CENTRO DE DESARROLLO DE
PRODUCTOS BIÓTICOS
Campus en Sutton Bonington, Inglaterra, bajo la dirección del Dr. Luis Arturo
Bello Pérez.
(PIFI).
INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
COORDINACIÓN GENERAL DE POSGRADO E INVESTIGACIÓN
En la Ciudad de Yautepec, Morelos el día 29 del mes de Julio del año 2004, el que
suscribe IBQ. Claudia Edith Millán Testa alumna del Programa de MAESTRÍA EN
DESARROLLO DE PRODUCTOS BIÓTICOS con número de registro B021745, adscrita al
Centro de Desarrollo de Productos Bióticos, manifiesta que es autora intelectual del presente
trabajo de Tesis bajo la dirección del Dr. Luis Arturo Bello Pérez y cede los derechos del
trabajo intitulado“Estudios estructurales y moleculares del almidón de fuentes no
convencionales: mango (Mangifera indica L.), plátano (Musa paradisiaca) y okenia (Okenia
hypogaea)” al Instituto Politécnico Nacional para su difusión, con fines académicos y de
investigación.
M. C. Guadalupe Méndez Montealvo, por darme su apoyo para realizar este trabajo y sobre
todo por su amistad incondicional.
Al Departamento de Desarrollo Tecnológico, por otorgarme las facilidades para realizar este
trabajo.
A mis compañeros de maestría por su amistad: Laura, Mirna, Fernando, Juan Pablo, Andrés,
Nelly, Paul, Polo, Alex Mora, Alex.
Glenis Ortega McEwen, Presidenta de Glen-Tech Services, por asesoría y sabios conocimientos
brindados.
A mis padres, que me han dado todo lo que ellos no tuvieron, que me hayan enseñado a guiarme
con el corazón y mente, los dos son increíbles.
A mis hermanos, por darme su confianza, cariño y apoyo durante tanto tiempo.
A mi tío Eladio, tía Bety y a mis primos Armando y Marco, por estar siempre apoyándome en
los buenos y malos momentos.
A Omar, por su comprensión, cariño y confianza, brindado todo este tiempo que tenemos
juntos.
A mis amigos del alma que siempre han estado conmigo y me han enseñado el significado de la
verdadera amistad: Sergio, Erika, July, Lupita, Roselis, Edith, Carlos, Vivian, Chris,
Suwanna.
Contenido
CONTENIDO
Pág.
RESUMEN 1
ABSTRACT 3
I INTRODUCCIÓN 5
II ANTECEDENTES 6
2.1 Almidón 6
2.1.1 Composición química del almidón 8
2.1.1.1 Amilosa 8
2.1.1.2 Amilopectina 8
2.1.1.2.1 Modelos estructurales 10
2.1.1.3 Amilosa y amilopectina en el gránulo 11
2.2 Cristalinidad del almidón 15
2.3 Relación estructura-función del almidón 18
2.4 Solubilización: una medida importante para la caracterización estructural
de los almidones 20
2.5 Sistemas utilizados para la caracterización estructural de los almidones 22
2.5.1 Cromatografía de líquidos de alta resolución de exclusión por
tamaño (CLARET) 22
2.5.2 Detector de dispersión de luz en forma estática (DLE) 22
2.5.2.1 Modo por lote (obtención de diagramas de Zimm) 23
2.5.3 Detector de índice de refracción (IR) 23
2.5.4 Combinación de cromatografía (CLARET) con los detectores de
dispersión de luz en forma estática (DLE) e índice de refracción
(IR) 25
Contenido
LISTA DE CUADROS
No. Pág.
LISTA DE FIGURAS
No. Pág.
