ENGENHARIA DE TECIDOS NO DESENVOLVIMENTO

DE VÁLVULAS CARDÍACAS

I,II I,II I,II I,II

Joana Oliveira , Marcio Maciel , Rita Ramos , Tiago Pereira
I
Instituto Superior de Engenharia de Lisboa
II
Escola Superior de Tecnologia da Saude de Lisboa
INTRODUÇÃO

O coração é a bomba propulsora do sistema circulatório, que permite que o sangue circule pelo corpo. Existem várias doenças associadas a este, sendo a doença das válvulas cardíacas umas das principais causas de doenças
cardiovasculares, resultando em mais de 25.000 mortes anualmente nos Estados Unidos. Nesse sentido, a engenharia de tecidos surgiu como uma estratégia de tratamento, implementando uma prótese valvular que vem substituir a região com
a lesão, aumentando posteriormente a área envolvente com o crescimento do tecido endógeno. Os recentes avanços em micro e nanotecnologias, incluindo a micro-fabricação, a preparação de próteses baseados em micofibras, em hidrogéis
3D encapsulados em células, bem como os métodos para desenvolvimento de tecido biológico intensificaram a potencialidade das construções de tecido de válvulas cardíacas viáveis, funcionais e implantáveis.
De seguida, serão apresentadas duas pesquisas com diferentes visões na conceção de tecido de válvulas cardíacas. As abordagens apresentadas são diferentes, mas visam a melhoria da eficiência e durabilidade das próteses de válvulas já
desenvolvidas. No artigo desenvolvido por Antonio D'Amore, Samuel K. Luketich , et al., publicado a Janeiro de 2018, demonstra a eficiência da técnica de double component fiber deposition (DCD) no controlo da morfologia, da mecânica e da
microestrutura em macroescula, ao mesmo tempo que produz as válvulas cardíacas compostas por fibras microscópicas.
No artigo desenvolvido por Jolanda Kluin, Hanna Talacua, et al., publicado em Outubro de 2016, pretende apresentar as estratégias atuais que recorrem de células de cultura in vitro ou descelularizadas oriundas de dadores humanos ou
animais. O artigo propõe e demonstra uma técnica, do qual um implante de válvula elastomérica é preenchido com células endógenas, para formar novo tecido valvular. Após a realização de testes em animais, num período de 12 meses,
verificou-se que o implante foi gradualmente substituído por um colagénio em camadas e a matriz elástica sofreu uma reabsorção conduzida por células.

“Heart valve scaffold fabrication: Bioinspired control of macro-scale morphology, mechanics and “In situ heart valve tissue engineering using a bioresorbable elastomeric implant - From
micro-structure” material design to 12 months follow-up in sheep”
Antonio D'Amore, Samuel K. Luketich, Giuseppe M. Raffa, Salim Olia, Giorgio Menallo, Antonino Mazzola, Flavio D'Accardi, Tamir Grunberg, Xinzhu Gu, Michele Pilato, Jolanda Kluin, Hanna Talacua, Anthal I.P.M. Smits, Maximilian Y. Emmert, Marieke C.P. Brugmans, Emanuela S. Fioretta, Petra E. Dijkman, Serge H.M. S€ontjens, Renee
Marina V. Kameneva, Vinay Badhwar, William R. Wagner. Duijvelshoff, Sylvia Dekker, Marloes W.J.T. Janssen-van den Broek, Valentina Lintas, Aryan Vink, Simon P. Hoerstrup, Henk M. Janssen, Patricia Y.W. Dankers, Frank P.T.
Journal of Biomaterials, Volume 150, Páginas 25-37. Janeiro 2018. Baaijens, Carlijn V.C. Bouten.

