MICROBIOLOGIA AMBIENTAL
PRESENTADO POR:
PRESENTADO A:
IBAGUE TOLIMA
NOVIEMBRE DE 2017
INFORME LABORATORIO - COMPONENTE
PRÁCTICO
INTRODUCCIÓN
En el presente laboratorio se darán a conocer los procedimientos y técnicas propias para el análisis
microbiológico de bacterias y hongos, teniendo como objetivo reforzar nuestro conocimiento teórico y
adquirir nuevos conocimientos mediante la práctica, realizando técnicas de recuento microbiano,
manejo de muestras con disoluciones y observación de diferentes clases de bacterias y hongos.
La Microbiología es la ciencia que se dedica al estudio de los microorganismos, estos forman un grupo
muy extenso y diverso de organismos cuyo tamaño. La unidad de medida es el µm micra o micrón. La
microbiología, como ciencia básica, investiga: Procesos vitales de los microorganismos, generación
de energía, crecimiento, reproducción, la diversidad microbiana, la taxonomía microbiana, la evolución
microbiana como ciencia aplicada, se relaciona con otras ciencias, agricultura, medicina, industria
alimentaria, biotecnología, ecología, etc. Para estudiar la intervención de los microorganismos en los
procesos de estas ciencias. Los microorganismos se encuentran ampliamente distribuidos en la
naturaleza en donde pueden crecer y reproducirse: suelo, agua, animales, plantas y seres humanos.
Muchos microorganismos pueden transportarse a través del aire aunque en este medio no se
reproducen, el picaporte de una puerta, las manos, incluso los apuntes están cubiertos de
microorganismos y pueden producir infecciones, si bien solo unos pocos microorganismos son
capaces de producir enfermedades, algunas de estas son tan graves que justifican la preocupación y
la necesidad de tener medidas preventivas para evitar infecciones.
Técnicas Básicas en el laboratorio de microbiología Para estudiar los microorganismos, debemos
conseguir su crecimiento en cultivo puro, en el laboratorio debemos proporcionarle nutrientes, a través
de los medios de cultivos, y las condiciones ambientales para que se puedan desarrollar.
Debemos evitar que microorganismos del ambiente se introduzcan en nuestros cultivos y los
contaminen por ello, en microbiología se trabaja con elementos estériles y en condiciones de
esterilización, la eliminación de todos los microorganismos presentes en una sustancia u objeto es un
prerrequisito para poder estudiar, conservar y transportar cultivos de microbianos puros. El laboratorio
de microbiología se ocupa de los ensayos de esterilidad, detección, aislamiento, recuento e
identificación de microorganismos bacterias, levaduras y hongos filamentosos y pruebas de
endotoxinas bacterianas en diferentes materiales ejemplo, materias primas, agua, productos,
superficies, vestimentas y el medio ambiente, valoraciones usando microorganismos como parte del
sistema de pruebas.
OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL
Identificar diferentes especies de microorganismos como hongos y bacterias mediante toma de
muestras en laboratorio de agua de charco y evaluación microbiológica en alimentos.
Realizando procedimientos de siembra, coloración, tinción e identificación macroscópica y
microscópica de estos.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Identificar diferentes especies de microorganismos mediante métodos de siembra microbiana.
Realizar métodos de tinción mediante coloración simple y compuesta.
Clasificación de hongos mediante la observación microscópica.
Identificar medios de cultivo diferencial y selectivo.
Controlar el crecimiento bacteriano de Gram- positivo y Gram -negativos.
Identificar mediante el método microscópico cianobacterias.
Identificar unidades formadoras de colonias.
Establecer normas y principios básicos de comportamiento en el laboratorio.
MARCO TEORICO
BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO
Los laboratorios de microbiología están regidos por normas de seguridad e higiene que deben
cumplirse a cabalidad para garantizar la protección contra infecciones de los estudiantes u otro
personal que labora en estas instalaciones, así como garantizar la calidad de las técnicas y la
confiabilidad de los resultados.
