Mantenimiento a largo plazo de células T vírgenes humanas a través de

homeostasis in situ en sitios de tejido linfoide

Joseph JC Thome 1 , 2 , * ,Boris Grinshpun 3 , * ,Brahma V. Kumar 1 ,Masaru Kubota 1 , 4 ,Yoshiaki
Ohmura 1 , 4 ,Harvey Lerner 5 ,Gregory D. Sempowski 6 ,Yufeng Shen 3 yDonna L. Farber 1 , 2 , 4 , †
1 Columbia Center for Translational Immunology, Columbia University Medical Center, Nueva York,
NY 10032, EE. UU.
2 Departamento de Microbiología e Inmunología, Columbia University Medical Center, Nueva York,
NY 10032, EE. UU.
3 Departamento de Biología de Sistemas, Columbia University Medical Center, Nueva York, NY 10032,
EE. UU.
4 Departamento de Cirugía, Columbia University Medical Center, Nueva York, NY 10032, EE. UU.
5 LiveOnNY, Nueva York, NY 10001, EE. UU.
6 Human Vaccine Institute, Duke University, Durham, NC 27710, EE. UU.
↵ † Autor correspondiente. Correo electrónico: df2396@cumc.columbia.edu
↵ * Estos autores contribuyeron igualmente a este trabajo.
Science Immunology 02 de diciembre de 2016:
vol. 1, Número 6, eaah6506
DOI: 10.1126 / sciimmunol.aah6506

