TESTES SOROLÓGICOS

PRIMÁRIOS:
REAÇÕES COM
ANTICORPOS MARCADOS
 INTRODUÇÃO

 Utilização de anticorpos em Ensaios Sorológicos  1954: Teste

de Imunofluorescência (Weller & Coons); 1959:
Radioimunoensaio (Yalow & Berson)
 Anos 60: enzimas conjugadas a antígenos e anticorpos (Nakane
& Pierce, 1967; Avrameas, 1969)
 Anos 70: ELISA (Engvall & Perlmann, 1971); produção de
anticopos monoclonais (Kohler & Milstein, 1975) 
desenvolvimento de novos testes (kits comerciais)
 Métodos colorimétricos, radioativos, fluorescentes,
quimioluminescentes, etc.
 Agentes infecciosos, anticorpos, hormônios, alérgenos,
poluentes, etc.

Ronald & Stimson, 1998

 REAÇÃO DE IMUNOFLUORESCÊNCIA

 Anticorpos conjugados com fluorocromos

 Fluorocromos: substâncias que absorvem luz de menor 
e, quando excitados com luz ultravioleta, emitem luz de
maior  (fluorescência)
 Mais utilizados: isiotiocianato de fluoresceína e rodamina
(absorvem em  diferentes, mas emitem luz na faixa do
visível)
 Teste direto  pesquisa de antígenos (células ou tecidos)
 Teste indireto  pesquisa de anticorpos, ou de antígenos
 Referência para sorodiagnóstico de várias doenças que
acometem os animais, como para a raiva, toxoplasmose,
leishmaniose, leptospirose.
REAÇÃO DE IMUNOFLUORESCÊNCIA

Luz Incidente Luz Emitida

(Excitação)
IMUNOFLUORESCÊNCIA
Reação de Imunofluorescência Indireta
Figure 3.6a

Fig 3.6b
Principle of
Immunofluorescence
IMUNOFLUORESCÊNCIA
1 3

1: Vero não-infectada + soro positivo para

Coronavírus (Sars)
2: Vero infectada + soro positivo para
Coronavírus
3: Esfregaço de sangue com formas de
tripanossoma
 Reação de
Imunofluorescência Direta
para o Diagnóstico do Vírus
da Raiva
FIGURE 1 - Photomicrographs of direct immunofluorescence reactions in the presence (A and B) of
rabies virus antigens in the brain tissue samples subjected to cryopreservation at -20°C for up to 2 years
(immunofluorescence microscope equipped with 400X magnification; Carl Zeiss, Germany). A:
Cryopreservation in 68% SUC for 1 year demonstrating very abundant antigens in all fields of view,
uncountable (++++). B: Cryopreservation in 68% SUC for 2 years demonstrating few antigens, 1 or more
particles in less than 100% but more than 50% of the fields of view (++). SUC: sucrose Source:
LABOVIR-UECE, 2012.
 Reação de
Imunofluorescência Indireta
para o Diagnóstico do Vírus
da Leucemia Felina
 IMUNOFLUORESCÊNCIA

 Vantagens: limiar de detecção; específica; reprodutível;

simples execução; determinação de classes e subclasses de
anticorpos
 Desvantagens: microscópio de fluorescência; diminuição
da fluorescência sob irradiação; subjetividade na leitura;
ausência de automação
 CITOMETRIA DE FLUXO

 Identificação e separação de células baseadas na

dispersão de luz e fluorescência sob feixe de laser
 Estudo de populações de leucócitos  luz dispersa 
tamanho e forma da célula
 Identificação de populações e/ou subpopulações de
linfócitos T e B
 FACS (fluorescence-activated cell sorter)  separação de
uma única célula

Barrientos et al., 2000

 Anti-CD Linfocitário

Citômetro de Fluxo

Schematic representation of a flowcytometer. For details please see text. (1) Forward-scatter detector, (2) side-
scatter detector, (3) fluorescence detector, (4) filters and mirrors, and (5) charged deflection plates.
 Anti-CD Linfocitário

Citômetro de Fluxo

Schematic representation of a flowcytometer. For details please see text. (1) Forward-scatter detector, (2) side-
scatter detector, (3) fluorescence detector, (4) filters and mirrors, and (5) charged deflection plates.
 T CD4+
Mab / CD3+
anti-CD4+ T CD4+ T CD8+
/ CD3+ / CD3+

T CD4+ T CD3+ Mab

anti-CD3+
T CD8+

Mab
T CD4+ anti-CD8+
Gating strategy to define lymphocyte subsets. (i) Histogram (univariate) plot of CD3 expression; this one-
dimensional graph corresponds to a typical bar chart and is called “histogram” in flow cytometry. (ii)
Pseudocolor plot of CD3 versus CD4. This display gives a better view on the distribution of CD3 expression
than the histogram, in particular for **CD3 low expressing cells; note both axes are logarithmic, unlike the
linear axes of scatter plots in Figure 2. (iii) Cartoon detailing interpretation of quadrant gates of (ii). CD3 +CD4+
cells are displayed in the top right quadrant (46.2% of lymphocytes). CD, cluster of differentiation.
Como são detectados / mensurados os
níveis de Anticorpos em Fluidos
Biológicos?
 ELISA

 Enzyme-Linked Immunosorbent Assay  Anticorpos

conjugados com enzimas  conversão de substrato
incolor em produto colorido
 Enzimas mais utilizadas (+ de 25): Peroxidase; Fosfatase
Alcalina, -Galactosidase e Glicose Oxidase
 Suportes sólidos: microplacas de poliestireno e
polivinilcloreto (interação hidrofóbica)
 Método direto  antígenos
 Método indireto  anticorpos
 Sandwich e Competitivo  antígenos e anticorpos

