Análisis y comparación de

métodos de purificación de
proteínas.

Alumna: María Paz Castillo Cáceres

Carrera: Bioquímica

Asignatura: Bioquímica I

Fecha entrega: martes 24 de abril, 2018

Introducción:

La purificación de proteínas son una serie de procesos que permiten la aislación de un solo tipo de
proteína desde una mezcla compleja. La importancia de este proceso radica en que es vital para la
caracterización de la función de la macromolécula, estudiar su estructura en interacciones, como por
ejemplo estructuras enzimáticas, u otros. Para la purificación, se aprovechan diversas características de
las proteínas, que permiten separarlas y que son propias de la proteína de interés. Algunas de ellas son:

 Carga
 Tamaño o peso molecular de la proteína
 Solubilidad
 Punto isoeléctrico
 Hidrofobicidad
 Estabilidad relativa, etc.

Los métodos de purificación están basados en las propiedades anteriores, y son diversos. Hay varios
pasos en las técnicas de purificación, y que abarcan procesos como extraer la proteína desde la matriz
biológica en la que se encuentra, hasta separar la proteína de interés de todas las demás.

Cabe mencionar, que en la purificación de proteínas es necesario la consideración de algunos

parámetros, tales como la pureza, que es la que debe ir aumentando conforme se avanza en las etapas
de purificación, el nivel de actividad enzimática, que no debe perderse a medida que se realiza el
procedimiento, y los costos asociados a todas estas etapas, los que deben minimizarse, aumentando de
todas formas la eficacia del proceso diseñado para la purificación.
Metodología

Se realiza una simulación de un protocolo de purificación mediante el software “Protlab”

(http://www.agbooth.com/pp_ajax/). La metodología utilizada en primer lugar fue la comparación y
análisis de las siguientes técnicas:

 Ensayo de purificación mediante la precipitación con sulfato de amonio

 Comparación entre la Cromatografía por afinidad y filtración por gel
 Comparación entre la cromatografía de intercambio iónico con cromatografía de interacción
hidrofóbica
 Creación de un protocolo optimizado para la purificación de la muestra de interés

Para los primeros tres puntos, se procede a ensayar distintas condiciones para cada análisis y se procede
a la comparación entre ellos, y la elección de los más adecuados para purificar la proteína en cuestión.

Luego, una vez elegidas las técnicas adecuadas (tratamiento por calor y cromatografía de intercambio
iónico), se lleva a cabo la purificación en las condiciones óptimas elegidas.
Resultados

Comparación de diversas técnicas de purificación

1) Precipitación por sulfato de amonio

Saturación Proteína (%) Enzima (%) Saturación Proteína (%) Enzima (%)
(%) (%)
5 1 0 55 72,5 76,9
10 99,2 99,6 60 84,6 85,4
15 4,9 0 65 90,9 90,8
20 7 0 70 94,2 94,2
25 11,1 0 75 96,2 96,3
30 15 0 80 97,4 97,7
35 21,1 0 85 98,1 98,5
40 27,7 8 90 98,6 99,1
45 36,7 42 95 99,0 99,4
50 52 63,4 100 99,2 99,6

1) Precipitación por calor

Temperatura Tiempo (min) Enriquecimiento Enzima total (U) Rendimiento (%)

(°C)
25 30 1.0 2400 100%
50 60 2.2 2400 100%
75 90 0 0 0
2) Separación por filtración por gel

Matriz gel Enriquecim Enzima total (U) Rendimiento

iento (%)
Sephadex G-50 17,1 2275 94,8
Sephadex-100 17,3 2027 92,0
Sephacryl s-200 HR 17.5 2224 92,7
Ultrogel AcA 54 20,2 2282 95.1
Ultrogel AcA 44 19.2 2089 95,0
Ultrogel AcA 34 5.5 1980 82,5
Bio-Gel P60 18.2 2327 97,0
Bio-Gel P150 14,9 2094 87,3
Bio-Gel P300 2.2 1887 78,6

3) Cromatografía de intercambio iónico

4) Cromatografía de interacción hidrofóbica

5) Cromatografía de afinidad
 1) Identificación de proteína en análisis

 Número de proteína: 17
 Temperatura de actividad enzimática estable: hasta 50°C
 Valor de pH de actividad enzimática estable: 4-10.5
 Masa molecular (aproximada según SDS-PAGE): 14,5 KDa

2) Condiciones de trabajo definidas para cada análisis

Tratamiento por calor Cromatografía de intercambio iónico

Temperatura aplicada: 50°C Resina intercambiadora: CM-celulosa
Tiempo de aplicación: 60 min Combinación de fracciones: 80-94
Gradiente de sal: 0.0 – 0.25 mM
pH buffer: 7.5

3) Tabla 1111111: Tabla de purificación con protocolo optimizado para la proteína 17

