Espectroscopía IR

Rango de transiciones entre niveles de energía vibracionales

La frecuencia se suele expresar en números de onda (cm-1), o sea, la

inversa de la longitud de onda.

Near IR: Equipo similar a un espectrofotómetro UV-VIS

Middle IR: Medición FT-IR (FT: Transformada de Fourier)
Far IR: Posible con modernos equipos FT-IR, pero poco utilizada
 Espectroscopía IR

DESVENTAJA:
Absorción intensa del agua cerca de 1650 y 3300 cm−1

SOLUCION:
Medidas en muestras en capas finas (10 μm) en D2O, o
parcialmente deshidratadas.

OTRA ALTERNATIVA: Uso de ATR (Attenuated Total

Reflection), que evita los problemas asociados con la medición
de transmitancia limitando el grosor de la muestra efectiva a
una capa fina cerca de la superficie. MUY UTILIZADO EN
MEMBRANAS BIOLOGICAS
 VIBRACIONES MOLECULARES

Una transición es activa en IR dependiendo de la simetría

Reglas de selección propias (fuera del alcance de esta clase) 
 MODELO DEL OSCILADOR ARMONICO
Molécula diatómica (modelo clásico)

Ley de Hooke (resorte)

Valores de k:
200-800 Nm-1 (enlaces simples)
1000-1500 Nm-1 (enlaces multiples)

Regla de selección vibracional

Solamente para un oscilador armónico!

VIBRACIONES MOLECULARES
MODOS NORMALES DE VIBRACION
EN MOLECULAS POLIATOMICAS

3N-6 modos normales

3N-5 en una molécula lineal
 VIBRACIONES MOLECULARES

Una molécula diatómica heteronuclear tiene un MOMENTO

DIPOLAR PERMANENTE

Si el enlace vibra con la frecuencia del modo normal, el momento del

dipolo oscila a la misma frecuencia. Si la frecuencia del modo normal
cae en el rango IR, es ACTIVA EN IR.

Un modo normal que no da lugar a un dipolo magnético oscilante NO

ES ACTIVO EN IR, por ej el estiramiento de molécula diatómica
homonuclear

INACTIVO ACTIVO
Characteristic amide bands in N-methylacetamide

H H

O H
AB I II III V IV VI
TOTAL: 9 bandas

Amide II

Amide III
 Characteristic amide bands in N-methylacetamide

H H

O H
AB I II III V IV VI

FOUR CHARACTERISTIC BANDS

1. In dilute solution (no H bonding) a sharp band at 3400--3460 cm-1
(amide A) is assigned to a pure NH stretching. When H bonds are formed, the band
shifts to 3120--3320 cm−1 and the amide B band appears.
2. All proteins show a strong band in the 1600—1700 cm−1 region (amide I), which
shifts to higher frequencies in dilute solution. This band corresponds to a mode
essentially involving the C=O stretching.
3. Amide II : 1510 and 1570 cm−1. This is a more complex band (mode mixing).
4. Amide III bands (1350--1570 cm−1) are predominantly due to the
in-phase combination of N--H in-plane bending and C--N stretching vibrations and
are highly sensitive to the secondary structure
Resolution in IR spectra of proteins can be improved by
second derivative

Conveniente para identificar

las frecuencias de picos no
resueltos:
Aquí la banda de Amide I se
resuelve en 7 componentes
 Amide I bands of α-chymotrypsin 5% w/v in D2O

Interpretación del espectro mediante deconvolución espectral

Las bandas a 1627, 1637 and 1674 cm−1 corresponden a láminas

β, la banda ca. 1653 cm−1 a α-helice y las bandas a 1687, 1681,
y 1665 cm−1 corresponden a giros.
 Curve fitting analysis of FTIR spectra of α-chymotrypsin in the
amide III region: (a) native state, (b) 6 M guanidine
hydrochloride

Nativa: bandas a 1323, 1311 and 1304 cm−1 (hélice) y 1248, 1234
1222 cm−1: hojas β

Desplegada: Pérdida bandas a más de 1300 cm−1 (α-helix) y

aumento de bandas entre 1248 y 1270 cm−1 (random coils).
Curve fitting analysis of FTIR spectra of α-chymotrypsin in the
amide III region: (a) native state, (b) 6 M guanidine
hydrochloride

Spectral bands in the amide III region

1330--1295 cm−1, α-helix
1295—1270 cm−1, β-turns
1270--1250 cm−1, random coils
1250--1220 cm−1, β-sheets
 ESTRUCTURA SECUNDARIA POR IR

The amide I mode (1600--1700 cm−1) is the most widely used

band. Spectra are recorded in D2O. The overlap of the random
coil and the α-helix band makes it difficult to predict the α-
helix content.

Amide II region (1510 and 1570 cm−1): intense, but not very
sensitive to secondary structure changes. It also overlap with
bands originating from amino acid side-chain vibrations.

Amide III region (1350--1200 cm−1) in-phase combination of

N--H bending and C--N stretching vibrations and are highly
sensitive to secondary structure. In contrast to amide I band,
there is no H2O interference in this region. Signals are less
intense but better defined for quantitative analysis of protein
secondary structure.
 Podemos predecir la
estructura secundaria en
base a la secuencia?
 Algorithms for Aligning Sequences
Algorithms are used to calculate a similarity score to infer
sequence homology between two sequences

• BLASTp, Needleman - Wusnsch (global)

– Calculates the a global similarity score between two
sequences in the library.
• FASTA, Smith - Waterman (local)
– Searches for both full and partial sequence matches
i.e. local similarity obtained

Multiple Sequence Alignment:

– CLUSTAL W
• Aligns sequence according to their evolutionary
relatedness
Algo más moderno?
JPred4