia del
ciclo de Krebs funcional). Los integrantes de ambos grupos pueden diferenciarse cultivándolos
en agar sólido que contenga alcohol y una suspensión de cal. Como consecuencia de la
formación de ácido acético por oxidación del alcohol primero se formará alrededor de las
colonias de ambos grupos un halo claro en el agar que tiene aspecto opaco y turbio porque el
ácido acético transforma la cal en acetato de cal soluble. En las del grupo Gluconobacter esta
zona se mantiene y aumenta lentamente. Por el contrario en Acetobacter el acetato cálcico se
precipita como CaCO3 que se degradará a CO2 y H2O con lo que la zona clara en torno a las
colonias se enturbiará otra vez si se siguen incubando las placas.
La característica metabólica que define al grupo de las bacterias acéticas es la capacidad de
utilizar una gran diversidad de sustratos y la incapacidad de oxidarlos completamente. A pesar
de tratarse de microorganismos aerobios, acumulan en el medio que crecen una gran cantidad de
catabolitos diferentes. Son responsables de la “fermentación acética” a partir del etanol y
también de la formación de ácido glucorónico a partir de la glucosa, sorbosa del sorbitol,
dihidroxiacetona de la glicerina y 5 – cetogluconato de la glucosa. Las bacterias del ácido

83
acético, además de muchos alcoholes, oxidan ácidos orgánicos como el pirúvico y el láctico y
algunos de ellos producen celulosa.
Gluconobacter es siempre catalasa positivo, pero en las especies del género Acetobacter
la prueba de catalasa puede dar una reacción débil e incluso nula (A. peroxydans). Las
bacterias acéticas pueden aislarse fácilmente de vinagre y también del vino, cerveza o de
zumos de frutas agriadas. A su vez, el género Acetobacter inicialmente fue dividido en tres
grupos: peroxydans (A. peroxydans y A. paradoxum); oxydans (A. pasteurianus,
A. levanicux, A. ascendens y A. rauceus) y mesoxydans (A. aceti, A. xylinum y
A. mesoxydans). Actualmente se aceptan solo tres especies: A. aceti, A. pasteurianus y
A. peroxydans, las demás serían subespecies.

2. Objetivos
2.1 Aislar e identificar bacterias acéticas.
2.2 Seleccionar bacterias acéticas según su producción de acidez.
2.3 Mantener adecuadamente bacterias acéticas productoras de acidez.
3. Procedimiento

3.1 Aislamiento e identificación de bacterias acéticas

Muestra
Frutas ácidas: limón, naranja, lima, uva.
Enriquecimiento de la muestra
 Depositar 20 mL de cerveza en frascos de boca ancha.
 Sumergir por 15 minutos y en frascos separados uva, manzana, limón y naranja.
 Retirar los frutos.
 Cubrir los frascos con gasa o malla para evitar la entrada de insectos.
 Mantener a temperatura ambiente hasta por 4 días.
 Observar el crecimiento bacteriano en forma de un velo o película blanquecina
sobre la superficie.
 Realizar una tinción de Gram para determinar la presencia de bacilos cortos
Gram negativos.

Aislamiento
 Tomar una pequeña porción de la película bacteriana desarrollada en las
muestras enriquecidas y sembrarla mediante la técnica de agotamiento y estría
sobre agar Lee.
 Incubar en aerobiosis a 30 °C durante 24 horas.

84
 Seleccionar las colonias amarillas.
 Realizar tinción de Gram.
 Repicar a viales conteniendo Agar Manitol o un frasco con 25 mL de cerveza.

Identificación
 Catalasa: Positiva para Acetobacter y Gluconobacter.
 Crecimiento a pH 4.5: Positivo en caldo levadura glucosa pH 4,5.
 Oxidación del etanol a CO2: Cultivar en tubos conteniendo Agar Lee.
A las 24 horas el medio de cultivo las colonias que produjeron ácido acético se
observarán de color amarillo.
A las 48 o 72 horas el medio de cultivo y las colonias que oxidan el etanol a
CO2 retornan al color inicial del medio de cultivo.

3.2 Selección de bacterias acéticas según su producción de acidez


Tomar 2,5 mL de una suspensión en solución salina de cada una de las bacterias
acéticas (agar manitol) o 2,5 mL de cerveza culivada y sembarlos en matraces
conteniendo 50 mL de cerveza.
Incubar a 30 °C durante 48 horas.
Determinar la acidez titulable a través del método acidimétrico de Mann (Factor para
ácido acético = 0, 006005)
Realizar los cálculos correspondientes.

85
Cuadro 11.1. Características diferenciales de los géneros Gluconobacter, Acetobacter y
Pseudomonas
Características Gluconobacter Acetobacter Pseudomonas
Polar o Polar
Peritrica o ninguna
Flagelación ninguna
+
Crecimiento a pH 4.5 + -
Oxidación de:
+ (F)
Etanol a ácido acético a CO2 + (M) -
+
Ácido acético a CO2 - d
+
Lactato a CO2 - +
d
Glucosa a gluconato + d
Aminoácidos por células en reposo
+
Ciclo de Krebs - +
+
Producción de 5 – cetogluconato - +
d
Cetogénesis + -
d
Quinonas Q10 + -
-
Quinonas Q9 +
+
Hidrólisis de: -
Lactosa y almidón
-
Gelatina - d
-
Pigmentos verdosos y/o fluorescentes -/D d
-
- d
M: marcado, F: fuerte, d: variable
Fuente: Parés y Juárez, 1997

3.3 Mantenimiento de bacterias acéticas


Cultivar las bacterias acéticas en tubos tapa rosca con medio Estándar GYC, incubar a
30 ºC y mantener en refrigeración. Subcultivar mensualmente.
Las bacterias acéticas también se pueden mantener en cerveza, renovándola
semanalmente.

86
Frutas ácidas 20 mL de
cerveza

Frutas ácidas en
cerveza por 15
minutos

Retirar los frutos

Cubrir los frascos


con gasa para
evitar la entrada
de insectos

Mantener a
temperatura ambiente
hasta por 4 días

Observar crecimiento
bacteriano en forma
Tinción de Gram:
de película superficial
bacilos cortos
Gram negativos

Figura 11.1 Enriquecimiento de la muestra para aislamiento de bacterias acéticas.

87
Alícuota de
la película

Aerobiosis a
30 ºC/24
horas

Muestra
enriquecida Agar Lee

Cultivar
Tinción de
Gram

Gluconobacter Incubar a 30 ºC / Incubar a


48 horas 30ºC/ 24
horas

Agar Lee

Bacilos
Gram
negativos
Acetobacter

Figura 11. 2 Aislamiento de bacterias acéticas.

88
Sembrar
2,5 mL de la
suspensión

Incubar en Determinar
aerobiosis a la acidez
30 ºC/48
horas

50 mL de cerveza
Suspensión de
bacterias acéticas en
cerveza

Sembrar 2,5 mL
de la suspensión

Renovar
Mantenimiento cerveza
semanalmente
50 mL de cerveza

Figura 11.3 Selección y mantenimiento de bacterias acéticas según su producción de acidez.

4. Anexo
4.1 Medio de enriquecimiento: Cerveza
Colocar asépticamente en frascos de boca ancha 20 mL de cerveza.

4.2 Medio Lee (g/L)


CaCO3 2,0
KH2PO4 0,1
K2HPO4 0,2
Peptona 10,0
Casaaminoácidos 1,0
Extracto de levadura 10,0
Glucosa 10,0
Agar agar 16,0
Agua destilada csp 1L
pH 7,0
Indicador Azul de bromotimol
Disolver y esterilizar a 121 °C x 15 minutos. Antes de su uso incorporar 5
mL de etanol.

89
4.3 Medio estándar, GYC (g/L)
Extracto de malta 3,0
Extracto de levadura 10,0
D – glucosa 50,0 g
Agar agar 25,0 g
Agua csp 1L
Mantener en frascos con tapa rosca

4.4 Medio agar manitol (g/L)


Extracto de levadura 5,0
Peptona 3,0
Manitol 25,0
Agar agar 15,0
H2O csp 1L
pH 7,0
Mantener en frascos con tapa rosca

5. Referencias bibliográficas
Alva, R. & Romero, J. (2001). Obtención de vino y vinagre a partir de la banana. Tesis
Ingeniero Químico .Lambayeque, Perú, Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo.

Castillo, M. & Chavarri, N. (2004).Optimización de la concentración de inóculo, sustrato


y tiempo de incubación en la obtención de vinagre utilizando Acetobacter aceti
CECT 298T a partir de licor de maíz en biorreactor Airlift. Tesis de Licenciatura.
Lambayeque, Perú. Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo.

Parés, R. & Juárez, A. (1997). Bioquímica de los Microorganismos. México: Editorial


Reverté.

90
PRÁCTICA XII
ACTINOMICETOS PRODUCTORES DE ANTIBIÓTICOS

1. Introducción

Los metabolitos secundarios como los antibióticos son moléculas sintetizadas por
determinados microorganismos normalmente en una fase tardía del ciclo de crecimiento. Son
compuestos que no son necesarios para la biosíntesis celular, no tienen por lo tanto un papel
directo en el metabolismo energético y, en consecuencia no se conoce con claridad la razón de
su existencia. La biosíntesis de los metabolitos secundarios está estrechamente relacionada con
el metabolismo primario de las células que los producen, ya que usualmente sus precursores son
metabolitos primarios normales o modificados como ácidos orgánicos, unidades de isopropano,
aminoácidos alifáticos y aromáticos, bases purinas o pirimídicas.

De todos los productos tradicionales obtenidos por fermentación los más importantes para
la salud humana son los metabolitos secundarios entre los que se incluyen, además de los
antibióticos, ciertas toxinas de hongos, alcaloides, insecticidas, factores de crecimiento vegetal
(giberelinas), pigmentos y tensioactivos.

