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CROMATOGRAFIA

Laboratório
de Química
Orgânica
Definição Geral

 A cromatografia é um
método físico-químico de
separação que se
fundamenta na migração
diferencial dos
componentes de uma
mistura devido a diferentes
interações entre duas fases
imiscíveis: fase móvel (gás,
líquido ou um fluido
supercrítico) e fase
estacionária (fixa, colocada
Transporte dos componentes de
em uma coluna ou numa uma amostra por uma fase móvel
superfície sólida). através de uma fase estacionária
A grande variedade de combinações
entre fases móveis e estacionárias a
torna uma técnica extremamente
versátil e de grande aplicação.

A cromatografia pode ser utilizada


para a identificação de compostos, por
comparação com padrões previamente
existentes, para a purificação de
compostos, separando-se as
substâncias indesejáveis e para a
separação dos componentes de uma
mistura.
Histórico

 1906 o botânico russo Mikhail Tswett


descreveu suas experiências na éter de
separação dos componentes de petróleo
extratos de folhas. mistura de
pigmentos

 Os termos cromatograma,
cromatografia, método CaCO3 pigmentos
cromatográfico aparecem em dois separados
trabalhos descrevendo suas
experiências para separar pigmentos
de um extrato de folhas (clorofila e
xantofila) e gemas de ovo, utilizando
uma coluna de vidro empacotada
com CaCO3 finamente dividido (fase
estacionária) e éter de petróleo (fase
móvel). A separação dos Cromatografia (grego)
componentes pode ser verificada por
meio de faixas coloridas na coluna. kroma [cor] + graph
[escrever]
 Apesar do estudo de Tswett e
de outros anteriores que
poderiam ser considerados
precursores do uso dessa
técnica, a cromatografia foi
praticamente ignorada até a
década de 30, quando foi
redescoberta. A partir daí,
diversos trabalhos na área
possibilitaram seu
aperfeiçoamento e, em
conjunto com os avanços
tecnológicos, levaram-na a
um elevado grau de
sofisticação, resultando no
seu grande potencial de Mikhail Semenovich
aplicação em várias áreas. Tswett
(1872-1919)
Classificação dos Métodos
cromatográficos

Cromatografia

Planar Coluna

Centrífuga Líquida
CCD CP CSC Gasosa
(Chromatotron)

Clássica CLAE CG CGAR


 Segundo a forma
física do sistema
cromatográfico:
cromatografia
planar,
cromatografia em
coluna e centrífuga.

 Segundo o modo
de separação:
adsorção, partição,
troca iônica,
exclusão ou
misturas desses
mecanismos.
 Segundo a fase estacionária utilizada: fase
estacionárias sólidas, líquidas e quimicamente
ligadas.

Esqueletos fósseis
(SiO2 + óxidos
metálicos) de algas
microscópicas

Exemplos de fases estacionárias


 Segundo a fase móvel empregada:

Cromatografia líquida – Na cromatografia líquida


clássica (CLC), a fase móvel é arrastada através da
coluna apenas por força da gravidade, enquanto que na
cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) se
utilizam fases estacionárias de partículas menores,
sendo necessário o uso de uma bomba de alta pressão
para eluição da fase móvel.
Cromatografia gasosa - As separações podem ser
obtidas por cromatografia gasosa simples (CG) e por
cromatografia gasosa de alta resolução (CGAR). A
diferença entre as duas reside nos tipos de colunas
utilizadas. Enquanto na CGAR são utilizadas colunas
capilares, nas quais a fase estacionária é um filme
depositado na coluna.
Cromatografia supercrítica (CSC) - Utiliza-se um
vapor pressurizado, acima da sua temperatura crítica.
Classificação Método Fase Estacionária Tipo de
equilíbrio
Líquido-líquido ou Líquido adsorvido Partição entre
partição em um sólido líquidos imiscíveis
Fase líquido-ligado Espécies Partição entre
quimicamente líquidos e
ligadas a uma superfície ligada
superfície sólida
Cromatografia Líquido-sólido ou Sólido Adsorção
Líquida adsorção
Troca iônica Resina de troca- Troca iônica
iônica
Exclusão por Liquido em Partição ou
tamanho ou gel interstícios de filtração
filtração sólido polimérico ou
gel polimérico
Gás-líquido Líquido adsorvido Partição entre gás
em um sólido e líquido
Cromatografia Gás-ligado Espécies ligadas a Partição entre o
gasosa uma superfície gás e superfície
sólida ligada
Gás-sólido Sólido Adsorção
Cromatografia Fase móvel fluido Espécies orgânicas Partição entre
com fluido supercrítico ligadas a uma fluido supercrítico
supercrítico superfície sólida e superfície ligada
Centrífuga - CHROMATOTRON
 Chromatotron é uma
cromatografia em camada
delgada preparativa e
acelerada centrifugamente.
 Foi desenvolvida pelos
autores do Compendium of
Organic Synthetic Methods.
Substitue as CCD
preparativas, pequenas
colunas e HPLC. Com
dimensiões ~ 30 cm.
 US Patent no. 4139458.
Pendentes em outros
países
Princípio de operação