Ferreira e Ávila, 1996; Butler, 2000

 ELISA
Desnaturação das proteínas
adsorvidas (>90%)
Anticopos de captura: 10 a 25%
funcionais  Ag capturados são
10x mais funcionais do que os
adsorvidos na placa
Entretanto, 6% necessários para
o desenvolvimento do teste
 to detect Ab 6. ELISA

to detect Ag

to detect Ag

FIGURE 6-10
Variations in the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) technique, similar to
RIA except using an Enzyme (alkaline ⓟ, horseradish peroxidase, & β-galactosidase)
: safer & less costly.
 ELISA INDIRETO

Antígeno Soro anti

Fonte de proteínas Conjugado anti
estranhas ao sistema

Lavagens
Lavagens
 ELISA DIRETO COM
ANTICORPO DE CAPTURA
Soro anti Antígeno
Fonte de proteínas Conjugadoanti
estranhas ao sistema

Lavagens
 ELISA INDIRETO COM
ANTICORPO DE CAPTURA
Soro anti (espécie A) Soro anti (espécie B) (/?)
Fonte de proteínas Conjugado anti B
estranhas ao sistema
Antígeno (/?)
Lavagens
ELISA
 IMMUNOBLOTTING (Western blotting)

 Transferência de proteínas separadas por eletroforese do

gel de poliacrilamida para membranas  ELISA

 Resolução obtida pela separação eletroforética de mistura

de proteínas + especificidade de anticorpos usados como
sondas para a detecção de Antígenos

 Suportes: membranas de nitrocelulose (interações

hidrofóbicas); nylon, polyvinyldifluoride (PVDF)  alta
capacidade de ligação a proteínas

 Quantificação de bandas por densitometria

Stott, 2000
IMMUNOBLOTTING (Western blotting)
IMMUNOBLOTTING (Western blotting)
IMMUNOBLOTTING (Western blotting)
IMMUNOBLOTTING (Western blotting)
 IMMUNO-DOT

 DOT-ELISA  reação imunoenzimática sobre membranas

 Qualitativa ou semi-quantitativa: rápida e simples

 Proteínas solúveis, fungos, protozoários, bactérias e vírus

Stott, 2000
IMMUNO-DOT
 IMUNOHISTOQUÍMICA / IMUNOCITOQUÍMICA

 Detecção e localização de antígenos celulares/teciduais

 Anticorpos conjugados com enzimas  conversão de
substrato incolor em produto colorido (deposição pode ser
observada diretamente ao microscópio óptico)
 Enzimas mais utilizadas: Peroxidase; Fosfatase Alcalina,
-Galactosidase e Glicose Oxidase
 Método direto  Acs primários conjugados (detecção de
antígenos)
 Método indireto  Acs secundários conjugados (detecção
de antígenos ou anticorpos)
 Desvantagens: atividade enzimática endógena,
armazenamento inadequado dos conjugados
Ferreira & Ávila, 1996; Kumar, 2000
 IMUNOHISTOQUÍMICA

Peroxidase
H2O2 + DAB H2O + 1/2 O2 + DAB (Oxidada = COR)

Detecção de bacilos nas

vilosidades intestinais
 IMUNOHISTOQUÍMICA

Peroxidase
H2O2 + DAB H2O + 1/2 O2 + DAB (Oxidada = COR)
 Método ABC
IMUNOHISTOQUÍMICA

Ags em Células / Tecidos Ags em Células / Tecidos

Ags em Células / Tecidos Ags em Células / Tecidos

Peroxidase
H2O2 + DAB H2O + 1/2 O2 + DAB (Oxidada = COR)
 IMUNOHISTOQUÍMICA

Substrato Produto
Peroxidase
3,3´-Diaminodenzidine tetrahydrochloride (DAB) Marrom
4-Chloro-1-naphthol (CN) Azul
P-Phenylenediamine dihydrochloride Azul-preto
Fosfatase alcalina
5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl phosphate (BCIP), nitroblue tetrazolium (NBT) Azul-preto
-Galactosidase
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl- -D-galactosidase (IbGa) Azul
Glicose Oxidase
Marrom
Glicose/trinitroblue tetrazolium (TNBT)

Kumar, 2000
IMUNOMIGRAÇÃO RÁPIDA
IMUNOMIGRAÇÃO RÁPIDA
IMUNOMIGRAÇÃO RÁPIDA

NASA
IMUNOMIGRAÇÃO RÁPIDA
IMUNOMIGRAÇÃO RÁPIDA
 RADIOIMUNOENSAIO

 Limiar de detecção: nano ou picogramas

 Quantificação de hormônios, drogas, marcadores
tumorais, alérgenos, anticorpos e antígenos microbianos
 Quantidade de reagente marcado (Ag ou Ac) quantifica o
Ag ou Ac não-marcado na amostra  competição
 Marcação com radioisótipos (125I e 131I)
 Determinação de curvas-padrão
 Desvantagens: custo, vida média dos reagentes e risco
operacional

Ferreira & Ávila, 1996

 RADIOIMUNOENSAIO

 Lembrando o equilíbrio!

Ac + Ag* AcAg*

AcAg* + Ag AcAg* + AcAg + Ag*

 RADIOIMUNOENSAIO
 Curva-padrão
LIMIAR DE DETECÇÃO

Rose et al, 1997

 REFERÊNCIAS

http://webmed.unipv.it/immunology/agabint.html

http://www.med.sc.edu:85/book/immunol-sta.htm

http://www.biointeractive.org/

Diagnóstico Laboratorial das Principais Doenças

Infecciosas e Auto-Imunes. A. W. Ferreira; S. L. M. Ávila.
Editora Guanabara Koogan, 1996.