Los actinomicetos comprenden bacterias en su mayoría aerobias y algunas anaerobias


encontradas en animales y el hombre. Generalmente son Gram positivos, presentan una
diversidad morfológica considerable desde formas bacilares hasta formas filamentosas
ramificadas a modo de esporulación compleja con un pocentaje de G + C en su ADN superior
al 55 %. Su crecimiento es lento y las colonias desarrollan sobre la superficie de los medios
sólidos con una consistencia firme y adheridas firmemente al sustrato solidificado. Están
constituidas por micelio vegetativo (inmerso en el medio de cultivo sólido) y micelio aéreo en
cuyos extremos se encuentran las conidias (esporas asexuadas) que brindan a la colonia su
pigmentación y su apariecia polvorienta; sin embargo algunos actinomicetos sólo producen
micelio vegetativo.

Los actinomicetos son microorganismos muy ubicuos y aunque las primeras cepas fueron
aisladas de fuentes humanas y animales, el suelo constituye su reservorio más rico y a partir
del cual estos microorganismos pueden invadir numerosos biotopos.

91
2. Objetivos

2.1 Aislar actinomicetos de suelo agrícola.


2.2 Seleccionar actinomicetos productores de antibióticos.
2.3 Identificar actinomicetos productores de antibióticos.
2.4 Mantener adecuadamente actinomicetos productores de antibióticos.

3. Procedimiento

3.1 Aislamiento de actinomicetos de suelo

a. Muestra
100 g de suelo agrícola
b. Tratamiento de la muestra
 Si la muestra de suelo se encuentra húmeda, dejarla secar bajo sombra.A
continuación, triturarla con rodillo y posteriormente tamizarla (malla de 1,6
mm )
 Realizar diluciones de la muestra en solución salina hasta 10-2. Para la
primera dilución tomar una submuestra de 25 g del tamizado y depositarlos en
un matraz conteniendo 225 mL de solución salina estéril (10-1). Agitar
vigorosamente durante 20 minutos. Para la dilución 10-2 tomar 1 mL de la
dilución anterior y trasvasar a un tubo con 9 mL de solución salina estéril.
c. Aislamiento
 Tomar una alícuota de la dilución 10-2 y sembrarla mediante la técnica de
agotamiento y estría sobre agar Jensen al que se le ha incorporado Nistatina
más Ciclohexamida (50 µg/ mL.) para inhibir el desarrollo de mohos y y
Polimixina B (5µg/ mL) y Penicilina (1µg/ mL) para limitar el crecimiento de
otras bacterias.
 Incubar en aerobiosis a temperatura ambiente (30 °C) hasta por 5 días.
 Seleccionar las colonias características de actinomicetos: pequeñas, adheridas
fuertemente al sustrato, compactas, secas, pulverulentas, mayormente
pigmentadas, con olor a tierra húmeda.
 Realizar tinción de Gram de cada una de las colonias. Observar la morfología
celular, disposición de conidias, esporas y presencia o ausencia de
fragmentación en el micelio.
 Cultivar en viales conteniendo agar Jensen inclinado.

92
3.2 Selección de actinomicetos productores de antibióticos (Test de antibiosis)
 Sembrar cada uno de los actinomicetos, agotando completamente sobre la tercera
parte de una placa de Petri con agar Waksman e incubar en aerobiosis, a 30 °C
durante 4 días.
 Sembrar por estría y en forma perpendicular al actinomiceto (a 2 mm) cada una de
las cinco bacterias prueba: Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Bacillus
anthracis, Staphylococcus aureus y B. subtilis.
Incubar a 37 °C durante 24 horas.
 Observar y medir la zona de inhibición del crecimiento de las bacterias prueba.

3.3 Identificación morfológica de actinomicetos productores de antibióticos


Tomar en cuenta las características macroscópicas de las colonias y microscópicas de
las células. En cuanto a las colonias la forma es circular, tamaño pequeño, mayormente
pigmentadas, de textura coriácea, fuertemente adheridas al sustrato, compactas, de aspecto
polvoriento y con olor a tierra húmeda.
Para determinar las caracteristicas microscópicas de las células realizar el microcultivo
de cada una de los actinomicetos e investigar la presencia de conidias y disposición (aisladas,
en pares, cadenas cortas, cadenas largas, espirales, rectas) o la presencia de esporangios (con
esporas móviles o no móviles). Realizar una tinción de Gram y observar células Gram positivas
y formación de filamentos ramificados con o sin fragmentación y presencia de conidias con
diferente disposición.

Microcultivo (Método de Riddell)


Utilizar una cámara húmeda que consiste en una placa de Petri con un triángulo de
vidrio como soporte de una lámina portaobjetos y un algodón ligeramente humedecido. Colocar
en la parte central de la lámina portaobjetos un pequeño bloque cuadrado de agar Jensen y
sembrar cada actinomiceto en la periferia del agar. Posteriormente cubrir el bloque de agar con
una laminilla cubre objetos estéril e incubar durante 3 días a temperatura ambiente.

3.4 Mantenimiento de actinomicetos productores de antibióticos


 Sembrar cada uno de los actinomicetos productores de antibióticos en caldo
glicerinado 20 %.
 Incubar a 30 °C durante 3 días.
 Mantener en refrigeración.

93
Muestra: 100 g de suelo Tamizar la muestra Pesar 25 g de la muestra
agrícola

Sembrar por
agotamiento y estría

Agar Jensen Dilución 10-2 Dilución 10-1

Incubar a 30 ºC/hasta
por 5 días

Cultivar

Agar Jensen

Seleccionar colonia de
actinomiceto Tinción de
Gram

Figura 12.1 Aislamiento de actinomicetos de suelos agrícolas.

94
30 ºC/ 4 días

Cultivo puro de Sembrar el actinomiceto agotando Sembrar por estría y en forma


actinomiceto completamente sobre la tercera parte perpendicular al actinomiceto cada
de la placa con Agar Waksman una de las cinco bacterias prueba

37 ºC / 24horas

Bacterias prueba
1) Escherichia coli
2) Klebsiella pneumoniae
3) Bacillus anthracis Observar y medir la zona
de inhibición del
4) Staphylococcus aureus
crecimiento de las
5) Bacillus subtilis bacterias prueba

Figura 12. 2 Selección de actinomicetos productores de antibióticos (Test de antibiosis).

95
4. Anexo

4.1 Agar Jensen (g/L)


Sacarosa 2,0
Caseína hidrolizada 0,25
Sulfato de magnesio 0,20
Cloruro férrico 0,10
Agar agar 20,0
Agua destilada csp 1L
pH 7,0

4.2 Medio Waksman para la producción de antibióticos (g/L)


Extracto de carne 5,0
Peptona 5,0
Cloruro de sodio 5,0
Glucosa 10,0
Agar agar 15,0
Agua destilada csp 1L
pH 7,0

4.3 Caldo glicerinado


Cloruro de sodio 0,5
Peptona 1,0
Glicerina 20 mL
Agua destilada 80 mL
pH 7,0

96
5. Referencias bibliográficas
Hernández, A. & Mondragón, A. (2002). Actinomicetos aislados de suelos agrícolas para el
control de Epinotia aporema “barrenador de brotes” en Medicago sativa “alfalfa”
Ferreñafe, Lambayeque, Marzo – diciembre.2001. Tesis de Licenciatura .Lambayeque,
Perú, Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo.
Huaman, S. & Lupuche, J. (2002). Evaluación de la actividad insecticida de los actinomicetos
aislados de suelos agrícolas del distrito San José, frente a Spodoptera frugiperda
“cogollero del maíz”. Lambayeque, Febrero-Octubre, 2001. Tesis de Licenciatura.
Lambayeque, Perú. Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo.
Sandoval, M. & Vásquez, J. (2001). Actinomicetos mesofílicos aerobios con actividad
antimicrobiana, aislados de suelos degradados en la provincia de Lambayeque,
Febrero- setiembre, 2000. Tesis Licenciatura .Lambayeque, Perú, Universidad
Nacional Pedro Ruiz Gallo.
Sialer, C. & Horna, D. (2002). Efecto de sustancias secretadas por Streptomyces spp. aislados
de “hormigas” (tribu Attini) sobre dermatofitos. Tesis de Licenciatura. Lambayeque,
Perú. Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo.

97
PRÁCTICA XIII
Aspergillus niger PRODUCTOR DE ÁCIDO CÍTRICO

1. Introducción

Los ácidos orgánicos producidos por microorganismos se obtienen en fermentaciones


clásicas o anaerobias (ácido láctico, ácido propiónico) y en las fermentaciones oxidativas u
oxidaciones incompletas (ácido acético, ácido glucónico, ácido fumárico, ácido cítrico, ácido
glutámico, cetoácidos, oxoácidos).

Los microorganismos productores de ácidos pueden ser detectados cuando son cultivados
en medio con agar y carbonato de calcio. Los carbonatos insolubles como el CaCO3 finamente
pulverizado son muy útiles, porque debido a su insolubilidad no crean en el medio de cultivo
condiciones fuertemente alcalinas, especialmente si se usan con otros amortiguadores; sin
embargo, cuando el pH disminuye por debajo de 7,0 el carbonato se descompone con
desprendimiento de CO2. Las colonias microbianas productoras de ácidos disuelven la caliza
precipitada o insoluble observándose fácilmente zonas claras sobre el fondo opaco del medio de
cultivo.

Muchos ácidos se obtienen a escala industrial en procesos con hongos. La ventaja de su


utilización se basa sobre todo en la fácil recuperación de los organismos a partir del caldo de
cultivo. Entre los principales ácidos producidos por hongos se encuentran el láctico (Rhizopus),
fumárico (Mucor, Cunninghamella, Circinella, Rhizopus), glucónico y cítrico (Aspergillus,
Penicillium).

El ácido cítrico se produce en su totalidad por fermentación. El descubrimiento de la


capacidad de algunos hongos filamentosos de producir ácido cítrico se remonta a 1893, gracias
a los estudios de Wehmer. En 1917 Currie demostró que especies de Aspergillus niger
acumulaban ácido cítrico a la par con ácido oxálico. Posteriormente se definieron las
condiciones que reducían la producción del ácido oxálico contaminante. A partir de entonces,
variedades de Aspergillus niger han dominado la producción industrial, fundamentalmente
porque su fisiología es más conocida que la de otros hongos y porque utilizan materias primas
de bajo costo como melazas de caña.

