LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI LINGKUNGAN

MODUL II
ENUMERASI MIKROORGANISME
(METODE TPC)

Shift 5
Kelompok 3
Farissa Saisarah Munir (1506730741)
Syafira Ayuningtyas (1506674122)

Asisten : Jonathan Megan

Tanggal Praktikum : 10 April 2017
Tanggal Disetujui :
Nilai Laporan :
Paraf Asisten :

LABORATORIUM TEKNIK PENYEHATAN DAN LINGKUNGAN

DEPARTEMEN TEKNIK SIPIL
FAKULTAS TEKNIK
UNIVERSITAS INDONESIA
DEPOK
2017
 ENUMERASI MIKROORGANISME
1.1 Tujuan Praktikum
Menghitung jumlah mikroorganisme pada suatu sampel dengan teknik enumerasi dan
metode Total Plate Count (TPC) dengan tingkat pengenceran tertentu.

1.2 Teori Dasar

1.2.1 Pengertian Enumerasi
Enumerasi adalah teknik yang digunakan untuk menghitung jumlah
mikroba dengan tujuan menentukan jumlah sel dari suatu kultur bakteri secara
kuantitatif. Proses penghitungan dilakukan dengan menghitung jumlah sel bakteri
yang mampu membentuk koloni di suatu media. Satuan yang digunakan adalah
Colony Forming Units (CFU) yaitu untuk mengukur kemampuan suatu koloni
bakteri membelah diri menjadi koloni yang baru.
Definisi dari mikroorganisme adalah makhluk hidup ataupun organisme
yang memiliki ukuran sangat kecil dan untuk dapat melihatnya dibutuhkan alat
bantu seperti mikroskop. Sedangkan pengertian enumerasi yaitu suatu perhitungan
jumlah mikroorganisme yang terkandung di dalam suatu sampel.

1.2.2 Metode Enumerasi

Terdapat dua cara perhitungan pada metode enumerasi yaitu perhitungan
secara langsung dan tidak langsung. Salah satu cara untuk melakukan perhitungan
secara langsung adalah menggunakan ruang hitung (Counting Chamber). Proses
perhitungan dilakukan dengan memasukkan sampel yang akan diperiksa ke dalam
ruang hitung yang volumenya telah diketahui. Jumlah ruang hitung terdiri dari 25
kotak dengan luas dan volume yang berbeda. Selanjutnya proses perhitungan
dilakukan dengan cara mengalikan volume dengan jumlah mikroba pada masing-
masing kotak. Sehingga akan diperoleh data jumlah mikroba per millimeter
sampel. Kekurangan dari metode ini adalah sel hidup atau mati tidak dapat
dibedakan
Sedangkan perhitungan dengan cara tidak langsung dapat dilakukan
dengan menggunakkan metode Total Plate Count (TPC). Metode TPC dapat
digunakan untuk menghitung bakteri hidup pada sampel cair maupun padat.
Namun jika menggunakan sampel padatan, sampel harus dilarutkan terlebih
dahulu hingga homogen. Selanjutnya larutan sampel diencerkan dengan beberapa
 variasi faktor pengenceran. Sampel yang akan diperiksa, diencerkan terlebih
dahulu sampai konsenterasi tertentu menggunakan akuades steril. Larutan sampel
yang sudah diencerkan diinokulasikan menggunakan metode tuang pada dua
cawan petri untuk setiap pengenceran. Lalu diinkubasi pada temperatur 36oC
selama 24-48 jam. Setelah inkubasi dapat dilakukan perhitungan jumlah koloni
pada setiap cawan.

Syarat perhitungan jumlah koloni mikroba yaitu :

• Jumlah koloni tiap cawan petri antara 30-300 koloni, bila tidak ada, pilih yang
mendekati.
• Tidak ada spreader (koloni yang menutup lebih dari setengah luas cawan
petri).
• Bila perbandingan jumlah mikroba antara pengenceran yang lebih besar dengan
pengenceran sebelumnya <2, hasilnya dirata-ratakan, tetapi bila >2, yang
dipakai jumlah mikroba dari pengenceran sebelumnya.
• Rata-ratakan jumlah koloni mikroba untuk pengenceran yang sama.