Journal of Biomaterials, Volume 125, Páginas 101-117. Maio 2017

Neste artigo utiliza-se uma técnica de eletrodeposição (DCD) que emprega elétrodos multifásicos compostos eletricamente por Elastômero bioabsorvível, à base de policarbonato modificado com bis-ureia (PC-BU). Para a eletrofiação, o polímero
materiais condutores e isolantes para orientar seletivamente a deposição de fibras na anatomia geométrica das válvulas
desenvolvidas para controlar a sua macro e microestrutura e consequentemente a função resultante. Assim, a técnica de deposição Metodologia PC-BU foi dissolvido em solventes e agitado durante a noite. A solução de polímero foi entregue a um fluxo constante
para um capilar de metal ligado a uma fonte de energia de alta tensão. Um mandril rotativo aterrado foi usado como
de componentes duplos (DCD) é composta por dois componentes, o primeiro é feito de liga metálica eletricamente condutora coletor. Quando o jato de polímero acelerou em direção ao coletor, o solvente evapororou e uma fibra de polímero
agindo como um polímero de superfície de coleta, enquanto o segundo componente feito de materiais com menor condutividade reduz a deposição das fibras nas Nível molecular carregada foi depositada no alvo rotativo na forma de uma malha não tecida (Fig. 10C).
regiões, que de outra forma receberia acumulação excessiva de massa durante o processo de fabricação. Para a caraterização da válvula realizada por esta técnica Fabricação das
teve-se que ter em conta vários parâmetros de análise, entre eles: a espessura do folheto, as propriedades biaxiais e de rigidez, imagem de “multi-photon” e válvulas
análise estrutural quantitativa de microscopia eletrônica, ex vivo quasi-estático teste de coaptação da válvula e avaliação da dinâmica da válvula num aparelho Escala macroscópica Anel de poliéter-éter-cetona (PEEK) para estabilizar a geometria da válvula. Esta coroa consistiu de um anel com três
duplicador de pulso de pressão. É de salientar que para avaliação deste método foi utilizado tecido descelularizado de suíno. postes, diâmetro externo de 20 mm (Fig. 10D, 10E, 10F). As válvulas foram esterilizadas por esterilização por óxido de
etileno. E ainda, antes da implantação, as válvulas foram revestidas com fibrina.

Fig. 1 - Para avaliar a capacidade do A citotoxicidade foi determinada usando um Ensaio de citotoxicidade MTT, onde esta referência é definida em 100% de viabilidade celular. Já as propriedades
DCD para reproduzir folhetos dos
quatro tipos de válvulas (mitral, mecânicas do PC-BU foram determinadas pela realização de ensaios de estresse-deformação da tração uniaxial em amostras sólidas de osso de cão. Os valores relat-
tricúspide, aórtica e pulmonar) foi ados representam a média ± desvio padrão (n = 3).
necessário caraterizar a relação
entre a espessura do folheto e o Para a avaliação da funcionalidade hidrodinâmica, a válvula foi colocada dentro de um anel de silício de 21 mm diâmetro e posicionado em um sistema de teste
tempo de processamento.
Fig. 5 - Finalmente para avaliar pulsátil hidrodinâmico contendo uma solução salina fisiológica. A válvula foi submetida as condições de fisiologia pulmonar por 1 h, e os resultados foram gravados
a função da válvula sob
condições de fluxo fisiológico, em vídeos para comprovação da resistência e durabilidade.
a dinâmica da válvula
projetada foram testados in
A funcionalidade in vivo das válvulas propostas foi estudada, em ovelhas, em
vitro e comparada com uma três fases: 02 meses, com 01 animal; 06 meses com 05 animais; e 12 meses,
válvula comercial protésica de com 04 animais. Foram monitorados a função da válvula, recrutamento celular
última geração
in situ, formação de neo-tecido, reabsorção da matrix e propriedades
mecânicas. Todos os animais, durante a cirurgia, foram sedados, e tiveram seus
ECG, pressão arterial, capnografia e temperatura, monitotorados.
Fig. 2 - Fabricação de válvulas com três
velocidades tangenciais diferentes do mandril e
três velocidades de varredura diferentes e era
avaliar rigidez dos folhetos através de um
protocolo experimental e um aparelho de 3 Fig. 10 - Constituição da válvula. (A) Sintetização electrofiada do PC-BU com a infiltração e formação do tecido. (B)
pontos. Estrutura molecular do PC-BU. (C) Imagem microscópica das fibras da estrutura da válvula (escala 50µm). (D-F) Tudo
de PC-BU e coroa estrutural. (G) Testes in vitro no funcionamento da válvula demonstrando bom fechamento e
abertura conforme ISO 5840.