98
2. Objetivos

2.1 Aislar e identificar Aspergillus niger.


2.2 Detectar y seleccionar cepas de A. niger productores de ácidos orgánicos.
2.3 Mantener adecuadamente A. niger productores de ácidos orgánicos.

3. Procedimiento

3.1 Aislamiento e identificación de A. niger

Muestra: 100 g de suelo agrícola

1- Procesamiento de la muestra
 Tamizar la muestra de suelo (tamiz con malla de 1,6 mm) y del material
obtenido tomar 10 g y llevarlos a un matraz con 90 mL de solución salina
estéril (10-1).
 Homogenizar durante 20 minutos.
 Realizar una dilución en solución salina hasta 10-2.

2- Aislamiento e identificación de Aspergillus niger


 Tomar un alícuota de la dilución 10-2 y y sembrarla por agotamiento y estría
sobre agar Sabouraud Dextrosa (placas de Petri)
 Incubar las placas a temperatura ambiente (30 ºC) hasta por 5 días.
 Seleccionar las colonias características de Aspergillus niger, tomando en cuenta
las características macroscópicas y microscópicas.
 Repicar las colonias seleccionadas a tubos conteniendo agar Sabouraud
Dextrosa inclinado.

3- Características macroscópicas de la colonia de Aspergillus niger


La colonia es inicialmente blanca o amarilla y rápidamente desarrolla un efecto de
pimienta negra sobre la superficie a medida que se forman las conidias (que pueden
volverse densas) de tal manera que la colonia se vuelve negra con el reverso de
color crema. El aspecto de la colonia es pulvurulenta y uniforme.

4- Características microscópicas de la colonia de Aspergillus niger


 Hifas vegetativas: Hifas tabicadas que forman micelio filamentoso irregular,
ramificado, tabicado y de pared gruesa.

99
 Conidióforo (Esporóforo de sostén): Hifas fértiles que emergen o parten de
una célula alargada del micelio vegetativo denominada célula pie (foot cell) y
terminan en una porción ensanchada o vesícula. Son incoloras, o amarillo
pardo, lisas, no tabicadas y de paredes gruesas.
 Vesícula o cabeza esporifera: Vesícula esférica de la cual emergen estructuras
de forma de botella denominados fialides, cuyos extremos son puntos de
crecimiento, de donde las conidas continuamente se están formando. La
conidia más joven es la que está más cerca de la fiálide y la más vieja es la que
está más lejos, al final de la cadena (Basipetalmente).
Según algunos autores las fialides se presentan en dos series: primarias y
secundarias. Según otros autores las estructuras que salen directamente de la
vesícula se denominan métulas y están adosadas en paquetes cubriendo la
vesícula (forma radial) y sobre ellos están las fialides que son más pequeñas,
con distribución más uniforme y es a partir de ellas de donde emergen las
conidias.
 Conidias: Se ubican sobre las fiálides formando cadenas (catenuladas) y al
madurar presentan una pared gruesa y rugosa debido a una sustancia negra
(aspergilina) que se deposita sobre su superficie y por tanto oscurecen la
superficie de la vesícula.

3.2 Detección y selección de A. niger productor de ácidos orgánicos


b. Detección (screening primario)
 Tomar un pequeño fragmento de colonia de cada una de las cepas de A.
niger y colocarlo en el centro de placas de Petri servidas con agar carbonato de
calcio.
 Incubar a temperatura ambiente (30 ºC) por 4 días. A continuación mantener las
placas de Petri en refrigeración por 48 horas.
 Reconocer la producción de acidez por la formación de un halo traslúcido
alrededor y por debajo de la colonia.
c. Selección (screening secundario)
 Sembrar un fragmento de 1 cm de la colonia de A. niger productora de acidez
en un matraz con 50 mL de medio de fermentación.
 Determinar la acidez inicial (método acidimétrico de Mann).
 Incubar a températura ambiente (30 °C) durante 5 días.
 Determinar la acidez final (método acidimétrico de Mann).
 Factor para ácido cítrico: 0,007005

100
Cálculo de acidez
Volumen titulado : 5 mL
Gasto de NaoH : 7,5 mL
Factor para ácido cítrico : 0,007005

% acidez :
acidez : 1,05075 % de acidez expresada como ácido cítrico

3.3 Mantenimiento de A. niger productor de ácidos orgánicos


Sembrar A. niger productor de acidez en tubos conteniendo agar papa dextrosa
(PDA). Incubar a 30° durante 5 días. Mantener en refrigeración.

101
Muestra: 100 g de Tamizar la Pesar 10 g de la muestra
suelo agrícola muestra

Sembrar por
agotamiento y
estría

Agar Sabouraud Dextrosa Dilución 10-2 Agregar 10 g de la


muestra en 90 mL de
SSE (10-1)
Incubar a 30 ºC/
hasta por 5 días

Cultivar

Agar Sabouraud Aspergillus niger


Dextrosa

Figura 13.1 Aislamiento e identificación de Aspergillus niger.

102
Tomar un
fragmento

30 ºC / 4 días y
luego refrigerar

Aspergillus niger

Agar Carbonato de Calcio Halo alrededor de la


colonia

Figura 13.2 Detección y selección de Aspergillus niger productor de ácidos orgánicos.

Incubar a 30 ºC
por 5 dias

Aspergillus niger

Tomar 5 mL del cultivo y


50 mL de medio titular con NaOH 0.1N
de fermentación

Figura 13.3 Detección y selección de Aspergillus niger productor de ácidos orgánicos.

Subcultivar en agar
papa Dextrosa
Incubar a 30 ºC
hasta por 5 días

Aspergillus niger Mantener en


refrigeración

Figura13. 4 Mantenimiento de Aspergillus niger productor de ácidos orgánicos.

103
4. Anexo

4.1 Agar Papa Dextrosa (g/L)


Infusión de papa 500 mL
Dextrosa 20,0
Agar agar 20,0
H2O destilada csp 1L
pH 5,6
Para obtener la infusión de papa hervir 200 g de papa pelada y picada en 500 mL.
de agua destilada. Después de 15 minutos completar a 500 mL con agua destilada,
enfriar, filtrar y completar nuevamente.

4.2 Agar Sabouraud Dextrosa (g/L)


Dextrosa 20,0
Peptona 10,0
Agar agar 20 ,0
H2O destilada csp 1L
pH 5,6
Para inhibir el desarrollo bacteriano agregar cloramfenicol al 0,05 % (disolver una
cápsula de cloramfenicol de 250 mg en 10 mL de metanol). Agregar 2 mL del
antibiótico en 1 L de agar Sabouraud Dextrosa estéril y enfriado a a 45 – 50 °C.

4.3 Medio agar carbonato de calcio (g/L)


Extracto de levadura 10,0
NaCl 5,0
Glucosa 30,0
Peptona 5,0
Na2HPO4.12H2O 1,0
Agar 15,0
Carbonato de calcio (CaCO3) 10,0
H2O destilada csp 1L
pH 6,5

104
4.4 Caldo sacarosado para producción de ácidos orgánicos: Medio de
fermentación (g/L)
Sacarosa 190 ,0
MgSO4.7H2O 0,3
(NH4)NO3 2,3
CaCO3 5,0
KH2PO4 1,0
H2O destilada csp 1L
pH 3 (ajustar con HCl 2M)

5. Referencias bibliográficas

Aldana, W. & Espinoza, M. (2001). Estudio paramétrico de la producción de ácido cítrico a


partir de Ipomoea batata (camote) variedad morado con Aspergillus. Tesis Ingeniero
Químico .Lambayeque, Perú, Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo.

Claudio, E. & Zegarra, L. (1998). Aislamiento y selección de mohos productores de ácido


cítrico a partir de sacarosa. Tesis de Licenciatura. Lambayeque, Perú. Universidad
Nacional Pedro Ruiz Gallo.

Felipe, G. & Minchán, H. (2000). Optimización de la concentración de sustrato, pH y tiempo


de incubación en la producción de ácido cítrico por A. niger en cultivo sumergido.
Tesis de Licenciatura. Lambayeque, Perú. Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo.

Torres, P. & Uriarte, M. (2002). Efectos del metanol en la producción de ácido cítrico por
Aspergillus niger en un medio de glucosa. Tesis Ingeniero Químico. Lambayeque, Perú.
Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo.

Parés, R. & Juárez, A. (1997). Bioquímica de los Microorganismos. México: Editorial


Reverté.

105
PRÁCTICA XIV
SELECCIÓN DE UNA CEPA ENOLÓGICA DE
Saccharomyces cerevisiae

1. Introducción
En el mercado existen levaduras enológicas como Saccharomyces cerevisiae Montrachet
y Pasteur Champagne; sin embargo, se prefiere el uso de cepas levaduriformes que procedan de
la zona vinícola donde se van a utilizar. Estas levaduras nativas o levaduras locales
seleccionadas, están adaptadas a las condiciones climáticas de la zona, a la materia prima, es
decir al mosto a fermentar y son responsables, al menos parcialmente de las características
únicas de los vinos obtenidos.

1.1 Aislamiento de levaduras


El primer paso para seleccionar una levadura nativa, es conocer la biota autóctona a
través de un estudio ecológico en el que se realizan aislamientos de fermentaciones
espontáneas en la zona a estudiar, durante varias campañas. De esta manera, además de tener
un número mayor de cepas, el aislamiento de una misma cepa durante años consecutivos puede
ser un buen indicador de que se trata de una cepa bien adaptada a las condiciones de la zona.