La vida de las células T no termina a los 40 Abstracto

Las células T naive se desarrollan en el
timo. Aunque la función tímica disminuye con
la edad, las células T son persistentes durante
toda la vida humana. Thome et al. examinaron
los tejidos linfoides humanos de donantes que
varían de 2 meses a 73 años de
edad. Descubrieron que, aunque el número de
timocitos doble positivos y de emigrantes
tímicos recientes disminuyó en individuos> 40
años de edad, las células T vírgenes se
mantuvieron funcionalmente en los ganglios
linfáticos. Hubo una superposición mínima en
el clonotipo entre los tejidos linfáticos, lo que
sugiere que los ganglios linfáticos pueden
mantener un conjunto diverso de
especificidades de células T. Estos datos
sugieren que la ubicación realmente importa:
la compartimentación del tejido y la
homeostasis son fundamentales para
mantener las células T vírgenes a lo largo de
la vida humana.
Las células T naive se desarrollan en el timo y
coordinan las respuestas inmunes a nuevos
antígenos; sin embargo, los mecanismos para
su persistencia a largo plazo durante la vida
humana permanecen
indefinidos. Investigamos el desarrollo y
mantenimiento de linfocitos T vírgenes
humanos en tejidos linfoides primarios y
secundarios obtenidos de donantes de
órganos individuales de 2 meses a 73
años. En el timo, la frecuencia de timocitos
doblemente positivos disminuyó bruscamente
en donantes> 40 años de edad, coincidiendo
con la reducción de los emigrantes tímicos
recientes en tejidos linfoides, mientras que las
células T vírgenes se mantuvieron
funcionalmente predominantemente en los
ganglios linfáticos (NL). Análisis de la
distribución clonal del receptor de células T
mediante la secuenciación de CDR3 de
CD4 + y CD8 + vírgenesLas células T en bazo
y LN revelan expansiones clonales específicas
de sitio de células T vírgenes de individuos
mayores de 40 años, con una superposición
clonal mínima entre tejidos linfoides. También
identificamos la distribución clonal de linfocitos
T virales sin tratamiento previo dentro de LN
específicos sobre la base del uso de VJ. En
conjunto, estos resultados sugieren un
mantenimiento prolongado de las células T
vírgenes a través de la homeostasis in situ y la
retención en el tejido linfoide.
INTRODUCCIÓN
La capacidad de responder a nuevos
antígenos está mediada en gran medida por
las células T vírgenes, que se generan en el
timo y emergen en la periferia mediante la
migración a través de sangre y linfáticos. La
producción de nuevas células T vírgenes del
timo es más alta en el nacimiento y durante la
infancia, y existe una reducción establecida en
la función tímica y el volumen que comienza
en la pubertad ( 1 ). No se entiende cómo y si
las células T vírgenes humanas se mantienen
en el contexto de la disminución de la
producción de timo a lo largo de la vida. Por
otra parte, la vida humana continúa
aumentando, y la capacidad de las personas
para mantener la salud y estar libres de
enfermedades infecciosas / crónicas, incluso
en los años avanzados ( 2 , 3) sugiere que el
sistema inmune humano tiene mecanismos
específicos para mantener la funcionalidad
durante muchas décadas. Sin embargo, la
identificación de mecanismos para preservar
la inmunidad en humanos sigue siendo difícil
de evaluar e investigar.
La capacidad de las células T para reconocer
diversos antígenos depende de su
especificidad para el receptor de células T
(TCR). La transposición del gen TCR en los
timocitos en desarrollo da como resultado que
cada nueva célula T ingenua exprese un único
TCR, que, en humanos, puede comprender
más de 100 millones de especificidades
diferentes ( 4 ). Cuando se activan por el
antígeno / complejo de histocompatibilidad
mayor (MHC), proliferan clones de células T
vírgenes y se diferencian por células T
activadas / efectoras, de las cuales una
proporción puede persistir como células T de
memoria. Aunque las células T vírgenes
predominan en la sangre periférica al nacer,
hay una acumulación gradual de células T de
memoria con la edad, y las células T vírgenes
comprenden, en promedio, del 20 al 40%
de las células T circulantes CD4 + o CD8 + en
adultos ( 5 - 7) En ratones, el mantenimiento
de linfocitos T vírgenes depende en gran
medida de la producción de timo, mientras que
en humanos, el mantenimiento de linfocitos T
vírgenes en sangre parece ser impulsado por
la expansión periférica homeostática ( 8 ), que
puede producirse por señalización tónica o
citoquinas homeostáticas como la interleucina
7 (IL-7) ( 9 ). No se sabe si estas distinciones
aparentes en el mantenimiento de linfocitos T
vírgenes entre ratones y humanos se deben al
sitio de muestreo [bazo y ganglio linfático (LN)
en ratones en comparación con la sangre en
humanos], las diferencias de duración (1 a 2
años en ratones versus> 80 años en
humanos) u otros factores. En los seres
humanos, la sangre es la principal muestra
accesible, pero solo contiene del 2 al 3% del
complemento total de células T ( 10), mientras
que las células T vírgenes se generan en el
timo y se siembran y se activan en los órganos
linfoides secundarios.
Hemos establecido un recurso para obtener
múltiples tejidos de donantes de órganos
humanos a través de un protocolo de
colaboración e investigación con la
organización de obtención de órganos para el
área metropolitana de Nueva York
(LiveOnNY). Este acceso a los tejidos
humanos ha permitido el estudio de
subconjuntos de células T humanas, la función
y la organización clonal en tejidos linfoides y
mucosales de diversos individuos de todas las
edades ( 7 , 11 , 12 ). A partir del análisis
colectivo de más de 70 donantes, se encontró
que las células T vírgenes persistían en
frecuencias de 20 a 40%, predominantemente
en LN, bazo y sangre de adultos jóvenes en la
séptima década de la vida
( 7 , 11 , 12).) Presumimos que estos sitios
linfoides podrían servir como reservorios para
el mantenimiento a largo plazo de las células
T vírgenes, y su caracterización podría revelar
mecanismos que no pueden dilucidarse a
partir de estudios en sangre. Además,
consideramos si clones específicos de células
T vírgenes mostraron compartimentación
como se describe para subconjuntos de
células T de memoria ( 12 , 13 ).
Aquí, presentamos un análisis detallado del
desarrollo y mantenimiento de células T
vírgenes en humanos en tejidos linfoides
primarios y secundarios obtenidos de
donantes de órganos individuales, de 2 meses
a 73 años. Analizamos los mecanismos para
el mantenimiento de linfocitos T vírgenes
mediante el análisis de la distribución clonal
de TCR, según lo determina la secuenciación
de CDR3 de CD4 + y CD8 + vírgenes .Las
células T en bazo y LN de donantes que
abarcan seis décadas de vida. Nuestros
resultados revelan que cada sitio de tejido
linfoide contiene un complemento único de
clones de células T vírgenes con mínima
superposición entre tejidos, que se observan
expansiones clonales de células T vírgenes,
particularmente en individuos> 40 años de
edad, y que estas expansiones están
contenidas dentro de específicos sitios. En
conjunto, estos resultados demuestran
mecanismos dependientes de la localización
para el mantenimiento de las células T
vírgenes humanas a través de la homeostasis
in situ, con posibles efectos sobre la
sensibilización y la localización de las
respuestas inmunitarias más adelante en la
vida.
RESULTADOS
Alteraciones estructurales y timocitos doble
positivos reducidos después de los 40 años
Obtuvimos tejidos de timo de donantes de
diferentes edades y examinamos la integridad
del timo mediante análisis histológico y
composición de timocitos mediante citometría
de flujo. El tejido tímico sufre atrofia
relacionada con la edad, evidenciada por una
disminución en el espacio epitelial del timo con
