Neumonía adquirida en la comunidad en Chile: la relevancia

clínica en la detección de virus y bacterias atípicas.

Abstract
Neumonía adquirida en la comunidad adulta (CAP) es una causa mundial relevante de
morbilidad y mortalidad, sin embargo, la etiología a menudo sigue siendo incierta y la terapia
es empírica. Aplicamos convencional y diagnóstico molecular para identificar virus y atípicos
bacteria asociada con CAP en Chile.

Metodos: Utilizamos esputo y hemocultivos, serología IgG / IgM y técnicas de diagnóstico

molecular (PCR, PCR transcriptasa inversa) para la detección de bacterias clásicas y atípicas
(neumonía por Mycoplasma, Chlamydia pneumoniae, Legionella pneumoniae) y virus
respiratorios (adenovirus, virus sincitial respiratorio (VSR) ), metapneumovirus humano, virus
de la influenza, virus parainfluenza, rhinovirus, coronavirus) en adultos mayores de 18 años
que presentaban NAC en Santiago de febrero de 2005 a septiembre de 2007. La severidad fue
calificada al ingreso por el índice de severidad de la neumonía de Fine.

Resultados
La detección global en 356 adultos reclutados fue de 92 (26%) casos de un único patógeno
bacteriano, 80 (22%) casos de un solo agente patógeno viral, 60 (17%) casos con infección
bacteriana y viral mixta y 124 (35%) casos sin un agente patógeno identificado

Streptococcus pneumoniae y RSV fueron los patógenos bacterianos y víricos más comunes
identificados. La detección de agentes infecciosos mediante PCR proporcionó una mayor
sensibilidad que las técnicas convencionales. Para nuestra sorpresa, no se observó ninguna
relación entre la gravedad clínica y las únicas o coinfecciones.

Conclusiones: El uso de diagnósticos moleculares amplió la detección de virus y bacterias

atípicas en adultos con CAP, como únicas o coinfecciones. La gravedad CLÍNICA y el resultado
fueron independientes de los agentes etiológicos detectados.

Introducción:
La neumonía adquirida en la comunidad (NAC) es una causa mundial de morbilidad y
mortalidad.

A pesar de los avances en el diagnóstico, la etiología de la NAC a menudo permanece incierta y

la terapia es empírica.

La baja sensibilidad de los cultivos de sangre y esputo y la presencia de una flora bacteriana
heterogénea en el tracto respiratorio superior confunden la interpretación de las pruebas.

Los virus respiratorios son la causa mundial de infecciones agudas de las vías respiratorias
inferiores (ALRI) en niños y su diagnóstico específico a menudo se realiza mediante técnicas de
inmunodiagnóstico. En los niños, a diferencia de los adultos, el diagnóstico anaetiológico se
evalúa fácilmente mediante muchas técnicas de diagnóstico porque el desprendimiento viral
es alto y prolongado.

El desarrollo de métodos moleculares con una sensibilidad mejorada y La especificidad ha

allanado el camino para la detección de nuevos virus, para la identificación de patógenos que
son difíciles de cultivar, y para la detección de patógenos más adelante en el proceso de la
enfermedad.
El diagnóstico molecular ha mejorado nuestro entendimiento de los ALRI en niños y en
adultos.
La estacionalidad de los ALRI es similar en las enfermedades respiratorias pediátricas y adultas,
lo que sugiere una etiología similar. En informes anteriores presentamos la epidemiología y el
impacto clínico de Mycoplasma pneumoniae y virus respiratorio sincicial (VSR) en adultos
chilenos con NAC.

Aquí presentamos una evaluación exhaustiva de la etiología bacteriana y viral de la NAC en

adultos. Postulamos que los virus y las bacterias atípicas, ya sean únicas o co-infecciones,
juegan un papel relevante en la PAC de adultos y que el diagnóstico molecular definirá la
etiología específica en la mayoría de los casos. También exploramos la relación entre el
patógeno respiratorio y la gravedad clínica con un índice de puntaje de gravedad validado.