1.2 Identificación de cepas de levaduras


La primera diferenciación que se debe realizar a las colonias de levaduras aisladas es a
nivel de especie, mediante medios selectivos, concretamente el medio lisina en donde
Saccharomyces cerevisiae no crece (porque la única fuente de nitrógeno es la lisina), pero si
desarrollan otras levaduras. La segunda diferenciación, para la cual se eligen 40 a 50 colonias
de S. cerevisiae aleatoriamente, permite la identificación a nivel de cepa utilizando técnicas de
biología molecular (análisis de los perfiles de restricción del ADN mitocondrial: RFLPs).

1.3 Proceso de selección en laboratorio


Los criterios utilizados para la selección de cepas de S. cerevisiae consistían en una
sucesión de pruebas para determinar la ausencia o presencia de ciertos caracteres importantes en
cepas vínicas como presencia de factor killer, tiempo de fermentación, capacidad fermentativa
en mostos con elevada concentración de azúcar, formación de sulfuro de hidrógeno;
sin embargo, el ir probando cada una de las cepas en fermentaciones individuales y caracterizar
todos los productos finales es una labor muy tediosa, por lo que es preferible realizar la
selección de cepas en fermentaciones masivas por competencia.

106
Se elige un número definido de cepas de S. cerevisiae, se inoculan en un mismo
fermentador y se hace un seguimiento de su crecimiento durante la fermentación. La población
inicial de las cepas debe ser la misma para que todas tengan las mismas posibilidades de
imposición (1 x 105 UFC/ mL).

El número de cepas a analizar dependerá de las cepas aisladas, pero no sería aconsejable
utilizar un número superior a 20 (población final de 2 x 107 UFC / mL).Si se tiene un número
superior a 20 cepas, es recomendable descartar algunas. Un criterio a seguir puede ser tomar
como referencia las fermentaciones espontáneas y elegir aquellas cepas que hayan tenido una
presencia relevante a lo largo de éstas. De hecho, se pueden dar casos de cepas, que se hayan
aislado en porcentajes muy bajos en un momento determinado de la fermentación y en un solo
año y que por tanto, no puedan considerarse levaduras representativas de la zona, ya que
probablemente se trate de cepas poco resistentes al etanol y a las condiciones existentes, y que
por tanto, no se impondrían en un fermentación competitiva.

Las fermentaciones se hacen a escala de laboratorio, es decir, en pequeños


fermentadores (botellas de 500 mL de capacidad). Es importante intentar simular las
condiciones de fermentación que posteriormente se utilizarán en bodega. Para ello, lo ideal es
utilizar mosto concentrado diluido (450 mL con una concentración final de azúcar de 200 g/L,
una acidez de 6 y un pH inicial de 3.3), ya que tiene todos los nutrientes necesarios para una
correcta fermentación. Además, al utilizar este mosto concentrado se puede regular la
concentración de azúcares, lo cual ya supone una característica adicional de selección al poderse
fijar unas condiciones más o menos restrictivas de fermentación (por ejemplo, altos contenidos
en azúcar condicionarán altos grados alcohólicos).

Aparte de la propia competencia entre cepas, se puede aplicar algún otro criterio de
selección que pueda resultar interesante y así acelerar el proceso de selección. Este criterio
dependerá del tipo de fermentación al que se dirija la selección (Cuadro 9). El seguimiento de
las cepas se realiza por RFLPs del ADN mitocondrial seleccionando las cepas que se imponen
en la fermentación.

107
Cuadro 14. 1 Características deseables y no deseables en la selección de una cepa enológica
de Saccharomyces cerevisiae.

Características deseables Características no deseables


 Alta tolerancia al etanol  Producción de SO2
 Total degradación de azúcares fermentables  Producción de H2S
 Resistencia al SO2  Producción de acidez volátil
 Capacidad fermentativa a bajas temperaturas  Producción de acetaldehído y
 Máxima reducción de fase de latencia piruvato
 Degradación de ácido málico  Producción de espuma
 Capacidad fermentativa a altas presiones  Formación de precursores del
 Producción de glicerol carbamato de etilo

 Producción de B – glucosidasa  Producción de polifenol oxidasas

 Fenotipo Killer
Fuente: Torija, 2002

1.4 Fermentaciones industriales en laboratorio (bodega experimental)


Cada una de las cepas de S. cerevisiae seleccionadas se inocula de forma individual en
un fermentador con mosto concentrado diluido y se monitorea durante la fermentación. Aunque
parezca de poca importancia, se trata de un paso básico, ya que el hecho de una cepa se haya
impuesto en una fermentación masiva no garantiza que pueda realizar una fermentación
completa por ella sola. Además, se deben analizar las características organolépticas del vino
obtenido con cada cepa, análisis que hasta ahora no se había podido hacer porque al ser un
conjunto de cepas no se podía saber cual era la que proporcionaba las diferentes características,
favorables o desfavorables.

Después de las pruebas en el laboratorio que permiten determinar qué cepas presentan
buena capacidad fermentativa (estudio de la velocidad y duración de la fermentación),
resistencia a elevadas concentraciones de azúcares (debido a las características particulares de
la zona de selección), resistencia a elevadas concentraciones de etanol, producción de glicerol,
ésteres, alcoholes superiores, baja acidez volátil y resistencia a SO2, se realiza una cata y se
eligen las cepas que además de fermentar correctamente, tienen el mejor perfil cromático,
aromático y gustativo.

108
1.5 Fermentaciones industriales (bodega industrial)
Las levaduras elegidas se inoculan de forma independiente en un depósito a escala
industrial. Se hace el seguimiento de la fermentación, controlando la imposición de la cepa
estudiada sobre la biota autóctona de la zona mediante RFLPs del ADN mitocondrial. En caso
de imposición, se realiza una analítica completa de los vinos obtenidos, tal y como se ha
explicado en las fermentaciones en laboratorio, con la posterior cata realizada por especialistas.
Las cepas que cumplan todos éstos requisitos estarán aptas para ser seleccionadas. Si se tienen
varias, en la elección de una u otra se deberán valorar, principalmente, las características
organolépticas, es decir, aquellas que proporcionen un vino de mayor calidad.

1.6 Deshidratación
Si las cepas levaduriformes seleccionadas son de interés comercial, queda un último
paso por investigar que es su deshidratación. No todas las cepas resisten bien ni mantienen sus
características tras el secado y la posterior rehidratación y por tanto, aunque se trate de una cepa
de características extraordinarias, sino se puede deshidratar, no será una buena levadura para
uso industrial.

La producción de levaduras secas activas (LSA) es un proceso muy importante, ya que


se realiza en aerobiosis (es decir, en presencia de oxígeno), para conseguir una elevada
biomasa y una reserva de ácidos grasos insaturados y esteroles muy necesarios durante el
proceso fermentativo (en semianaerobiosis) donde la síntesis de estos compuestos está inhibida.
Este proceso hace que las levaduras estén metabólicamente activas cuando se rehidratan y por
tanto, su imposición sea más rápida. Por este motivo, no es necesario hacer un pie de cuba antes
de inocular estas LSA. De hecho, el hacer demasiadas réplicas al preparar el pie de cuba antes
de inocular, puede restarle efectividad a las LSA.

Una vez que la levadura ha superado todas estas fases, aún se hace necesario el análisis
de su estabilidad genética. Es conocida una cierta inestabilidad que hace que después de muchas
generaciones (como en la producción industrial de LSA), el porcentaje de mutaciones de las
cepas levaduriformes sea elevada, por lo que dicho análisis es un requisito imprescindible.

1.7 Proceso de selección en bodega


Una vez superadas las diferentes fases del proceso de selección y de producción
industrial (incluido el secado), queda la última fase y definitiva: su uso industrial en bodega y su
aceptación final, que es la auténtica prueba de fuego de todo el proceso.

109
2 Objetivos
2.1 Aislar e identificar S. cerevisiae de mosto fermentado.
2.2 Seleccionar S. cerevisiae según el tiempo de duración de la fermentación y grado
alcohólico alcanzado.
2.3 Mantener adecuadamente S. cerevisiae seleccionada.

3 Procedimiento

3.1 Aislamiento e identificación de S. cerevisiae a partir de mosto fermentado

3.1.1. Obtención de mosto fermentado


a) Adquirir 0,5 kg de uva dulce tinta (pulpa y hollejo púrpura) o tintórea (hollejo
púrpura).
b) Proceder al desgranado: Manualmente separar los granos del raspón en cada
racimo y colocarlos en un depósito limpio. En simultáneo eliminar los frutos
deteriorados.
c) Realizar el estrujado: Triturar los granos de uva, lo suficiente para lograr la
separación total de hollejo y la pulpa pero no para deteriorar las pepas.
d) Depositar el material resultante o mosto en un matraz de fermentación previamente
esterilizado. Tapar con algodón e incubar a 30 ºC durante 24 horas. Cambiar
el algodón por una tapa hermética de goma que presenta un agujero en el centro
para permitir la salida de CO2 a través de una cánula que desemboca en un frasco
conteniendo una solución de NaCl al 20 %. Incubar a 30 ºC durante 72 horas.

3.1.2 Aislamiento de levaduras


b) Tomar una alícuota del mosto fermentado y sembrar mediante la técnica de
agotamiento y estría sobre agar Sabouraud glucosado con antibiótico (placas de
Petri).
c) Incubar a 30 ºC durante 24 a 48 horas.
d) Seleccionar las colonias redondas, blancas o cremosas, convexas, con bordes
enteros, de consistencia mantecosa, con un diámetro aproximado de hasta
5 mm y realizar una tinción simple con azul de metileno para verificar la presencia
de levaduras.
e) Subcultivar las colonias levaduriformes en viales conteniendo conteniendo agar
Sabouraud glucosado inclinado e incubar a 30 ºC durante 24 horas.