el volumen del órgano reemplazado por tejido
graso ( 14 , 15 ). Para asegurar que
estábamos aislando las poblaciones de
células T de timo viable y no de grasa,
realizamos tinciones de hematoxilina y eosina
(H & E) de tejidos aislados y buscamos
evidencia de corpúsculos de Hassall (HC) que
son un sello estructural del timo humano y
consisten en células epiteliales dentro de la
médula tímica ( 16) Los tejidos tímicos
obtenidos de donantes pediátricos y adultos
de diferentes edades tenían estructuras HC
visibles, con tejido de timo pediátrico que
exhibía una densidad significativamente mayor
de HC de tamaño más pequeño en
comparación con adultos con estructuras HC
mayores ( Fig. 1 , A y B), demostrando la
edad cambios estructurales asociados dentro
del tejido tímico activo en adultos.
Fig. 1Alteraciones en la estructura del timo
y disminución de la timopoyesis con la
edad.
( A ) Histología representativa de secciones de
timo de individuos de edades indicadas
visualizadas mediante tinción con H y E,
mostrada a 10 aumentos (arriba), con una
sección ampliada que se muestra a
continuación con 40 aumentos. Las
estructuras HC son estructuras circulares
teñidas de rosa en cada campo. ( B ) Número
promedio de estructuras HC por panel de
visualización en donantes pediátricos (0 a 2
años, n = 8; blancos) y adultos (23, 25, 30, 49,
50 y 57 años; n = 6; negros). ** P =
0.0002. ( C ) diagramas de citometría de flujo
representativos que indican la expresión
coordinada de CD4 y CD8 en células T en
tejido de timo de donantes de edades
indicadas, delineando DP y subconjuntos de
CD4 y SP CD8 con el porcentaje de cada uno
indicado en cuadrantes. (D ) Expresión de
CD69 por subconjuntos de DP y SP a partir de
tejido de timo obtenido de donantes de edades
indicadas. ( E ) Porcentaje compilado de
timocitos DP en tejido de timo de donantes de
edades y sexo indicados (azul, masculino,
rojo, femenino) de 27 donantes (ver tabla S1).
Los timocitos aisladas de tejido tímico activo
exhibieron las subpoblaciones de timocitos
canónicas delineados por la expresión de CD4
y CD8 en subconjuntos con frecuencias
características incluyendo doble positiva (DP)
CD4 + CD8 + y de un solo positivo
CD4 + CD8 - (20%) o CD8 + CD4 - (10%)
células, con células DP que comprenden la
mayoría (60 a 80%) del total de timocitos
( 15 ). Encontramos frecuencias
características de estos subconjuntos de
timocitos en el tejido del timo de donantes
jóvenes con bajas frecuencias de timocitos DP
en el timo de donantes mayores ( Fig. 1C).,
ver fig. S1 para estrategia de puerta). Estos
subconjuntos también exhibieron tinción de
CD69 característica para los subconjuntos de
timocitos ( 17 , 18 ), exhibiendo el DP una
expresión de CD69 menor que
los subconjuntos de CD4 + y CD8 + ( Figura
1D , parte inferior). La frecuencia de las
poblaciones de DP fue consistentemente del
60 al 80% de los timocitos desde la infancia
hasta la cuarta década de vida, y después de
los 40 a los 50 años, hubo una fuerte
disminución en el porcentaje de células DP a
<15% de timocitos ( Fig. 1E ). Estos hallazgos
muestran que la timpopoyesis activa no
muestra un declive gradual, pero puede cesar
abruptamente en algún momento discreto
después de los 40 años de edad.
Las células T vírgenes se mantienen
diferencialmente en función del linaje y el sitio
del tejido linfoide
Investigamos el mantenimiento de células T
de fenotipo naïve (células
CD3 + CD45RA + CCR7 +CD4 + o CD8 + ,
véase la estrategia de activación en la figura
S1) en tejidos de circulación, linfoides y
mucosas en función de diferentes grupos de
edad asociados con alta o niveles bajos de
timpopoyesis basados en los resultados de
la Fig. 1. Estratificamos los grupos de edad en
donantes pediátricos (2 meses a 5 años),
donantes de adultos jóvenes (15 a 39 años)
con producción activa de timo y donantes
adultos de mediana edad / mayores (> 40
años, con la mayoría de los donantes entre 40
a 60 años de edad) con una producción de
timo disminuida. En donantes pediátricos, se
pueden encontrar proporciones apreciables de
células T vírgenes en todos los sitios
examinados, con las proporciones más bajas
observadas en el intestino delgado y los
pulmones, como se describió previamente
( 11 ). En adultos jóvenes y adultos mayores,
la proporción de células T vírgenes en los
tejidos de la mucosa era insignificante; sin
embargo, se encontraron proporciones
sustanciales en sangre, bazo y LN ( Fig.
2A)) Entre los grupos de edad de adultos
jóvenes y mayores, la proporción de células T
vírgenes disminuyó significativamente en el
bazo, LN inguinal (ILN) y LN de drenaje
pulmonar (LLN) para las células T CD4 + y
CD8 + , y en sangre para CD8 + T células,
mientras que las frecuencias de células T
vírgenes en LN mesentérica (MLN) fueron
similares en todos los grupos de edad adulta
para las células T CD4 + y CD8 + ( Fig. 2A ,
comparar líneas discontinuas a líneas negras
sólidas, y tabla S2), indicando mantenimiento
diferencial en varios sitios. Incluso en las
edades de adultos mayores, hasta el 20% de
las células T CD4 + y del 30 al 40% de las
CD8 + Las células T se mantuvieron como
células de fenotipo naïve en LN, lo que
sugiere un mantenimiento a largo plazo de
células T vírgenes sin exportación continua
desde el timo.
Fig. 2Las células TCD4 + y CD8 + naive se
mantienen diferencialmente en sitios
linfoides.
( A ) Frecuencias medias ± SEM
de linfocitos T vírgenes (CCR7 + CD45RA + )
CD4 +(izquierda) y CD8 + (derecha) en tejidos
indicados de donantes estratificados en tres
grupos de edad: pediátricos (0 a 2 años; n =
18; rojo), adulto más joven (de 15 a 40
años, n = 27; negro punteado) y adultos
mayores (más de 41 años; n = 24; negro). Ver
los medios individuales, SEM y valores P en la
tabla S2. ( B ) Naïve CD4 + (arriba) o
CD8 +(abajo) Las células T dentro de los
cuatro sitios indicados de tejido linfoide como
una función de la edad, con cada punto que
representa un tejido donante individual de un
total de 69 donantes (ver tabla S1). Porcentaje
medio de linfocitos T CD8 / linfocitos CD
vírgenes en cada sitio: SP, 31/35 ( P =
0,16); ILN, 57/42 ( P <0,001); LLN, 49/38
( P <0,001); MLN, 48:41 ( P = 0.01). ( C ) niveles mensurables en RTE, pero se diluyen
Frecuencia de células T naïve en múltiples gradualmente con cada división celular debido
tejidos de donantes individuales (total, 40), a la homeostasis o la activación dirigida por
donde se obtuvieron los cuatro sitios tisulares, antígenos ( 21 ). Se clasificaron células
que se muestra como un mapa de calor que T naïve (CD45RA +CCR7 + ) CD4 + y CD8 + de
muestra el porcentaje relativo de células T sitios linfoides (bazo, ILN, LLN y MLN) y SP
vírgenes en cada sitio clasificado por edad en CD4 + o CD8 +timocitos y el contenido de
donantes. TREC evaluado utilizando un ensayo de
reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
bien establecido ( figura 3A , ver Materiales y
métodos) ( 21 , 22 ).
Además, investigamos la dinámica de la
pérdida y el mantenimiento de linfocitos T
vírgenes en sitios linfoides específicos (bazo,
ILN, LLN y MLN) para las células T CD4 + y
CD8 + y su persistencia diferencial en los
tejidos de las personas ( Fig. 2 , B y DO). En
general, hubo una mayor proporción de
células CD8 + T vírgenes mantenidas en LN
examinadas en todas las edades en
comparación con células T CD4 + vírgenes
( Fig. 2B ), con reducciones pronunciadas en
la frecuencia de células T vírgenes en ILN,
LLN y MLN en 30 a 40 años de edad para las
células T CD4 + , mientras que las frecuencias
para las células T CD8 se mantuvieron en
estos sitios en ciertos individuos hasta> 50
años de edad ( Fig. 2C).) En contraste con el
mantenimiento diferencial de CD8 +
en comparación con células T CD4 + en LN, el