1.2.3 Media Pertumbuhan

Medium adalah tempat untuk menumbuhkan mikroba. Mikroba memerlukan
nutrisi untuk memenuhi kebutuhan energi, bahan pembangun sel, dan sintesis
protoplasma serta bagian-bagian sel lainnya. Setiap mikroba mempunyai sifat
fisiologis tertentu, sehingga memerlukan nutrisi tertentu pula.
Ada tiga jenis media pengembangbiakan berdasarkan bentuknya antara lain:
• Media padat, yaitu media berbentuk padat yang mengandung agar 1-1,5%
misalnya nutrient agar.
• Media cair yaitu media yang berbentuk cair yang tidak mengandung agar,
misalnya nutrient broth.
• Media semi padat, yaitu media yang berbentuk padat pada suhu dingin, dan
berbentuk cair bila suhu panas, misalnya media SIM (media yang digunakan
untuk uji produksi sulfur, indiol, motilitas).
Media padat sering digunakan untuk pertumbuhan koloni bakteri. Salah satu
contohnya adalah Plate Count Agar (PCA). Plate Count Agar (PCA) merupakan
sebuah media pertumbuhan mikroorganisme yang umum digunakan untuk
menghitung jumlah bakteri total (semua jenis bakteri) yang terdapat pada setiap
 sampel seperti makanan, produk susu, air limbah dan sampel-sampel lainnya yang
juga biasanya menggunakan metode Total Plate Count (TPC). Plate Count Agar
(PCA) merupakan media padat, yaitu media yang mengandung agar sehingga
setelah dingin media tersebut akan menjadi padat.

1.2.4 Faktor yang Mempengaruhi Pertumbuhan Mikroorganisme

Beberapa faktor yag dapat mempengaruhi atau memicu pertumbuhan
mikroorganisme yaitu sebagai berikut :
• Sumber karbon dan nitrogen
Bakteri diklasifikasikan menjadi dua kelompok besar berdasarkan senyawa
yang dapat digunakan sebagai sumber karbon yaitu autotrof yang
menggunakan senyawa inorganik dan heterotof yang menggunakan senyawa
organik.
• Karbon dioksida
Bakteri memerlukan CO2 untuk pertumbuhan yang dapat diambil dari udara
bebas atau dihasilkan dalam proses metabolisme oleh organisme itu sendiri.
Namun, beberapa bakteri memerlukan tambahan CO2 untuk tumbuh seperti
Neisseria meningitis, Campylobacter jejuni.
• Oksigen
Berdasarkan kebutuhan oksigennya bakteri di bagi menjadi lima kelompok
yaitu anaerob obligat, anaerob aerotoleran., anaerob fakultatif, aerob obligat,
bakteri mikroaerofilik
• Suhu
Bakteri patogen pada manusia biasanya tumbuh baik pada suhu 37oC. akan
tetapi suhu optimal untuk pertumbuhan bakteri kadang lebih tinggi ataupun
sangat rendah.
• pH
Sebagian besar bakteri pathogen tumbuh paling baik pada pH yang sedikit basa
yaitu berkisar pH 7.2-7.6.

1.2.5 Jenis Bakteri pada Makanan

Keberadaan mikroorganisme pada makanan dapat berdampak positif
maupun negatif. Mikroorganisme yang berdampak positif yaitu karena
keberadaannya diperlukan guna proses pembuatan makanan itu sendiri.
 Sedangkan, berdampak negatif karena keberadaannya di suatu makanan
dengan jumlah yang melebihi standar baku mutu dapat memicu terjadinya
penyakit bagi manusia yang mengkonsumsinya. Berikut merupakan beberapa
mikroorganisme yang memiliki dampak positif, seperti Lactobacillus,
Rhizopus sp, dan Saccharomyces cerevisiae berguna untuk proses pembuatan
makanan. Sedangkan contoh mikroorganisme yang memiliki dampak negatif
seperti Escherichia coli, Cronobacter spp. (E. sakazaki), dan Salmonella sp.
Bakteri ini merupakan bakteri pathogen yang menyebabkan penyakit.