110
3.2 Identificación de S. cerevisiae
a) Para identificar el género Saccharomyces inducir la formación de la fase sexual
(facultad esporulante), cultivando cada una de las cepas levaduriformes en agar
Sabouraud glucosado durante 24 horas y sembrándolas por dos veces consecutivas en
medio de preesporulación agar nutritivo enriquecido contenido en tubos de prueba.
Después de incubar a 30 ºC durante 48 horas en cada una de las resiembras, sembrar
en el medio de esporulación agar acetato contenido en tubos de prueba. Incubar a 30 ºC
y examinar los cultivos semanalmente hasta por 20 días mediante extensiones
coloreadas con la tinción de Schimwell modificada por Mc Chung para investigar la
presencia de ascas con ascosporas.
El método de coloración consiste en:
 Tomar una pequeña muestra del cultivo examinado y mezclar con una gota de
agua sobre una lámina portaobjetos. Fijar en la llama del mechero muy
lentamente y cubrir con verde de malaquita 5 % durante 30 a 60 segundos.
 Calentar por tres veces hasta la emisión de vapores. Enjuagar con agua tibia
durante 30 segundos. Cubrir con una solución acuosa de safranina 0,5%
durante 30 segundos.
 Lavar, secar y observar con objetivo de inmersión.
 Anotar la presencia de ascosporas coloreadas de verde y el resto de material
color rojo. Contar su número y la forma de las mismas en el interior del asca.
 Las ascosporas de S. cerevisiae se forman en número de una a cuatro en un
asca. Son redondas y lisas con un diámetro aproximado de 3.5 µm. Con
frecuencia se forma una cuña protoplasmática entre las ascosporas.

b) Para identificar la especie S. cerevisiae realizar la prueba de fermentación de


carbohidratos. Obtener una suspensión de células (de cada una de las cepas de
levaduras cultivadas en agar Sabouraud glucosado durante 24 horas) en solución salina
estérilizada e inocular 0,1 mL en tubos de 16 x 160 mm (con campana de Durham)
conteniendo 9 mL de medio base de fermentación más carbohidratos al 2 %: glucosa,
galactosa, sacarosa, maltosa, lactosa y 4 % de rafinosa. Incubar por 48 horas (hasta por
15 días) a 30 °C. No ajustar herméticamente el tapón de los tubos. La fermentación es
positiva cuando en las campanas de Durham se observa la presencia de gas. Un color
amarillo indica la utilización del carbohidrato más no la fermentación de éste.

c) Para determinar las características morfológicas de las levaduras, sembrar 0.1 mL de


la suspensión de células en tubos conteniendo 9 mL de caldo extracto de malta. Incubar
a 30 °C durante 2 a 10 días.

111
A partir del tercer día de incubación tomar una gota del cultivo, realizar un frotis y
una tinción con azul de metileno. Determinar la forma de las células, dimensiones y
reproducción vegetativa. S. cerevisiae puede tener forma elíptica y redondeada siendo la
forma de la mayor parte de las células jóvenes redondeada u oval. Miden de 3 a 7 µm de
ancho por 4 a 14 µm de longitud (la relación entre la longitud y ancho por lo general es
menor que 2). Su reproducción vegetativa es por gemación multilateral.
A partir del quinto al décimo día de incubación observar que el crecimiento de
S. cerevisiae en medio líquido se caracteriza por un desprendimiento gaseoso más o
menos abundante. El líquido se encuentra en un principio alterado apareciendo
posteriormente un depósito cuando el líquido se clarifica. Observar cuidadosamente el
aspecto de la espuma y luego del depósito o la película.

3.3 Selección de S. cerevisiae según el tiempo de duración de la fermentación y


concentración de alcohol alcanzado

3.3.1 Obtencion del mosto


Adquirir 1 kg de uvas dulces, lavarlas con agua potable y obtener mosto de
manera similar a lo explicado en el item 3.1.1. Filtrar el mosto, determinar su volumen y
proceder a su acondicionamiento (corrección del azúcar, acidez y primer sulfitado). Para la
corrección del azúcar, homogenizar el mosto con una paleta de madera y determinar los grados
Brix. Para iniciar el proceso de fermentación el mosto debe tener un máximo de 24 ºBrix. Si
el valor es menor agregar azúcar blanca en una cantidad determinada a través del siguiente
cálculo:

(Peso de la muestra de mosto)(Brix deseado - Brix inicial )


100  Brix deseado

Ejemplo:

Suponer que se toma una muestra de 750 g de mosto con 15 ºBrix.

(0,750)(24 15)
 0,088Kg
100  24

Se deben agregar 88 g de azúcar para alcanzar 24 ºBrix.

112
En caso de no tener Brixómetro, agregar 120 g de azúcar blanca por litro del volumen total del
mosto a fermentar. Para la correción de la acidez del mosto, medir con la cinta de pH y ajustar a
3,3 con ácido tartárico. A continuación realizar el primer sulfitado agregando 0,1 g de
metabisulfito de sodio por litro de mosto. Homogenizar con la paleta de madera.

3.3.2 Fermentación en laboratorio


Depositar 285 mL de mostopreviamente acondicionado en matraces de 500
mL de capacidad e inocularlos con 15 mL de una suspensión de levaduras cultivadas en agar
Sabouraud glucosado a 30 ºC por 24 horas. Determinar el número de células viables. La
población final de levaduras deberá ser de aproximadamente 2 x 107 UFC / mL.
Tapar con algodón e incubar a 30 ºC durante 24 horas. Cambiar el algodón por
una tapa hermética de goma que presenta un agujero en el centro para permitir la salida de CO2 a
través de una cánula que desemboca en un frasco conteniendo una solución de NaCl al 20 %. y
en donde se observará el burbujeo del CO2 eliminado durante el proceso Incubar a 25 ºC
durante 72 horas.
La finalización del burbujeo determinará el final de la fermentación, momento
en el cual se medirán los grados de alcohol alcanzados (método de destilación o con el
vinómetro). En caso de no tener el equipo necesario la capacidad productiva de alcohol
también se puede determinar indirectamente pesando diariamente cada uno de los matraces
previa agitación a fin de eliminar el anhídrido carbónico. La determinación del peso se debe
realizar hasta que éste muestre un valor constante lo que indica que la fermentación ha
concluído.

3.4 Mantenimiento de cepa enológica de S. cerevisiae seleccionada


Sembrar la cepa de S. cerevisiae seleccionada en caldo Sabouraud Glucosado, incubar a
25 ºC durante 24 horas y mantener en refrigeración.

113
0.5 Kg de uva Estrujado
Desgranado

Cambiar el
algodón por
una tapa 30 °C /
hermética 24horas

30 °C por 72 horas.

Figura14.1 Obtención de mosto fermentado.

114
Sembrar sobre Incubar a
ASG con 30 °C por
antibiótico 24-48
horas
Tomar una alícuota del
mosto fermentado
Selecciónar colonias

Tinción
simple

Incubar a 30 °C
durante 24 horas

Cultivo puro de
levaduras
Subcultivar en ASG

Figura 14.2 Aislamiento de levaduras.

115
30 °C/48h. 30 °C/48h.

Incubar a 30 °C y
examinar los cultivos
semanalmente hasta
Cultivo puro por 20 días
levaduriforme
Agar nutritivo
enriquecido
Agar Acetato

Tinción de
Schimwell
modificada

Figura 14.3. Identificación del género Saccharomyces.

116
Inocular 0,1 mL Gl Ga Sa Ma La

Saccharomyces sp. Carbohidratos: glucosa, galactosa, sacarosa,


maltosa, lactosa
Suspensión de
Sacchromyces sp. 30 ºC/2-15 días

Gl Ga Sa Ma La

(+) (+) (+) (+) -


( )
La fermentación se evidencia por la
Saccharomyces cerevisiae presencia de gas en las campanas de
Durham

Figura 14.4 Identificación de Sacharomyces cerevisiae.

117
1 kg de uva Desgranar
Lavar

Determinar
su volumen

Estrujar
Filtrar
600 mL de
mosto

Agregar la cantidad
necesaria de azúcar blanca
para obtener el 24 ºBrix

Medir el Mosto
Brix corregido

Figura 14.5 Obtención del mosto corregido.

118
30 ºC /24
horas

Depositar 300 mL Colocar tapa hermética


de mosto en Inocular 6 mL de la
frascos de 500 mL suspensión de S. cereviseae
30 ºC/72 horas (hasta
finalización del
burbujeo)

Medir con el vinometro


los grados de alcohol Mosto
alcanzados fermentado

Figura 14.6 Fermentación en laboratorio.

119
4 Anexo
4.1Agar Sabouraud glucosado (g/L)
Peptona 10,0
Glucosa 20,0
Agar agar 20,0
Agua csp 1L
pH 5,6

4.2 Agar nutritivo enriquecido (g/L)


Glucosa 50,0
Extracto de levadura 10,0
Caldo nutritivo 30,0
Agar agar 20,0
Agua destilada csp 1L
pH 5,6

4.3 Medio Agar acetato (g/L)


Acetato de potasio 9,8
Glucosa 1,0
Extracto de levadura 2,5
Agar 20,0
Agua csp 1L
pH 6  0.5

4.4 Medio base para fermentación de carbohidratos (g/L)


Peptona 50,0
Extracto de carne 1,0
NaCl 5,0
Agua csp 1L
pH 7.0
Una vez que se ha medido el pH agregar el indicador rojo de fenol
0,02 g por l L. Luego agregar el carbohidrato según corresponda (2 o 4
%).

4.5 Caldo extracto de malta


Pesar 1,5 g de extracto de malta para 100 mL de agua destilada.