1 Estructura química de los componentes del almidón. 9
Diagrama de la estructura molecular de la amilopectina propuesto por (1)
2
Haworth, (2) Staudinger, (3) Meyer y (4) Robin. 12
ABREVIATURAS
Å amstrom
CDB calorimetría diferencial de barrido
cm centímetro
CLARET cromatografía de líquido de alta resolución por exclusión de tamaño
CPG cromatografía de permeación por geles
°C grado centígrado
Da dalton
df dimensión fractal
DMSO dimetilsulfóxido
DLE detector de dispersión de luz en forma estática
∆H entalpía
h hora
g gramo
GP grado de polimerización
g/mol gramo por mol
gn gravedad
J/g joule por gramo
KV kilovolt
MM masa molar
M molaridad
mA miliamper
µm micra
mg miligramo
mL mililitro
µL microlitro
min minuto
nm nanómetro
α nivel de significancía
Abreviaturas
RG radio de giro
r.p.m revoluciones por minuto
s Segundo
pH potencial de hidrogeno
Tp temperatura de pico ó gelatinización
v/v volumen/volumen
W watt
Resumen
RESUMEN
El almidón es un carbohidrato importante a nivel mundial, debido a que en los últimos años ha
cobrado gran interés por su amplio uso en la industria de alimentos, agroquímica y farmacéutica,
entre otras. Actualmente existe la necesidad de buscar fuentes alternativas (plátano, mango y okenia)
para la obtención de dicho polisacárido. Es importante conocer las características estructurales y
moleculares, ya que esto servirá para sugerir las posibles aplicaciones. El objetivo del presente
trabajo fue determinar las características moleculares y estructurales del almidón de plátano (Musa
paradisiaca), mango (Mangifera indica L.) y okenia (Okenia hypogaea). Se realizó la
caracterización química, microscópica, estructural, molecular, así como también su perfil
calorimétrico. En la composición química, los almidones de fuentes no convencionales presentaron
valores altos de proteínas y lípidos al compararlos con el de maíz, reportado en otro estudio, estas
diferencias posiblemente se debieron al origen botánico y al método de aislamiento utilizado. En lo
que respecta a la microscopía electrónica de barrido, los almidones de plátano, mango y okenia
mostraron formas ovoides como el almidón de plátano y esféricas que es el caso de los almidones de
mango y okenia, el almidón de plátano presentó un tamaño de gránulo en un intervalo de 10-40 µm,
mango de 5-10 µm y en okenia de 1-3 µm. En cuanto a los estudios de microscopía de luz
polarizada, en los tres almidones se observó la cruz de malta, lo que indica una organización
estructural de los componentes del almidón dentro del gránulo. Con respecto a los estudios de
difracción de rayos-X, los almidones de mango y okenia presentaron un patrón tipo -A y el almidón
de plátano un patrón tipo -C. En los estudios de espectroscopía de infrarrojo, los almidones
presentaron un alto nivel de organización de la región cristalina dentro del gránulo relacionándolo
con la posible resistencia a un ataque enzimático. En los estudios estructurales de los almidones
(plátano, mango y okenia), se utilizó un sistema por lote y fueron disueltos en agua a diferentes
tiempos de calentamiento (40, 50, 60 y 70 s) en un horno de microondas, la masa molar (MM) y radio
de giro (RG) disminuyeron cuando incrementó el tiempo de calentamiento.
1
Resumen
Haciendo un análisis con la teoría de fractales, se encontró que los almidones presentaron
estructuras ramificadas al azar (almidón de okenia y mango) y globulares (almidón de plátano), esto
demuestra diferencias estructurales en los almidones. El almidón de plátano presentó una
temperatura de gelatinización más alta que los almidones de mango y okenia, esto puede ser
atribuido al tamaño de gránulo así como también a la longitud de las cadenas de la molécula de
amilopectina. En el caso de la entalpía, los almidones de plátano y mango presentaron valores más
altos (23.43 y 21.19 J/g, respectivamente) comparados con el almidón de okenia (15.02 J/g). Los
estudios moleculares y estructurales mostraron diferencias entre los almidones de diferentes fuentes
botánicas, lo cual puede repercutir en sus propiedades funcionales.
2
Abstract
Abstract
Starch is a world-wide important carbohydrate, because in the last years, its use has been extended
in diverse industries such as foods, agrochemicals and pharmaceuticals, etc. Nowadays, it is
necessary to look for alternative sources (e.g. banana, mango, okenia) for obtaining this
polysaccharide. It is very important to know the structural and molecular characteristics of
starches, since this will help to suggest its possible applications. The objective of this work was to
determine the molecular and structural characteristics of banana (Musa paradisiaca), mango
(Mangifera indica L.) and okenia (Okenia hypogaea) starches. The chemical, microscopic,
structural and molecular characterization was performed along with its calorimetric profile. In the
chemical composition, the starches from non-conventional sources presented high values of
proteins and lipids when comparing them with that of corn, reported in a previous study, these
differences were possibly due to the botanical origin and the isolation method. Scanning electron
microscopy of banana, mango and okenia starches, showed ovoid and spherical forms, banana
starch presented a granule size in an interval of 10-40 µm, mango starch of 5-10 µm and okenia
starch of 1-3 µm. Respect to the study of polarized light microscopy in the three starches, the
maltese cross was observed, indicating that the starch isolation method used, produced intact
granules. Mango and okenia starches presented an A-type X-ray diffraction pattern and the
banana starch a C-type X-ray diffraction pattern. In the studies of infrared spectroscopy, the
starches presented a high level of organization of the crystalline region inside the starch granule,
related with the possible resistance to enzymatic hydrolysis. Static light scattering was used for
the structural study of the starches (banana, mango and okenia).The samples were dissolved in
water at different heating times (40, 50, 60 and 70 s) in a microwave oven, the molar mass (MM)
and radii of gyration (RG), decreased as the heating time increased. Making a fractal theory (df)
analysis, it was found that the studied starches showed characteristics of globular structures
(mango and okenia starches) and branching structure (banana starch), this suggest structural
differences among the three starches.