 A amostra a ser
separada é aplicada
como uma solução no
centro do disco giratório
umedecido com o
solvente.
 A eluição com solvente
gera bandas circulares
de separação dos
componentes que são
removidos juntamente
com o solvente para um
tubo de recepção.
 Capacidade: 500 mg por componente, cerca de1 g total.
 Adsorventes: Silica gel, alumina e silica gel - nitrato de prata.
 Solventes: Compatível com todos os solventes comumente
usados nas outras técnicas cromatográficas, inclusive ácido
acético. Não apropriada para uso com ácidos minerais.
 Vantagens especiais:
* Não aplicação de “spot” ou raspagem de bandas.
* Separações são rápidas, cerca de 20 min.
* Permite a observação direta por UV ou de compostos
coloridos durante a eluição.
* Camadas finas de 1, 2 or 4 mm apresentam alta capacidade.
* Utiliza-se pouco solvente e a eluição por gradiente é fácil. O
solvente é regenerado in situ, podendo ser re-utilizado.
* Atmosfera de nitrogênio previne oxidação das amostras.
* Compacta (facilmente removida de um laboratório para outro),
poucos controles e não necessita altas pressões.
* Baixo preço. Chromatotrons custam menos que um simple
HPLC preparativo.
Cromatografia em Papel
 A cromatografia em papel (CP) é uma técnica de
partição líquido–líquido, estando um deles fixado a
um suporte sólido. O suporte é saturado em água e
a partição se dá devido à presença de água em
celulose (papel de filtro). Este método, embora
menos eficiente que a CCD, é muito útil para a
separação de compostos polares, sendo
largamente usado em bioquímica.

 Utiliza-se pequena quantidade de amostra


(microgramas a miligramas). As manchas podem
ser reveladas por meio de luz UV, vapores de iodo,
soluções de cloreto férrico e tiocianoferrato de
potássio, etc)

 Cromatografia em papel com fase normal (papel é


saturado com a fase estacionária polar, p. ex.
água) e com fase reversa (papel é tratado com
outro líquido, p.ex.: acetona e dimetilformamida,
parafina, óleo, silicone, solventes orgânico).
Cromatografia em Camada Delgada

 A cromatografia em camada delgada (CCD) é uma técnica de


adsorção líquido–sólido. Nesse caso, a separação dos
componentes da mistura ocorre em função da migração
diferencial sobre uma camada delgada de adsorvente, fixo
numa superfície plana, por meio de uma fase móvel (um
líquido ou misturas de líquidos).

 O fenômeno é principalmente de adsorção (partição ou troca


iônica), a separação se dá pela diferença de afinidade dos
componentes de uma mistura pela fase estacionária. Os
adsorventes comerciais mais utilizados são: sílica, alumina,
celulose, terra diatomácea e poliamida.

 Utiliza-se pequena quantidade de


amostra (microgramas a miligramas). As
manchas podem ser reveladas por meio
de luz UV, vapores de iodo, soluções de
cloreto férrico e tiocianoferrato de
potássio, fluorescências, radioatividade,
etc.
 O parâmetro mais importante a ser considerado
em CCD é o fator de retenção (Rf), o qual é a
razão entre a distância percorrida pela substância
em questão e a distância percorrida pela fase
móvel. Os valores ideais para Rf estão entre 0,4 e
0,6.

 A CCD pode ser usada tanto na


escala analítica quanto na
preparativa.

 Por ser um método simples, rápido,


visual e econômico, a CCD é a
técnica predominantemente
escolhida para o acompanhamento
de reações orgânicas, sendo
também muito utilizada para a
purificação de substâncias e para a
identificação de frações coletadas
em cromatografia líquida clássica.
Cromatografia em Coluna
 A cromatografia em coluna é uma técnica
usada para a separação de muitos
compostos orgânicos. Essa técnica
fundamenta-se basicamente na polaridade
relativa das moléculas envolvidas.
 Utiliza-se tubos de vidro compactado com
um material polar finamente dividido
(suporte sólido ou fase estacionária), em
geral, alumina ou silicagel, empacotado com
um solvente orgânico ou uma mistura de
solventes.
 Uma solução contendo o composto que se
deseja purificar é aplicada na superfície
superior da fase estacionária, e após
eluição coletar frações com volume
predeterminados, as quais muito
provavelmente conterão os componentes da
mistura separados.
 Velocidade na qual um composto é
eluido da coluna depende de sua
polaridade, da polaridade da fase
estacionária e da polaridade do
solvente utilizado como eluente. Se o
composto é mais atraído pela fase
estacionária do que pelo solvente, ele
migrará mais lentamente da coluna.
Caso contrário, se o composto tiver
maior afinidade pelo solvente ele
migrará mais rapidamente da coluna,
gastando menos tempo e solvente. O
êxito de uma coluna dependerá então
da escolha de um suporte e solvente
adequados para a sua realização.

 Atualmente a técnica mais utilizada


pelos químicos orgânicos para a
separação de uma mistura de
compostos é a cromatografia rápida:
Coluna Cromatográfica Rápida (flash-
column chromatography) e Coluna Variantes rápidas da
Cromatográfica Rápida e a Seco (dry- cromatografia em coluna
column flash chromatografy)
Cromatografia Gasosa de Alta
Resolução (CGAR) e Cromatografia
Líquida de Alta Eficiência (CLAE)
Cromatografia Gasosa
 O principal mecanismo de separação da
Cromatografia Gasosa (CG) está baseado
na partição dos componentes de uma
amostra entre a fase móvel gasosa e a
fase estacionária líquida. A utilização de
fases estacionárias sólidas, as quais
levariam à separação por adsorção,
apresenta poucas aplicações.
 A cromatografia gasosa é uma das
técnicas analíticas mais utilizadas. Além
de possuir um alto poder de resolução, é
muito atrativa devido à possibilidade de
detecção em escala de nano a picogramas
(10–9 a 10-12 g).
Modelo de um CG moderno
 A grande limitação deste método é a
necessidade de que a amostra seja volátil
ou estável termicamente, embora
amostras não voláteis ou instáveis possam
ser derivadas quimicamente.
Funcionamento do Cromatógrafo Gasoso
 A amostra é vaporizada e introduzida
em um fluxo de um gás adequado
denominado de fase móvel ( FM) ou
gás de arraste.
 O fluxo de gás com a amostra
vaporizada passa por um tubo
contendo a fase estacionária FE
(coluna cromatográfica), onde ocorre a
separação da mistura.