4.6 Medio base para fermentación de carbohidratos (g/L)


Verde de malaquita 0,01 g
Agua destilada 100 mL

4.7 Solución safranina


Safranina 0,25 mL
Agua 100 mL

120
4.8 Recuento de células viables
El recuento de células puede ser realizado en cámaras de contaje o hematocímetros
(diseñados para contar glóbulos de sangre) que consisten en una lámina de cristal de una
dimensión aproximada a la de una lámina portaobjetos, pero de mayor grosor. Tienen ranuras en
forma de H, con rieles a cada lado que sostienen un cubreobjeto grueso especial a una distancia
de 0,1 mm por encima de las dos porciones interiores de la H, que forman dos cámaras entre
éstas y el cubreobjeto. El cubreobjeto es grueso para impedir que se hunda en el centro en su
parte no sostenida, lo cual reduciría el volumen de las cámaras. El fondo de cada una de las
cámaras tiene un rayado “Neubauer” de 9 mm2 (3 mm por lado) dividido en nueve cuadrados
principales (C.P.) de 1 mm por lado, en los que se cuenta arbitrariamente el contenido de cinco:
los cuatro de las esquinas y el central (A, B, C, D y E) para calcular la concentración de
propágulos cuando éstos son relativamente grandes. Como el volumen sobre cada C.P. es 0,1
mm3, para calcular la concentración por cc (10 000 veces mayor), se procede en la forma
siguiente:

SUMA de 5 C.P. x 2 000 = número / cc

Cuando los propágulos son pequeños se usa el C.P. central que está dividido en 25
cuadrados secundarios (C.S.) de 32 mm por lado y a su vez cada uno está dividido en 16
cuadrados menores de 0.05 mm por lado. Entonces la concentración se calcula así:
NÚMERO en el C.P. CENTRAL x 10 000 = número / cc

Se pueden conseguir resultados similares representativos haciendo contadas en una


fracción del C.P. central, con la consiguiente reducción de la labor. Se cuentan lo propágulos en
un número reducido de los C.S. Por ejemplo, si se observan los cuatro C.S. esquinados y el
central, entonces:

SUMA de 5 C.S. x 50 000 = número / cc

Si se observan los cuatro C.S. esquinados y cuatro que rodean al central, entonces:
SUMA de 8 C.S. x 31 250 = número / cc

121
4.1.1 Procedimiento para realizar el recuento de células levaduriformes viables
- Realizar una suspensión acuosa del cultivo de S. cerevisiae.
- Llevar 0,5 mL de la suspensión de levaduras hacia un tubo y adicionar 0,5
mL de azul de metileno (proporción 1/1).
- Homogenizar y hacer recuento en la cámara de Neubauer en los cinco
cuadrados principales o primarios.
- Las células viables se observan refringentes, incoloras y las células no
viables de color azulado u opacas.
- Realizar los cálculos correspondientes y multiplicar por el factor de
dilución.
Factor de dilución = Volumen total diluido/Volumen de la muestra.
1/0.5 = 2

5. Referencias bibliográficas

Alvarado, X. & Muro, J. (2007). Concentración de inóculo y tiempo de fermentación en la


elaboración de chicha de jora con Saccharomyces cerevisiae nativa.Tesis Licenciatura.
Lambayeque, Perú, Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo.

Chirre, C. & Farroñay, D. (2007). Concentración de inóculo y tiempo de fermentación en la


elaboración de cerveza Lager en el Centro de Producción-Investigación de la
Cervecería Industrial “La Otra”. Lambayeque.Tesis Licenciatura. Lambayeque, Perú,
Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo.

Zamora, D., (2006). Concentración de inóculo y tiempo de fermentación en la elaboración de


vino semiseco por Saccharomyces cerevisiae nativa a partir de Vitis vinífera
“uva”.Tesis Licenciatura. Lambayeque, Perú, Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo.

Reaño, A .& Sierra, Z. (2008). Estudio técnico para la elaboración de cerveza tipo Ale con
adición de zumo de piña como un sucedáneo no amiláceo. Tesis Ingeniero en Industrias
Alimentarias. Lambayeque, Perú, Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo.

Torija, J., (2002). Ecología de levaduras: Selección y adaptación a fermentación vínica. Tesis
Doctorado. España, Universidad Rovira y Virgili.

122
PRÁCTICA XV
BIOINSECTICIDAS: Bacillus sp. COMO LARVICIDA DE
Anopheles sp.

1. Introducción
La malaria o paludismo es una enfermedad caracterizada porque en los glóbulos rojos se
encuentran protozoos del género Plasmodium, transmitidos por la picadura de la hembra del
mosquito Anopheles ó vector de esta enfermedad endémica en el Perú. Anopheles es un díptero
que se desarrolla en climas tropicales, como el de la Amazonía y la Costa Norte Peruana, donde
su diseminación es amplia.

Los compuestos químicos constituyen una excelente arma de lucha antivectorial, pero
afectan a los seres vivos, contaminan el ambiente e inducen resistencia en el insecto vector.
Como alternativa se han establecido programas de Control Vectorial Integrado basados en la
combinación racional de los métodos de control disponibles químicos, físicos, biológicos,
especialmente los microbiológicos.

En el control microbiológico se utilizan insecticidas elaborados con entomopatógenos


como las bacterias del género Bacillus, específicamente Bacillus thuringiensis y
Bacillus sphaericus, que producen sustancias tóxicas con alto grado de especificidad para larvas
de dípteros hematófagos. Actualmente, existen en el mercado biolarvicidas como
Vertobac y Gresleaf elaborados con estos microorganismos y sus productos; sin embargo, a
pesar de su eficacia larvicida presentan desventajas en cuanto a su efecto residual, debido a una
poca adaptación de estas cepas a las condiciones ambientales de cada región, por lo que, en
diversas áreas malarígenas se han desarrollado líneas de investigación tendientes a buscar
nuevas cepas de bacterias con capacidad larvicida, que puedan ser utilizadas eficientemente
como controladores de insectos.

2. Objetivos
2.1 Aislar Bacillus spp.
2.2 Seleccionar Bacillus spp. segùn su potencial biocida frente a larvas de Anopheles sp.
2.3 Identificar la especie de Bacillus controlador de larvas de Anopheles sp.
2.4 Mantener decuadamente Bacillus sp. controlador de Anopheles sp.

123
3. Procedimiento

3.1 Aislamiento de Bacillus sp.


Muestra: 10 g de fango del fondo de criaderos de Anopheles sp. (totoral, arrozal,
filtración, dren)

 Pesar 2 g de la muestra de fango y realizar diluciones seriadas en solución salina


estéril hasta 10-3 .
 Llevar la dilución 10-3 a tratamiento térmico de 80 ºC durante 10 minutos (baño
maría) y luego someter a enfriamiento rápido.
 De la dilución 10-3 tomar una alícuota y sembrarla mediante la técnica de
agotamiento y estría sobre la superficie de agar nutritivo (Placas de Petri).
 Incubar en aerobiosis a 30 ºC, durante 24 horas.
 Seleccionar las colonias desarrolladas y realizar una tinción de Gram para
verificar la presencia de bacilos.
 Cultivar las colonias seleccionadas en viales con agar Tripticasa Soya (TSA),
para obtener cultivos puros.

3.2 Selección de Bacillus segùn su potencial biocida frente a larvas de


Anopheles sp.

3.2.1 Obtención de larvas de Anopheles sp.


 Seleccionar criaderos soleados con agua limpia y vegetación herbácea
emergente.
 Realizar la recolección de larvas de Anopheles sp. mediante el “Método de
Cucharón”, utilizando un cucharón blanco de mango largo que se sumerge
con movimiento firme y en ángulo de 45º respecto a la superficie de agua,
para posteriormente extraerlo sin que rebose el agua. Con un gotero
plástico de boca ancha recolectar los estadíos larvales de Anopheles sp. y
transferirlos a recipientes con agua del mismo criadero.
 En el laboratorio mantener las larvas en fuentes de fierro enlozado con
agua del mismo criadero de origen hasta su empleo en los ensayos de
patogenecidad.

124
Cuadro 15.1. Características de anofelinos a nivel del campo

Características Anofelinos Culicinos


Posición en la superficie del Paralela Perpendicular (en ángulo)
agua
Sifón respiratorio Ausente Presente, Tamaño
variable
Cabeza y tórax Cabeza mas estrecha que Cabeza distinguible del
tórax tórax

Anopheles: Larvas con poca fotofobia, movimiento rápido en forma de látigo, respiran
en posición horizontal a la superficie.
Aedes: Larvas con fotofobia y timidez, movimiento en forma de víbora, respiran en
posición perpendicular a la superficie.
Culex: Larvas sin fotofobia movimiento en forma de látigo, respiran en posición
inclinada.

3.2.2 Pruebas de patogenecidad de Bacillus sp.


a. Obtención de la suspensión bacteriana (esporas y cristales de Bacillus
sp.)
 Cultivar Bacillus sp. sobre la superficie inclinada de agar Tripticasa
Soya e incubar en aerobiosis a 30 º C durante 5 días.
 Verificar la esporulación a través de una tinción de Gram.
 Realizar una suspensión celular en solución salina y estandarizar la
concentración con el tubo 6 del nefelómetro de Mc Farland (1,8 x 109
esporas y cristales/ mL).

b. Efecto de Bacillus sp. sobre larvas de Anopheles sp.


 Depositar 10 mL de cada una de las suspensiones bacterianas
previamente estandarizadas sobre 90 mL de agua destilada estéril
contenida en recipientes plásticos de primer uso y con una capacidad de
250 mL. En cada recipiente se tendrá una concentración final de
aproximadamente 1.8 x 108 esporas y cristales/mL.
 Colocar diez larvas de Anopheles sp. (de preferencia III estadío).
 Acondicionar un control positivo con el insecticida Griselef (Bacillus
sphaericus cepa 2362) y un control negativo con 100 mL de agua
destilada estéril y diez larvas de Anopheles sp.

125
 Alimentar las larvas con comida para peces (para evitar el canibalismo).
 Determinar la sobrevivencia de las larvas de Anopheles sp. después de 24,
48 y 72 horas de entrar en contacto con la suspensión de Bacillus sp.
Considerar como larvas muertas aquellas que no reaccionan al ser
tocadas en la región cefálica. En caso de que el control negativo
presente una mortalidad comprendida entre 5 a 20 % corregir los
porcentajes de mortalidad mediante la fórmula de Abbott.