1.2.6 Standar Baku Mutu

Penetapan batas maksimum cemaran mikroorganisme pada makanan
diatur oleh Peratutan BPOM. Berikut merupakan batas maksimum jumlah
mikroba yang diperbolehkan pada bubuk bumbu dapur instan.
Tabel 1. Tabel Batas Maksimum Jumlah Mikroba yang Diperbolehkan Pada
Makanan (Bumbu Instan Bubuk)
79 Sup instan bubuk (termasuk ALT(30oC,72 jam) 1x105 koloni/g
sup krim instan bubuk) APM Koliform 20/g
APM Escherichia coli <3/g
Salmonella sp negatif/25g
Staphylococcus aureus 1x103 koloni/g
Clostridium
perfringens 1x102 koloni/g
Kapang dan khamir 1x102 koloni/g
sumber : Badan Pengawas Obat dan Makanan RI, tabel Jenis dan Batasan maksimum cemaran mikroba
dalam makanan
Dalam Peraturan tersebut dapat diketahui bahwa batas maksimal

kandunganmikroba yang diperbolehkan pada bubuk bumbu dapur instan yaitu 1 x 105

koloni/gr untuk ALT, 20/g untuk APM koliform, kurang dari 3/gr untuk Escherichia
coli, negatif/25 gr untuk Salmonella sp, 1 x 103 koloni/g untuk Staphylococcus aureus
dan Clostridium perfringens, dan 1 x 102 koloni/g untuk kapang dan khamir . Oleh
karena itu, jika suatu makanan berbahan dasar tersebut memiliki kandungan mikroba
melebihi batas yang ditentukan dapat menyebabkan dampak negatif dan berbahaya
jika dikonsumsi.
1.3 Alat dan Bahan
• Alkohol 70%
• 3 tabung reaksi (9 ml NaCl)
 • 6 cawan petri dengan media PCA (Plate Count Agar)
• Pipet tip 1 ml (3 tip untuk 1 ml, 6 tip untuk 0.1 ml)
• Pembakar spirtus
• Spreader
• Shaker
• Erlenmeyer 100 ml
• Larutan NaCl 85%
• Suspensi mikroba (bumbu bubuk)
• Semprotan alkohol
• Inkubator

1.4 Langkah Kerja

Preparasi Sampel
1. Meja kerja dan tangan disterilkan menggunakan alkohol
2. Bubuk sampel diambil dan ditimbang sebanyak 1 gram
3. 1 gram sampel dimasukkan ke dalam 99 larutan NaCl 85% pada labu
erlenmeyer 100 ml dan dihomogenkan dengan mengguncang labu erlenmeyer
tersebut.
4. Mulut labu erlenmeyer ditutup dengan alumunium foil dan diikat dengan karet
gelang.
5. Labu erlenmeyer diletakkan ke atas shaker selama 30 menit.

Pengujian Sampel (Enumerasi)