 A FE pode ser um sólido adsorvente


(Cromatografia Gás-Sólido) ou, mais
comumente, um filme de um líquido
pouco volátil, suportado sobre um
sólido inerte (Cromatografia Gás-
Líquido com Coluna Empacotada ou Esquema de um CG e de um
Recheada) ou sobre a própria parede cromatograma
do tubo (Cromatografia Gasosa de
Alta Resolução).
Equipamento básico de um
cromatógrafo a gás

1 - Reservatório de Gás
e Controles de Vazão /
Pressão.
2 - Injetor (Vaporizador)
de Amostra.
3 - Coluna
Cromatográfica e Forno
da Coluna.
4 - Detector.
5 - Eletrônica de
Tratamento
(Amplificação) de Sinal.
6 - Registro de Sinal
(Registrador ou
Computador).
 Na cromatografia gás-líquido (CGL), os dois fatores que
governam a separação dos constituintes de uma amostra
são:

 a solubilidade na FE: quanto maior a solubilidade de um


constituinte na FE, mais lentamente ele caminha pela coluna.
 a volatilidade: quanto mais volátil a substância (ou, em
outros termos, quanto maior a pressão de vapor), maior a
sua tendência de permanecer vaporizada e mais
rapidamente caminha pelo sistema.

 As substâncias separadas saem


da coluna dissolvidas no gás de
arraste e passam por um detector;
dispositivo que gera um sinal
elétrico proporcional à quantidade
de material eluido. O registro deste
sinal em função do tempo é o
cromatograma, sendo que as
substâncias aparecem nele como
picos com área proporcional à sua
massa, o que possibilita a análise
quantitativa
Exemplo de um cromatograma.
Constituintes básicos de um sistema
cromatográfico e cuidados especiais

 Reservatório de Gás de Arraste. O gás de arraste fica contido


em cilindros sob pressão. O parâmetro mais importante para
escolha do gás é a sua compatibilidade com o detector. Os gases
mais empregados são H2, He e N2 e a vazão do gás de arraste,
que deve ser controlada, é constante durante a análise.

 Sistema de Introdução de Amostra. A a introdução da amostra é


feita no injetor (ou vaporizador). Na versão mais simples, trata-se
de um bloco de metal conectado à coluna cromatográfica e à
alimentação de gás de arraste. Este bloco contém um orifício com
um septo, geralmente de borracha de silicone, pelo qual amostras
líquidas ou gasosas podem ser injetadas com microseringas
hipodérmicas. Amostras sólidas podem ser dissolvidas em um
solvente adequado. O injetor deve estar aquecido a uma
temperatura acima do ponto de ebulição dos componentes da
amostra, para que a amostra se volatilize completa e
instantaneamente e seja carregada para a coluna. Se a
temperatura for excessivamente alta, pode ocorrer decomposição
da amostra.
 A quantidade de amostra injetada depende da coluna e
do detector empregado. Para colunas empacotadas,
volumes de 0,1 µl a 3,0 µl de amostra líquida são típicos.
Volumes altos prejudicam a qualidade de injeção
(alargamento dos picos) ou saturam a coluna
cromatográfica. Para a cromatografia gasosa de alta
resolução (CGAR), os volumes de injeção deveriam ser
da ordem de nanolitros.

 Coluna Cromatográfica e Controle de Temperatura


da Coluna. A amostra deve entrar na coluna na forma
de um segmento estreito, para evitar alargamento dos
picos. Após injetada e vaporizada, a amostra é
introduzida na coluna cromatográfica, onde é efetuada a
separação. Na CG a "afinidade" de um soluto pela FM é
determinada pela volatilidade do soluto, sua pressão de
vapor, que é função da estrutura do composto e da
temperatura. Alterando-se a temperatura, altera-se
também a pressão de vapor e, por conseguinte, a
"afinidade" de uma substância pela FM. O controle da
temperatura deve ser rigoroso.
 Detector - Um dispositivo que indica e quantifica os
componentes separados pela coluna. Um grande número de
detectores têm sido descritos e usados em CG. Existem,
entretanto, algumas características básicas comuns para
descrever seu desempenho:
1. Seletividade. Alguns detectores apresentam resposta para
qualquer substância diferente do gás de arraste que passe por
ele. Estes são os chamados detectores universais. Por outro
lado, existem detectores que respondem somente a
compostos que contenham um determinado elemento químico
em sua estrutura, que são os detectores específicos. Alguns
detectores respondem a certas classes de compostos
(detectores seletivos).
2. Ruído. São os desvios e oscilações na linha de base (sinal do
detector quando só passa o gás de arraste). Pode ser causado
por problemas eletrônicos, impurezas e sujeiras nos gases e
no detector, etc.
3. Tipo de Resposta. Alguns detectores apresentam um sinal
que é proporcional à concentração do soluto no gás de
arraste; em outros, o sinal é proporcional à taxa de entrada de
massa do soluto no detector.
4. Quantidade Mínima Detectável (QMD). É a quantidade
de amostra mínima para gerar um sinal duas vezes mais
intenso que o ruído. É uma característica intrínseca do
detector. Quanto menor a QMD, mais sensível o detector.

5. Fator de Resposta. É a intensidade de sinal gerado por


uma determinada massa de soluto, que depende do
detector e do composto estudado. Pode ser visualizado
como a inclinação da reta que correlaciona o sinal com a
massa de um soluto (curva de calibração). Quanto maior
o fator de resposta, mais confiável a análise quantitativa.