Resultados *2 GAG - glicosaminoglicanos

*1 estreitamento anormal de um vaso sanguíneo, outro órgão ou estrutura tubular do corpo.

2 meses 6 meses 12 meses

A B C  As válvulas apresentam boa funcionalidade sem ocorrência de estenose*1 ,

com exceção de uma amostra aos 12 meses ( Fig. 13 - #12.4 )
 Nenhum dos animais apresentou quaisquer sinais clínicos de falência da
Fig. 4 - Estas válvulas foram avaliadas em ex-vivo em suínos de Fig. 3 - Foi utilizado a imagem de multi-foton
forma a ser possível fazer uma avaliação da sua capacidade em Figura 11- válvulas pulmonares em ovinos com 2 meses ( A ) ,6 meses ( B ) e 12 meses ( C ) de implementação válvula ( ex: sopros ou ascite ) durante o período de Follow– up.
para estudar a micro-arquitetura da válvula
reter as suturas e suportar valores fisiologicamente relevantes triscupide nativa de porcino com a válvula
de pressão atrioventricular.
6 meses 12 meses
tricúspide desenvolvida
 As válvulas foram extensivamente colonizadas por células hospedeiras. O neo-
teido endógeno foi formado de forma progressiva ao longo dos meses,
substituindo a estrutura sintética inicial.

Fig. 7 - Parâmetros alterados foram: velocidade
tangencial do mandril (u (raio)), que determina o
alinhamento das fibras e, como consequência,
anisotropia mecânica) e velocidade de varredura (R, que
determina interseções de fibra por área e o módulo de
flexão).
Para demonstrar o controle sobre o projeto da válvula na
mecânica plana e fora do plano, o projeto do mandril foi
Fig. 6 - A necessidade de criação de dispositivos menores necessários testado em 9 configurações diferentes cobrindo a faixa
para indicações aórticas e pulmonares, exigirão maior velocidade de operacional de interesse para a aplicação da válvula
rotação. Em conjunto com a concavidade do mandril, entre em
conflito com a necessidade de deposição de fibra precisa e
controlável.
Figura 12 – Desenvolvimento das válvulas pulmonares em ovinos aos 6 meses e 12 meses
AMOSTRAS - 6 MESES
 No entanto, a degradação da estrutura não foi total ainda dentro dos 12 meses
de acompanhamento
 Macroscopicamente, todas as válvulas explantadas mostraram folhetos
maleáveis e ausência sinais de calcificação patológica, nem complicações
AMOSTRAS - 12 MESES
tromboembólica.
 Em uma das amostras de 6 meses e duas das amostras de 12 meses, uma
pequena irregularidade foi observada nas extremidades de cada folheto, no
entanto, estas não afetavam a funcionalidade da válvula.
Notar que esta válvula em particular já apresentava uma delineação menor dos folhetos poliméricos

Figura 13 – irregularidades dos folhetos das válvulas amostrais aos 6 meses e 12 meses ( assinaladas por setas a
Fig. 8 - O controlo da anisotropia é determinado pela capacidade de
6 meses
controlar a microestrutura e induzir o alinhamento das fibras.
Espessura
(depende da velocidade tangencial do mandril, que é uma função Corante CD31
(mm)
linear do raio da válvula )