Método Proteína Enzima (U) Rendimiento Purificación Costo

(mg) (%) (h/100U)
INICIAL 959,0 2400,0 100,0 1,0 0
Tratamiento por 426,2 2400,0 100,0 2,2 0,042
calor
Cromatografía de 13,3 2397,0 99,9 72,2 0,334
intercambio
iónico

4) Protocolo de purificación
a) PRIMER PASO: TRATAMIENTO CON CALOR

Imagen: SDS-PAGE 1D después de tratamiento con Imagen: Western Blot con anticuerpo específico para la
calor. Se aprecia aún gran “contaminación” de otras proteína 17. Se aprecia la presencia de la proteína de
proteínas en la muestra. interés.
B) SEGUNDO PASO: CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO

Imagen: Cromatograma y ensayo de actividad enzimática

(curva roja). Se aprecia que la actividad se encuentra entre
las fracciones 74-87. (éstas fracciones corresponderán al
pool de enzima purificada)

Imagen: SDS-PAGE 1D (izquierda) y Western

Blot (derecha). Se observa que, luego de la
cromatografía de intercambio iónico, se logra
separar la enzima del resto de las proteínas.
Discusión de resultados y conclusiones.

Luego de haber ensayado con las técnicas disponibles para la purificación, podemos obtener un protocolo
optimizado para el tratamiento de la muestra.

Se ha seleccionado como primer paso de purificación de la enzima, el tratamiento por calor. Se

sabe que las proteínas se desnaturan a determinada temperatura (propia de cada caso) y que la actividad
enzimática de nuestra proteína de interés es estable por algunas horas, hasta 50° C. Se aplicó la
temperatura antes mencionada, por un periodo de 60 minutos. Se eligió esta técnica como técnica inicial
ya que, como estamos en presencia de una mezcla compleja de proteínas (muchas macromoléculas que
interfieren con nuestra proteína de interés) necesitamos poder separarla de la mayor parte de estos
interferentes. Ya que se sabe que la estabilidad térmica de las proteínas es variable, cierta parte de las que
se encuentran en la muestra se desestabilizará por acción del calor (las más termolábiles), quedando así
las proteínas más termoestables, como se puede apreciar en la imagen n°------------. Luego, en la imagen
……….., corroboramos mediante la aplicación de un anticuerpo específico para nuestra proteína, que no se
vio afectada por el calor, ya que se aprecia mediante SDS-PAGE, y que se purificó en cierto grado la mezcla
inicial, ya que podemos ver en la tabla 1 tabla de purificación, que disminuye la masa de proteína inicial,
pero se mantiene el rendimiento (100%) con respecto a la enzima y las unidades de la misma no
disminuyeron. Por lo anterior, debemos aplicar otra técnica para terminar la purificación.

Se ha elegido como el siguiente paso, una cromatografía de intercambio iónico, en las condiciones
especificadas en la tabla ----- . El fundamento de la técnica es que, se pasa un analito por una reina
intercambiadora de iones (fase estacionaria, FE) y las interacciones analito-FE se dan de forma
electrostática, entre la primera y los grupos ionizados de la segunda. Entonces, de acuerdo a esto, si la
proteína posee grupos cargados negativamente, se unirá a una resina intercambiadora de aniones
(cargada positivamente) y viceversa. Se utiliza la columna CM-cellulose, y se adiciona un tampón con un
valor de pH cercano al punto isoeléctrico de la proteína (8,25), ya que a este pH la proteína se encontraría
cargada negativamente (podría intercambiarse con la resina CM-cellulose) y de esta forma, teniendo un
pH al menos una unidad bajo o sobre el punto isoeléctrico de la enzima en este caso, se logrará enlazar la
proteína a la matriz. Luego, se opta por un gradiente de sal para eluir la columna. Aquí se debe tener
especial cuidado ya que, para aplicar este punto, debemos poner atención en la fuerza iónica aplicada a la
muestra, ya que al aumentar la fuerza iónica, disminuye la afinidad de la resina por el analito, por lo que
no retendría la muestra, y esto es lo que utilizaremos para obtener nuestra enzima purificada. Agregamos
un gradiente de concentración de sales desde 0.0 a 0.25 M, y esto nos permitirá eluir la columna con
eficiencia. Podemos observar en el gel SDS-PAGE de la imagen ….. que se ha obtenido una banda
característica, libre de otras proteínas interferentes, lo que nos haría pensar que estamos en presencia de
la proteína purificada. Para afirmarlo, se aplica un anticuerpo especifico para la enzima, y podemos
observar en la imagen ….. que esta corresponde a la proteína 17, y que se ha purificado de forma exitosa.
El rendimiento para este caso fue de un 99,6%, terminando el protocolo con 2397/2400 Unidades de
enzima.

Como conclusión, es importante mencionar que se puede realizar un protocolo de purificación adecuado
para cada proteína. Es importante la consideración de diversos puntos para lograr optimizar un
procedimiento, cual es el análisis que más se adecúa a las características de cada analito, los costos y el
tiempo asociado, para poder tener protocolos eficaces y óptimos.