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Virología Molecular

2017

Guía de Trabajos Prácticos

Docentes
Prof. Cecilia Czibener
Prof. Diego Alvarez
Ayudante de 1º Fernando Merwaiss
Ayudante de 1º María José Pascual

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CLASIFICACIÓN DE LOS LABORATORIOS SEGÚN EL NIVEL DE
RIESGO DE LOS MICROORGANISMOS QUE SE MANIPULAN.

El trabajo en el laboratorio con material contaminado con agentes infecciosos o sustancias tóxicas
para el hombre y el medio ambiente, representa un aspecto importante a tener en cuenta durante la
práctica laboral. De este modo, la bioseguridad resulta fundamental para la prevención de
accidentes que puedan poner en peligro al operador y la comunidad. Durante el trabajo en el
laboratorio se generan cotidianamente numerosas situaciones que nos exponen al contagio de
distintos agentes patógenos.
Los microorganismos pueden clasificarse, de acuerdo al riesgo de transmitir infecciones, en 4
grupos de riesgo que se describen a continuación:

Grupo de riesgo I: escaso riesgo individual y comunitario


Microorganismos que tienen pocas probabilidades de provocar enfermedades humanas o
enfermedades de importancia veterinaria.

Grupo de riesgo II: riesgo individual moderado, riesgo comunitario limitado


Agentes patógenos que pueden provocar enfermedades humanas o enfermedades en animales,
pero que tienen pocas probabilidades de entrañar un riesgo grave para el personal de laboratorio,
la comunidad, el ganado o el medio ambiente.

Grupo de riesgo III: riesgo individual elevado, riesgo comunitario escaso


Agentes patógenos que suelen provocar enfermedades humanas graves pero que
habitualmente no se propagan de una persona infectada a otra.

Grupo de riesgo IV: elevado riesgo individual y comunitario


Microorganismos que suelen provocar enfermedades graves en las personas o en los animales y
que pueden propagarse fácilmente de un individuo a otro, directa o indirectamente.

A su vez, los laboratorios se dividen según sus características de diseño, construcción y medios de
contención en tres tipos:
Laboratorio básico: comprende los laboratorios que trabajan con agentes de los grupos I y II.
Laboratorio de contención: está instalado para trabajar con agentes del grupo de riesgo III.
Laboratorio de contención máxima: está concebido para trabajar con agentes infecciosos del
grupo de riesgo IV ó en experimentos microbiológicos.

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Grupos de riesgo en relación con el tipo de laboratorio:

GRUPO DE RIESGO CLASIFICACIÓN DEL EJEMPLOS DE LABORATORIO


LABORATORIO
I Básico Enseñanza básica
Escaso riesgo individual
y comunitario

II Básico Hospital de nivel primario,


Riesgo individual moderado (con cámaras de laboratorios de
y riesgo comunitario bioseguridad y diagnóstico; enseñanza
limitado dispositivos universitaria; laboratorio de salud
de protección pública; servicios
personal) primarios de salud

III Contención Laboratorios de


Riesgo individual elevado y riesgo diagnóstico
comunitario escaso especializados

IV Contención Laboratorios que trabajan


Elevado riesgo individual y Máxima. con agentes patógenos
comunitario peligrosos

VÍAS DE CONTAGIO
A continuación se enumeran algunas de las vías de contagio más frecuentes, debiéndose
considerar que no son las únicas.

1- Autoinoculación accidental.
a- por agujas
b- por pipetas Pasteur.
c- por micropipetas.
d- por material de vidrio roto.

2- Contaminación de piel y mucosas.


El trabajo sin guantes y más aún cuando la integridad de la piel de las manos no sea completa es
un grave riesgo. Además, las mucosas son vías de entrada muy apropiadas para un número muy
grande de agentes patógenos.
Ciertas condiciones favorecen el ingreso a través de estas vías:
a- permeabilidad alterada: heridas sin cicatrizar, microescoriaciones, eczemas, sequedad y
agrietamiento de la piel.
b- exposición de extensas áreas sanas.
c- eslabón mano-boca.
d- salpicaduras en los ojos.

3- Aspiración bucal.
Producida frecuentemente por malas prácticas tales como pipetear con la boca, comer o fumar en
el laboratorio.

4- Inhalación de microaerosoles.
Es una de las vías más importantes y generalmente no tenida en cuenta, a pesar de la frecuencia
con que los aerosoles son producidos en el laboratorio.
Se enumeran algunas de las situaciones en las que pueden producirse aerosoles:
a) al agitar tubos destapados.

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b) en la homogeinización mecánica.
c) en roturas.
d) al expulsar la última gota de una pipeta.
e) en las salpicaduras al destapar un recipiente.
f) en la centrifugación de tubos destapados.
g) en las roturas de los recipientes en el proceso de centrifugación.
h) al frenar súbitamente la centrífuga, cuando se centrifugan tubos destapados.

Las normas de bioseguridad son un conjunto de reglas destinadas a proteger al personal de


laboratorio de este tipo de accidentes y a la comunidad y al medio ambiente del daño que los
desechos originados en el laboratorio puedan producir.