METODOS DE SIEMBRA
Siembra en Estría Compuesta: Con éste procedimiento se puede conseguir una buena separación de
las colonias y aislarlas fácilmente. Pará ello Se flamea el asa redonda, se toma la muestra del material
a estudiar (agua residual), se coge parte de la muestra para colocarla en el tubo de ensayo que
contiene el agua peptonada Homogenizar, luego se Colca el inoculo en uno de los extremos de la caja
de Petri con el medio de cultivo indicado. Extienda el cultivo haciendo 4 estrías paralelas, sin romper
el agar y Terminado la siembra, marcar las cajas en el borde de la base de la caja y envolverla en
papel vinipel para llevarlas a incubar a 37 °C
TÉCNICAS DE TINCIÓN
Las tinciones en microbiología son las primeras herramientas que se utilizan en el laboratorio para el
diagnóstico de las enfermedades infecciosas. Desde hace más de un siglo han ayudado a resolver
problemas de etiología microbiana. Hay una gran variedad de tinciones, que se han ido desarrollando
para la detección de los diferentes agentes infecciosos –en los que se incluyen bacterias, parásitos y
hongos–. La tinción de Gram se considera básica en la valoración inicial de muestras para análisis
bacteriológico, mientras que la tinción de Wright se ocupa para el diagnóstico de enfermedades muy
particulares en el rubro de la parasitología. Hay técnicas tintoriales específicas de gran utilidad, como
la tinción de Ziehl-Neelsen, que se utiliza para el diagnóstico de enfermedades crónicas como la
tuberculosis o la actinomicosis, o la tinción de azul de lactofenol, que preserva e identifica a los
componentes estructurales de los hongos. Las diferentes tinciones en el laboratorio microbiológico
tienen una utilidad fundamental para el diagnóstico y tratamiento oportuno de múltiples patologías de
etiología infecciosa.
Tinción simple: Un solo colorante. Se basan en el hecho de que las células tienen una composición
química diferente a la de su entorno, de modo que ambos se comportan de forma diferente frente a un
colorante.
Tinción de Gram: Fue desarrollada empíricamente por Christian Gram en 1884, a pesar del tiempo
transcurrido la tinción apenas se ha modificado y es unos de los primeros pasos que se realiza para
cualquier identificación bacteriana. Ayuda a determinar rápidamente las características morfológicas,
por lo que es útil en la indicación de los antibióticos. Esta tinción también permite establecer si el
material enviado al laboratorio para su cultivo posee la calidad adecuada.
Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir una serie
de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presión de oxígeno adecuado, así como
un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y factores
de crecimiento necesarios y debe estar exento de todo microorganismo contaminante.
La mayoría de las bacterias patógenas requieren nutrientes complejos similares en composición a los
líquidos orgánicos del cuerpo humano. Por eso, la base de muchos medios de cultivo es una infusión
de extractos de carne y Peptona a la que se añadirán otros ingredientes.
El agar es un elemento solidificante muy empleado para la preparación de medios de cultivo. Se licúa
completamente a la temperatura del agua hirviendo y se solidifica al enfriarse a 40 grados. Con
mínimas excepciones no tiene efecto sobre el crecimiento de las bacterias y no es atacado por aquellas
que crecen en él.
La Gelatina es otro agente solidificante pero se emplea mucho menos ya que bastantes bacterias
provocan su licuación.
También se añaden colorantes que actúan como indicadores para detectar, por ejemplo, la formación
de ácido o como inhibidores del crecimiento de unas bacterias y no de otras (el Rojo Fenol se usa
como indicador ya que es rojo en pH básico y amarillo en pH ácido. La Violeta de Genciana se usa
como inhibidor ya que impide el crecimiento de la mayoria de las bacterias Gram-positivas).
De acuerdo a su consistencia, los medios de cultivo pueden clasificarse en:
Líquidos: Se utilizan para el crecimiento de cultivos puros en lote. Se denominan caldos de cultivo
y no tienen agar en su formulación.
Semisólidos: Contienen 0.5% de agar en su formulación. Se utilizan para estudiar la movilidad de
las bacterias (presencia o ausencia de flagelo).
Sólidos: Contienen de 1.5 a 2% de agar en su formulación. Estos medios inmovilizan a las células,
permitiéndoles crecer y formar masas aisladas visibles llamadas colonias. Las colonias permiten al
microbiólogo reconocer la pureza del cultivo; las placas que contengan más de un tipo de colonia
no provienen de un cultivo puro. Las placas de agar también se utilizan para la determinación de
células viables (recuento en placas).
