UNIVERSIDAD AUTONOMA DE
CHIHUAHUA
BIOLOGÍA MOLECULAR
M.C. Edward Alexander Espinoza Sánchez
Objetivo.
Obtener una amplificación del gen 16S de una procariota.
Objetivo específico.
Conocer la diferencias que hay en la extracción de ADN cromosomal y
plasmídico, así como saber el papel que juega cada reactivo.
Introducción
MATERIALES y REACTIVOS
ADN de diferentes cepas bacterianas.
Iniciadores para el gen 16 S del rARN:
8F (5’-GCG GAT CCG CGG CCG CTG CAG AGT TTG ATC CTG GCT
CAG-3’) y 1492R (5’-GGC TCG AGC GGC CGC CCG GGT TAC CTT
GTT ACG ACT T-3’) (Relman, 1993).
Mezcla de desoxirribonucleótidos (dATP, dTTP, dCTP, dGTP).
Cloruro de magnesio (MgCl2).
Amortiguador (Buffer PCR).
Enzima Taq Polimerasa.
H2O inyectable.
Agarosa
Amortiguador TAE 1X
SYBR® Safe ADN gel stain
Amortiguador de muestra (Azul de bromofenol y glicerol)
Marcador de peso molecular (100 pb ladder)
METODOLOGÍA
1. En un tubo de 0.2 mL para PCR se colocan todos los reactivos
(mantener los reactivos y la mezcla de reacción en hielo) (dNTP, MgCl2,
buffer PCR, primer 8F, primer 1492R, Taq polimerasa, ADN digerido
previamente).
2. Mezclar los reactivos con micropipeta, cerrar bien el tubo de 0.2 mL y si
es necesario dar un spin en la microcentrífuga para llevar la mezcla de
reacción al fondo del tubo. Luego se colocan los tubos en el
termociclador con el siguiente programa: 1 ciclo de desnaturalización
inicial a 94 ºC por 5 minutos, 35 ciclos de desnaturalización 94 ºC por 1
minuto, alineamiento 55 ºC por 1 minuto, extensión 72 ºC por 1 minuto y
1 ciclo de Extensión final a 72 ºC por 5 minutos.
3. Al final de la amplificación, se mantienen las muestras en el
termociclador a una temperatura de 4 ºC, pero se recomienda sacarlas
en el menor tiempo posible y guardarlas a una temperatura de -20 ºC
hasta su uso.
4. Para visualizar el producto de PCR se realiza una electroforesis en gel
de agarosa al 1.5% con amortiguador TAE 1X, a 80 V durante 80
minutos. En cada pozo se cargan 3 µl del producto amplificado
(amplicón) mezclados con su correspondiente amortiguador de carga. El
tamaño del fragmento esperado es de 1500 pb, por lo que se
recomienda utilizar el marcador de peso molecular 100 bp Ladder.
Resultados
Conclusiones
Referencias.
Kim OS, Cho YJ, et al. (2012). Introducing EzTaxon: a prokaryotic 16S rRNA
Gene sequence database with phylotypes that represent uncultured
species. International Journal of Systematic and Evolutionary
Microbiology.
Jalava, J. (1995). Use of the polymerase chain reaction and DNA sequencing
for detection of Bartonella quintana in the aortic valve of a patient with
culture-negative infective endocarditis. Clinical Infectious Diseases.