% Mortalidad Corregida  % mortalidad expuestas - % mortalidad del control negativo 100


100 - % mortalidad del control negativo

3.2.3 Recuperación de Bacillus sp.


 Colectar las larvas muertas en el ensayo de de Bacillus sp. que presente
la mayor mortalidad.
 Depositarlas en un frasco estéril, desinfectarlas con hipoclorito de sodio al
0,1 % durante 1 minuto, enjuagarlas con agua destilada estéril durante
1 minuto y triturarlas con 2 mL de solución salina estéril.
 Tomar una alícuota del triturado de larvas y sembrar mediante la técnica de
agotamiento y estría sobre la superficie de agar nutritivo.
 Incubar en aerobiosis a 30 ºC durante 24 horas.
 Realizar una coloración de Gram para determinar morfología y reacción
tintorial.
 Obtener un cultivo puro en agar tripticasa soya.

3.2.4 Confirmación del efecto Biocida de Bacillus sp.


 Con Bacillus sp. recuperado y cultivado en agar Tripticasa Soya durante
5 días obtener una suspensión bacteriana (esporas y cristales), estandarizar
la concentración en el tubo 6 del nefelómetro de Mc Farland y realizar un
bioensayo con larvas de Anopheles sp.

126
3.3 Identificación de las especies de Bacillus
 Caracterización macroscópica de colonia: Color, tamaño, bordes, forma,
elevación.
 Caracterización microscópica de células: Forma, reacción tintorial, presencia de
espora y cristal. Para observar las esporas y cristales realizar la coloración de
verde de malaquita modificada (realizar un frotis, cubrirlo con verde de malaquita
al 6 %, calentar en el mechero por debajo de la lámina hasta que exista
desprendimiento de vapores blancos por tres veces, dejando enfriar cada vez,
enjuagar con agua corriente, cubrir el frotis con carbol fucsina al 0,1 % durante
1 minuto, eliminar el exceso de colorante, enjuagar y dejar secar a medio
ambiente)
 Pruebas de motilidad, hemólisis, hidrólisis de la gelatina, Voges Proskauer, rojo
de metilo, indol, hidrólisis del almidón, utilización de carbohidratos glucosa,
arabinosa, manitol.

3.4 Mantenimiento de Bacillus sp.


Sembrar Bacillus sp. controlador de Anopheles sp. en viales conteniendo agar
tripticasa soya, incubar a 30 ºC durante 24 horas y mantener en refrigeración.

4. Anexo

4.1 Verde de Malaquita al 6 %


Verde de malaquita 6g
Agua destilada csp 100 mL
Disolver en caliente, homogenizar y guardar en frasco oscuro

4.2 Carbol fucsina al 1 %


Fúcsina básica 10 g
Etanol absoluto 100 mL
Fenol al 5 % 1 000 mL
Mezclar y guardar en frasco oscuro

127
5. Referencias bibliográficas

Novoa, N. y Pacherres, A. (2003) Cepas nativas de Bacillus spp. como potenciales


conroladoresde larvas de Anopheles pseudopunctipennis. Sullana, enero-
setiembre 2001. Tesis Licenciatura. Lambayeque, Perú, Universidad Nacional
Pedro Ruiz Gallo.

128
PRÁCTICA XVI
BACTERIAS DEGRADADORAS DE PETRÓLEO DIESEL

1. Introducción
La utilización masiva de combustibles fósiles genera anualmente 2 800 millones de
toneladas de dióxido de carbono de los 76 000 millones de toneladas existentes en la atmósfera.
El dióxido de carbono junto con otros gases como el dióxido nitroso, metano,
clorofluorocarbonados, compuestos halogenados y vapor de agua constituyen el grupo de gases
invernadero que absorven la radiación reflejada provocando el calentamiento global de la
atmósfera y cambiando dramáticamente el clima del planeta. Adicionalmente a los cambios
climáticos globales el uso masivo del petróleo como fuente de energía y como materia prima ha
generado la contaminación ambiental que ocasiona el deterioro progresivo de la calidad del
ambiente y constituye una amenaza real a la salud pública así como es responsable de la
extinción de gran cantidad de especies animales y vegetales.
El principal origen del crudo y productos del petróleo tales como benceno, tolueno, xileno
(BTX) e hidrocarburos aromáticos polinucleares (PAHs) liberados al ambiente son las pérdidas
de los tanques de almacenamiento, los vertidos y accidentes durante su transporte. Una de las
herramientas para combatir la contaminación ambiental generada por derrames de petróleo es la
biodegradación del petróleo o ruptura de los compuestos complejos a compuestos simples y
menos tóxicos. Durante los últimos años el interés por la búsqueda de microorganismos con
capacidad degradativa de petróleo como bacterias, mohos y levaduras se ha incrementado con
miras a utilizarlos en la recuperación microbiana de los suelos y cuerpos de agua
contaminados con petróleo. La biorremediación o utilización de microorganismos como las
bacterias que metabolizan petróleo como fuente de carbono y energía, constituye una alternativa
saludable frente al deterioro progresivo de la calidad del ambiente por el derramamiento de
crudos, permitiendo la biodegradación de los hidrocarburos y recuperación de los suelos
contaminados.

2. Objetivos
2.1. Aislar bacterias degradadoras de petróleo Diesel a partir de suelo contaminado.
2.2. Cuantificar el petróleo Diesel degradado por bacterias aisladas de suelos
contaminados.

3. Metodología
3.1 Muestra
100 g de suelo contaminado con petróleo

129
3.2 Aislamiento de bacterias heterótrofas
Para favorecer el aislamiento de bacterias heterótrofas pesar 10 g de cada muestra de
suelo contaminado y enriquecerlas en 90 mL de caldo Bushnell Haas, a 30 °C, durante
24 horas. Después, tomar una alícuota de 0,1 mL y sembrarla mediante la técnica de
agotamiento y estría sobre agar nutritivo, King B y Mac Conkey. Incubar a 30 °C durante
24 horas. A continuación, en el agar nutritivo agrupar las colonias desarrolladas, según sus
características morfológicas y seleccionar una representante de cada grupo. De igual manera en
el agar King B seleccionar las colonias formadoras de fluorescencia y en el agar Mac Conkey
las colonias lactosa negativas. Realizar una tinción de Gram y después cultivar en agar
Tripticasa Soya (TSA) y Bushnell Haas con 4 % de petróleo Diesel, constituyendo los cultivos
puros, que serán guardados en refrigeración a 8 °C.

3.3 Tiempo requerido para la utilización del petróleo como fuente de carbono y
energía
Para la obtención del inóculo, cultivar cada bacteria nativa en 10 mL de caldo
nutritivo, a 30 °C durante 24 horas. Posteriormente, centrifugar el caldo nutritivo (3500 rpm)
durante 10 minutos, eliminar el sobrenadante, lavar el sedimento con solución salina
esterilizada (0,87 %, p/v) y estandarizar la concentración celular con el tubo 3 del nefelómetro
de Mc Farland (9 x 108 cel mL-1). A continuación, de cada una de las suspensiones bacterianas
previamente estandarizadas tomar 1 mL e inocularlo por triplicado en tubos de prueba de
16 x 150 mm con 10 mL de caldo Bushnell Haas con indicador púrpura de bromocresol y
0,1 mL de petróleo Diesel. Considerar un tubo con caldo de cultivo no inoculado como testigo.
Incubar a 30 °C hasta por 10 días, con agitación manual, diariamente por 10 minutos y en
simultáneo investigar el viraje del indicador del lila al amarillo, que se interpretará como
positivo para la utilización del petróleo como fuente de carbono y energía.

3.4 Cuantificación de las Unidades de Actividad Emulsificante (UAE)


De cada uno de los inóculos bacterianos previamente estandarizados tomar 1 mL e
inocular por triplicado en tubos de prueba de 16 x 150 mm con 10 mL de caldo extracto de
levadura más 0,2 mL de etanol. Considerar un tubo con caldo de cultivo no inoculado como
testigo. Incubar a 30 °C, durante 3 días con agitación manual, diaria por 10 minutos y en
simultáneo investigar la presencia de burbujas y turbidez del medio de cultivo. A continuación,
verter el caldo cultivado en tubos y centrifugarlos (3500 rpm) durante 10 minutos. Después,
tomar 1 mL de cada sobrenadante y llevar a tubos de prueba con 9 mL de caldo extracto de
levadura etanol más 0,2 mL de petróleo Diesel. Tapar herméticamente (tapa rosca) y agitar
manualmente durante 1 minuto hasta lograr una emulsión.

130
Posteriormente, con un tubo “blanco” conteniendo caldo extracto de levadura etanol
más 0,2 mL de petróleo Diesel (testigo) calibrar a cero el espectrofotómetro digital de luz
visible, 335 - 1000 nm, y leer la absorbancia de cada una de las muestras a 540 nm. Después,
realizar la conversión de la absorbancia a unidades de actividad emulsificante por mililitro,
considerando 0,826 de absorbancia como una Unidad de Actividad Emulsificante por mililitro,
UAE mL-1.
3.5 Eficiencia de la biorremediación de suelo contaminado con petróleo por tres
bacterias nativas seleccionadas
Inocular las tres bacterias en terrarios con suelo contaminado con petróleo, donde se
determinará la eficiencia de la biorremediación usando las tecnologías de bioestimulación y
bioaumentación.
a. Recolección y acondicionamiento de suelo contaminado
Colectar suelo contaminado con petróleo, homogenizar sobre una manta de
polietileno y tamizar a través de una malla metálica de 15 mm de diámetro .
b. Cálculo y aplicación de nutrientes para la bioestimulación
Realizar la bioestimulación o aplicación de los nutrientes nitrógeno y fósforo
hasta alcanzar la relación C:N:P de 100:10:1, para lo cual se agregarán 0,235 g de urea (46 % N)
y 0,024 de fosfato diamónico (18 % N y 46 % P) por terrario.
c. Propagación de bacterias para la bioaumentación
Obtener el inóculo de cada bacteria nativa por el método de siembra a gran
escala, trabajando con un inóculo madre, intermedio y definitivo. Cultivar las bacterias nativas
seleccionadas en 3 mL de caldo nutritivo, a 30 ˚C durante 24 horas. A continuación, obtener un
paquete celular y estandarizar su concentración con el tubo 3 del nefelómetro de Mc Farland,
obteniendo una suspensión bacteriana con 9,0 x108 cel mL-1 Por ejemplo para la propagación,
inocular 0,6 mL de la suspensión bacteriana en 5,4 mL de caldo Bushnell Haas con 5 % de
petróleo Diesel, incubándolos a 30 °C por 24 horas, constituyendo el inóculo madre. Inocular
éste en 54 mL de caldo Bushnell Haas con petróleo Diesel incubándose a 30 °C por 24 horas
para constituir el inóculo intermedio e inocular a su vez, éste en 540 mL del mismo caldo
Bushnell Haas, incubado en las mismas condiciones y constituyendo el inóculo definitivo en
una cantidad de 600 mL. para 30 bandejas. Luego tomar una muestra representativa de 1 kg de
suelo para determinar el contenido de Hidrocarburos Totales de Petróleo (TPH) y realizar la
caracterización físico – química en el laboratorio de suelos A continuación, distribuir el suelo
contaminado en bandejas de plástico o terrarios, de 40 x 28 cm con un área de 0,11 m2, a razón
de 4 kg por unidad..