bazo exhibió una disminución similar

pronunciada de células T vírgenes a partir de
los años jóvenes adultos (20 años) para las
células T CD4 + y CD8 + ( Figura 2, A y B), lo
que podría atribuirse a la mayor renovación de
las células T vírgenes en el bazo frente a la
LN en base a un análisis de Ki67 en un
número limitado de donantes (figura S2). En
conjunto, este análisis revela disparidades
previamente desconocidas en el
mantenimiento de las células T vírgenes
durante la vida en diferentes compartimentos
linfoides, con ciertos NL que sirven como
nichos potenciales para la persistencia a largo
plazo de las células de fenotipo naïve, y con el
bazo representando un compartimento más
transitorio para la T naïve células durante la
juventud.

Pérdida de contenido reciente de emigrante

tímico y compartimentación en tejidos linfoides
mayores de 40 años
Los emigrantes tímicos recientes (RTE) se
pueden detectar en la periferia por la
presencia de ADN extracromosómico
resultante del evento de reordenamiento del
gen TCR-δ, que se produjo durante el
desarrollo tímico ( 19 - 21 ). Estos círculos de
escisión TCR (TREC) están presentes a

Fig. 3Las células T vírgenes conservan la
funcionalidad independientemente de la
extensión de las RTE.
( A ) El contenido de RTE entre células T
vírgenes se midió mediante la cuantificación
de TREC utilizando un enfoque basado en
PCR (ver Materiales y métodos). Los gráficos
muestran el contenido de TREC por
100.000 células T CD4 + (superior) y
CD8 + (inferior) ordenadas de sitios linfoides
(círculo, bazo, triángulo invertido, ILN,
cuadrado, LLN, triángulo, MLN), CD4 + CD8 - o
CD8 + CD4 - células de cada timo indicadas
por "X", y células T totales de tejidos
obtenidos de los donantes de 17 y 73
años. Cada color representa un donante
individual (valores individuales en la tabla
S3). ( B ) Naïve y TEM CD4 + y CD8 +Las
células T se clasificaron a partir de bazo, ILN y
MLN, se estimularon con perlas anti CD3 /
CD28 / CD2 y se evaluó el contenido de
citocina en sobrenadantes utilizando el kit BD
Cytokine Bead Array (ver Materiales y
Métodos). Producción de IL-2 e IFN-γ (en
picogramos por mililitro, significa ± SEM) por
células T CD4 y CD8 vírgenes aisladas de
tejidos de donantes <35 años de edad (dos a
cuatro donantes, barras blancas) y> 50 años
de edad (se muestran dos a cuatro donantes,
excepto las células T CD4 del bazo, que son
de un donante, barras negras). ( C )
Producción de IL-2 e IFN-γ por células
vírgenes y de memoria (TEM) CD4 y CD8 de
LLN de donantes individuales <35 años de
edad (cuatro donantes: 29, 25, 26 y 34 años)
y> 50 años de edad (cuatro donantes: 54, 56,
52 y 59 años). Los niveles de citoquinas están
normalizados por el donante e indicados
por Zpuntuación [(nivel de citoquinas - nivel
medio de citoquinas) / SD]. Los valores para
cada citocina medida se muestran en la tabla
S4.
En promedio, los niveles de TREC a una edad
determinada fueron similares entre los
linfocitos T CD4 + y CD8 + . Sin embargo, se
observaron dos tipos de cambios asociados
con la edad en los niveles de TREC. En primer
lugar, hubo una disminución general en el
contenido de TREC de células T CD4 + y
CD8 + vírgenes y células T tímicas con la
edad, con la reducción más notable de los
niveles de TREC a <1000 después de los 40
años ( figura 3A ; tabla S3). para valores de
TREC individualizados), proporcionando
evidencia adicional para una reducción
abrupta en la producción de timo en humanos
después de los 40 años.
El segundo cambio asociado a la edad en los
niveles de TREC se observó entre los tejidos
dentro de un donante individual. En los tejidos
linfoides pediátricos y adultos jóvenes, el
contenido de TREC de las células T vírgenes
no fue equivalente en un solo individuo [ Fig.
3A (diferentes valores de tejido para cada
individuo comparten el mismo color) y la tabla
S3]. Por ejemplo, en un donante de 3 años
(donante 82, tabla S3), el mayor contenido de
TREC de células T CD4 + vírgenes se
encontró en el timo seguido de ILN y luego
bazo, mientras que para un donante de 12
años , se detectaron niveles de TREC
mayores en células T vírgenes sin tratamiento
previo, seguidas por LLN e ILN ( Fig. 3A y
tabla S3). Se observaron niveles de TREC
diferentes entre las células T vírgenes
aisladas de diferentes sitios, principalmente en
individuos menores de 40 años (Fig. 3 y
fig. S3), con individuos mayores de 40 años
con niveles bajos de TREC comparables en
sitios distintos. Las variaciones en el contenido
de TREC entre sitios linfoides de un individuo
podrían reflejar una siembra tímica diferencial
y / o diferencias en la activación o
mantenimiento de células T vírgenes in situ.
También comparamos la expresión de CD31
por células T CD4 + vírgenes en donantes de
diferentes edades (figura S4), como marcador
de RTE ( 23 ). Aunque la frecuencia global de
CD31 en células T CD4 + totales fue indicativa
de producción tímica reducida y siembra de
células T vírgenes en sitios de mucosas en
adultos (figuras S4, A y B), su expresión por
células de fenotipo naïve en adultos no
disminución, coincidente con la disminución de
los niveles de TREC encontrados en los
donantes (figura S4C). Estos resultados
sugieren que CD31 no es un buen marcador
para medir la producción de timo en adultos.
Los subconjuntos de células T Naïve
mantienen la funcionalidad con la edad
Para evaluar si las células T vírgenes en el
tejido linfoide mantuvieron su funcionalidad e
ingenuidad a diferentes edades asociadas con
la presencia o ausencia de producción de
timo, medimos el perfil de citocinas
de células T CD4 + y CD8 + vírgenes aisladas
de tejidos linfoides después de anti-CD3 /
activación mediada por anti-CD28 ex
vivo. Evaluamos la producción de citoquinas
múltiples en sobrenadantes de cultivo para
determinar si las células T vírgenes producían
predominantemente IL-2 o si habían adquirido
la capacidad de producir citoquinas efectoras
más asociadas con las respuestas de las
células T de memoria, incluido el interferón-γ
(IFN-γ). Sin embargo, las células T vírgenes
de todos los sitios tisulares (bazo, ILN y LLN)
y de donantes de diversas edades produjeron
predominantemente IL-2 con niveles bajos a
insignificantes de IFN-γ ( Fig. 3B).y tabla S4),
IL-4 e IL-10 (figura S5). Las células T de
memoria, por el contrario, exhibieron una
capacidad mejorada para producir niveles
sustanciales de IFN-γ, IL-4 e IL-10 en
comparación con las células T vírgenes dentro
del mismo sitio del mismo donante ( Fig. 3C ,
Fig. S5, y tabla S4). En conjunto, estos
resultados indican que las células T vírgenes
definidas por la expresión fenotípica de
CD45RA y CCR7 permanecen funcionalmente
ingenuas, incluso en presencia de una
producción tímica decreciente.
La secuenciación de TCR de poblaciones de
células T muestra diferencias en la diversidad
de secuencia tanto con la edad como con el
subconjunto
Los análisis anteriores revelaron que los LN
sirvieron como reservorios potenciales para el
mantenimiento funcional de células T vírgenes
y que las células T CD4 + y CD8 + vírgenes se
mantuvieron diferencialmente en función de la
edad. Para obtener nuevos conocimientos
sobre los mecanismos para el mantenimiento
humano ingenuo de células T en estos sitios
clave durante los períodos de producción de
timo activo (<40 años) y bajo (> 40 años),
analizamos la distribución clonal de células T
vírgenes dentro y entre sitios de tejido que
usan la plataforma immunoSEQ para
secuenciar todas las secuencias de TCR
CDR3β humanas posibles ( 24 , 25 ). El uso
de immunoSEQ se ha aplicado para
diseccionar el origen clonal de subconjuntos
de memoria ( 26 ) y para detectar clones de
células T antígeno-específicas en muestras
clínicas (27 , 28 ). Aquí, aplicamos
immunoSEQ para evaluar cómo las células T
vírgenes humanas se distribuyeron
clonalmente en bazo (SP), ILN y
LLN. Extrajimos muestras de ADN de CD4 + y
CD8 +Células T de un total de 19 donantes,
incluidos subconjuntos ingenuos de 13
donantes y poblaciones de memoria efectora
(TEM) de 10 donantes, de los cuales
subconjuntos ingenuo y TEM se analizaron
juntos en tejidos de 4 de estos donantes (tabla
S5). A partir de estos datos, evaluamos la
diversidad de TCR en diferentes tejidos y
donantes en función de la edad, y la
superposición de tejido de clones de linfocitos
T vírgenes individuales con respecto al grado
en que se encuentra una población clonal en
un tejido en otros sitios del mismo individuo
. Comparamos estos aspectos de la diversidad
y distribución clonal de TCR en el subconjunto
correspondiente de TEM porque nuestros
estudios previos habían revelado diferencias
en la diversidad y la superposición de tejido en
las células TEM CD4 + y CD8 + , aunque la
edad no era un factor contribuyente ( 7 ).
Para todos los subconjuntos de células T
utilizados para el análisis de TCR, obtuvimos
números de lectura de tamaño adecuado para
calcular la diversidad y la superposición de
tejido (10 5 a 10 6lee por muestra; ver tabla
S5). Definimos un clonotipo distinto por
secuencia de nucleótidos y evaluamos la
diversidad clonal de células T vírgenes en
tejidos en función de la edad utilizando el
índice de Simpson, una medida de diversidad
que da la probabilidad promedio de que dos
clonotipos seleccionados aleatoriamente de
una población sean idénticos (ver Materiales y
Métodos). El análisis de los repertorios
ingenuos de TCR del bazo, ILN y LLN de 13
donantes de 1 a 60 años nos permitió evaluar
la influencia general en la diversidad debido a
la disminución del rendimiento
tímico. Identificamos una disminución general
de la diversidad (mayor índice de Simpson)
después de los 40 años de edad, aunque con
una gran variabilidad entre los donantes ( Fig.
4A ). Para ingenuo CD8 +Células T, hubo un
rango más amplio de valores entre las
muestras de un rango de edad dado, sin
embargo, se observó una mayor diversidad a
edades> 40 años ( Fig. 4A , derecha). No
encontramos diferencias significativas en la
diversidad de linfocitos T vírgenes y / o la
expansión clonal entre los sitios linfoides al
comparar bazo, ILN y LLN de todos los
donantes examinados ( Fig. 4A y Fig. S6).
Fig. 4 Ladiversidad del repertorio TCR de
las células T vírgenes disminuye con la
edad y es distinta de los subconjuntos
TEM.
Las células Naïve (CD45RA + CCR7 + )
CD4 + y CD8 + T se clasificaron a partir de
bazo, ILN y MLN, y las secuencias de CDR3β
se amplificaron y secuenciaron (ver Materiales
y Métodos). ( A ) La diversidad del repertorio
en los tejidos del bazo (rojo), ILN (azul) y LLN
(verde) se cuantifica a granel según el índice
de Simpson (ver Materiales y métodos) y se
representa frente a la edad del donante, como
se muestra para
CD4 + (izquierda) Linajes CD8 + (derecha)
compilados de 11 y 13 donantes,
respectivamente (ver tabla S5), donde cada
punto representa un solo tejido de un donante
individual. ( B) La frecuencia máxima de
clonación es mayor para las células T de
memoria que para las células T vírgenes. La
frecuencia del clon secuenciado más grande
en la muestra se traza para células T CD4 + y
CD8 +para subconjuntos tanto ingenuos como
TEM. Los valores de P significativos basados
en la prueba t de Student se indican entre las
células TEM CD4 + y CD8 +y entre las
poblaciones naïve y TEM dentro
del linaje CD4 + o CD8 + . ( C ) Diversidad
clonal de cada combinación observada de VJ
calculada por la entropía de Shannon para
subconjuntos ingenuos y TEM para
CD4 + (arriba) y CD8 +(abajo) linajes. Las
poblaciones ingenuas se representan
mediante triángulos, y las poblaciones TEM se
representan mediante círculos. Los clones se
agruparon de cada donante y se separaron
por su cassette VJ. El registro de
curvas 2 Nrepresenta la diversidad máxima
posible para un número fijo de clones.
Además, evaluamos cómo la expansión de clones
ingenuos en comparación con los clones TEM
experimentados con antígeno. Debido a que el
índice de Simpson asigna mayor importancia a los
clones presentes en una frecuencia más alta,
postulamos que la frecuencia del clon más grande
en cada población de células T sería suficiente para
distinguir las diferencias en la diversidad de estos
dos subtipos ( figura 4B ). Entre el repertorio de
TEM, los clones de frecuencia más alta fueron
significativamente mayores que los del repertorio
ingenuo, con los clones de TEM más expandidos
presentes en frecuencias de 50 a 200 veces mayores
que los clones de células T sin explorar expandidos
al máximo ( Fig. 4B ). Además, los repertorios
ingenuos y TEM para las células T CD8 + estaban
más expandidos que los
correspondientes subconjuntos de células
T CD4 + (Fig. 4B ).
Se comparó la diversidad de TCR de las células
naive y TEM en el nivel de recombinación del
casete VJ. Se calcularon las frecuencias de
clonación para todas las muestras, y las muestras
del mismo linaje (CD4 + o CD8 + ) y el subconjunto
(ingenuo o TEM) se agruparon juntas. Para todos
los clones generados por el mismo cassette VJ, la
diversidad de pares se calculó mediante la entropía
de Shannon ( figura 4C y materiales y métodos). A
través de diferentes pares de VJ, la entropía de
Shannon de los repertorios de células T CD4 + y
CD8 + ingenuas fue cercana a la diversidad máxima
posible, log 2 N , donde Nes el número de
clonotipos generados por un par de VJ
particular. Por el contrario, la entropía VJ de las
muestras TEM fue mucho más baja que la de las
células T vírgenes y se redujo significativamente en
comparación con la máxima. En conjunto, la
diversidad y la entropía de VJ de las células
ingenuas y TEM en sitios linfoides indican que los
clones de células T vírgenes muestran una
expansión clónica considerablemente menor que
los clones TEM, con expansiones clónicas de
células T vírgenes observadas con mayor
frecuencia en individuos mayores de 40 años.