Definidos: es aquél medio de cultivo del cual se conoce su composición exacta. Son muy
utilizados en estudios fisiológicos. Los medios mínimos son medios definidos que únicamente
le proporcionan al microorganismo los nutrientes necesarios para crecer, pe ro no para
desarrollarse óptimamente.
Complejos: es aquél del cual no se conoce la composición exacta del medio. A menudo, los
medios complejos emplean sangre, leche, extracto de levaduras, extracto de carne u otras
sustancias muy nutritivas pero de las cuales se desconoce la composición química exacta.
Estos medios son muy utilizados para cultivar bacterias desconocidas o bacterias de
requerimientos nutricionales muy complejos.
Medios Selectivos: Son aquéllos que poseen uno o más componentes añadidos, los cuales
inhibirán o prevendrán el crecimiento de ciertos tipos de especies de bacterias y/o promoverán
el crecimiento de las especies deseadas. Uno puede ajustar las condiciones físicas de un medio
de cultivo tales como el pH, la temperatura, para hacerlo selectivo para los organismos de
interés.
Medios Diferenciales: Permiten al investigador distinguir entre diferentes tipos de bacterias con
base en alguna característica observable en su patrón de crecimiento en el medio, ya sea por
producción de algún pigmento o por cambios de color en el medio debido a indicadores de pH,
o por halos de degradación de algún componente en el medio de cultivo.
Medios de Enriquecimiento: Contienen algún componente que permite el crecimiento de cierto
tipo específico de bacteria, pero no contienen sustancias inhibidoras.
Medios Enriquecidos: Se emplean para cultivar microorganismos que requieren un gran número
de factores de crecimiento. Generalmente contienen extractos biológicos poco usuales como
sangre, suero en polvo, extracto de cerebro de res, yema de huevo, etc. El procedimiento se
hace mediante una siembra de la muestra en caja de Petri por medio del método ecométrico y
determinar el índice de crecimiento absoluto (ICA).
CONTROL DEL CRECIMIENTO BACTERIANO
Los factores físicos y químicos tienen un efecto notable sobre la vida de los microorganismos en su
medio ambiente natural. Algunos estimulan su desarrollo en tanto que otros lo retardan o lo impiden.
El conocimiento del efecto de esos parámetros medio ambientales no solo permitió estudiar los
microorganismos bajo condiciones controladas de laboratorio para favorecer su crecimiento sino que
posibilitó aprender la forma de controlarlos.
El crecimiento bacteriano es la división de una bacteria en dos células hijas en un proceso llamado
fisión binaria. Previniendo que no se produzca ningún caso de mutación las células hijas resultantes
serán genéticamente idénticas a la célula original. De este modo tiene lugar la "duplicación local" de
la población bacteriana. Las dos células hijas creadas tras la división no sobreviven necesariamente.
Sin embargo, si el número de supervivientes supera la unidad, en promedio, la población bacteriana
experimenta un crecimiento exponencial. La medición de una curva del crecimiento exponencial de las
bacterias en un cultivo ha sido tradicionalmente una parte de la formación de todos los microbiólogos.
Los procesos fundamentales empleados para ello son la enumeración bacteriana (conteo bacteriano)
por métodos directos e individuales (microscopía, citometría de flujo1), por métodos directos y masivos
(biomasa), por métodos indirectos e individuales (conteo de colonias), o por métodos indirectos y en
bloque (número más probable, turbidez, absorción de nutrientes). Los modelos permiten conciliar la
teoría con las mediciones.
OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA DE CIANOBACTERIAS
Cyanobacteria: Es el nombre de un filo del reino Bacteria (único del dominio del mismo nombre) que
comprende a las cianobacterias y, en algún sentido, a sus descendientes por endosimbiosis, los
plastos. Las cianobacterias se caracterizan por ser los únicos procariotas que llevan a cabo fotosíntesis
oxigénica, por ello también se les denomina oxyphotobacteria. El procedimiento se hace Colocando
en el centro de la lámina portaobjeto una gota del agua que trajo como muestra y colocar luego una
laminilla encima de esta preparación y esperar 2 minutos. Finalizado este tiempo montar al microscopio
y observar en 10X, 40X y 100X con el fin de ver las características de la bacteria mejor.
