Biología Molecular III

Amplificación del fragmento del gen gap A, mediante

la Reacción en Cadena en Polimerasa
David Flores, Gabriel Guamán, Carolina Panchana, Janine Peralta, Sasha Sigüenza,
Josué Villota
Laboratorio de Biología Molecular III
Ingeniería en Biotecnología
Departamento de Ciencias de La Vida y La Agricultura
Universidad de las Fuerzas Armadas ESPE
daflores10@espe.edu.ec, gaguamnp@espe.edu.ec, cjpanchana@espe.edu.ec,
svsiguenza@espe.edu.ec, jnvillota@espe.edu.ec

Resumen
La reacción de la cadena de la polimerasa se ha establecido como una técnica común en los
laboratorios de investigación debido a que permite una rápida amplificación de muestras de DNA,
aumentando así su cantidad, para posteriores análisis. En este informe se amplificó el fragmento
del gen GapA de Klebsiella pneumoniae HS11286 haciendo uso de un termociclador y las
condiciones necesarias para la amplificación, programando temperaturas de desnaturalización
94°C, alineación 60°C y extensión 72°C en 35 ciclos de un minuto, con una posterior electroforesis
en gel de agarosa. Se logró una amplificación selectiva del fragmento de GapA, observándose
bandas de aproximadamente 600 pb en el electroferograma. Para confirmar estos resultados, se
realizó una PCR in silico del gen obteniéndose bandas de 663bp en la posición 2132725bp del
genoma bacteriano.
OBJETIVO: Realizar la amplificación del gen gapA de Klebsiella pneumoniae HS11286 mediante
la reacción en cadena de polimerasa (PCR), realizar una corrida electroforética en gel de agarosa del
producto obtenido, observar los resultados y compararlo con un ensayo de amplificación in silico.

I. INTRODUCCIÓN delimitan la zona del ADN que será copiado,

nucleótidos que serán adicionados a la nueva cadena y
La reacción en cadena de polimerasa (PCR) es un
la enzima ADN Taq pol, la cual es termoestable a altas
método inventado por K. B. Mullis, el cual es un
temperaturas, que se encargara de hacer la síntesis
procedimiento de síntesis in vitro usado para
química en presencia de iones de magnesio (Fonseca et
amplificar fragmentos de ADN mediante su incubación
al., 2010). Generalmente, es emplea una doble cadena
sucesiva a diferentes temperaturas (Damián et al.,
de ADN la cual es desnaturalizada por calentamiento a
2013). En la técnica de la PCR se requiere de un molde
94-95 °C, lo que permite el alineamiento de los primers
o ADN matriz, unos primers o iniciadores que
complementarios en los extremos 3’ de cada cadena,
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esto se da a una temperatura dependiente de los Biotecnología Humana de la Universidad de las

primers, y finalmente, la elongación de las cadenas a Fuerzas Armadas - ESPE.
una temperatura de 72-74 °C (Damián et al., 2013);
Los reactivos para PCR fueron proporcionadas por
todo este proceso se conoce como un ciclo.
el Laboratorio de Biotecnología Humana.
Según Fonseca et al. (2010), el interés de esta técnica
Se toma en cuenta la Tabla 2, para agregar la
es que no importa la cantidad de sustrato de la que se
cantidad de reactivos necesarios para el master mix.
parte, ya que si el número de ciclos de amplificación
Se debe tomar en cuenta que se harán 3 tubos de
de ADN es suficiente se obtendrá una cantidad de
preparación, uno con cada muestra de ADN, además
producto elevado, debido a que se trata de un fenómeno
de un control que no contendrá ADN, por lo cual los
de amplificación exponencial. Cabe destacar que la
cálculos se multiplican por 3.
sensibilidad de la técnica es muy alta, presentando
algunos inconvenientes como es la elevada Tabla 2. Información sobre los volúmenes de
probabilidad de obtener falsos positivos debido a reacción del ensayo
contaminación, ya que no es una técnica cuantitativa Concent Concen Master
Volume
sino semi-cuantitativa (Damián et al., 2013). React ración tración Mix (3
n Inicial
ivos Stock inicial Rx)
El gen gapA presente en Klebsiella pneumaniae, (Vi)
(Cs) (Ci)
traduce la enzima gliceraldehído 3-fosfato Buffer 5uL 1.5uL
deshidrogenasa (EC: 1.2.1.12), la cual cataliza la GoTa 5X 1X
fosforilación oxidativa del gliceraldehído 3-fofato q
(G3P) a 1,3 bifosfoglicerato (BPG) usando el cofactor dNTP 0.5uL 1.5uL
20mM 0,4mM
NAD. La primera etapa de reacción implica la s
formación de un intermedio hemiacetal entre G3P y un MgCl 1.5uL 4.5uL
25mM 1,5mM
resto de cisteína, y este intermedio hemiacetal se oxida 2