6. Faixa Linear Dinâmica. É a razão entre a menor e a


maior massa entre as quais o fator de resposta de um
detector para um soluto é constante, isto é, onde a curva
de calibração é linear. Os dois detectores mais
significativos em CG são o Detector por Condutividade
Térmica (DCT) e o Detector por Ionização em Chama
(DIC).
Detector por Condutividade Térmica (DCT)
 O funcionamento do DCT é baseado no fato de que a velocidade de
perda de calor de um corpo quente para um corpo mais frio é
proporcional, dentre outros fatores, à condutividade térmica do gás
que separa estes corpos. Um filamento metálico muito fino (de W, Au
ou liga W-Re) é aquecido pela passagem de uma corrente elétrica
constante. Este filamento fica montado dentro de um orifício em um
bloco metálico (cela), aquecido à uma temperatura mais baixa que
aquela do filamento, por onde o gás de arraste proveniente da coluna
passa continuamente.
 Quando um componente é eluido da coluna, ele sai
misturado com o gás de arraste e passa pelo
detector. Se a condutividade desta mistura for
diferente daquela do gás de arraste puro, o
filamento passa a perder calor para o bloco numa
taxa diferente daquela do equilíbrio. O aquecimento
do filamento quando a amostra é eluida causa uma
variação na sua resistência elétrica e a resistividade
de um metal aumenta com a temperatura. O
filamento é montado em um circuito de ponte de 1. Bloco metálico; 2. Entrada de
Wheatstone, que converte a variação na resistência gás; 3. Saída de gás; 4. Filamento
elétrica do filamento numa variação de voltagem, metálico; 5. Alimentação de
que é coletada em um registrador gerando o corrente
cromatograma.
 O DCT é um detector universal, sensível à concentração do
soluto no gás de arraste. Geralmente, quando se usa DCT,
o gás de arraste é He ou H2. Pelo fato destes gases terem
condutividades térmicas altíssimas, as misturas gás de
arraste mais o soluto sempre terão condutividades térmicas
menores que a do gás de arraste puro, o que impede sinais
negativos, além de se obter maiores fatores de resposta.

 Entretanto, o DIC é considerado um detector pouco


sensível. A QMD de um modelo moderno, para propano, é
de 400 pg/ml de gás de arraste, com faixa linear de 106.
Apesar disso, o fato de ser universal, barato e de operação
simples, o faz extremamente útil para análises que não
necessitem de alta sensibilidade.
Detector por Ionização em Chama (DIC).
 Durante a queima de um composto
orgânico, são formados diversos íons e
como conseqüência, a chama resultante
torna-se condutora de eletricidade. O
funcionamento do DIC baseia-se neste
fenômeno.
 O gás de arraste saindo da coluna
cromatográfica é misturado com H2 e
queimado com ar ou O2. A chama
resultante fica contida entre dois
eletrodos, polarizados por uma voltagem
constante. Como a chama de H2 forma
poucos íons, ela é um mau condutor
elétrico e quase nenhuma corrente passa
entre os eletrodos. Ao eluir um composto Cela de um detector por
orgânico, ele é queimado e são formados ionização de chama
íons na chama, que passa a conduzir
corrente elétrica. A corrente elétrica
resultante, da ordem de pA, é amplificada
e constitui o sinal cromatográfico.
 Quase todos compostos orgânicos podem
ser detectados pelo DIC.

 Apenas substâncias não inflamáveis (CCl4,


H2O) ou algumas poucas que não formam
íons na chama (HCOOH) não dão sinal.
Assim, ele é um detector praticamente
universal. De um modo geral, quanto
ligações C-H tiver o composto, maior a sua
resposta (maior sensibilidade). Ele é muito
mais sensível que o DCT, pois dependendo
do composto, podem ser detectados entre
10 pg e 400 pg, com faixa linear dinâmica
de 107. Provavelmente é o detector mais
usado em CG.
Parâmetros fundamentais de um sistema de CG

 Retenção - O tempo de retenção (tr) é definido como o tempo


transcorrido entre a injeção da amostra e o máximo do pico
cromatográfico. Porém, mesmo que a substância não interagisse
de forma alguma com a FE, o seu tempo de retenção não seria
nulo, pois transcorreria algum tempo entre a sua injeção e a sua
passagem pelo detector. O parâmetro que realmente reflete as
características físico-químicas de retenção tempo de retenção
ajustado (t’r), que é determinado composto é o tempo de
retenção descontado do tempo morto, tm, (tempo que o gás de
arraste demora para percorrer a coluna).

 Seletividade - Capacidade de um sistema diferenciar dois


compostos, é definida por α, sendo uma característica
que, na CG, é mais associada à coluna cromatográfica.
 Eficiência - A eficiência é expressa pelo número de pratos
teóricos (n), que é calculada usando-se um parâmetro de
retenção (o tr) e a largura do pico cromatográfico - no caso, a
largura de base, wb. A altura equivalente a um prato teórico (h) é
dada pela razão entre o comprimento da coluna cromatográfica
(L) e n.

 Resolução - A resolução entre duas substância é a razão entre


a diferença das distâncias de migração e a média das larguras
das bandas.

Se as larguras dos picos forem próximas, pode-se utilizar a


simplificação
Na CG existe um grande número de fases estacionárias
líquidas e sólidas disponíveis comercialmente, de modo
que a natureza da FE é a variável mais importante na
otimização da seletividade.