3
Abstract
The banana starch showed a higher gelatinización temperature, than those of mango and okenia
starches, this can be related with its X-ray diffraction pattern (type -C), since it has been reported
that the crystallinity levels and the diffraction pattern, are attributed to the granule size, as well as
the chain lengths in thfe amylopectin molecule. In the case of the gelatinization enthalpy, the
banana and mango starches presented higher values (23.43 and 21.19 J/g, respectively) than
okenia starch (15.02 J/g). The molecular and structural studies, showed differences among the
starches from different botanical sources, which can affect their functional properties.
4
I. Introducción
I. INTRODUCCIÓN
5
II. Antecedentes
II. ANTECEDENTES
2.1 ALMIDÓN
6
II. Antecedentes
7
II. Antecedentes
2.1.1.1 Amilosa
2.1.1.2 Amilopectina
8
II. Antecedentes
Amilosa
Amilopectina
9
II. Antecedentes
10
II. Antecedentes
en el grupo o extremo reductor y solo existe una cadena de este tipo por molécula (Bello-Pérez
y col., 2002).
Se ha obtenido información mas detallada de la estructura de la amilopectina usando
enzimas desramificantes (pululanasa o isoamilasa), para hidrolizar selectivamente los enlaces
glucosídicos α(1-6) en los puntos de ramificación y β–amilasa combinada con pululanasa, para
obtener dextrinas β–límite. En base a este tipo de estudios, Robin y col. (1974), propusieron un
modelo para la amilopectina, basado en la estructura de racimo o grupo (“cluster”). En este
modelo (Figura 2), las cadenas A y B son lineales y tienen un GP de 15 y 45, respectivamente.
Cada racimo contiene de dos a cuatro cadenas A estrechamente asociadas, donde los racimos de
las cadenas A, son responsables de las regiones cristalinas dentro del gránulo. Las áreas
intercristalinas (amorfas) se presentan a intervalos de 0.6-0.7 nm y contienen la mayor cantidad
de enlaces α(1-6), siendo relativamente susceptibles a los agentes hidrolíticos (ácidos y
enzimas). En general, la molécula de amilopectina es de 1.0 a 1.5 nm de diámetro y de 12 a 40
nm en longitud.
Los gránulos de almidón están formados por regiones cristalinas y amorfas, mostrando
una “Cruz de Malta” cuando son observados bajo luz polarizada (Katz y col., 1993). Este
fenómeno es conocido como birrefringencia, el cual indica que existe un alto grado de
orientación molecular dentro del gránulo, sin referencia a ninguna forma cristalina
La región cristalina está formada por cadenas de racimos de la amilopectina mientras
que la región amorfa esta formada por puntos ramificados de la amilopectina y por la amilosa
(Zobel, 1988). La región cristalina ha sido la más estudiada y es consecuentemente la más
entendida. La estructura del gránulo del almidón y el arreglo de sus componentes en diferentes
niveles de organización (Figura 3), permite explicar las propiedades fisicoquímicas y
funcionales, así como la digestibilidad de los diferentes almidones.
11
II. Antecedentes
Reductor
Racimo
Enlace
α (1-6)
12
II. Antecedentes
a)
b)
c)
d)
e)
13
II. Antecedentes
b) Dentro de las cubiertas cristalinas y amorfas, la estructura esta asociada con canales
amorfos. La cubierta amorfa contiene compartimientos con tamaños más pequeños que
en la cubierta cristalina.
14
II. Antecedentes
15
II. Antecedentes
16
II. Antecedentes
2θ
Angulo de difracción
17
II. Antecedentes
El estudio del almidón ha evolucionado, en los años 60´s se reportó que la forma y
tamaño de sus gránulos tenían un papel importante en sus propiedades funcionales; en la década
de los 70´s, se reportó que la relación amilosa/amilopectina era importante para determinar las
propiedades funcionales de los almidones, a finales de los 80´s e inicio de los 90´s, los estudios
ya estaban enfocados a conocer la longitud promedio de las cadenas de la amilopectina, la
relación de cadenas cortas/largas, el grado de ramificación, así como también se reportó que la
masa molar del almidón y de sus componentes, influyen en las propiedades funcionales (Bello-
Pérez y col., 2002).
El modelo de grupos de la estructura de la amilopectina propuesto por Robin y col.
(1974), ha sido apoyado con estudios estructurales realizados por Hizukuri (1986); este autor
encontró que las características de distribución de las longitudes de cadenas son inconsistentes
con los modelos estructurales de Haworth, Staudinger o Meyer, pero consistente con el modelo
de grupos. La relación de cadenas A:B cuyo intervalo es de 2.6:1.0 ó 1.0:1.0, ha sido usada
como patrón para verificar o rechazar diferentes modelos estructurales de la molécula de
amilopectina (Eliasson y col., 1987).