luego a un tioéster, con reducción concomitante de Prime 0.167uL 0.498uL

r
NAD a NADH. El NADH reducido se intercambia 30μM 0,2μM
Forwa
luego con el segundo NAD, y el tioéster es atacado por
rd
un fosfato inorgánico nucleófilo para producir BPG.
Prime 0.167uL 0.498uL
Esta proteína está involucrada en el paso 1 de la vía
r
secundaria que sintetiza piruvato a partir de D- 30μM 0,2μM
Rever
gliceraldehído 3-fosfato. Las proteínas (UNIPROT, se
2013). Taq 0.20uL 0.6uL
5U/μL 1U/μL
II. MATERIALES Y MÈTODOS Pol
Agua 14.96uL 47.14uL
A. Preparación de reactivos y muestras ultra ---- ----
pura
Después de haber realizado el protocolo de limpieza 1,5ng/μ 2.5uL 5
de cabinas de flujo laminar, se procedió a la ADN 15ng/μL
L
obtención de todos los reactivos necesarios para el Vf= 25 VMM=74.
master mix en distintos eppendorf. μL 97uL
Las muestras para la amplificación del gen gap A,
fueron proporcionadas por el Laboratorio de Se prepararon 3 reacciones por grupo, ya que la
amplificación del fragmento gapA se realizó en
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dupletas, por lo que se rotuló 3 tubos eppendorf M1 del marcador de peso molecular de 1Kb se encuentre
(Master Mix), M2 (segunda reacción) y el C(-) a 1cm del borde inferior.
(control sin ADN).
III. RESULTADOS
La enzima es agregada como último paso, ya que al
tener contacto con el DNA comienza a actuar.  Análisis del gen gapA de Klesbsiella
pneumanie en el programa NCBI
B. PCR
La figura 1 indica el locus, y el tamaño del gen gapA
Se configuró el programa mostrado en la Tabla 3 en
el tamaño en bp analizados a partir de los primers
el termociclador.
Locus NC_0168451
Tabla 1. Programa utilizado en el termociclador Tamaño 663 bp
Primer F 5´CTTCAGAAGCTCCACTCACGG 3´
Temperatur Tiemp Ciclo
Primer R 5’
a (°C) o (min) s
CTTCAGAAGCGGCTTTGATGGCTT´
Desnaturació
94 2 1
n Inicial
Figura 1: Análisis del gen gapA en NCBI-Blast
Desnaturació
94 30 seg
n
35
Annealing 60 30 seg La figura 2 indica la secuencia completa del gen
Extensión 72 1 gapA de Klebsiella pneumonie obtenida en NCBI-
Extensión Blast.
72 30 seg 1
Final
Conservación 4 - 1

Posteriormente se colocó la gradilla con los tubos

eppendorf en el termociclador.
Por último, se realizó el protocolo de limpieza de la
cámara de flujo laminar.
C. ELECTROFORESIS

Primero se preparó un gel de agarosa al 1,5% en 80

mL de buffer TBE 1X de acuerdo al protocolo del
laboratorio. Posteriormente se cargó el marcador de
peso molecular de 100bp de la siguiente manera:
3µL de buffer de carga + 7µL de marcador. Figura 2: Secuencia del gen gap A

Después se midieron 10 uL de producto de  Amplificación

amplificación de cada tubo eppendorf (M1, M2 y
Resultados obtenidos en el ensayo de amplificación
C(-)) y se cargaron a continuación del marcador de
del gen gapA (gliceraldehido-3- fosfato
peso molecular.
deshidrogenasa) de Klebsiella pneumonie.
Se corrió el gel de electroforesis durante una hora a
100 voltios y 300mA, hasta que indicador amarillo

pb
600
300
200
C(-) M1 M2 M B. PCR
Figura 3: Electroforesis de la amplificación del gen gapA de
Klebsiella pneumonie. En agarosa 1.5 % TBE.C(-): Control
Negativo, M: Marcador, M1 y M2: Muestras con el DNA
 Amplificación en el software In silico.
Figura 4: PCR in silico del gen gapA de Klebsiella
pneumoniae HS11286
IV. DISCUSIÓN
A. Preparación de reactivos y muestras
Según Genómica Médica (2015) “la primera etapa
para realizar una reacción en cadena de polimerasa
es la preparación del master mix, esta etapa es
crucial para obtener buenos resultados (2015). El
master mix con las cantidades exactas tiene la
ventaja de que el costo por cada reacción disminuye
considerablemente (Pacheco, 2014). En la Tabla 2
Biología Molecular III
podemos encontrar las cantidades exactas de los
componentes del coctel para el PCR, que fueron
usados en esta práctica de laboratorio. Y según la
Figura 3 la muestra corrida en el gel de
electroforesis de amplificación del gen gapA de
Klebsiella pneumonie presentó una banda bien
definida en el carril M1 y otra igual de definida en
el carril M2, la calidad de esta reacción está
estrechamente relacionada con la pureza y
características intrínsecas de todos los componentes
del master mix preparado.
La PCR es un ensayo enzimático simple. Dentro del
proceso de elongación de la cadena de ADN se unen
los cebadores que debe detectar a la cadena de DNA
diana para amplificarse (Garibyan, 2015).
Según Balari (2015), la concentración optima de los
primers en la mayoría de reacciones de PCR se
encuentra entre 0.2-0.5 𝜇𝑀, lo que nos garantiza la
correcta reacción de amplificación, y como se
observa en la figura 3, los resultados obtenidos tras
la electroforesis en el gel de agarosa se evidencia la
amplificación del gen gap A en la que se utilizó 0.2
𝜇𝑀, a esto se suma lo descrito por (Louis, 2017)
sobre la importancia de un buen diseño de primers,
en figura 1 y 2 el análisis del gen se pudo realizar a
partir de los primers previamente diseñados y
colocados dentro del master mix, dando como
información el locus, el tamaño, la secuencia del gen
que se va amplificar (Klesbsiella pneumanie)
comprobando la defectibilidad de los primers
utilizados.
C. ELECTROFORESIS
Para observar los amplicones generados tras el
procedimiento de PCR se utilizó electroforesis en
gel de agarosa 1.5% con la tinción del bromuro de
etidio, observando en la figura 3 dos bandas cuyos
tamaños del fragmento amplificado en teoría deben
ser idénticos a los predichos a partir de la secuencia
de nucleótidos obtenida con el programa NCBI,
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cabe destacar que en el control negativo no presento