 As FE líquidas são as mais empregadas em CG. FE sólidas (carvão


ativo, sílica, peneiras moleculares e polímeros porosos) são
aplicadas para separação de gases e compostos de baixo massa
molar. Em princípio, para um líquido ser usado como FE em CG ele
deve ser pouco volátil (pressão de vapor até 0,1 mmHg ou 13,332
Pa na temperatura de trabalho) e termicamente estável. Para esta
fase ser empregada em uma separação em particular, ela precisa:
1. ser um bom solvente para os componentes da amostra, caso
contrário o efeito será o mesmo de temperaturas de coluna
excessivamente altas (os compostos ficarão quase que o tempo todo
no gás de arraste, sendo eluidos muito rapidamente e sem
separação);
2. ser um bom solvente diferencial, isto é, além de dissolver bem todos
os constituintes da amostra, fazê-lo com solubilidades
suficientemente diferentes para que eles possam ser separados; e
3. ser quimicamente inerte em relação à amostra.
 As FE mais populares são os silicones. Silicones são polímeros
extremamente estáveis e inertes, o que os torna especialmente
adequados à CG. Nesta classe, as polidimetilsiloxanas são os
menos polares. A substituição dos grupos metila na cadeia por
outros grupos (fenil, ciano, trifluoropropil, etc.) fornece FE com
polaridades crescentes. Comercialmente, são disponíveis sob
diversas denominações, muitas delas praticamente equivalentes.
SE-30, OV-1 e DC-200 são nomes comerciais para
polidimetilsiloxano de fabricantes diferentes.

 Outra classe de FE importante é a dos poliglicóis. São polímeros de


etilenoglicol e epóxido, preparados com diferentes tamanhos de
cadeia polimérica. São FE moderadamente polares, adequadas para
separação de álcoois, aldeídos, éteres, etc. A denominação
comercial "Carbowax" designa a série de poliglicóis mais conhecida
(p.ex., Carbowax 20M é polietilenoglicol com massa molar média de
20.000.000 g/mol).

 Um terceiro grupo importante de FE é o dos poliésteres. São obtidos


por condensação de diácidos com glicóis. São fases altamente
polares. As fases mais comuns desta categoria são o succinato de
dietilenoglicol (DEGS) e o adipato de dietilenoglicol (DEGA).
 A coluna cromatográfica é o local onde ocorre a interação entre a
amostra e a FE. Existem duas geometrias básicas de colunas para
CG: as colunas empacotadas (ou recheadas), e as colunas tubulares
abertas (ou capilares).

 Nas colunas empacotadas, a FE líquida é depositada sob a forma de


um filme fino e uniforme sobre partículas de um suporte adequado. O
suporte deve ser um sólido poroso com grande área superficial,
inerte e de boa resistência mecânica. O tamanho das partículas e
dos poros deve ser o mais uniforme possível. O material mais
empregado como suporte é a diatomite, esqueletos fósseis de algas
microscópicas (diatomáceas), compostos principalmente de SiO2
amorfa e traços de óxidos metálicos. A diatomite preparada para
suporte de CG é comercializada com o nome de "Chromosorb",
dentre outros.

 Para preparar uma coluna empacotada, o material de enchimento


(FE sobre suporte) é colocado da forma mais uniforme e compacta
possível ("empacotado") em um tubo de comprimento e diâmetro
adequados. Os materiais mais usados para os tubos de colunas são
o aço inox e o vidro, sendo o primeiro preferido pelo manuseio mais
fácil. Se o material de enchimento não for colocado na coluna de
forma compacta e uniforme, os espaços vazios resultantes
funcionarão como câmaras de diluição para a amostra. O resultado
serão picos mais largos e menor eficiência.
 O tamanho da coluna é variável. Tipicamente são usadas colunas
com diâmetros internos de 1 mm a 4 mm e 1 m a 3 m de
comprimento. Quanto maior a coluna, maior a eficiência; entretanto,
também aumenta o tempo de análise. Colunas muito longas
oferecem uma resistência muito alta à passagem de gás, exigindo
pressões excessivamente altas. Além da natureza da FE e da
qualidade do empacotamento, existem duas variáveis importantes
que influem no desempenho de uma coluna empacotada:

A percentagem de FE no material de enchimento. A


percentagem de FE sobre o suporte é um parâmetro que deve ser
rigidamente controlado. Se a quantidade de FE for muito baixa,
partes da superfície do suporte ficarão expostas à amostra, que
poderá ser adsorvida. O resultado é o alargamento ou deformação
dos picos. Quanto mais FE, maior a retenção. A seletividade
também aumenta, porém às custas de aumento do tempo de análise
e diminuição da eficiência.

O diâmetro das partículas do suporte. Quanto menor o diâmetro


das partículas do suporte, maior a eficiência da coluna. A
uniformidade das partículas também é importante. Recheios com
partículas cuja distribuição de tamanho seja muito grande serão
pouco eficientes. Se for usado suporte com partículas
excessivamente finas, a resistência à passagem de gás será muito
alta.
 A capacidade de processamento de amostra das colunas
capilares é menor que aquela das empacotadas. Dependendo
da coluna, ela pode ser saturada com quantidades tão
pequenas quanto 0,001 µl de amostra. Como a injeção direta de
volumes de amostra desta ordem de grandeza é inviável, deve-
se recorrer ao artifício da divisão de amostra na injeção. Um
inconveniente dessa metodologia é ajustar reprodutivelmente a
razão de divisão (fração da amostra injetada que entra na
coluna) o que pode acarretar erros na análise quantitativa. Além
disso, amostras contendo constituintes com volatilidades muito
diferentes podem ser alteradas pela divisão: a fração da amostra
que realmente vai para a coluna fica enriquecida com os
componentes menos voláteis.