Los tejidos linfoides comparten muy pocos

clones ingenuos independientemente de la
edad del donante Fig. 5 Elrepertorio ingenuo muestra un
intercambio mínimo entre los tejidos.
Una gran ventaja de nuestras muestras de
donantes de órganos es la capacidad de
La secuencia de nucleótidos de cada clon en
comparar la distribución clonal de
tejidos múltiples de donantes individuales se
subconjuntos ingenuos (o TEM) entre sitios
analizó para solapamiento clonal. ( A )
distintos, permitiendo una evaluación de si las
Diagramas de Venn que muestran la
expansiones clonales observadas con células
superposición de secuencias de nucleótidos
T vírgenes dieron como resultado el
de los 1000 clones superiores para células
intercambio de clones específicos entre sitios
naïve y TEM CD4 + (superior) y
tisulares. Se evaluó la superposición de
CD8 + (inferior) entre tres sitios de tejido (rojo,
secuencias entre los 1000 clones superiores
bazo, azul, ILN, verde, LLN) de un 21 -un
para células TEM e ingenuas de cada uno de
donante de un año (donante 125, izquierda) y
los tres tejidos en individuos de diferentes
un donante de 51 años (donante 201,
edades. (Los números reales fueron
derecha). Los números reales son ligeramente
ligeramente superiores a 1000 para tener en
mayores que 1000 para tener en cuenta
cuenta los múltiples clones observados con el
clones adicionales presentes en números de
mismo recuento de lectura). Como se informó
lectura idénticos al clon 1000º. ( B)
anteriormente ( 7 ), y en consonancia con los
Superposición de clones naïve (gold) o TEM
donantes adicionales de todas las edades que
(blue) entre pares de tejidos en función de la
examinamos ( Fig. 5A).y fig. S7), hubo una
frecuencia de clonación (cuantificada como
superposición apreciable en clones TEM entre
recuento de lectura) para los donantes
sitios, con 20 a 30% de clones TEM CD4 y>
representativos que se muestran en (A). Para
40% de clones TEM CD8 encontrados en más
los clones con un recuento de lecturas dado
de un sitio tisular. Por el contrario, hubo
en el primer tejido, se representa gráficamente
notablemente pocos clones de células T
la fracción de superposición con todos los
vírgenes en más de un sitio, con la gran
clones en el segundo tejido. Los recuentos
mayoría de los clones de células T vírgenes
superiores a 20 se agrupan logarítmicamente
únicos del bazo, ILN o LLN del mismo donante
en 25 contenedores. ( C ) Gráfico de
( Fig. 5A ). Este intercambio mínimo de clones
frecuencia de solapamiento frente a clonación
de células T vírgenes entre sitios tisulares se
calculado como en (B), donde, para cada
observó en todos los donantes examinados
tejido, se han agrupado clones de múltiples
independientemente de la edad del donante
donantes analizados. El número de donantes
( Fig. 5A y Fig. S7).
se indica en cada gráfico individual.

Dado que los clones de células T vírgenes estaban
presentes en frecuencias generales reducidas en
comparación con las células TEM, era importante
establecer que la falta de solapamiento de clones de
células T vírgenes entre sitios no se debía al
muestreo u otras diferencias cuantitativas en la
frecuencia de clonación. Por lo tanto, investigamos
cómo la fracción de superposición clonal entre dos
tejidos se relacionó con el recuento de lecturas
clónicas o la frecuencia de las células naive y TEM
para cada donante ( figura 5B ). En los dos
donantes representativos, la frecuencia de
superposición para células TEM CD4 + y CD8 + es
baja pero medible para clones con cuentas de
lectura más bajas, después de un aumento lineal
pronunciado después de un cierto recuento de
lectura, con los clones más expandidos con una alta
probabilidad de ser detectado en ambos tejidos
( Fig. 5B, curva azul). Por el contrario, la curva de
recuento clonal frente a lectura para células T
vírgenes muestra una asociación muy reducida en
comparación con la de las células TEM y difiere en
función de la edad y de las células T CD4 + frente a
las células T CD8 + ( Fig. 5 , B y DO). Para las
células T CD4 + vírgenes, la superposición clonal
es insignificante para todos los recuentos de lectura
en el donante más joven y más viejo, mostrando
una línea plana ( Fig. 5B ), que indica una
superposición clonal mínima o insignificante. Para
las células T CD8 + vírgenes, las frecuencias de
clonación más altas están asociadas con la
superposición clonal para el donante de 21 años,
pero no para el donante de 51 años ( Fig. 5B).) En
el donante de 51 años de edad, los clones de células
T no tratados previamente expandidos no
mostraron solapamiento entre sitios incluso cuando
se compararon con una expansión cuantitativa
similar de clones de células T de memoria ( figura
5B , parte inferior). Cuando se compilaron todos
los datos de 14 donantes, la compartición tisular
mínima entre poblaciones expandidas de clones de
células T vírgenes es incluso más evidente,
particularmente para las células T CD4 + ( Fig.
5C ). En conjunto, estos análisis cuantitativos
revelan una compartimentación inesperada de
poblaciones expandidas de células T CD4 + y
CD8 + vírgenes en sitios linfoides, lo que sugiere
una expansión in situ durante su mantenimiento in
vivo.
También secuenciamos células ingenuas y TEM de
muestras replicadas para calcular la potencia de
detección en una frecuencia determinada (ver
Materiales y Métodos y la tabla S6). El
solapamiento clonal se calculó para cada conjunto
de repeticiones y para las correspondientes
muestras de tejido no replicadas de los mismos
donantes. Para cada recuento de lectura, la relación
entre la fracción de clones compartidos entre
repeticiones se comparó con la fracción compartida
entre diferentes tejidos para obtener una tasa de
superposición promedio. Este análisis arrojó tasas
entre 0,1 y 0,3 para células T CD4 + vírgenes, entre
0,3 y 0,5 para células T CD8 + vírgenes, entre 0,6 y
0,75 para células T CD4 + TEM , y entre 0,6 y 0,9
para TEM CD8 +Células T (tabla S6). En
comparación con las frecuencias de superposición
basales del análisis replicado, la frecuencia
despreciable de la superposición intertislada de los
clones de células T vírgenes sigue siendo coherente
con el mantenimiento in situ.
La distribución del uso de cassettes VJ entre
las células T vírgenes se vuelve más disímil
con la edad
Presumimos que la distribución de las
combinaciones de VJ sería similar entre las células
T en diferentes sitios cuando se siembra por el
timo, pero puede divergir cuando se mantiene
independiente del producto tímico. Probamos esto
usando la distancia de Jensen-Shannon (JSD, ver
Materiales y Métodos) ( 29 ). JSD es una medida
de la distancia entre dos distribuciones de
probabilidad, con dos distribuciones idénticas que
tienen una distancia de 0 y dos distribuciones
máximamente diferentes que tienen una distancia
de 1. La distribución de VJ para el donante de 21
años es similar para SP y LLN , y por lo tanto, el
valor de JSD es bajo ( Fig. 6A , izquierda). Sin
embargo, el uso de VJ para estos tejidos en el
donante de 51 años presenta muchas diferencias y,
en consecuencia, la distancia intertisona es
significativamente mayor ( Fig. 6A)., derecho). La
computación JSD para células T vírgenes en pares
de tejidos para cada donante revela un claro
aumento en la distancia VJ entre los donantes más
viejos para las células T CD4 + , con una tendencia
similar para las células T CD8 + , consistente con la
expansión sesgada y el mantenimiento de células T
vírgenes en sitios específicos ( Fig. 6B ).