También los estudios de difracción de rayos-X se han utilizado para conformar el
modelo de grupos y el papel de la amilopectina en la cristalinidad del almidón. El tipo de cristal
de la amilopectina depende de la masa molar promedio y la longitud de cadena: los patrones
tipo –A presentan, cadenas cortas (GP 26), largas para los tipo –B (GP 36) e intermedias (GP
28) para los tipo -C (Zobel, 1988; Biliaderis, 1991).
En otro estudio se concluyó que la longitud promedio de las cadenas de amilopectina,
depende principalmente de la longitud de la cadena del componente mayoritario, el cual
probablemente comprende cadenas tipo -B. Esos cambios regulares que se presentan en la
distribución de las longitudes de las cadenas, sugieren que un mecanismo de control fino, el cual
difiere ligeramente con las especies estudiadas, esta involucrado en la biosíntesis de la
amilopectina. Puede además concluirse que la longitud de las cadenas de la amilopectina es un
factor intrínsico que determina la estructura cristalina de los gránulos de almidón.
18
II. Antecedentes
19
II. Antecedentes
El primer paso para determinar la estructura molecular del almidón por alguna técnica,
es la disolución de la muestra en un disolvente apropiado, sin una degradación significativa de
sus componentes. Diversos disolventes han sido propuestos para almidones como: NaOH 1M
(Hizukuri, 1981), KOH 0.1M (Roger y Colonna, 1993), DMAc/LiCl (Politz y col., 1994) y
DMSO (Hizukuri, 1985; Bello-Pérez y col., 1998 a, b).
El dimetilsulfóxido (DMSO): (CH3-SO-CH3) Es el disolvente más utilizado para
solubilizar los almidones. Leach y Schoch (1962) estudiaron la solubilidad del gránulo de
almidón en DMSO, la cual fue determinada por medidas de pesos de almidón precipitado por
etanol, para obtener un sobrenadante después de centrifugar.
Los almidones presentan diferencias en la velocidad de solubilización en DMSO,
reflejando diferentes enlazamientos moleculares dentro del gránulo. Sahai y Jackson (1996)
estudiaron la estructura y propiedades químicas de almidones nativos usando DMSO al 90%
como disolvente. La “solubilidad aparente” de los almidones fue medida como el área bajo el
pico del cromatograma de la amilosa y la amilopectina, y se obtuvo la relación de amilosa y
amilopectina. Ellos reportaron que el tamaño del gránulo no influye en la solubilidad del
almidón en DMSO. French (1984) concluyó que DMSO solubiliza al almidón por ser un buen
aceptor de enlaces de hidrógeno, rompiendo los enlaces de hidrógeno almidón-almidón y agua-
almidón.
20
II. Antecedentes
21
II. Antecedentes
22
II. Antecedentes
Es un método utilizado para obtener gráficas de Zimm de una solución polidispersa, ésta
es preparada en diferentes concentraciones y son inyectadas a través del sistema, este método no
realiza ningún tipo de separación, de esta forma se obtiene información de la masa molar y del
radio de giro promedio de la macromolécula.
Otro parámetro que es obtenido a partir de este sistema, es el segundo coeficiente virial
(A2) (la interacción que hay entre el soluto y el disolvente). El RG siempre se obtendrá de la
dependencia angular de la luz dispersada. Esto se calcula a partir de la pendiente angular
después de extrapolar a la concentración cero. El segundo coeficiente virial se obtiene de la
concentración dependiente de la dispersión. Esto es calculado de la pendiente de la
concentración después de extrapolar a ángulo cero (Wyatt, 1993) (Figura 5).
23
II. Antecedentes
Proyección a
Rθ
Proyección a C - C
24
II. Antecedentes
En principio, para medir el cambio de índice de refracción de una solución, uno puede
deducir el cambio de concentración de un soluto diluido. De esta manera se puede conocer el
incremento de índice de refracción dn/dc (Wyatt, 1993).
25
II. Antecedentes
calibración) iii) usando CLARET con los detectores DLE y IR. Diferentes aspectos estructurales
del almidón han sido investigados usando el sistema CLARET-IR-DLE: (i) fracciones
individuales de amilosa y amilopectina (Roger y col., 1996; Bello-Pérez y col., 1998a,b; You y
col., 1999); (ii) almidones y amilopectinas desramificados (You y col., 1999; Ong y Blanshard
1995; Ramesh y col., 1999), y (iii) almidones enteros (Fishman y col., 1996; Chen y col., 1997;
Bello-Pérez y col., 1998a,b) (Cuadro 3).