 Dada a grande eficiência das colunas capilares, podem ser


realizadas separações de misturas extremamente complexas:
frações de petróleo, essências, amostras biológicas, etc. No
caso específico de análises de interesse ambiental (poluentes
em águas e ar, por exemplo), é quase que obrigatório o seu uso.
A tendência atual é que a maioria das análises seja feita com o
uso de colunas capilares. Isto não significa que as colunas
empacotadas estão sendo abandonadas, porém o seu uso deve
ficar restrito à aplicações específicas.
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
(CLAE)

 Em contraste à CG, o principal


mecanismo de separação da
cromatografia gasosa está
baseado na partição dos
componentes de uma amostra
entre a fase móvel líquida e a fase
estacionária sólida.

 A versatilidade desta técnica


reside no grande número de fases
estacionárias existentes, as quais
possibilitam análises e
separações de uma ampla gama
de compostos com alta eficiência.
Modelo esquemático de um equipamento básico
de CLAE

a) reservatório da fase móvel; b) bomba de alta


pressão; c) válvula de injeção; d) coluna;
e) detector e f) registrador.
Exemplo de cromatograma

Perfil cromatográfico de uma análise registrada automaticamente, de padrões de


aminoácidos. Fonte: Lehninger, 1990.
Funcionamento do cromatógrafo líquido

 As fase móveis utilizadas em CLAE devem possuir alto grau de


pureza e estar livres de oxigênio ou outros gases dissolvidos, sendo
filtradas e degaseificadas antes de uso.

 A bomba deve proporcionar ao sistema vazão contínua sem pulsos


com alta reprodutibilidade, possibilitando a eluição da fase móvel a
um fluxo adequado. A necessidade de uma bomba de alta pressão
para eluição da fase móvel na cromatografia líquida de alta eficiência
(CLAE) tendo sido no princípio denominada de cromatografia líquida
de alta pressão.

 As válvulas de injeção usadas possuem uma alça de amostragem


para a introdução da amostra com uma seringa e duas posições,
uma para o preenchimento da alça e outra para sua liberação para a
coluna. Existem alças de diversos volumes, sendo utilizadas
geralmente alças na faixa de 5-50 mL para injeções analíticas e 0,5-
2 mL para preparativas.
 As colunas utilizadas em CLAE são geralmente de
aço inoxidável, com diâmetro interno de cerca de
0,45 cm para separações analíticas e na faixa de 2,2
cm para preparativas.

 O comprimento das colunas é variável,


sendo comuns colunas analíticas de 10-
25 cm e preparativas em torno de 25-30
cm. Essas colunas são reaproveitáveis,
sendo empacotadas com suportes de
alta resolução, não sendo necessária
sua regeneração após cada separação.

 O detector mais utilizado para separações por CLAE é o


detector de ultravioleta, sendo também empregados
detectores de fluorescência, de indíce de refração, e
eletroquímicos, entre outros. Detectores de polarimetria para
CLAE, recentemente desenvolvidos, diferenciam compostos
quirais, através da rotação de seus estereoisômeros frente à
luz plano-polarizada.
Registro de Dados na Cromatografia
Líquida

 O registro de dados pode


ser feito através de um
registrador, um integrador
ou um microcomputador.

 Tanto na cromatografia
gasosa (CG) quanto na
cromatografia líquida
(comumente de alta
eficiência, CLAE) e a
banda é registrada como
um pico, que idealmente Cromatograma mostrando a
separação dos enantiômeros do tetramisol,
deve ter formato princípio ativo de vários medicamentos
gaussiano. usados para ascaridíase.
Mecanismos das separações em CLAE

 As separações em CLAE podem se dar por adsorção,


partição ou ambos. O suporte mais comumente utilizado é a
sílica. O uso de fases estacionárias líquidas adsorvidas a um
suporte não tem grande aplicação devido à perda de fase
estacionária, mas o uso de suportes modificados, os quais
foram desenvolvidos como conseqüência do problema acima,
possibilita a produção de uma imensa variedade de colunas
com diferentes propriedades e tipos de seletividade. As fases
assim obtidas são chamadas de quimicamente ligadas.

 As fases quimicamente ligadas, dependendo da modificação


feita ao suporte, podem atuar no modo normal, reverso ou
ambos. Na cromatografia em fase normal, a fase estacionária
é mais polar que a fase móvel, e em fase reversa, a fase
móvel é mais polar.
 Separações analíticas são predominantemente realizadas
em fase reversa, sendo a fase C18 (octadecilsílica) a
mais usada, ao passo que são preferidas fases que
atuem no modo normal para fins preparativos, em vista de
que separações no modo reverso utilizam fases móveis
aquosas.

 Entre as fases quimicamente ligadas, merecido destaque


deve ser dado às fases estacionárias quirais, as quais
possibilitam a separação direta de enantiômeros. Para
tanto, é necessária a presença de um seletor quiral como
parte integrante da fase estacionária.