Fig. 6 El uso de VJ entre tejidos muestra la
divergencia del repertorio de células T
vírgenes entre los donantes mayores.
( A ) Las 50 frecuencias VJ superiores para
las células T CD4 + del bazo y LLN se
representan una al lado de la otra para dos
donantes representativos, de 21 y 51 años. La
distancia VJ correspondiente para la muestra
se da en la esquina superior derecha. ( B ) La
distancia VJ para ocho donantes (siete
CD4 + y siete CD8 + ). La distancia se calcula
para cada par de tejidos de los mismos
donantes y se representa frente a la edad del
donante. Distancias entre bazo y LLN
(blanco), entre ILN y bazo (gris), y entre LLN e
ILN (negro).
DISCUSIÓN
El mantenimiento de células T vírgenes
durante toda la vida asegura que el sistema
inmune pueda responder a nuevos antígenos
que no se hayan encontrado previamente,
reduciendo la probabilidad de sucumbir a
patógenos infecciosos en diferentes etapas de
la vida. El grado en que las células T vírgenes
se mantienen en humanos y los mecanismos
para su persistencia a largo plazo han
resultado difíciles de abordar sobre la base del
muestreo limitado de sangre periférica. Aquí,
tomamos un enfoque no informado
anteriormente para analizar el desarrollo,
mantenimiento y repertorio de linfocitos T
vírgenes humanos en sitios linfoides primarios
y secundarios de un total de 128 donantes de
órganos que abarcan más de siete décadas
de vida. Nuestros hallazgos identifican LN
como reservorios principales para el
mantenimiento de células T vírgenes y un
repertorio de TCR diverso en presencia de
una producción tímica decreciente, que
disminuye notablemente después de los 40
años.
Los cambios del timo asociados a la edad
están bien documentados e incluyen la
reducción del volumen tímico, la pérdida de
células epiteliales tímicas, el aumento del
espacio perivascular y el predominio del tejido
adiposo ( 15 , 30 , 31 ). A partir de nuestro
análisis del tejido tímico de diferentes edades,
los timocitos DP CD4 + CD8 + fueron 60 a 80%
del total de los timocitos hasta la quinta
década de la vida, después de lo cual hay una
reducción significativa de 5 a 15% en las
células DP. Aunque esta conclusión general
de que los cambios precipitados en la
producción de timo se producen en la mediana
edad no se ha enfatizado previamente, las
frecuencias bajas y variables de DP y las
reducciones en el número de timocitos se
informaron previamente en adultos en
comparación con el timo pediátrico
(32 , 33 ). Los mecanismos precisos para este
descenso en la timpopoyesis no están claros,
pero podrían deberse a alteraciones en las
células epiteliales del timo, consistente con el
hallazgo de que la expresión del factor de
transcripción FoxN1 requerida para la función
tímica en ratones ( 34 , 35 ) se encontró
recientemente reducida en adultos ( 36 )
Esta fuerte reducción en el rendimiento del
timo después de los 40 años de edad también
fue paralela a la reducción en los niveles de
TREC (como indicadores de RTE) en células
T vírgenes del bazo y dos sitios LN. Estudios
previos mostraron niveles reducidos de TREC
con la edad en células T vírgenes de la sangre
periférica, con reducciones de 10 veces en los
niveles de TREC entre la tercera y la quinta
década de la vida ( 8 , 37 ). Aquí, revelamos
contenido diferencial de TREC en células T
vírgenes de tejido linfoide en individuos más
jóvenes (<40 años de edad) pero niveles de
TREC equivalentes entre tejidos en individuos
mayores (> 40 años de edad). En los modelos
de ratón, las RTE se transforman en linfocitos
T vírgenes al ingresar a LN ( 38).), lo que
sugiere que un contenido desigual de TREC
en los tejidos puede indicar una producción
activa de timo en ciertos sitios. Juntos,
nuestros resultados sugieren un programa
relacionado con la edad involucrado en el
cese de la producción de timo durante los
años intermedios de la vida.
A pesar de estas reducciones en la
exportación de timo, 20 a 40% de las células T
en LN (y porcentajes más bajos en el bazo) se
mantienen como fenotípica y funcionalmente
ingenuas. Para analizar los mecanismos para
esta persistencia a largo plazo de las células T
vírgenes, se utilizó la secuenciación profunda
de las cadenas TCRβ en las células T
vírgenes en bazo, ILN y LLN de donantes de 1
a 60 años. Integrar los resultados ingenuos de
TCR de todos los donantes revela que la
diversidad de TCR de las células T vírgenes
se mantiene en gran medida en los tejidos,
con expansiones clonales de clones de
linfocitos T vírgenes que se observan
principalmente en donantes> 40 años pero
aún muy reducidos en comparación con
observado con células T de memoria. Esta
modesta pérdida de diversidad de células T
vírgenes con la edad también se ha informado
por secuenciación profunda de TCR de células
T vírgenes en sangre ( 4).) Por lo tanto, las
células T vírgenes humanas en los tejidos
preservan tanto su diversidad como su
funcionalidad, independientemente de la
producción de timo.
Inesperadamente, encontramos un
solapamiento mínimo de clones de células T
vírgenes expandidos entre sitios linfoides
individuales en donantes de todas las edades,
especialmente para células CD4 + . Se
detectó superposición de clones muy
expandidos de células T CD8 + defenotipo
naive ; sin embargo, los subconjuntos de
células T CD8 + cebadas en humanos pueden
exhibir fenotipos ingenuos ( 39 , 40) Al
comparar la superposición clonal como
función de la frecuencia de clonación,
demostramos que para una frecuencia de
clonación dada, la mayoría de los clones de
células T vírgenes se detectan en un único
sitio, mientras que los clones de células T de
memoria se detectan en sitios múltiples. Estos
resultados sugieren dos mecanismos posibles
para el mantenimiento de células T vírgenes:
primero, que las células T vírgenes
permanecen residentes en sitios específicos y
no migran fácilmente entre los tejidos y,
segundo, que las expansiones clonales se
producen dentro de sitios específicos a través
de señales in situ, particularmente para los
ancianos donantes con salida tímica
insignificante.
A diferencia de nuestro hallazgo de clones
específicos de células T vírgenes que son
específicas de un sitio tisular, generalmente se
entiende a partir de estudios con ratones que
las células T vírgenes reinician continuamente
entre sitios linfoides, linfa y sangre ( 41 ). En
ratones, la transferencia adoptiva de células T
vírgenes produce la diseminación a múltiples
órganos linfoides secundarios ( 42 ) a través
de la expresión de CCR7 ( 43 ). Las células T
vírgenes en ratones requieren interacciones
análogas del TCR con moléculas del MHC
para la supervivencia y / o el mantenimiento
funcional ( 44 ) y citoquinas homeostáticas
tales como IL-7 ( 45 , 46 ) -interacciones que
tienen más probabilidades de ocurrir en LN y
no durante tránsito a través de la circulación.
Ahora se reconoce que una proporción
sustancial de células T de memoria de ratón (y
humanas) puede retenerse en los tejidos
como células T de memoria residente en tejido
distinguidas por expresión de CD69, que
también es un marcador de activación
temprana de células T ( 7 , 12 , 13)., 47 ). Sin
embargo, la residencia del tejido no se ha
asociado previamente con células T
vírgenes. Encontramos que, en los tejidos
humanos, ~ 20% de las células T vírgenes
administran CD69, lo que indica señalización o
retención potencialmente transitoria en sitios
de tejido LN. Debido a que las células T
vírgenes de ratón no presentan regulación
positiva de CD69 y se mantienen en gran
medida por la producción de timo a lo largo de
la vida ( 8), es posible que sus
comportamientos de migración sean distintos
de los de células T vírgenes humanas de vida
larga que exhiben expansión homeostática
periférica. Proponemos que, en humanos, la
retención de células T vírgenes en LN puede
ser necesaria para su preservación a largo
plazo.
La expansión clonal específica de sitio de