Diferentes técnicas son utilizadas para estudiar la estructura del almidón, sin embargo, la
información que estas proporcionan varían en una escala de nanoestructura, microestructura o
macroestructura, es necesario entender los principios básicos usados en las técnicas, los cuales
serán explicado en esta sección.
26
II. Antecedentes
27
II. Antecedentes
En este método se utiliza una celda conocida como reflactancia total atenuada (RTA)
(Figura 6). El principio se basa en el fenómeno de reflexión total interna y la transmisión de la
luz a través de un cristal, el cual presenta un índice de refracción alto. El material absorbente
(muestra) recibe la energía emitida por el cristal, provocando las vibraciones moleculares, las
cuales se representan en los espectrogramas.
En 1928 Katz, usando un difractor de rayos-X demostró que el pan se endurecía, debido a
la recristalización del almidón durante su almacenamiento (Hizukuri, 1961). La difracción de
rayos-X ha llegado a ser una técnica bien establecida para estudiar la cristalinidad de los
polímeros (orden de largo rango) y puede dar la información de su estructura, también ha sido
utilizada como una herramienta para medir el grado de gelatinización (Ottenhof, 2003).
El patrón de difracción de rayos-X, es usado para diferenciar entre almidones de cereales
y de tubérculos (Zobel, 1988) y para detectar cambios en la cristalinidad de la amilopectina,
causados por tratamientos físicos y químicos de los gránulos de almidón.
En principio existen dos métodos para medir el patrón en una unidad de difracción de
rayos-X: a) el método difractométrico, en el que los rayos desviados de la muestra se reciben en
un tubo contador Geiger-Muller en donde la señal se amplifica y se grafica b) el método
fotográfico, en el cual el patrón se mide en una película fotográfica. Los rayos-X son una forma
de radiación electromagnética con una longitud de onda típica entre 0.1 y 1.0 nm, que es
comparable al espacio molecular en un cristal. Cuando el destello del rayo-X choca con un
cristal colocado en una superficie especial, permite que el cristal sea rotado con respecto al
destello incidente y la difracción ocurre. La difracción es el fenómeno que se presenta cuando
una onda en movimiento interactúa con un obstáculo.
28
II. Antecedentes
Elementos de
calentamiento
Termopar
Prisma
Incidencia del láser IR Láser del detector IR
29
II. Antecedentes
El destello difractado es una medida para obtener información de la estructura del cristal
y las moléculas que lo forman (Bello-Pérez, 1995).
Sin embargo, la mayoría de los polímeros tienen material amorfo y cristalino, como es el
caso de los almidones nativos, el difractograma de rayos-X, es la superposición de dos tipos de
difractogramas (amorfos y cristalinos) (Figura 7).
30
II. Antecedentes
31
II. Antecedentes
32
II. Antecedentes
Los gránulos de almidón son insolubles en agua fría, pero se hinchan cuando se
calientan en un medio acuoso. Inicialmente, el hinchamiento es reversible y las propiedades
ópticas del gránulo no se pierden; sin embargo, cuando se alcanza una cierta temperatura, el
hinchamiento llega a ser irreversible y la estructura del gránulo se altera significativamente. Este
proceso es conocido como gelatinización y la temperatura a la cual ocurre este fenómeno se le
conoce como temperatura de gelatinización. La gelatinización es un fenómeno endotérmico al
cual se le ha aplicado algunos métodos de análisis térmicos para medir los fenómenos
involucrados en ellos (Donovan, 1979).
Dentro del análisis térmico se encuentra la calorimetría diferencial de barrido (CDB), la
cual se usa en diferentes áreas de investigación, desarrollo e inspección de calidad (Höhne y
col., 1996); en ella, la medición principal es la comparación de la velocidad del flujo de calor
para la muestra y la referencia, las cuales son calentadas o enfriadas a la misma velocidad, es
decir, la energía absorbida dentro de una sustancia y un material de referencia están sujetos a un
programa de temperatura controlada (Figura 9) (McKenzei, 1970). En el caso particular de los
alimentos, algunos investigadores han utilizado esta técnica para determinar la influencia del
contenido de humedad sobre el fenómeno de gelatinización, utilizando condiciones de exceso de
agua (>80% de humedad) y un contenido de agua limitado (< 70% de humedad), donde
obtuvieron una nueva endoterma a temperaturas superiores, esto ha sido atribuido a la fusión
verdadera de los cristales de amilopectina presentes en el gránulo del almidón (Biliaderis y col.,
1980). La variación en el contenido de humedad influye principalmente en la temperatura de
gelatinización, ya que cuando el contenido de agua disminuye (para una relación agua/almidón
inferior a 1, la temperatura de gelatinización aumenta de manera exponencial y alcanza un valor
cerca de 170 °C para un almidón seco (Colonna y Mercier, 1985). Otros factores que afectan
esta temperatura son la velocidad de calentamiento, los tratamientos hidrotérmicos, las
modificaciones químicas, las interacciones con lípidos, con proteínas, así como también las
interacciones en complejos amilosa-lípido y los efectos de solutos iónicos y no iónicos (Takaya
y col., 2000; Gómez-Aldapa, 2001; Svegmark y col., 2002).