 Tem sido utilizada em várias áreas da ciência, no


acompanhamento de sínteses, em análises de pesticidas,
feromônios, no isolamento de produtos naturais e
sintéticos e na produção e controle de qualidade de
medicamentos, dentre tantas outras aplicações.
Utilização da HPLC acoplado a técnicas
espectroscópicas na elucidação estrutural
de produtos naturais
Cromatógrafos acoplados à Espectrofotômetros
de Massa: GC-MS e HPLC-MS

HPLC - Diagrama esquemático

ESI and APCI HPLC/MS


Exemplos desenvolvidos no IQ
Espectro de massa (CG/MS)

O C H3
I
MM = 570

C 15 H 31
I
Análise quantitativa por cromatografia

 A análise quantitativa em
cromatografia é baseada em
estabelecer o valor da área da
banda cromatográfica. Na
cromatografia em coluna, isto
é, gasosa (CG) e em
cromatografia líquida
(comumente de alta eficiência,
CLAE) a banda é registrada
como um pico que, idealmente
deve ter formato gaussiano.
Em cromatografia gasosa de
alta resolução, onde são
usadas colunas capilares, não
é incomum que os picos
tenham perfil gaussiano.
 Similarmente ao que
ocorre na cromatografia
em camada delgada
(CCD), onde as
manchas observadas
tendem ao perfil
gaussiano, isto é,
aumentam das bordas
para o centro da
mancha e,
simetricamente,
diminuem do centro
para a outra borda. Isto
é mostrado na ao lado,
em que as quantidades
de analito numa
mancha foram obtidas
para secções verticais.
 Nas correspondentes bandas
cromatográficas as
quantidades dos analitos
tendem ao perfil gaussiano, isto
é, aumentam das bordas para
o centro da mancha e,
simetricamente, diminuem do
centro para a outra borda.

 Quando a banda
cromatográfica é registrada na
forma de pico, a sua área pode
ser calculada, como mostrado
abaixo, como a área do
triângulo isósceles que
“engloba” o pico
cromatográfico.
 Na cromatografia em camada
delgada a área da mancha é
estabelecida pelo princípio de
densitometria. A
densitometria faz a contagem
do número de pontos de uma
imagem.

 O procedimento e princípio de
obter áreas em CCD a partir
de imagens digitalizadas e
arquivadas em computador .
O número de pontos que
define a mancha (como “vista”
por um densitômetro ou
computador) é proporcional á
área da mancha.

O princípio da densitometria
 As placas – no caso com
manchas visíveis de corantes –
são digitalizadas e com o arquivo
gerado realiza-se a contagem dos
pontos (pixeis é o termo usado na
área de computação) que
compõem cada mancha. A
contagem pode ser feita
manualmente – com muita
paciência – ou por meio de um
programa que conte os pixeis.

 O número de pontos é
proporcional à área da
correspondente mancha e,
conseqüentemente, proporcional
à quantidade de analito nela
existente. Esta metodologia
representa o princípio de Princípio do estabelecimento de área de
uma mancha de CCD por meio de
estabelecimento de áreas escaneamento da placa cromatográfica.
cromatográficas.
 Apesar do método de determinar áreas ser diferente para CG
e CLAE, o princípio é o mesmo do usado em CCD. O princípio
básico da quantificação é que a área dos picos registradas no
cromatograma é proporcional à massa do composto injetada.
Assim, é fundamental para a confiabilidade da análise que a
área dos picos seja medida o mais exata e reprodutível
possível. Existem vários modos de se medir a área de um
pico cromatográfico:

1. Técnicas Manuais. Quando o cromatograma é coletado por


um registrador analógico, usualmente a área dos picos
(~triângulo isósceles) é medida manualmente. O
procedimento mais empregado consiste em medir a altura do
pico (h) e a sua largura de base (wb) ou à meia-altura (wh), e
calcula-se a área pelas fórmulas usadas para cálculo de área
de triângulo:

ou
2. Integradores Eletrônicos. Integradores são dispositivos
baseados em microprocessadores que coletam o sinal
cromatográfico, digitalizam-no (transformam o sinal elétrico
em números), detectam a presença de picos e calculam a
sua área. Integradores são muito mais precisos e rápidos
que qualquer método manual de medida, desde que
empregados convenientemente. Embora sejam dispositivos
caros, quando é necessária rapidez na produção de
resultados, o seu uso é quase mandatório.

3. Computadores. O integrador pode ser substituído por um


computador, desde que este tenha um dispositivo para
converter o sinal elétrico em números que possam ser
guardados em memória (conversor analógico-digital), e se
disponha de programas adequados para fazer a análise do
cromatograma digitalizado. O custo de um computador com
os acessórios necessários para coletar e analisar
cromatogramas é, via de regra, inferior ao de um bom
integrador. Além disso, com um software e operação
adequada, pode fornecer resultados mais confiáveis que
este último.
 Qualquer que seja o modo usado para medir a área dos
picos, o procedimento geral de uma análise quantitativa
por CG envolve a obtenção do cromatograma da amostra,
a medida da área dos picos de interesse e o cálculo da
massa correspondente a cada um dos picos. Este cálculo
deve ser feito empregando uma curva de calibração: um
gráfico correlacionando a área do pico com a massa do
composto.
 A curva de calibração é obtida cromatografando-se
padrões contendo massas conhecidas dos compostos a
serem quantificados. Para cada substância, deve ser feita
uma curva de calibração própria, já que cada composto
responde de maneira diferente ao detector.
 O esquema geral proposto acima é chamado de
padronização externa. Como é muito difícil conseguir boa
reprodutibilidade entre injeções diferentes, ele é muitas
vezes sujeito à grande imprecisão e inexatidão. Para
contornar este problema, pode-se usar a chamada
padronização interna, onde a cada solução a ser injetada
adiciona-se uma quantidade exatamente igual de um
composto que seja separável dos componentes da
amostra, e que não exista nela (padrão interno).
O uso das áreas cromatográficas –
A curva analítica
 É medindo-se as áreas
cromatográficas que se estabelecem
as quantidades de analitos em
amostras analisadas e a melhor forma
de realizar quantificações é a baseada
numa Curva Analítica. A Curva
Analítica é a relação entre sinais – no
caso as áreas – e quantidades do
analito a ser quantificado.