PRUEBAS DE ANTAGONISMO
La composición del micro flora y del micro fauna de un ecosistema está regulada por las interacciones
de los microorganismos de una comunidad entre sí y de los mismos con el medio no biótico de lo cual
surge un equilibrio dinámico. Si dos o más especies que coexisten en un lugar no se afectan
mutuamente la relación es neutralismo. Cuando algo de esto se modifica, las especies comienzan a
interactuar y las relaciones que se presentan pueden ser: comensalismo, protocooperación, simbiosis,
amensalismo, predación, parasitismo. La evaluación de estas relaciones in vitro permiten aislar y
seleccionar microorganismos con capacidad de Biocontroladores. En las pruebas de antagonismo se
trabaja con la técnica por enfriamiento, el Método de Igarashi y técnica de estrías.
En la técnica por enfriamiento se toma la caja de Petri con el medio de cultivo nutritivo y se divide en
la parte trasera por la mitad con un marcador de vidrio y se señala la mitad de cada una de las mitades
previamente divididas. Se marca cual microorganismo va a inocular en cada lado y finalmente por
punción sembrar los microorganismos. Incubar a 37ºC si uso bacterias o a 25ºC si uso hongos.
En método de Igarashi Se toma una caja de Petri y se divide en 4/4 y sembrar por siembra masiva con
un asa redonda, en un espacio de tres (3) centímetros un microorganismo seleccionado y finalmente
siembre en el centro por punción.
La técnica por estrías su proceso se hace en caja de Petri en la cual previamente usted sembró con
una estría en el centro una bacteria, sembrar a 0.5 cm, por medio de estrías, cuatro bacterias a evaluar.
En el revés de la caja con marcador de vidrio señale que microorganismos sembró. Incubar a 37ºC.
DIAGRAMA DE FLUJOS
METODOLOGÍA
INSTRUMENTOS
Asa redonda
Cajas de Petri
Mechero
Incubadora
Vinipel
Marcador de vidrio
Portaobjetos
Cubreobjetos
Tubos de ensayo
Asa redonda o curva
Asa recta
Pipetas estériles de 1 y 2 ml
Estufa
Vaso de Precipitado de 500 ml
Contador de colonias
Microscopio
REACTIVOS
B. Observación de levaduras.
Disuelva 2.5 g de azúcar de mesa y
aproximadamente 5 g de levadura de pan en 20
mL de agua destilada.
Incube la disolución anterior a 37 °C por 15 min.
4X
10X
40x
100x
4X
10X
40x
No se puso observar en el 4 objetivo
100x
• Los hongos acuáticos son los únicos miembros del reino fungí que en alguna parte de su ciclo de
vida producen células móviles llamadas flagelos, las cuales les ayudan a desplazarse por el medio
acuático
• Por medio de esta práctica se logró utilizar las técnicas aprendidas durante el transcurso del proceso
en el laboratorio. Se logró aprender a realizar algunos de los métodos que existen para cultivar
bacterias y de esta manera observar sus características tanto macroscópicas como microscópicas e
interpretación de las mismas, con lo que se observó que para cada bacteria existen características
diferentes que son las que las identifican y diferencian de otras bacterias, por lo que de esta manera
se le puede llegar a identificar con su correcta siembra y observación para análisis posteriores o
simplemente para la identificación de una bacteria en algún medio u organismo.
BIBLIOGRAFÍA
CIBEM. (S.F). Normas de la American Psychological Association (APA) para la confección
de referencias bibliográficas. [Documento PDF]. Recuperado de:
http://www.cibem.org/~josepr23/2017/CIBEM2017_OK/index.php/es/
Microinmuno. (S.F). Los medios de cultivo en microbiología. [Sitio Web]. Recuperado de:
http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/SeminarioMedios.htm
UNAD. (S.F). Guía para el desarrollo del componente práctico. [Documento PDF].
Recuperado de: https://es.scribd.com/document/227411935/Informe-Practica-
Microbiologia-Ambiental-Bucaramanga