33
II. Antecedentes
34
III. Justificación
III. JUSTIFICACIÓN
En el mercado existen fuentes de almidón como son maíz, papa y tapioca, siendo
algunas de ellas fundamentales para la alimentación humana. Se ha considerado buscar fuentes
no convencionales de almidón como son mango, plátano y okenia, con nuevas propiedades
funcionales y aplicaciones.
Bello-Pérez y col. (1999) han reportado las características fisicoquímicas de los
almidones de plátano, Aparicio-Saguilán (2001) para mango y Sánchez-Hernández y col. (2002)
para okenia, donde se ha manifestado que estos almidones podrían tener aplicación a nivel
industrial.
En los últimos años ha cobrado gran interés el estudio de la relación estructura-función,
para poder explicar como la estructura repercute en las propiedades funcionales de los
almidones y con esto, buscar las mejores aplicaciones y el desarrollo de nuevos productos. Por
otro lado, conociendo la relación entre estructura-función posiblemente se pudiera manipular la
biosíntesis y obtener almidones con propiedades especificas.
35
IV. Objetivos
IV. OBJETIVOS
36
V. Materiales y Métodos
V. MATERIALES Y MÉTODOS
5.1 Materiales
5.1.2 Reactivos
Todos los reactivos utilizados fueron de grado analítico de las marcas Sigma, Merck
(Darmstadt, Alemania) y Baker (México, DF)
5.2 Métodos
37
V. Materiales y Métodos
38
V. Materiales y Métodos
Las muestras de almidón se espolvorearon sobre una cinta conductora de cobre de doble
adhesión, la cual se fijó previamente en un soporte de aluminio del microscopio electrónico de
barrido JEOL (modelo JSEM 35CX; Japan Electronic Optical Limited, Japón). Las muestras se
cubrieron con una capa de carbón de 30 nm de espesor depositada al vacío (10-5 Torr) en una
evaporadora JEOL. La evaporadora estaba dotada de un adaptador rotatorio de ángulo variable
con objeto de asegurar una capa uniforme en toda la superficie de la muestra. Las muestras
recubiertas con carbón se colocaron en el ionizador de metales JEOL, y se recubrieron con una
capa de oro de 60 nm. Las muestras fueron observadas en el microscopio electrónico de barrido
a un voltaje de 8 KV y se tomaron las fotografías.
39
V. Materiales y Métodos
40
V. Materiales y Métodos
41
V. Materiales y Métodos
a través de 0.1 µm. La muestra se mantuvo sobre flujo de nitrógeno por 20 min. La copa de
teflón fue colocada dentro de una bomba policarbonatada. La muestra fue calentada por 40, 50,
60 y 70 s a 900 W en un horno de microondas. Posteriormente, la bomba se enfrió colocándola
en un baño de hielo por 30 min, la muestra fue centrifugada a 15000 r.p.m por 10 min a 15 ºC.
La solución sobrenadante fue pasada por un filtro de 5 µm. Se determino la concentración de
las muestras después de ser filtrada, a través de carbohidratos totales (Dubois y col., 1956).
Para la preparación de las muestras se utilizó el método propuesto por Bello-Pérez y col.
(1998a). Se prepararon 5 concentraciones diferentes de las muestras y cada concentración fue
colocada en jeringas de plástico. Las jeringas fueron colocadas, cada una a través de una bomba,
que estaba conectada directamente al detector de dispersión de luz. La masa molar (MM) y el
radio de giro promedio (RG) fueron determinados usando el método Berry-Plot de segundo
42
V. Materiales y Métodos
orden y se calcularon a través del programa del detector de dispersión de luz conocido
comercialmente como ASTRA versión 4.90.08 (Waytt Technology Corporation, 1994). El
alineamiento de los diferentes detectores de Dawn fueron observados sobre intervalos usando
tolueno filtrado (0.1 µm) (Bello-Pérez y col., 1998a, b).
43
V. Materiales y Métodos
El nivel de significancía utilizado en todos los análisis fue del 5% (α = 0.05). Cuando se
encontraron diferencias significativas en las variables medidas, se aplicó la prueba de
comparación múltiple de Tukey (Walpole y col., 1999).
44
VI. Resultados y discusión
45
VI. Resultados y discusión
46
VI. Resultados y discusión
Sánchez-Hernández y col. (2002) reportaron valores de cenizas de 0.52 % esto puede ser
debido a que la semilla de okenia almacena algunos minerales. Otros autores reportan diferentes
contenidos de cenizas de almidones como es el caso de amaranto (0.12 %) con distinto método
de aislamiento.