1. Meja disemprot dengan alkohol 70%
2. Tangan disemprot dengan alkohol 70%
3. Sampel diambil dari botol sampel sebanyak 1 ml menggunakan pipet otomatis 1
ml
4. Tabung reaksi dipanaskan dengan pembakar spiritus
5. Sebanyak 1 ml sampel dimasukkan ke dalam tabung reaksi berisi 9 ml NaCl
6. Pengenceran dilakukan dengan cara mengambil larutan sebanyak 1 ml dari
tabung reaksi pertama dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi kedua kemudian
dihomogenkan.
7. Pengenceran ketiga dilakukan dengan cara mengambil larutan sebanyak 1 ml
dari tabung reaksi kedua dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi ketiga
 8. Sebanyak 0,1 ml sampel diambil dengan pipet otomatis 0,1 ml
9. Pada bagian tepi cawan petri dipanaskan
10. Sebanyak 0,1 ml larutan yang telah diencerkan dimasukkan ke dalam cawan
petri dan bagian tepi cawan petri kembali dipanaskan ( masing-masing
pengenceran dimasukkan ke dalam dua cawan petri)
11. Spreader dipanaskan
12. Spreader dimasukkan ke dalam alkohol 70%
13. Spreader dikeringkan dengan dikibaskan diatas pembakar spiritus
14. Dilakukan proses spreading dengan hati-hati kemudian dibungkus dengan
plastic wrap dan cawan diletakkan dalam posisi terbalik
15. Cawan petri diinkubasi selama ± 48 jam
16. Setelah diinkubasi selama ± 48 jam mengeluarkan cawan petri dari inkubator
dan menghitung koloni bakteri pada setiap cawan petri
1.5 Hasil Pengamatan
Tabel Data Pengamatan
Tingkat Jumlah koloni mikroba
Pengenceran tiap seri (CFU/plate)
152
10-1
26
125
10-2
78
89
10-3
35
Sumber : Pengolahan Penulis, 2017
* Data yang berwarna merah tidak digunakan

1.6 Pengolahan Data

Rumus menghitung jumlah koloni :
𝐶𝐹𝑈⁄
𝐶𝐹𝑈⁄ = 𝑝𝑙𝑎𝑡𝑒 𝑥 𝑓𝑎𝑘𝑡𝑜𝑟 𝑝𝑒𝑛𝑔𝑒𝑛𝑐𝑒𝑟𝑎𝑛 𝑥 𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒 𝑝𝑒𝑚𝑏𝑢𝑎𝑡𝑎𝑛 𝑠𝑢𝑠𝑝𝑒𝑛𝑠𝑖
𝑔 𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒 𝑖𝑛𝑜𝑘𝑢𝑙𝑎𝑠𝑖 𝑘𝑒 𝑐𝑎𝑤𝑎𝑛 𝑥 𝑏𝑜𝑏𝑜𝑡 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙

• Tingkat Pengenceran 10-1

1
𝐶𝐹𝑈⁄ = 152 𝑥 10 𝑥 100
𝑔 0.1 𝑥1

𝐶𝐹𝑈⁄ = 1.520.000
𝑔
 • Tingkat Pengenceran 10-2
2
𝐶𝐹𝑈⁄ = 78 𝑥 10 𝑥 100
𝑔 0.1 𝑥1

𝐶𝐹𝑈⁄ = 7.800.000
𝑔
Rata-rata jumlah koloni = 4.660.000  5x106 CFU/g

1.7 Analisis
Analisis Percobaan
Praktikum yang berjudul enumerasi memiliki tujuan untuk menghitung
jumlah mikroba pada sampel bumbu bubuk menggunakan metode total plate
count (TPC). Sebelum memulai percobaan, praktikan mempersiapkan sampel
terlebih dahulu dikarenakan sampel yang digunakan berupa padatan. Langkah
pertama sampel bumbu bubuk ditimbang sebanyak 1 gram kemudian dimasukkan
ke dalam labu erlenmeyer yang berisi NaCl 85% sebanyak 99 ml. NaCl adalah
larutan pendispersi yang digunakan untuk mengencerkan sampel. Setelah sampel
dilarutkan, labu Erlenmeyer ditutup dekan aluminium foil agar tidak
terkontaminasi dengan udara luar. Selanjutnya, agar larutan NaCl dan sampel
menjadi homogen maka labu erlemeyer yang sudah ditutup tadi diletakkan pada
alat shaker selama 30 menit dengan kecepatan 250 rpm. Setelah proses ini larutan
sampel siap untuk digunakan untuk proses enumerasi.
Sebelum memulai proses enumerasi, pertama-tama praktikan membersihan
meja dan tangan dengan alcohol 70%. Tujuan dilakukan pembersihan untuk
mencegah adanya mikroorganisme lain yang mengontaminasi sampel sebab
praktikum ini harus dilakukan dengan steril. Kemudian praktikan menyalakan
spirtus yang akan digunakan untuk mensterilkan alat-alat seperti spatel, tabung
reaksi, cawan petri dan juga untuk menghangatkan lingkungan tempat percobaan
dilakukan sehingga membantu menciptakan kondisi yang steril di tempat tersebut.
Setelah menyiapkan alat dan bahan selanjutnya praktikan mengambil larutan
sampel sebanyak 1 ml dengan menggunakan pipet 1 ml dan memasukkan ke
dalam tabung reaksi yang berisi 9 ml NaCl dengan faktor pengenceran 101.
Kemudian tabung reaksi ditutup dengan kapas dan dihomogenkan. Ketika
memasukkan larutan sampel ke tabung reaksi, praktikan mendekatkan mulut
tabung reaksi ke api agar tidak ada bakteri luar yang masuk. Selanjutnya
pengenceran kedua, praktikan mengambil 1 ml larutan yang sudah diencerkan
pada tabung reaksi pertama dan memasukkan ke dalam tabung reaksi kedua.
Setiap akan mengambil sampel, pipet harus diganti dengan yang baru agar steril.
Langkah ini dilakukan hingga faktor pengenceran 103.
Variasi pengenceran dilakukan untuk mempermudah praktikan dalam
menghitung mikroba pada sampel. Tahap selanjutnya, sampel yang sudah
diencerkan diambil sebanyak 0,1 ml dan diletakkan di media agar pada cawan
petri. Langkah ini dilakukan sebanyak dua kali untuk masing-masing faktor
pengenceran. Ketika memasukkan sampel harus dilakukan di dekat api agar tidak
terkontaminasi bakteri luar. Kemudian praktikan menggunakan spatel untuk
meratakan sampel pada media. Spatel yang akan digunakan harus disterilkan
terlebih dahulu dengan cara membakar bagian bawah spatel ke api pada spirtus,
lalu memasukkan ke dalam alkohol, kemudian di bakar lagi dan didiamkan
sejenak agar spatel tidak terasa panas. Pendinginan spatel dimaksudkan agar
medium yang berada di dalam cawan tidak robek dan tidak mematikan
mikroorganisme akibat spatel yang masih panas. Sampel larutan harus diratakan
pada media agar mikroba dapat tumbuh secara merata dan mendapatkan nutrisi
yang cukup dari media. Kemudian bagian pinggir cawan petri yang sudah ditutup
didekatkan dengan api agar bakteri disekitar cawan petri mati. Cawan petri
diletakkan dengan posisi dibalik dengan media agar berada di atas dan dibungkus
dengan plastic wrap agar tidak terkontaminasi mikroba dari udara luar. Lalu
cawan tersebut diinkubasi selama 24-48 jam pada suhu 360C.
Langkah terakhir dilakukan pengamatan dan menghitung jumlah
mikroorganisme yang ada pada cawan. Suhu tersebut dipilih karena merupakan
suhu optimum dimana bakteri yang ada di dalam sampel dapat bertahan hidup.

Analisis Hasil
Data dari hasil pengamatan pada percobaan ini tidak semuanya dapat
digunakan sebab terjadi perbedaan data yang cukup jauh dengan faktor
pengenceran yang sama. Sehingga dari enam buah cawan petri hanya terdapat dua
cawan yang dapat digunakan data jumlah koloninya.
Dari percobaan ini didapatkan data jumlah koloni mikroorganisme tiap
cawannya seperti yang terlihat pada tabel data pengamatan. Kemudian dilakukan
perhitungan menggunakan persamaan rumus dan didapatkanlah jumlah bakteri
pada faktor pengenceran 101 sebanyak 1.5 x 106 CFU/gram dan faktor
pengenceran 102 sebanyak 7.8 x 106 CFU/gram. Sehingga diperoleh nilai rata-rata
jumlah mikroorganisme yang terdapat pada bumbu bubuk yang dijadikan sampel
di percobaan ini berkisar antara 5 x 106 CFU/gram.
Jika ditinjau dengan Peraturan BPOM, dimana batas maksimum
mikroorganisme menggunakan metode TPC yang diperbolehkan ada di suatu
makanan berupa bumbu bubuk adalah 1 x 105 CFU/gram. Sehingga dapat
dikatakan bahwa kandungan mikroba pada sampel bumbu bubuk yang digunakan
pada percobaan ini telah melewati batas yang ditetapkan yaitu 5 x 106 CFU/gram.
Oleh karena itu sampe tersebut tidak layak untuk dikonsumsi. Jika dikonsumsi
dapat menyebabkan efek negatif seperti gangguan pencernaan pada manusia yang
mengkonsumsinya.