células T vírgenes identificadas aquí sugiere
una naturaleza no aleatoria para la
persistencia de células T en un sitio en
particular. Los estudios elegantes en ratones
mostraron que la supervivencia de las células
T CD4 + naive se relacionó con su abundancia
y especificidad clónicas ( 48 , 49) Debido a
que las células T vírgenes humanas necesitan
persistir durante décadas, proponemos que
las interacciones afines puedan determinar
qué clones de células T vírgenes se retienen o
sobreviven en un sitio particular. Este sesgo
en la especificidad de las células T naive en
diferentes sitios está respaldado por nuestros
resultados de diferencia de uso de VJ,
revelando un sesgo de repertorio distinto en
un sitio linfoide en comparación con otro que
fue más notable después del cese del
producto tímico. Estos resultados indican una
expansión sesgada de clones específicos en
sitios de tejidos.
Nuestro estudio proporciona una "instantánea"
de la composición del subconjunto de células
T humanas dentro de sitios linfoides y
mucosales en individuos de un amplio rango
de edad que abarca siete décadas de
vida. Sin embargo, hay advertencias en
nuestro estudio que deben tenerse en
cuenta. No examinamos específicamente las
respuestas específicas de antígenos o
patógenos. El mantenimiento de linfocitos T
vírgenes específicos de antígeno puede seguir
diferentes cinéticas o dinámicas a partir de los
subconjuntos ingenuos fenotípicos
examinados aquí. Hay advertencias para el
análisis clonal de TCR, que se basan en
secuencias obtenidas de una fracción del total
de células T (o TEM) sin tratamiento previo en
un tejido particular; no fue posible secuenciar
cada una de las células T en el bazo humano,
por ejemplo, debido a la impracticabilidad de
este esfuerzo.
En conclusión, nuestra investigación de las
células T en órganos linfoides primarios y
secundarios humanos ha revelado nuevos
conocimientos sobre el mantenimiento de
células T vírgenes que no pueden
extrapolarse a partir del muestreo de sangre
periférica. Nuestros hallazgos proporcionan
mecanismos alternativos para la conservación
de la respuesta inmune ingenua por
homeostasis in situ y el mantenimiento en los
tejidos linfoides que pueden ser específicos
para los seres humanos. Estos resultados que
muestran repertorios específicos del sitio para
células T vírgenes tienen implicaciones para el
diseño de vacunas e inmunoterapias para
promover y regular la respuesta inmune,
particularmente en los años intermedios y
posteriores.
MATERIALES Y MÉTODOS
Diseño del estudio
Investigar objetivos
Este estudio tuvo como objetivo examinar la
longevidad de las células T y los mecanismos
de mantenimiento y correlacionar la
producción de timo en los órganos linfoides
humanos.
Muestras de investigación
Se usaron muestras de tejido de donantes de
órganos de 2 meses a 73 años.
Diseño experimental
Los linfocitos se aislaron de los tejidos, y los
subconjuntos de células T CD4 + y CD8 + se
analizaron mediante citometría de flujo para
los parámetros fenotípicos; por histología,
producción de citocinas y PCR para la
detección de TREC; y por secuenciación de
ADN de genes de TCR.
Aleatorización
Los tejidos se obtuvieron de donantes de
órganos con muerte cerebral en el área
metropolitana de Nueva York y se obtuvieron
según disponibilidad. Todos los datos de
donantes obtenidos se incluyeron en este
estudio. Los resultados no fueron cegados.
Tamaño de la muestra
Los datos se compilan a partir de tejidos de
128 donantes de órganos de 2 meses a 73
años. El número de donantes analizados para
cada enfoque experimental diferente se indica
en la figura leyenda y texto.
Adquisición de tejidos humanos
Los tejidos humanos se obtuvieron de
donantes de órganos fallecidos (con muerte
cerebral) en el momento de la adquisición del
órgano para el trasplante clínico a través de
un protocolo de investigación aprobado y un
acuerdo de transferencia de material con
LiveOnNY. Todos los donantes estaban libres
de enfermedades crónicas y cáncer y tenían
hepatitis B negativa, hepatitis C negativa y VIH
negativo (tabla S1). Los tejidos se recogieron
después de que los órganos del donante se
lavaran con una solución de preservación en
frío y después de que se completara la
adquisición clínica. La adquisición de estas
muestras no califica como investigación de
"sujetos humanos", como lo confirmó la Junta
de Revisión Institucional de la Universidad de
Columbia (IRB), porque los tejidos se
obtuvieron de individuos fallecidos. En algunos
casos, el tejido del timo también se obtuvo
como tejido descartado de pacientes
sometidos a cirugía cardíaca pediátrica a
través del Núcleo de Estudios Humanos del
Centro Columbia para la Inmunología
Traslacional (CCTI), con aprobaciones de IRB
mantenidas por este núcleo. El tejido del timo
fue removido por cirujanos cardiotorácicos
entrenados durante la adquisición del donante
de órganos y fue confirmado por tinción con H
& E.
Aislamiento de linfocitos de sitios tisulares
Las muestras de tejido se mantuvieron en
solución salina fría y se llevaron al laboratorio
entre 2 y 4 horas después de la obtención del
órgano. Las muestras se procesaron
rápidamente usando digestión enzimática y
mecánica como se describió anteriormente
( 11 , 12 , 50 ), dando como resultado altos
rendimientos de linfocitos viables.
Histología del timo
Las muestras de tejido del timo obtenidas de
donantes como se describió anteriormente se
crioconservaron y se fijaron en una matriz de
temperatura de corte óptima (Tissue-Tek) y se
mantuvieron a -80 ° C antes del corte. Las
secciones se tiñeron con H & E por el servicio
Histology Core dentro del Departamento de
Patología, Columbia University Medical
Center. La presencia y el número de HC se
contaron sobre la base de estructuras por
marco de visualización a 10 aumentos en tres
secciones de tejido separadas.
Análisis y clasificación de citometría de flujo
Para el análisis de marcadores de superficie
celular mediante citometría de flujo, las
suspensiones unicelulares se tiñeron con
anticuerpos conjugados con fluorocromo en
tampón de tinción por citometría de flujo
(suero bovino fetal al 1% / azida sódica al
0,1% en solución salina tamponada con
fosfato) presentados en la tabla S5. Las
muestras de control incluyeron cuentas de
compensación teñidas con fluorocromos sin
teñir y únicas (OneComp eBeads,
eBioscience). Las células teñidas se
analizaron usando LSR II o citómetro de flujo
FACSCanto (BD Biosciences) con FACSDiva
(BD Biosciences) y se analizaron usando el
software FlowJo (Tree Star). Para el
aislamiento de subconjuntos, las células T
teñidas como se describió anteriormente se
clasificaron usando BD Influx (BD
Biosciences), con controles de compensación
de célula única adquiridos tal como se
describió anteriormente. Las estrategias
representativas de compuerta usadas para los
timocitos y los subconjuntos de células T se
muestran en la fig. S1.
Estimulación de células T y análisis de
citocinas
Las células T se cultivaron en placas de 96
pocillos (100.000 células por pocillo) con o sin
perlas recubiertas con anti-CD2 / CD3 / CD28
(1 perla: 1 célula) durante 2 días en medio
Clicks a 37 ° C. Los sobrenadantes de los
cultivos de células T se analizaron para
determinar el contenido de citoquinas
mediante matriz de perlas citométricas (CBA)
usando el kit de citocinas II Th1 / Th2 de
humanos Biosciences II. Los analitos estándar
se adquirieron en el citómetro de flujo BD LSR
II usando plantillas proporcionadas, y se
generó una curva estándar para calcular la
concentración de la muestra.
Cuantificación de TREC humanos
Las células Naïve (CCR7 + / CD45RA + )
CD4 + y CD8 + T se clasificaron a partir de
bazo, ILN, LLN y MLN de donantes
individuales. Los timocitos CD4 + y
CD8 + positivos individuales se clasificaron a
partir de tejidos de timo y los sedimentos
celulares se almacenaron a -80 ° C antes del
análisis. El contenido de TREC se cuantificó