47
VI. Resultados y discusión
a)
40 μm
b)
c)
48
VI. Resultados y discusión
49
VI. Resultados y discusión
a)
b)
c)
50
VI. Resultados y discusión
51
VI. Resultados y discusión
Smits y col. (1998) reportaron, que la relación de las absorbancias a partir de las
longitudes de onda de 1045 y 1022 cm-1 con un valor menor de 1, implica una mayor cantidad
de material amorfo, y cuando el valor es mayor de 1 existe mas cantidad de material cristalino,
siendo un almidón mas organizado. Para los almidones de plátano, mango y okenia la relación
fue de 1.319, 1.151 y 1.352, respectivamente, por lo cual estos almidones presentan una mayor
cantidad de material cristalino; en el caso del almidón de mango la cristalinidad fue menor lo
cual podría influir en su funcionalidad.
Sevenou y col. (2002) encontraron, que los almidones que presentaban mayor nivel de
organización en la región cristalina, tienen alta resistencia a ataques enzimáticos, influyendo en
su digestibilidad, así como también, para la obtención de productos donde es necesaria la
hidrólisis de los almidones como obtención de maltodextrinas y jarabes de glucosa.
52
VI. Resultados y discusión
53
VI. Resultados y discusión
54
VI. Resultados y discusión
Mango
40 25.4 186
50 9.6 128
60 7.0 112
70 2.1 67
Okenia
40 6.7 106
50 3.4 92
60 1.9 76
70 0.2 73
55
VI. Resultados y discusión
Figura 14. Diagrama de Zimm del almidón de plátano con un tiempo de calentamiento de
40 s.
56
VI. Resultados y discusión
Figura 15. Diagrama de Zimm del almidón de mango con un tiempo de calentamiento de
40 s.
57
VI. Resultados y discusión
Figura 16. Diagrama de Zimm del almidón de okenia con un tiempo de calentamiento de
40 s.
58
VI. Resultados y discusión
Diversos autores han utilizado otros métodos para el estudio estructural de los almidones
como es el caso de: Millard y col. (1997), donde realizaron estudios de almidones de maíz
ceroso solubilizados a través de un calentamiento por un horno de microondas por 90 s,
reportando valores de MM de 586 x 106 g/mol y RG de 376 nm; posteriormente Bello-Pérez y
col. (1998a) propusieron un método, el cual consiste en un pretratamiento en DMSO al 90 %,
probaron diferentes tiempos de 35-90 s para determinar el tiempo adecuado para la
solubilización en agua a través de un calentamiento por un horno de microondas, ellos
reportaron para maíz normal, valores de MM entre 19 x 107 g/mol para 35 s de calentamiento y
RG de 250 nm y a 90 s de calentamiento, MM 2.7 x 107 g/mol y RG 100 nm, concluyendo que a
35 s se obtuvo una mayor solubilización de los almidones, así como también una buena
separación de amilosa y amilopectina.
En este estudio de la misma manera se probaron diferentes tiempos de calentamiento
para la solubilización de los almidones, donde se observó el mismo comportamiento al
aumentar el tiempo de calentamiento, disminuyó la MM y el RG, debido a la degradación de la
molécula por la temperatura que se alcanza a tiempos largos de calentamiento. Rolland-Sabaté y
col. (2003), utilizando almidones de camote de diferentes variedades y el método propuesto por
Bello-Pérez y col. (1998a), reportaron valores de MM y RG de 0.75-3.41 x 108 g/mol y 170-396
nm, respectivamente. Las diferencias, con los resultados de otros autores son debido al método
utilizado desde la preparación de los almidones y el sistema para obtener estos parámetros. Por
lo tanto es necesario tener un procedimiento óptimo para el estudio estructural de los almidones.
59
VI. Resultados y discusión
información de las propiedades estructurales de los almidones como una función de su masa
molar. En este estudio se utilizaron los parámetros:
M= K’ RG1/V = K’ RGdf
Donde: MM = masa molar, K` = constante, RG = radio de giro y v = 1/df. Esta relación puede ser
considerada con una definición de una dimensión fractal. Por ejemplo df = 3.0 definiría una
estructura homogéneamente globular, df = 2.0 definiría una estructura plana y df = 1.0 una
estructura lineal.
Dependencia de la masa molar con el radio de giro (df). En el Cuadro 6, se observan los valores
de df, para los almidones de plátano, mango y okenia de 2.81, 2.42 y 3.74 en el mismo orden,
por lo tanto los tres almidones presentaron una estructura homogéneamente globular. Bello-
Pérez y col. (1998 b) encontraron valores de df = 2.77 y 2.70 para amilopectinas de maíz y maíz
normal, respectivamente y para almidón de amaranto de 2.56. Las Figuras 17-19, muestran la
dependencia de la MM con el RG, para los almidones de okenia, mango y plátano,
respectivamente.