Métodos:
Pacientes y diseño del estudio

Se realizó un estudio prospectivo en pacientes ≥ 18 años de edad con CAP en dos hospitales en
Santiago de Chile desde febrero de 2005 a diciembre de 2007. El estudio fue aprobado por la
Universidad de Chile y el Comité de Ética Institucional de Salud y todos los sujetos en la
inscripción dieron consentimiento informado. La PAC se definió por la presencia de síntomas
respiratorios agudos durante menos de 1 semana y la radiografía de tórax que muestra nuevos
infitratos pulmonares. Los criterios de exclusión incluyeron condiciones
inmunocomprometidas (es decir, VIH, tratamiento activo para el cáncer, trasplante de
órganos, terapia inmunosupresora) y hospitalizaciones dentro de los 30 días anteriores a la
inscripción.

La información sobre la edad, el sexo, el tabaquismo, el tratamiento previo con antibióticos,

las comorbilidades y la presentación clínica, los signos vitales, los parámetros de laboratorio, la
terapia antimicrobiana y el curso hospitalario se registraron para todos los pacientes en
archivos estandarizados.

Los patrones radiológicos del tórax fueron descritos por radiólogos independientes como
infiltrados alveolares, intersticiales o mixtos; la extensión se clasificó según el número de
lóbulos afectados y la presencia de derrame pleural. La gravedad del paciente se evaluó
durante las primeras 48 h después de la inscripción según el índice de gravedad de la
neumonía descrito por Fine.

Se registraron los resultados de la enfermedad y la presencia de complicaciones como

insuficiencia renal, shock, ventilación mecánica y otros. Los pacientes que murieron entre la
admisión y 30 días después del alta se registraron
Colección de muestra

Además de las pruebas de laboratorio de rutina, como el conteo completo de células

sanguíneas, el panel de bioquímica, la saturación de oxígeno al ingreso, los pacientes tenían
recolección de orina y sangre para cultivo bacteriano y muestra de suero aguda para serología.
Se obtuvo esputo inducido y aspirado nasofaríngeo y se transportó inmediatamente sobre
hielo al laboratorio para diagnóstico bacteriano y viral.

Se prepararon alícuotas y se almacenaron a -80 ° C para pruebas posteriores.

Los participantes fueron contactados a las 4-6 semanas para el seguimiento y la recolección de
sueros convalecientes. Las muestras de suero se procesaron inmediatamente y se
almacenaron a -20 ° C hasta que se probaron.

Estudio Viral
-Procesamiento de muestras: Se prepararon alícuotas de muestra de secreciones respiratorias
para el ensayo de inmunofluorescencia, aislamiento viral en cultivo celular y PCR en tiempo
real.

-Aislamiento Viral: Cada muestra fue procesada como se describió previamente.

Brevemente, las muestras se inocularon en cultivos celulares de riñón canino HEp-2 y Madin-
Darby (MDCK) y se observó el desarrollo del efecto citopático (CPE) durante 1 semana,
después de lo cual se realizaron ensayos de inmunofluorescencia confirmatoria (IFA) para VSR,
adenovirus, influenza y parainfluenza los virus se realizaron en ambos cultivos celulares con y
sin ECP

- Ensayo de inmunofluorescencia indirecta: Se prepararon frotis por triplicado y se realizó IFA

para RSV, adenovirus, influenza A y B, virus parainfluenza 1-3 como se describe en otra parte,
utilizando anticuerpos monoclonales amablemente proporcionados por L Anderson (CDC,
Atlanta) y P Pothier (Dijon, Francia). Usamos conjugado comercial (Sigma) y anticuerpos
monoclonales específicos de virus (Chemicon) para la tipificación del virus de la influenza y
parainfluenza.

Serología

La prueba de inhibición de la hemaglutinación sérica (HI) para anticuerpos contra la influenza

(H3N2, H1N1 y B) se realizó como se describe en otra parte.

Los sueros pareados se inactivaron con la enzima que destruye el receptor (Denka Seiken
Corporation, Tokio, Japón), se incubaron durante la noche a 37 ° C y se calentaron a 56 ° C
durante 30 min.

Se utilizó una suspensión de glóbulos rojos de pavo al 0,5%, antígenos de control y antisueros
de referencia. Los casos que muestran al menos un aumento de cuatro veces entre los sueros
agudos y convalecientes se registraron como infección aguda.