12 meses Peso
2
*
Molecular
Fig. 9 - O módulo de flexão dos folhetos das válvulas foi calculado para (Kg/mol)
Tabela A - comparação dos resultados de largura, espessura e peso molecular das válvulas criadas ( 6 meses e 12 meses ) e as válvulas nativa
diferentes valores das velocidades tangenciais do mandril e velocidades de Figura 14 - evolução da endotilização ao longo dos 12 meses e as diferenças de concentração de DNA , GAG , HYP e Elastina entre a válvula criada e uma nativa

varredura (dita a rigidez de flexão). Limitação: A não linearidade da velocidade A endotelização progressiva foi evidente a partir da coloração de CD31 e análise SEM. Na tabela A, a estrutura polimérica remanescente apresentou uma modesta
de varredura vs relação do módulo de elasticidade em velocidades baixas,
Remoção de tecido com hipoclorito de sódio revela sinais claros de reabsorção do polímero diminuição do peso molecular, mas uma mudança clara no distribuição de
colocam em causa o controlo sobra a rigidez de flexão.
estrutural, ilustrado por fibras clivadas, bem como erosão na superfície. peso (dispersão D), indicando que os demais material foi reabsorvido.

CONCLUSÃO E DISCUSSÃO
Com a interpretação dos resultados dos dois artigos é possível constatar que apesar de ambos possuírem o mesmo objetivo e terem metodologias semelhantes, acabaram por ter abordagens diferentes. No primeiro artigo foi descrito a
experiência de criação de válvulas suínas através do método de DCD e posteriormente analisadas consoante vários parâmetros. Foi possível concluir que apesar do método de DCD ser bastante eficiente na modulagem dos recursos de controlo
mecânico conseguindo também controlar a microestrutura dos folhetos e deposição de microfibras em escala macro, ainda existem critérios que deverão ser mais explorados, entre eles a variabilidade da espessura dos folhetos, o controlo da
rigidez permanecer limitado, a utilização de testes de 3 pontos para a avaliação do modulo de elasticidade das válvulas que pode acarretar erros e finalmente ser explorado e aperfeiçoado uma 2º geração do madril utilizado. Já no segundo
artigo, foi desenvolvido um enxerto de polímero bioreabsorvível numa válvula pulmonar e testada in vivo em ovelhas avaliado a sua progressão e efeito. Desta forma conclui-se que a função da válvula a longo prazo é bastante satisfatória,
uma vez que a remodelação do enxerto resultou em tecido valvular com uma maturidade e estabilidade nunca antes obtida, assemelhando-se até à organização e comportamento de uma válvula nativa. Contudo o uso do anel de suporte
continua a não ser ideal e ainda só foi possível fazer estudos in vivo em válvulas pulmonares.
Portanto, embora os dois artigos tenham tido resultados positivos ainda é possível encontrar problemas para solucionar. Enquanto no primeiro artigo fez-se uma elaboração dos quatro tipos de válvulas e, posteriormente, uma avaliação ex
vivo da válvula tricúspide, para determinar o seu comportamento, no segundo artigo fez-se uma avaliação in vivo, mas apenas da válvula pulmonar, referindo somente a possibilidade futura de implementação do método em condições
aórticas. Contudo, em comparação com outras abordagens de Engenharia de tecido in situ de válvula, o segundo artigo utiliza uma tecnologia não requer nenhum tecido ou célula do doador, é bastante competitivo em termos de custos,
logística e regulação. Mais importante, oferece um controlo único e personalizado das propriedades mecânicas, de degradação e bioativas do material.

REFERÊNCIAS
D’AMORE, Antonio et alii. Heart valve scaffold fabrication: Bioinspired control of macro-scale morphology, mechanics and micro-structure. Journal of Biomaterials, v. 150, pgs. 25-37. Janeiro 2018. Disponível em <https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2017.10.011 >
HASAN, Anwarul et alii. Micro and nanotechnologies in heart valve tissue engineering. Journal of Biomaterials, v. 103, pgs. 278-292. Outubro 2016. Disponível em <https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2016.07.001 >
KLUIN, Jolanda et alii. In situ heart valve engineering using a bioresorbable elastomeric implant—From material design to 12 months follow-up in sheep. Journal of Biomaterials, v. 125, pgs. 101-117. Maio 2017. Disponível em <https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2017.02.007 >
XUE, Yingfei et alii. Biodegradable and biomimetic elastomeric scaffolds for tissue-engineered heart valves. Journal of Acta Biomaterialia, v. 48, pgs. 2-19. Janeiro 2017. Disponível em <https://doi.org/10.1016/j.actbio.2016.10.032 >