60
VI. Resultados y discusión
Mango
40 2.42 2.29
50 1.87
60 1.91
70 0.89
Okenia
40 3.74 1.25
50 1.27
60 1.32
70 1.16
61
VI. Resultados y discusión
Figura 17. Dependencia de la masa molar con el radio de giro del almidón de okenia
disuelto a diferentes tiempos.
62
VI. Resultados y discusión
Figura 18. Dependencia de la masa molar con el radio de giro del almidón de mango
disuelto a diferentes tiempos.
63
VI. Resultados y discusión
Figura 19. Dependencia de la masa molar con el radio de giro del almidón de plátano
disuelto a diferentes tiempos.
64
VI. Resultados y discusión
La calorimetría diferencial de barrido (CDB) fue usada para estudiar las transiciones de
fase de los almidones de plátano, mango y okenia (Cuadro 7). El almidón de okenia presentó
una temperatura de gelatinización más baja comparada con el almidón de plátano. En el caso de
la entalpía, los almidones de plátano y mango presentaron valores altos (23.43 y 21.19 J/g,
respectivamente) pero sin diferencias estadísticas entre si (α=0.05). El almidón de okenia
presentó valores más bajos de entalpía (15.02 J/g). Esta transición corresponde a la disociación
de las moléculas de amilosa y amilopectina dentro del gránulo de almidón y la salida de amilosa
a la fase continua (Fujita y Lida, 1992; Liu y col., 1991; Russel y Juliano, 1983). La temperatura
de gelatinización mas alta del almidón de plátano puede estar relacionada con su longitud de las
cadenas en la molécula de amilopectina (Hizukuri, 1985).
65
VI. Resultados y discusión
0.00
-0.10
-0.20
Log (p(q))
-0.30
-0.40
-0.50
-0.60
-0.70
0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 0.40
Log (qRg)
Figura 20. Gráfica doble logarítmica del factor de la partícula dispersada vs. el vector
dispersado normalizado del almidón de mango disuelto a 60 s.
66
VI. Resultados y discusión
67
VI. Resultados y discusión
Yuan y col. (1993) reportaron que los almidones que tienen amilopectina con cadenas
largas, tienen temperaturas de gelatinización más altas que las amilopectinas con cadenas cortas.
Otros factores que se consideran que influyen en la temperatura de gelatinización son: tamaño
del gránulo, organización cristalina, proporción y la organización estructural (amilosa y
amilopectina) dentro del gránulo (Chiotelli y Le Meste, 2002). Por lo cual, en los almidones de
fuentes no convencionales presentaron una relación de tamaño de gránulos con las propiedades
térmicas, ya que el almidón de plátano presentó el tamaño de granulo grande (10-40 µm) con
valores de temperatura y entalpía de gelatinización altos, en forma contraria con los almidones
de mango (5-10 µm) y okenia (1-3 µm).
Faisant y col. (1995), reportaron usando CDB para almidón de plátano en estado verde,
una temperatura de gelatinización del gránulo del almidón de 76.4 ºC y un valor de entalpía de
17.1 J/g, ambos valores son bajos comparados con los obtenidos en este estudio. También
Bello-Pérez y col. (1999), reportaron temperaturas de gelatinización de 74.5 y 75.0 ºC para
almidones de dos variedades de plátano, pero los valores de entalpía fueron más bajos (13.0 y
14.8 J/g). González-Reyes y col. (2003) reportaron en almidón de okenia una temperatura de
gelatinización de 71.0 ºC y un valor de entalpía 11.9 J/g, este valor de temperatura es similar al
determinado en este trabajo, pero el valor de entalpía es más bajo. En el caso del almidón de
mango, Kaur y col. (2004), reportaron una temperatura de gelatinización de 73.4 ºC y valores
de entalpía de gelatinización de 12.8 J/g.
68
VII. Conclusiones
VII. CONCLUSIONES
4. Los estudios de dispersión de luz en forma estática y el análisis por la fractales mostraron
diferencias estructurales en los almidones.
6. La información obtenida para los diferentes almidones estudiados, puede ser importante
para sugerir algunas aplicaciones específicas con la finalidad de desarrollar nuevos
productos.
69
VIII. Perspectivas
VIII. PERSPECTIVAS
Mediante estos resultados, entender mejor la influencia que tiene la estructura en las
propiedades funcionales de los almidones. Esta información es una herramienta importante, para
modificar las rutas metabólicas de la biosíntesis del almidón, a través de técnicas de biología
molecular y se puedan producir almidones con determinado contenido de amilosa y
amilopectina o más allá almidones con cierta estructura molecular, los cuales deben presentar
mejores propiedades funcionales, y por lo tanto nuevas aplicaciones.
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