Los sueros se analizaron para detectar anticuerpos contra RSV y metapneumovirus humano
(hMPV) mediante ensayos de microneutralización a RSV / A / Tracy (virus tipo A2) y RSV / B /
18537 (virus prototipo B) para medir RSV / A y RSV / B específicos anticuerpos neutralizantes
como se describió previamente.

Los anticuerpos hMPV también se detectaron mediante ensayos ELISA.

La seroconversión se definió por al menos un aumento de cuatro veces del título de

anticuerpos entre los sueros agudos y convalecientes mediante una o más de las pruebas
serológicas.

PCR de transcriptasa inversa para RSV y hMPV

Las muestras se trataron con el método de tiocianato de guanidinio-fenol-cloroformo para la

extracción de ARN.

El ADNc se sintetizó con 5 μL de ARN (muestra) y 0,52 μM de gen F cebador (F844: 50

TGTCTAACTATTTGAACA-30) para RSV y 10 μL de ARN y 0,52 μ M primer hexámero cebador
(Amersham Bioscience) para hMPV, durante 1 ha 37 ° C, seguido de 5 min a 95 ° C en un
AmpPCR Sistema 2400. Para RSV, una secuencia del gen N se amplificó con 10 μ M (cada uno)
de cebadores N1 y N2, 1 × Master SYBR Green I (Roche) y 2 μ LofcDNA.ForhMPV, una
secuencia del gen N se amplificaron con 0,5 μ M (cada uno) de N2 y N3 primers.

Las condiciones de ciclado incluyeron un paso de desnaturalización de 10 min a 94 ° C, seguido

de 50 (RSV) o 40 ciclos (hMPV) de 10 s a 94 ° C, 5 s a 58 ° C (RSV) o 52 ° C (hMPV) , 30 s a 72 ° C
en un instrumento Light Cycler 1.5 (Roche). Los amplicones se analizaron mediante análisis de
curva de fusión. Se incluyeron controles apropiados en cada ensayo

PCR de transcriptasa inversa para detección de rinovirus y coronavirus

El coronavirus humano (HCoV) y el picornavirus (PV) se detectaron mediante PCR de

transcriptasa inversa en tiempo real (RT-PCR) amplificando la región conservada del gen de
replicasa 1a y la región conservada de 50 NCR, respectivamente, como se describió
previamente.

El fragmento de 390 pb de PV se purificó y se secuenció usando el kit ABI PRISM Dye

Terminator Cycle Sequencing ready Reaction en el secuenciador automático ABI modelo 377
(Applied Biosystems, Inc, EE. UU.). Las secuencias se alinearon con otras secuencias en el
Banco de genes usando el programa de explosión Blast para diferenciar entre rinovirus y
enterovirus.

Estudio Bacterial
Culturas

Las muestras de esputo que mostraban> 25 leucocitos y <10 células epiteliales por campo de
potencia de 100 veces después de la tinción de Gram se cultivaron y procesaron de acuerdo
con técnicas estándar.
Los antígenos urinarios para Streptococcus pneumoniae se detectaron mediante pruebas
inmunocromatográficas (Binax NOW, Portland, Oregon, EE. UU.).

Para el aislamiento de especies de Legionella, se inocularon un subconjunto de 256 muestras

en medios BCYE y GVPC (Oxoid) y se incubaron a 37.8 ° C durante hasta 10 días; 125 de estos
casos también se estudiaron para el antígeno urinario usando pruebas
inmunocromatográficas.

La PCR confirmatoria se realizó en muestras positivas como se describe en otra parte.

Reacción en cadena de la polimerasa

Chlamydophila pneumoniae se detectó utilizando una PCR anidada dirigida a un segmento de

ADN cromosómico (PstI474) utilizando las cepas de referencia AR-39, TW-183 y CM-1 como
controles positivos.
Los cebadores HL y HR se usaron para la primera PCR y la PCR anidada se realizó como se
describe en otra parte.

Para M. pneu-moniae se usó una PCR dirigida a un fragmento de 277 pb del gen 16S rRNA, que
incluía una cepa FH de M pneumoniae como control positivo.

