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FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS

UNIVERSIDAD AUTONOMA DE
CHIHUAHUA

PRACTICA No. 4 “Amplificación de ADN


Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)”

BIOLOGÍA MOLECULAR
M.C. Edward Alexander Espinoza Sánchez

Luis Andres Carrillo Quezada 291921


Brenda Guiterrez Dominguez 291810
Karen Elizabeth Fernandez Monreal 291699
Karla Zuleem Jarmillo Sotelo 282348
Ana Cristina Gonzalez Gonzalez 271832
Ivonne Ahudey Gomez Varela 288327
Resumen
Se llevó a cabo una amplificación del gen 16S de procariota por el método de
reacción en cadena de la polimerasa y posteriormente se confirmó su
presencia por medio de electroforesis.

Objetivo.
Obtener una amplificación del gen 16S de una procariota.

Objetivo específico.
Conocer la diferencias que hay en la extracción de ADN cromosomal y
plasmídico, así como saber el papel que juega cada reactivo.

Introducción

La Reacción en cadena de la polimerasa, conocida como PCR p, es una


técnica de biología molecular, cuyo objetivo es obtener un gran número de
copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un mínimo. Esta
técnica sirve para amplificar un fragmento de ADN. Tras la amplificación,
resulta mucho más fácil identificar genes particulares como es el caso de 16S,
que es un componente de la subunidad pequeña 30S de los ribosomas
procariotas.

La comparación de las secuencias de los ARNr 16S permite establecer las


relaciones filogenéticas existentes entre los organismos procariotas, se usa
ampliamente para la identificación de cepas bacterianas como mínimo a nivel
de género, y muchas veces a nivel de especie y en microbiología clínica la
identificación molecular basada en el ADNr 16S se utiliza fundamentalmente
para bacterias cuya identificación mediante otro tipo de técnicas resulta
imposible, difícil o requiere mucho tiempo ya que el 16S es diferente para cada
una con pequeñas alteraciones.

MATERIALES y REACTIVOS
 ADN de diferentes cepas bacterianas.
 Iniciadores para el gen 16 S del rARN:
 8F (5’-GCG GAT CCG CGG CCG CTG CAG AGT TTG ATC CTG GCT
CAG-3’) y 1492R (5’-GGC TCG AGC GGC CGC CCG GGT TAC CTT
GTT ACG ACT T-3’) (Relman, 1993).
 Mezcla de desoxirribonucleótidos (dATP, dTTP, dCTP, dGTP).
 Cloruro de magnesio (MgCl2).
 Amortiguador (Buffer PCR).
 Enzima Taq Polimerasa.
 H2O inyectable.
 Agarosa
 Amortiguador TAE 1X
 SYBR® Safe ADN gel stain
 Amortiguador de muestra (Azul de bromofenol y glicerol)
 Marcador de peso molecular (100 pb ladder)

METODOLOGÍA
1. En un tubo de 0.2 mL para PCR se colocan todos los reactivos
(mantener los reactivos y la mezcla de reacción en hielo) (dNTP, MgCl2,
buffer PCR, primer 8F, primer 1492R, Taq polimerasa, ADN digerido
previamente).
2. Mezclar los reactivos con micropipeta, cerrar bien el tubo de 0.2 mL y si
es necesario dar un spin en la microcentrífuga para llevar la mezcla de
reacción al fondo del tubo. Luego se colocan los tubos en el
termociclador con el siguiente programa: 1 ciclo de desnaturalización
inicial a 94 ºC por 5 minutos, 35 ciclos de desnaturalización 94 ºC por 1
minuto, alineamiento 55 ºC por 1 minuto, extensión 72 ºC por 1 minuto y
1 ciclo de Extensión final a 72 ºC por 5 minutos.
3. Al final de la amplificación, se mantienen las muestras en el
termociclador a una temperatura de 4 ºC, pero se recomienda sacarlas
en el menor tiempo posible y guardarlas a una temperatura de -20 ºC
hasta su uso.
4. Para visualizar el producto de PCR se realiza una electroforesis en gel
de agarosa al 1.5% con amortiguador TAE 1X, a 80 V durante 80
minutos. En cada pozo se cargan 3 µl del producto amplificado
(amplicón) mezclados con su correspondiente amortiguador de carga. El
tamaño del fragmento esperado es de 1500 pb, por lo que se
recomienda utilizar el marcador de peso molecular 100 bp Ladder.

Resultados

Discusión reacción en cadena de la polimerasa

De una digestión parcial de un ADN procariótico, se va a amplificar el gen 16S,


obtentiendo multiples copias de este. Este ADN es colocado en un tubo con
varios reactivos que actuaran a la vez para poder comenzar la replicación de
ADN y asi poder obtener las copias de este gen.