Analisis Kesalahan
Perolehan data dari percobaan ini kurang akurat atau representatif. Hal
ini disebabkan oleh beberapa kesalahan yang terjadi ketika praktikum
berlangsung, seperti :
• Terjadinya kontaminasi mikroorganisme lain akibat proses pembersihan
area percobaan, sterilisasi spatel maupun tangan praktikan yang kurang
bersih. Kontaminasi mikroorganisme luar dapat mengakibatkan tingginya
jumlah mikroorganisme hasil praktikum dan mengurangi tingkat akurasi
data.
• Terjadinya kontaminasi dikarenakan pada proses percobaan tidak selalu
dilakukan dekat dengan api pada spirtus. Jika percobaan dilakukan dekat
dengan api, akan membunuh mikroba-mikroba dari luar sehingga data hasil
praktikum akurat tanpa pengaruh luar.
• Larutan sampel kurang homogen sehingga persebaran mikroorganisme
pada sampel kurang merata. Selain itu umlah sampel yang digunakan
sangat kecil sehingga sangat penting untuk menghomogenkan sampel.
• Kesalahan praktikan saat melakukan spreading sehingga bakteri tidak
tersebar merata di cawan dan mempersulit proses perhitungan koloni.
Proses spreading dilakukan praktikan secara bergantian menggunakan
sebuah spatel. Adanya kemungkinan spatel yang digunakan belum steril
sehingga sampel dari faktor pengenceran yang berbeda ikut terbawa. Selain
 itu karena proses spreading dilakukan secara bergantian, hal ini
menyebabkan mikroorganisme mengendap pada bagian bawah tabung
reaksi dan tidak terambil ketika diratakan pada media sehingga sampel
kurang akurat.

1.8 Kesimpulan
• Jumlah bakteri pada sampel bumbu bubuk yaitu sebesar 5x106 CFU/gram
• Sampel tidak memenuhi standar baku mutu Badan Pengawas Obat dan
Makanan Republik Indonesia
• Semakin tinggi tingkat pengenceran maka semakin sedikit jumlah bakteri
yang terdapat di dalamnya

1.9 Referensi
Fardiaz Srikandi. 1992. Polusi Air & Udara. Penerbit KANISIUS. Yogyakarta
Schlegel, H.G. dan K. Schmidt. 1984. Mikrobiologi Umum (edisi keenam
terjemahan). Gadjah Mada University Press. Yogyakartarta.
http://www.agriculturejournals.cz/publicFiles/28360.pdf. (diakses pada tanggal 14
April 2017)
odexindonesia.bsn.go.id/uploads/download/Regulasi Pangan BPOM No
HK.00.06.1.52.4011.pdf (diakses pada tanggal 14 April 2017)
https://www.scribd.com/doc/236895601/ENUMERASI-TPC (diakses pada
tanggal 14 April 2017)
http://jurnal.fkip.uns.ac.id/index.php/prosbio/article/download/7216/5003.
(diakses pada tanggal 14 April 2017)
www.eprints.undip.ac.id/24476/1/Hakka.pdf (diakses pada tanggal 14 April
2017)

LAMPIRAN

Tingkat Pengenceran 10-1 Tingkat Pengenceran 10