Serología

Las muestras de suero se analizaron para detectar anticuerpos IgM e IgG mediante IFA indir-
ect utilizando kits comerciales. Los sueros se absorbieron con un reactivo de IgG antihumano
(Zorba, Zeus, Inc, EE. UU.) Antes de la prueba de IgM. El kit de Chlamydia (SeroFIA, Sayvon,
Israel) se usó para C. pneumoniae e IgM ≥ 1: 16 o un aumento de cuatro veces en los títulos de
IgG entre sueros pareados se consideró como infección aguda; los títulos de IgG individuales o
en reposo ≥ 1: 512 se consideraron infecciones pasadas. Para M pneumoniae, se utilizó otra
prueba IFA (Zeus, EE. UU.) Y la infección aguda se asignó con IgM ≥ 1: 32 o seroconversión en
sueros pareados.

Las determinaciones de suero se realizaron a ciegas con respecto a otras pruebas virales o
bacterianas

Análisis Estadístico

El análisis se realizó utilizando la prueba Z para datos categóricos y la prueba t, suma de rangos
de Mann-Whitney o análisis de varianza de una vía de Kruskal-Wallis para variables continuas.
El nivel de significación se estableció en p <0.05. Los datos se analizaron usando el software
SigmaStat.

RESULTADOS
Paciencias y muestras

Se obtuvieron secreciones respiratorias y orina de 356 pacientes de 330 casos hospitalizados y

26 pacientes ambulatorios. Muestras de esputo de buena calidad estaban disponibles para 233
(65%) casos. Se realizó hemocultivo en 241 (75%) pacientes y se encontraron sueros
emparejados para 211 (68%) pacientes. El rinovirus y el coronavirus se estudiaron en un
subconjunto de 268 casos entre agosto de 2005 y septiembre de 2007. La serología para la
influenza se realizó solo en casos con sueros emparejados, que cubrieron las tres epidemias
anuales de influenza estacional. Se detectó un patógeno respiratorio en 232 (65.2%) de 356
casos, correspondientes a bacterias en 92 (26%) y virus en 80 (22%) casos. Se detectaron
infecciones virales / bacterianas mixtas en 60 (17%) casos. En 124 (35%) pacientes no se
detectó ningún agente (tabla 1). La muerte ocurrió en 28 (7.8%) casos, sin diferencia
significativa entre aquellos con o sin un agente infeccioso detectado.

Características clínicas de la población

Los factores de riesgo demográficos, las comorbilidades y los resultados no fueron

significativamente diferentes entre aquellos con o sin un patógeno detectable (tabla 2).
Además, los parámetros de laboratorio como las enzimas hemogram, glucosa, electrolitos,
urea y hepática no mostraron diferencias significativas (datos no mostrados). Solo la proteína C
reactiva fue significativamente más alta en pacientes con un agente patógeno detectable
(mediana = 211 mg / dL) en comparación con pacientes sin un agente patógeno identificable
(mediana = 158 mg / dL) (p = 0,01), aunque con un amplio rango de valores (Tabla 2).

El resultado clínico relacionado con la presencia de complicaciones, como progresión

radiológica, insuficiencia respiratoria, necesidad de ventilación mecánica o presencia de shock,
no mostró ninguna diferencia significativa entre ambos grupos. Solo el daño hepático (14/221
= 6.3% frente a 1/119 = 0.8%; p = 0.03) fue significativamente mayor en pacientes con un
patógeno detectable (tabla 2).

Sin embargo, la gravedad clínica de los casos se correlacionó con los parámetros descritos
clásicamente, como la edad, la comorbilidad, la hipotensión, la insuficiencia hepática y otros
(tabla 3).

Detección de agentes virales y bacterianos

La bacteria más comúnmente identificada fue S. pneumoniae (75 = 21.1%), aunque fue el
único patógeno en 38 casos (tabla 4). De estos 75 pacientes, 39 fueron analizados por cultivo
de esputo, 61 por hemocultivo y 73 por detección de antígeno en orina, y se identificó S.
pneumoniae en 12 (30.8%), 15 (24.6%) y 60 (82.2%) casos, respectivamente.

M pneumoniae y C pneumoniae se detectaron en 32 (9%) y 28 (7,9%) casos, respectivamente,

pero solo en 13 casos para cada agente fueron ellos el único patógeno. Para la neumonía M, la
PCR y la serología arrojaron resultados similares (69.7% y 72.7%, respectivamente, 42.4% de
los casos fueron positivos en ambas pruebas).