131
d. Inoculación de bacterias nativas degradadoras de petróleo
Para determinar la eficiencia de la biorremediación de un suelo contaminado con
petróleo se realizó un ensayo con quince tratamientos diez de ellos correspondieron a la
inoculación independiente de cada una de las bacterias seleccionadas, tres tratamientos fueron
consorcios de bacterias y dos tratamientos fueron testigos con nitrógeno - fósforo, suplementado
y absoluto. En cada tratamiento se tuvieron dos repeticiones, totalizando 30 unidades
experimentales. En los tratamientos correspondientes a la inoculación, independiente de las
bacterias nativas (T1 a T10) en cada terrario con 4 kg de suelo contaminado se añadieron
400 mL (10 %) del inóculo, previamente obtenido.
En los consorcios se inocularon 80 mL de cada una de las cinco bacterias seleccionadas
por requerir el menor tiempo en la utilización del petróleo (T11), 80 mL de cada una de las
cinco bacterias con el mayor número de UAE (T12) y 40 mL de cada una de las diez bacterias
nativas seleccionadas (T13). El testigo con nitrógeno y fósforo no fue inoculado y a su vez el
testigo absoluto no fue ni bioestimulado ni bioaumentado. Inmediatamente después de la
inoculación, el contenido de los terrarios se mezcló durante 5 minutos y a continuación éstos se
ubicaron bajo un área techada de 5 x 6 m . Se realizaron riegos (Figura 44), interdiarios con
agua de pozo, durante los primeros 60 días y dos veces por semana los últimos 30 días y
después de cada riego el contenido de los terrarios fue removido durante 5 minutos.

e. Monitorización del proceso: análisis físico – químico


Inmediatamente después de la inoculación bacteriana y después de 30,60 y 90 días,
tomar una muestra representativa de 30 g en cada tratamiento y llevar al laboratorio donde se
tomarán tres submuestras de 10, 5 y 10 g para investigar el pH, humedad y bacterias,
respectivamente. Para medir el pH depositar 10 g de suelo en un frasco con 25 mL de agua
destilada (1: 2,5) y agitar durante 90 segundos antes de la medición.
Para la determinación de la humedad obtener el peso de un crisol limpio y seco (Pb),
pesar en éste 5 g de suelo (Pshb), y después secarlos en horno a 105 °C hasta obtener peso
constante. Finalmente pesar el crisol con la muestra de suelo seco (Pssb). Determinar la
humedad al inicio del ensayo y después del riego correspondiente, interdiario durante los
60 primeros días y dos veces por semana durante los últimos 30 días. Calcular el contenido de
agua con la siguiente fórmula:

% Ɵg = (Pshb - Pssb) x 100


(Pssb - Pb)

132
f. Monitorización del proceso: análisis biológico
Realizar el análisis microbiológico y un bioensayo de fitotoxicidad en Latuca sativa L.
“lechuga”.

- Análisis microbiológico
Inmediatamente después de la inoculación y mensualmente contar las bacterias
heterótrofas e hidrocarbonoclásticas. Para el recuento de bacterias heterótrofas utilizar el
método de placa fluida o vertido en placa, para lo cual se deben pesar 10 g de suelo con los
que se obtendrá una suspensión en 90 mL de agua destilada esterilizada, que a la vez constituirá
la dilución 10-1. A continuación, realizar diluciones decimales entre 10-4 a 10-7 , y de las tres
últimas diluciones tomar 1 mL por duplicado y depositarlos en placas de Petri esterilizada
Inmediatamente después, agregar el agar Plate Count, licuado y enfriado entre 44 - 46 °C y
homogenizar, el contenido durante 30 segundos. Incubar a 30 °C durante 48 horas y después
contar en las placas que presentaron entre 30 a 300 colonias. Cuando no se observen colonias en
las placas considerar como un número menor de 1 dividido por el correspondiente volumen
inoculado en la placa de Petri. Obtener la media del conteo de las placas correspondientes y
expresar los resultados como Unidades Formadoras de Colonias por gramo de suelo (UFC g-1).

UFC/g suelo = N°colonias x Volumen dilución x 1


mL dilución factor dilución g suelo

Para el recuento de bacterias hidrocarbonoclásticas utilizar la técnica del


Número Más Probable, o Método de Tubos Múltiples, empleando el caldo Bushnell Haas
(5 mL), con el indicador púrpura de bromocresol y 0,025 mL de petróleo Diesel, como fuente de
carbono. Para el recuento, inocular 1 mL de las diluciones 10-1, 10-2 y 10-3 de la muestra de
suelo por duplicado en tubos con caldo, Bushnell Haas – petróleo Diesel e incubar a 30°C
hasta por 5 días.Considerar como positivo el viraje del indicador púrpura de bromocresol del lila
al amarillo y realizar el cálculo correspondiente.

- Bioensayo de fitotoxicidad
Para determinar el efecto de las sustancias presentes en los suelos
biorremediados sobre el índice de germinación, realizar un bioensayo de fitotoxicidad. De cada
tratamiento tomar una muestra representativa de 10 g de suelo y realizar una dilución 1/5,
tomando 10 g de suelo con 50 mL de agua destilada esterilizada. A continuación, colocar
20 semillas de lechuga var. GREAT LAKES, distribuidas por duplicado sobre un papel filtro
circular depositado sobre la base de placas de Petri previamente esterilizadas y verter sobre
ellas 6 mL de la dilución de suelo biorremediado.

133
Tapar las placas de Petri y cubrir con papel kraft durante 120 horas, a
temperatura ambiente. Incluir un control negativo, donde las diluciones de suelo serán
reemplazadas por agua destilada esterilizada y dos controles positivos, en donde se depositarán
las diluciones de suelo de los tratamientos testigo con N - P y testigo absoluto. Después de 120
horas contar las semillas germinadas y medir la longitud de las radículas emergidas. Calcular el
porcentaje de germinación relativo, (PGR), el crecimiento relativo de radícula (CRR) y el índice
de germinación (IG).

g. Eficiencia de la biorremediación de suelos contaminados por petróleo


Para determinar la eficiencia de la biorremediación de suelo contaminado con petróleo
expresado en porcentaje, realizar el análisis de Hidrocarburos Totales de Petróleo (TPH), al
finalizar el proceso (90 días) en los tratamientos que presenten el mayor índice de germinación
y en los testigos nitrógeno – fósforo y absoluto.

E = Si – Sf x 100
Si

Donde:
E = Eficiencia de degradación de petróleo (%)
Si = Concentración inicial de TPH
Sf = Concentración final TPH

h. Identificación y conservación de bacterias nativas degradadoras de


petróleo
Realizar las pruebas correspondientes para determinar el género y especie de las
bacterias degradadoras de petróleo.

134
4. ANEXO
4.1 Caldo Bushnell Haas (g/L)
KH2P04 1,0
K2HP04 1,0
(NH4)2S04 1,0
MgSO4 0,20
Cl2Ca 0,02
FeCl3 0,005
Agus destilada csp 1000 mL
pH 7,0
4.2 Caldo Extracto de levadura etanol (g/L)
KH2 P04 18,0
K2HP04 6,0
MgS04 0,2
(NH4)2SO4 4,0
Extracto de levadura 3,0
Etanol 20,0 mL
Agus destilada csp 1000 mL
pH 7,0

4.3 Cálculo de las concentraciones de urea y fosfato diamónico requeridos para alcanzar

una relación C:N:P de 100:10:1 (en Carreño, 2008)

a) Cálculo de FDA (18%N – 46%)


100 kg FDA 46 U/P
x 1 U/P

x = 2,174 kg FDA.Ha-1
x = 0,217g FDA. m2

Adición por terrario:


0,217g FDA 1 m2
x 0,112 m2
x = 0,024 g FDA

100 kg FDA 18 U/N


0,000024 kg FDA x

x = 0,000024 kg N
x = 0,004 g N FDA

135
b) Cálculo de Urea (46% N)
100 kg urea 46 U/N
x 10 U/N

x = 21,739 kg urea. Ha-1


x = 2,1739 g urea. m2

Adición por terrario:


2,174 g urea 1 m2
x 0,112 m2
x = 0,239 g N

0,239 g N (urea) - 0,004 g N (FDA)


x = 0,235 g urea

5. BIBLIOGRAFIA

Llanos, C. (2012). Eficiencia de la biorremediación de suelos contaminados con petróleo por


bacterias nativas en el distrito de Pimentel, departamento de Lambayeque, 2011. Tesis
de Licenciatura. Lambayeque, Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo.
Ramírez, N., (2005) Degradación de petróleo Disesel a diferentes concentraciones de
nitrógeno y fósforo por cepas nativas de Pseudomonas sp. Lambayeque, 2005. Tesis de
Maestría. Lambayeque, Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo.
Tapia, I., (2002) Capacidad degradativa del petróleo de hongos aislados de agua de mar-
Litoral del Puerto Eten. Enero-Mayo, 2002. Tesis de Licenciatura. Lambayeque,
Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo.

136