utilizando un enfoque de PCR en tiempo real
establecido con una curva estándar de
moléculas conocidas de TREC humano
( 51 ). Se usaron las siguientes secuencias de
cebador y sonda: cebador 5 ', 5'-
CACATCCCTTTCAACCATGCT-3'; 3
'cebador, 3'-GCCAGCTGCAGGGTTTAGG-
3'; sonda, 5'-6-FAM-
CAGGGCAGGTTTTTGTAAAGGTGCTCACTT
-3'BHQ1 (Black Hole Quencher).
Análisis estadístico y visualización de datos
para datos celulares
Se calcularon las estadísticas descriptivas
(medias, desviaciones estándar y recuentos)
para cada subconjunto y tejido de células T en
Microsoft Excel. La varianza de frecuencia se
determinó para cada subconjunto y tejido
mediante la comparación múltiple post hoc de
Holm-Sidak después del análisis de varianza
de dos vías (ANOVA) para excluir los efectos
dependientes del subconjunto en GraphPad
PRISM (GraphPad Software
Inc.). Los valores P y b de dos colas
resultantes se graficaron en Microsoft Excel y
GraphPad Prism.
Secuenciación de TCR
El fenotipo Naïve (CD45RA + CCR7 + ) y TEM
(CD45RA - CCR7 - ) -fenotipo CD4 + y
CD8 + células T se clasificaron de dos a tres
LN completos para ILN y LLN y bazo humano
(7-cm 2 piezas) de individuos donantes (tabla
S1). En algunos casos, se aisló ADN de
gránulos de células usando el Mini Kit AllPrep
ADN / ARN (QIAGEN) junto con columnas
QIAshredder (QIAGEN), y la concentración de
ADN se evaluó usando NanoDrop (Thermo
Scientific). Se enviaron pellets de células o
ADN a Adaptive Biotechnologies para la
secuenciación profunda de TCRβ usando la
plataforma immunoSEQ ( 24).) El número de
células y las lecturas productivas para cada
población de cada donante se presentan en la
tabla S5.
Adquisición de datos TCR y control de calidad
La plataforma immunoSEQ utilizada para la
secuenciación de TCR tiene un protocolo
estandarizado que identifica y amplifica de
manera única el CDR3, mediante el uso de
plantillas sintéticas y técnicas de
agrupamiento para corregir los errores de
PCR y secuenciación ( 24 , 27 ). Los datos de
secuenciación resultantes se descargaron de
servidores Adaptive (nucleótidos,
aminoácidos, genes V y J y recuentos de
lectura). Los conjuntos de datos se filtraron
para seleccionar secuencias productivas (en
marco, sin codones de parada prematuros)
usando la designación de "tipo de marco"
(Adaptive Biotechnologies). Verificamos la
calidad de los datos mediante el submuestreo
de nuestros datos y la identificación de
mesetas en el número de clones únicos
observados, lo que indica la saturación de
fragmentos de cromosomas secuenciados.
Para identificar los clones contaminantes en
un donante debido a la clasificación (que es
99% exacto), aplicamos un filtro para eliminar
la contaminación de bajo nivel entre
las muestras CD4 +y CD8 + . Para cada clon
observado en cualquiera de las muestras en
un donante, asignamos identidad CD4 + y
CD8 + sobre la base de la frecuencia máxima
( p ) entre todas las muestras del mismo
donante. Para un clon asignado como CD4 + ,
si estaba presente en cualquiera de
las muestras CD8 + del mismo donante con
frecuencia <0.5 p , este clon se eliminó de
las muestras CD8 + como contaminante de
CD4 +(y viceversa); de lo contrario, se
determinó que este clon era ambiguo y se
eliminó de todas las muestras. En promedio, la
fracción de lecturas que se filtraron fue <0,4%
de muestras sin experiencia previa y <1,5% a
partir de muestras TEM (figura S8).
Métodos estadísticos para analizar los datos
de secuenciación de TCR
La diversidad clonal se midió usando el índice
de Simpson y la entropía. El índice de
Simpson se usó para cuantificar la diversidad
de las células T vírgenes, que exhibían una
baja expansión clonal, y se define como la
suma de las frecuencias clonales al cuadrado:
La entropía de Shannon se usó
para comparar la diversidad de clones de cada
tipo de combinación de genes VJ. La entropía
se define como el valor esperado negativo del
registro de frecuencias clonales observadas
y proporciona un equilibrio
entre la riqueza de especies (número de
secuencias únicas) y la uniformidad (su
frecuencia en la población); está
estrechamente relacionado con el JSD
utilizado en los cálculos de divergencia ( 29 ),
que viene dada por la siguiente ecuación:
JSD se calculó para cada donante entre cada
par de tejidos P y Q , tal como se describió
anteriormente ( 29 ). La distancia se calculó
para los pares de genes VJ. Los cálculos se
realizaron en R .
Medición de la superposición clonal entre
sitios de tejido
Los 1000 clones principales se seleccionaron
por secuencia de nucleótidos, con clones
adicionales incluidos si estaban presentes en
el mismo recuento de lectura que el milésimo
clon en la muestra después de clasificar por
recuento de lectura. La superposición clonal
se midió como el número de secuencias de
nucleótidos encontradas en todas las
muestras que se comparan. La superposición
entre pares de tejidos a través de la frecuencia
se calculó en R , con el recuento de lectura de
clones en el tejido 1 presente en el eje xy
la frecuencia de superposición con todos los
clones de tejido 2 en el eje y . Para resolver
casos con solo unos pocos clones observados
en recuentos más grandes que dan como
resultado una frecuencia de solapamiento de 0
o 1, los clones presentes en recuentos de
lectura mayores que 20 en el tejido 1 se
agruparon en 25 intervalos de igual tamaño en
el registro 10escala. Secuencias idénticas de
diferentes donantes se mantuvieron
separadas para evitar cambiar los recuentos
de lectura correspondientes a una muestra. El
mismo enfoque se aplicó a los datos
agregados en los dos tejidos.
Para corregir la variabilidad en el poder de
detección de los clones compartidos debido a
las diferencias en la frecuencia clonal
promedio, utilizamos el uso compartido de
réplicas como línea de base para el
intercambio de intertissue (consulte la tabla
S6). Para cada recuento de lecturas,
comparamos la fracción ( f 1) de clones
superpuestos observados entre dos sitios con
la fracción ( f 0) de clones superpuestos de
réplicas, definiendo la tasa de superposición
como r = f 1 / f 0 para muestras ingenuas y
TEM. A continuación, se calculó una relación
promedio sobre todos los recuentos de
lectura, ponderada por el número de clones
presentes en cada contenedor para ajustar el
poder de detección.(1)
MATERIALES COMPLEMENTARIOS
Fig. S1. Estrategia de control de citometría de
flujo.
Fig. S2. Rotación proliferativa de células T
naïve en tejidos.
Tabla S2. Estadística descriptiva de
frecuencias de linfocitos T vírgenes en
diferentes tejidos estratificados por grupos de
edad.
Tabla S3. Valores TREC para células T
vírgenes en el timo y tejido linfoide de
donantes individuales.
Tabla S4. Fuente de datos para todas las
citocinas medidas en este estudio.
Tabla S5. Resumen de los datos de
secuenciación de TCR para todas las células
TEM e ingenuas de tejido analizadas.
Tabla S6. Cálculo de la potencia de detección
de superposición utilizando muestras
replicadas.
Tabla S7. Paneles de anticuerpos utilizados
en este estudio.
1. Thome JJC, Grinshpun B, Kumar B V.,
Kubota M, Ohmura Y, Lerner H, et al. Long-
term maintenance of human nai ve T cells
through in situ homeostasis in lymphoid
tissue sites. Sci Immunol [Internet]. 2016
Dec 2 [cited 2018 Apr 16];1(6):eaah6506-
eaah6506. Available from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/283
61127

Fig. S3. Compartimentalización de RTE en

tejidos.

Fig. S4. Expresión de CD31 por

células T CD4 + en tejidos de donantes con la
edad.

Fig. S5. Producción de IL-4 e IL-10 por células

T vírgenes y de memoria en sitios linfoides.

Fig. S6. Diversidad de TCR de células T

vírgenes en sitios linfoides.

Fig. S7. Superposición clonal de células T

vírgenes y de memoria entre tejidos de
donantes individuales.

Fig. S8. Selección de secuencias productivas

de TCR ingenuo por filtración.

Tabla S1. Información del donante y uso de la

figura para este estudio.