C. pneumoniae fue detectado por PCR (19/28) y serología (15/28), con 6 de 28 casos (21.4%)
detectados por ambas pruebas.

Legionella pneumophila se detectó en 13/256 casos (5.07%), 3 por cultivo, 10 por detección de
antígeno (uno por ambos); todos los casos fueron confirmados por PCR. Los virus más
comúnmente detectados fueron RSV (n = 48), PV (n = 41) y hMPV (n = 41), pero solo se
produjeron infecciones en 18, 17 y 8 casos, respectivamente (tabla 4).
Rendimiento de diferentes técnicas para el diagnóstico viral

La detección de un patógeno vírico mediante IFA convencional y técnicas de cultivo celular fue
infrecuente, con solo 2 de 48 infecciones por RSV y 6 de 27 casos de influenza. La técnica de
RT-PCR identificó 32 casos de RSV. La serología de microneutralización para VSR e HI para
influenza detectó seroconversión en 20 de 184 (10,8%) y 26 de 211 (12,8%) adultos con sueros
pareados, respectivamente. La RT-PCR fue la única prueba aplicada para el diagnóstico de
hMPV, PV y cor-onavirus, lo que resultó en la detección de 41 (11.5%), 41 (11.5%) y 20 (4.5%)
casos, respectivamente (tabla 4).

Estacionalidad

Durante la encuesta de 36 meses, circulaban virus respiratorios con un claro predominio del
VRS durante las tres temporadas de invierno (mayo-julio) (figura 1); los virus de influenza
presentados como una epidemia en otoño / invierno y los virus parainfluenza tuvieron una
mayor prevalencia durante los meses de otoño. Esta epidemiología es consistente con los
patrones reportados previamente en Chile.

La PAC alcanzó su punto máximo durante los meses de invierno. Fue influenciado por la
epidemiología observada con S pneumoniae, RSV y virus de la influenza. Otros agentes fueron
endémicos durante todo el año (figura 1).

Clasificación de severidad clínica e infección

El análisis de los parámetros demográficos y clínicos no pudo demostrar una relación entre la
clasificación de la infección (bacteriemia, virus o coinfección mixta) y el resultado de la
gravedad de la enfermedad.
Además, la presencia de múltiples patógenos no contribuyó a una enfermedad más grave
(datos no mostrados). El puntaje de severidad de Fine aplicado al ingreso tampoco mostró
diferencias entre las agrupaciones patogénicas (tabla 5).

DISCUSIÓN
La etiología de la NAC en adultos no se entiende bien. Llevamos a cabo este estudio
prospectivo durante un período de 3 años en Santiago para determinar si el uso integral del
diagnóstico convencional y molecular mejoraría la identificación etiológica de la NAC en
adultos y determinaría si el agente etiológico afectaba la gravedad de la enfermedad.

Se identificó un agente etiológico en el 65% de los casos. S pneumoniae y RSV fueron los
patógenos bacterianos y víricos más comunes identificados. Se produjeron casos únicos y
coinfecciones en 139 (39%) y 93 (26%) casos de PAC, respectivamente. En 102 (28.7%) de los
356 casos de PAC, se incluyeron patógenos potencialmente prevenibles por vacuna (S neumoia
y virus de la influenza).

El análisis se realizó globalmente, comparando grupos con y sin un agente infeccioso

detectable y por clasificación de infección (viral viral, bacteriana y mixta y bacteriana) porque
la infección única por unos pocos patógenos principales era poco común
El CAP adulto se observó durante todo el año, con una estacionalidad invernal distinta. Los
brotes de S pneumoniae, RSV e influenza contribuyeron al aumento de CAP en adultos durante
los meses de invierno.

Existen vacunas efectivas contra la influenza y S pneumoniae. El mayor uso de estas vacunas
podría reducir las tasas de adultos CAP, en particular durante los meses de invierno. En este
estudio, no se registró la información sobre el historial de vacunación.

Históricamente, la vacunación contra la influenza y S pneumoniae en adultos no ha sido bien

aceptada por esta población, a pesar de que existen recomendaciones nacionales para la
vacunación de adultos mayores y grupos en riesgo.