 Dispondo da equação da curva


analítica pode-se calcular as
quantidades do analito em amostras.
As amostras a serem analisadas são
preparadas da mesma maneira que as
soluções-padrão, a corrida é realizada
sob as mesmas condições usadas
para o conjunto de padrões e as áreas
do analito nas amostras são Esboço de uma Curva Analítica linear
determinadas. (representada pela equação de uma reta).
Obtendo-se uma curva analítica

 O primeiro passo para obter a curva


analítica é preparar um conjunto de Concentrações preparadas e
soluções com um padrão do analito que se áreas obtidas para as
deseja quantificar em amostras. Portanto, é correspondentes sinais
necessário conhecer a identidade do cromatográficos
analito e dispor dele na forma de padrão
(puro ou, se isso não for possível, com
pureza exatamente conhecida e
determinada independentemente).

 Dispondo dos dados aplica-se a eles uma


Regressão Linear para obter a equação da
curva analítica, isto é, a relação funcional
entre Sinais e Quantidades. Para o caso
dos dados da Tabela, a equação de reta
que relaciona as áreas com as
concentrações do analito é:
 Suponhamos que para uma amostra
esta área foi estabelecida como de
184 pixeis. Este valor é substituído
na equação da curva analítica e
obtém-se a quantidade do analito na
amostra (no caso a sua
concentração).
 Note-se que a curva analítica é
definida como a relação entre sinais
e quantidades; no entanto, na
equação as quantidades são
representadas pelas concentrações
das soluções. Isto implica que os
volumes de amostra aplicados na
placa cromatográfica foram iguais,
pois, C = Q / V (C= concentração; Q
= quantidade; V =volume).
 Numa curva analítica interpolam-se
Gráfico da curva analítica obtida para os
resultados. As extrapolações não dados da tabelado.
refletem resultados efetivamente
quantitativos.
Exemplos desenvolvidos no IQ
Separação de mistura de o- e p-nitrofenol por CG

 A separação do o- e p-nitrofenol por CG constitui-se um bom


exemplo do efeito das interações intramoleculares sobre as
propriedades físicas dos compostos. No isômero orto, os
grupos OH e NO2 podem associar-se internamente por meio
de ligações hidrogênio, transformando-se no componente
menos polar.

OH OH OH
NO2
HNO3-H2O
+

NO2
Separação de mistura de o- e p-nitrofenol por CG

Cromatogramas obtidos no CG-Varian, método 2. (a)


CH2Cl2 puro. (b) o-Nitrofenol padrão dissolvido em
CH2Cl2.
Separação de mistura de o- e p-nitrofenol por CG

Cromatogramas obtidos no CG-Varian, método 2: (a) p-


Nitrofenol padrão dissolvido em CH2Cl2. (b) Mistura de o-e
p-nitrofenol dissolvido em CH2Cl2 obtida por meio da
reação de nitração (HNO3-H2SO4).
Exemplos desenvolvidos no IQ
Acompanhamento de reação por análise
cromatográfica no CG

HO HO OH
H2SO4
+
O O
AcOH, H2O2
OH

IBX,
AcOEt, O OH
o
80 C I
O
IBX
O
O
Antibiótico Ác. iodóxibenzóico
O
macrolídeo
O
Acompanhamento de reação por análise
cromatográfica no CG

HO HO OH
+
O O
OH
Acompanhamento de reação por análise
cromatográfica no CG

HO

O
OH

IBX,
AcOEt,
o
80 C

O
O
Exercício de CLAE - Provão
 A cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) é um dos métodos
cromatográficos mais modernos utilizados em análise (CLAE
analítica) e separação/purificação de misturas (CLAE preparativa).
No próximo slide são dados os cromatogramas X, Y e Z de uma
mistura de compostos presentes em analgésicos: aspirina (A),
cafeína (B), fenacetina (C) e paracetamol (D), utilizando três fases
móveis diferentes, no modo isocrático, em uma mesma coluna.
Avaliando esses cromatogramas, responda às perguntas abaixo.
(a) Qual a fase móvel mais apropriada para ser utilizada em
escala preparativa, e a fase móvel mais adequada para utilização
em escala analítica, considerando um grande número de amostras
a serem analisadas? Justifique sua resposta.
(c) Sabendo-se que o composto mais polar elui primeiro, qual o
composto de maior tempo de retenção? Justifique sua resposta.
(b) Qual o tipo de coluna (fase reversa ou fase normal) utilizada
nestes três experimentos? Justifique sua resposta.
Referências
 COLLINS, C.H.; BRAGA, G.L. e BONATO, P.S. Introdução a
métodos cromatográficos.5ª ed. Campinas: Editora da Unicamp,
1993.
 DEGANI, A. L. G.; QUEZIA , B. C.; VIEIRA, P. C. Cromatografia
– Um breve ensaio. Química Nova Na Escola. 1998, No. 7, 21.
 Pereira, A. S.; Radler, F. A. N. Estado da arte da cromatografia
gasosa de alta resolução e alta temperatura. Química Nova,
2000, 23,
 ANDRADE, J.B.; PINHEIRO, H.L.C.; LOPES, W.A.; MARTINS,
S.; AMORIM, A.M.M. e BRANDÃO, A.M. Determinação de
cafeína em bebidas através de cromatografia líquida de alta
eficiência (CLAE). Química Nova, 1995, 18, 379.
 Antônio Luiz Pires Valente (in memoriam), Fabio Augusto e
Cássio Ricardo Fares Riedo - ANÁLISE QUANTITATIVA POR
CROMATOGRAFIA Universidade Estadual de Campinas,
Chemkeys.com.
 http://www.chromatotron.com/chromatotron/specs.html