Se agrega al tubo el buffer de PCR, el buffer es necesario en la reacción ya


que va a mantener el pH estable en el medio, las polimerasas que son
agregadas posteriormente son sensibles a cambios de pH cuando se trata de
su eficiencia y especificidad en la síntesis de ADN. Este buffer normalmente
está formado por Tris-HCl, KCl y MgCl2. En la reacción de PCR se añaden los
cuatro dNTPs que son desoxirribonucleótidos que conforman la secuencia de
ADN, estos nucleótidos libres son nucleósido trifosfatos que contienen iones de
fosfato en una solución con iones de hidrogeno libres, estos iones interactúan y
forman ácido fosfórico e incrementan la acidez de la solución de PCR, aquí es
donde el buffer Tris-HCl actúa para mantener el pH estable entre 8 a 9.5 para
la reacción de polimerasa, Tris-HCl también se puede encontrar en el buffer de
Taq.

El KCl facilita la unión de los iniciadores o primers de la hebra molde por su


unión a los grupos fosfatos de las hebras de ADN, una vez estabilizada la
carga, el primer y la hebra molde no se repelen por cargas eléctricas. El MgCl2
actúa como un cofactor para la Taq polimerasa y un agente estabilizador para
el alineamiento de la fase de elongación, el ion magnesio se une al grupo
fosfato de los dNTP y facilita la disociación de los fosfatos beta y gama que
forman a los dNMP (nucleósido monofosfato proveniente de nucleósido
trifosfato).

La Taq polimerasa es esencial para la realización del PCR, proviene de la


bacteria Thermus aquaticus, su función es actuar como el ADN polimerasa, la
cual se encarga de sintetizar cadenas de ADN nuevo, la diferencia principal es
que la Taq polimerasa al pertenecer a Thermus aquaticus puede actuar a
temperaturas altas sin ser desnaturalizada, por lo tanto en la desnaturalización
que sucede a 94 ºC donde las hebras de ADN serán separadas, la Taq
polimerasa podrá actuar sobre esas hebras separadas y agregar nucleótidos
complementarios para formar nuevas cadenas de ADN. Sin embargo La Taq
polimerasa no puede actuar sola, requiere una secuencia corta de ADN que
actué como punto de inicio para la síntesis de ADN, para eso existe el primer
que son secuencias cortas de ADN, regularmente de 18 a 22 bases, que le
permiten a la Taq polimerasa actuar. Los primers tienen secuencias definidas
las cuales eligen donde se va a comenzar el proceso de amplificación, se
utilizan dos primers que se encuentren en hebras opuestas orientadas una a la
otra y que no se encuentren apartadas entre sí porque el producto de un primer
es el sustrato del otro para obtener la replicación total del ADN.

Este proceso de unión de primer con hebra se le conoce como alineamiento, al


enfriar la muestra a 55 ºC esto permite a los primers alinearse con el ADN,
pegándose a sitios complementarios del ADN que deseamos replicar. Si
usamos una temperatura de de alineamiento es muy baja, obtendremos un
PCR menos específico, y si es muy alta, la especificidad será mayor, aunque si
es demasiado alta no se amplificará nada, pues la unión de los oligonucleótidos
con sus sitios complementarios será poco estable y la polimerasa no podrá
iniciar la síntesis.

Por último el proceso de extensión sucede a 72 ºC donde la actividad de la Taq


polimerasa es más alta, aquí la Taq polimerasa utilizando al primer como sitios
de inicio, puede comenzar a agregar nucleótidos a la hebra molde para formar
una cadena nueva de ADN, estos ciclos se repiten para estar replicando
nuevas cadenas cada periodo de tiempo establecido y puede continuar asi
hasta que uno de los reactivos se acabe, como es el caso de dNTP, el cofactor
MgCl2, ect. El producto final pasa a un gel de electroforesis que es teñido con
SYBR para poder observar si se obtuvo la replicación del gen que se buscaba.

Conclusiones

Referencias.

Kim OS, Cho YJ, et al. (2012). Introducing EzTaxon: a prokaryotic 16S rRNA
Gene sequence database with phylotypes that represent uncultured
species. International Journal of Systematic and Evolutionary
Microbiology.

Neal, J. (2002). Identification of Mycobacterium spp. by using a commercial 16S


ribosomal DNA sequencing kit and additional sequencing libraries.
International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology.

Jalava, J. (1995). Use of the polymerase chain reaction and DNA sequencing
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culture-negative infective endocarditis. Clinical Infectious Diseases.

Espinosa, L. (2014). Guía práctica sobre la técnica de PCR.

Greif, G. PCR: Reacción en cadena de la polimerasa. Institut Pasteur de


Montevideo. Unidad de Biología Molecular.

Aitken, A. (2012, Noviembre 10). TE buffer (Tris-EDTA buffer). Recuperado


Marzo 8, 2018 de http://www.nhm.ac.uk/content/dam/nhmwww/our-
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Alexander, S. (2018). Primer in Genetics and Genomics Series: Final Remarks.


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Institutos Nacionales de la Salud, Instituto Nacional de Investigación del


Genoma Humano " Glosario Hablado de Términos Genéticos".
Recuperado Abril 18, 2018 de https://www.genome.gov/glossaryS/
https://www.genome.gov/glossaryS/?id=163