El uso integral de diagnósticos moleculares, ensayos serológicos, pruebas de antígenos

urinarios y cultivos de esputo y sangre inducidos mejoró la detección general de un agente
infeccioso en adultos que presentaban NAC. La detección de bacterias víricas y atípicas fue tan
frecuente como la clásica S pneumoniae. No hubo síntomas o signos antecedentes que
pudieran estar asociados con un agente etiológico específico. Además, los hallazgos de la
radiografía de tórax no pudieron definir la etiología

La identificación de un agente bacteriano utilizando esputo y hemocultivos fue poco frecuente,

y la detección de un patógeno bacteriano mejoró con el uso del análisis del antígeno urinario
para S. pneumoniae. La implementación de la tecnología de diagnóstico molecular ha
mejorado y ampliado el espectro de potenciales agentes etiológicos debido a la mejor
identificación de los agentes conocidos y el reconocimiento de nuevos agentes asociados con
enfermedades respiratorias.

En virología, las técnicas moleculares se usan ampliamente y para algunos agentes constituyen
el principal método de identificación (es decir, hMPV, PV, coronavirus). Además, la menor
carga y la menor duración de la diseminación viral que ocurre en los adultos en comparación
con los niños hace necesario el uso de herramientas de diagnóstico altamente sensibles en los
adultos. Para las bacterias atípicas, la PCR se debe utilizar como técnica de diagnóstico
primaria; desafortunadamente, su aplicación a menudo está restringida a los principales
centros académicos y de diagnóstico.

Para nuestra sorpresa, no pudimos encontrar una relación entre la gravedad de la enfermedad
y el agrupamiento patogénico principal o la clasificación de infección. La mayoría de los
agentes detectados ocurrieron con mayor frecuencia con otros patógenos que con el único
patógeno. Detectamos muchos agentes infecciosos utilizando nueva tecnología de diagnóstico,
pero la traducción de este hallazgo no estaba clara. La detección de patógenos tradicionales,
como S pneumoniae y bacterias atípicas, podría explicar el resultado clínico, pero la detección
de RSV y hMPV, patógenos respiratorios virales reconocidos en la población pediátrica, debe
considerarse cuidadosamente en adultos.

La identificación de otros virus como rinovirus y coronivavirus hace que sea más difícil asignar
una interpretación etiológica debido a que también pueden ocurrir infecciones asintomáticas y
desprendimiento de virus prolongado. La detección frecuente de dos o más agentes
infecciosos podría ser la situación más probable en CAP en comparación con la asignación
clásica de un único agente a un resultado patógeno.
Las características clínicas o radiológicas no son características de S pneumoniae CAP. En este
estudio, casi el 50% de los casos de S pneumoniae ocurrieron como coinfecciones. Este
hallazgo sugiere que la presentación clásica de la Pneumoccocal CAP como el único patógeno
podría no ser correcta y que otros patógenos podrían contribuir a la enfermedad. En la
actualidad, el uso de tecnología de diagnóstico más sensible dificulta la simple asociación entre
el agente y la enfermedad.

En resumen, factores como la edad y las comorbilidades son relevantes para la gravedad de la
NAC. A pesar de las mejoras en la identificación de un agente etiológico asociado con CAP, no
pudimos demostrar una significación clínica durante el proceso agudo. La detección relevante
de bacterias y virus clásicos y atípicos debe considerarse en la intervención antimicrobiana
empírica inicial.

Se detectaron bacterias atípicas en aproximadamente el 20% de los casos, justificando la

cobertura antimicrobiana. La estacionalidad de los agentes respiratorios virales también
debería influir en la recomendación para la terapia antiviral de influenza.

En conclusión:

1. Los virus y las bacterias atípicas se detectan con tanta frecuencia como S pneumoniae
en pacientes con NAC si se aplica la tecnología de diagnóstico moderna.

2. No pudimos demostrar que el tipo de infección (bacteriana frente a viral) o el número

de patógenos (único versus coinfecciones) afectaran negativamente el resultado
clínico.

3. La detección de múltiples agentes infecciosos en adultos CAP es común y debe

considerarse en la selección de la terapia antimicrobiana empírica.

4. La vacunación contra la influenza y S pneumoniae puede reducir la admisión de

adultos CAP, especialmente durante la temporada de invierno.