banda alguna y según lo descrito por Garibyan
(2015) los cebadores en la reacción especifican el  Balari, K. (2015). A fast and reliable method
producto de ADN exacto que se enriquecerá, al for monitoring of prophage-activating
tener una secuencia complementaria al ADN diana chemicals. Obtenido de
que debe detectarse y amplificarse es por esta razón https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/293
27434
que el control negativo al no tener en su reacción
templado de DNA los primers no pueden unirse y  BioCision. (2017). Obtenido de
obviamente la enzima Taq – polimerasa no actúa http://www.biocision.com/campaigns/pcr-
uniendo los dNTP’s y por eso no hay amplificación. preparation-espanol
La amplificación PCR en el programa In silico y  Castillo, F. (2005). Biotecnologia
NCBI de la muestra del gen y gapA de Klebsiella Ambiental. Madrid: Tebar. Obtenido de
pneumoniae HS11286 (5333942 bp) produce un https://books.google.com.ec/books?id=19ff
fragmento de longitud de 663bp y se encuentra en la PAm3E3kC&pg=PA332&dq=hindiii+enzi
posición 2132725bp. Mientras que, en nuestro gel ma+tipo&hl=es&sa=X&ved=0ahUKEwiD
de electroforesis se observó una banda bien definida hOv-
de 600bp tanto en el carril M1 y en el carril M2 oNbYAhVGPN8KHSS8ApsQ6AEIJTAA#
(Duplicado). Ver Figura 3. Las bandas obtenidas v=onepage&q&f=true
durante la práctica se encuentran dentro del rango
teórico, lo que nos quiere decir que la extracción de  Fernández, J., & Ulloa, S. (2017).
DNA, la preparación del master mix, el PCR y la RECOMENDACIONES PARA
electroforesis fueron realizadas correctamente LABORATORIOS QUE REALIZAN LA
TÉCNICA DE REACCIÓN EN CADENA
D. CONCLUSIONES DE LA POLIMERASA (PCR). Chile:
 El coctel de PCR es una de las etapas Instituto de Salud Pública.
principales, para la obtención de buenos
amplicones en la corrida electroforética. En  Genómica Médica. (2015). Protocolos de
el ensayo la preparación del master mix, el preparación de muestras. Obtenido de
PCR y la electroforesis fueron realizadas http://www.genomicamedica.com/secuenci
correctamente, dando la presencia de acion/assets/protocolos-vfinal.pdf
amplicones.
 Herráez, A. (2011). biomodel. Universidad
de Alcalá, España.
 Se logró la amplificación del gen gapA
aislado de Klebsiella pneumaniae en gel de  Howard Hugues, F. (2015). Amplificación
agarosa al 1,5 % TBE, obteniendo un por la PCR. The Virtual Bacterial ID
fragmento de 600 pb. Laboratory.
 Kameyama, L., Oviedo, N., & Guarneros, G.
 El programa NCBI-Blast y In sílico PCR
(2012). Bacteriófago Lambda. Obtenido de
reportaron un amplicón de 665 pb en el locus
Departamento de Genética y Biología
pb2132725bp, concordante al obtenido en la
Molecular, CINVESTAV-Instituto
PCR el cual fue de 600 pb.
Politécnico Nacional:
E. BIBLIOGRAFÍA

http://www.biblioweb.tic.unam.mx/libros/m
icrobios/Cap18/
 Segal, C. (2005). Biologia Molecular de la
Celula I. Mexico: UNAM. Obtenido de
https://books.google.com.ec/books?id=-
i_7RXUu44IC&pg=PT92&dq=enzimas+de
+restriccion+introduccion&hl=es&sa=X&v
Biología Molecular III
ed=0ahUKEwi02KrBn9bYAhWFmeAKHc
tkAIgQ6AEILTAB#v=onepage&q&f=true
 UNIPROT. (2013). Glyceraldehyde-3-
phosphate dehydrogenase. Obtenido de
http://www.uniprot.org/uniprot/P24164
Biología Molecular III
Biología Molecular III
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