PRÁCTICAS CORRECTAS DE LABORATORIO


La mayoría de las exposiciones ocupacionales son causadas por error humano debido a prácticas
incorrectas. Las prácticas destinadas a disminuir los riesgos de accidentes son:
1. El ingreso al laboratorio debe restringirse al personal autorizado.
2. En el laboratorio no se puede comer, beber, fumar, manipular lentes de contacto ni maquillarse.
3. Se deben higienizar las manos frecuentemente, sobre todo luego de manipular materiales
potencialmente contaminados, luego de retirarse los guantes y antes de abandonar el lugar de
trabajo.
4. Siempre deben usarse guantes cuando se trabaja con material o equipos potencialmente
patogénicos, oncogénicos o contaminados.
5. No se deben colocar las manos en la boca, nariz, ojos o cara.
6. Se deben utilizar guardapolvo, barbijos y anteojos siempre que la tarea lo requiera.
7. Afuera del laboratorio o en áreas destinadas a la alimentación nunca se debe utilizar la ropa de
protección.
8. El material contaminado o la ropa de trabajo deben descontaminarse antes de ser lavados,
descartados o reparados.
9. Nunca se debe pipetear con la boca.
10. Se debe limitar la formación de aerosoles. Para esto se deberán utilizar contenedores con tapa,
especialmente aquellos destinados a la centrifugación. Para el trabajo con agentes infecciosos o
con materiales o cultivos celulares sospechosos de contener agentes patogénicos o carcinogénicos
se utilizarán gabinetes de seguridad biológica.
11. Extracción de sangre: una vez realizada la extracción de sangre, la aguja se colocará en un
recipiente de paredes rígidas (vidrio, cartón grueso, plástico) que una vez lleno se tapará y colocará
en bolsas de descarte de residuos patológicos. Luego de realizada la trasvasación de la sangre a
los respectivos tubos (poniendo especial atención en evitar la formación de microaerosoles), la
jeringa se colocará en un recipiente que contenga una solución de hipoclorito de sodio 1:10 (tiempo
mínimo de contacto 2 h) y luego se descartará en bolsa roja. Los algodones y/o gasas utilizados
para la extracción, se colocarán en bolsas rojas. Las extracciones se deben realizar siempre con
guantes de latex. Nunca se deben volver a tapar las agujas antes de descartarlas.
12. Recepción de muestras clínicas: las muestras se recibirán en el área destinada a tal efecto. La
persona encargada de recibir las muestras, verificará:
a) que la documentación que la acompaña no esté manchada con sangre, en caso de estarlo se
transcribirá y se desechará en bolsas rojas.
b) que el recipiente que contiene la muestra esté perfectamente rotulado.
c) que dicho recipiente no esté manchado por fuera. En caso de estarlo se limpiará con una gasa o
algodón embebido en solución de hipoclorito de sodio 1:10 antes de colocarlo en la gradilla. El
rótulo de los tubos que contienen material de alto riesgo se realizará de acuerdo al código
internacional, que consiste en un círculo de color rojo autoadhesivo que se colocará en el tubo y en
la receta.
13. Centrifugación: el incorrecto uso de la centrífuga atenta contra la seguridad de un laboratorio,
ya que puede producir aerosoles. Para evitar esto deberán observarse las siguientes
recomendaciones:

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a) se deben balancear los tubos.
b) no centrifugar tubos de vidrio. Si resulta imposible, observar la existencia de tacos de goma en
el fondo de las camisas, para evitar roturas.
c) todos los tubos deben estar tapados durante la centrifugación. En caso que los tubos se
centrifuguen destapados, una vez finalizado el proceso se deberá esperar 5 minutos y luego abrir la
centrífuga, para evitar la dispersión de los aerosoles que se hayan producido.
d) los cambios de velocidad de centrifugación deberán hacerse lenta y progresivamente.
e) nunca se deberá abrir o frenar la centrífuga con elementos extraños, antes que detenga su
marcha normalmente.
f) todas las partes móviles de la centrífuga como cabezales, camisas y soportes deben ser
rutinariamente autoclavados o enjuagados con un desinfectante adecuado (por ejemplo,
glutaraldehído al 2 %).
g) para evitar fallas a altas velocidades se deberá contar con un servicio técnico responsable y
adecuado, como así también evitar el uso de piezas móviles de centrífugas de distinto origen ya
que esto es altamente peligroso.
14. Separación de sueros:
a) deberá ser realizado por personal capacitado para dicha tarea.
b) en el trasvasamiento de los sueros, utilizar pipetas Pasteur preferentemente de plástico. Las
pipetas Pasteur utilizadas se sumergirán por completo en hipoclorito de sodio 1:10, en el que
permanecerán hasta el otro día antes de ser lavadas.
c) es conveniente tener siempre durante el procesamiento algodón embebido en hipoclorito de
sodio, para el que caso en que se produzcan salpicaduras o derramamientos de sangre o líquidos
biológicos.
15. Se debe colocar un papel absorbente sobre la superficie de trabajo.
16. Las pipetas contaminadas deben descartarse en forma horizontal dentro de un recipiente que
contenga suficiente cantidad de solución desinfectante para que permita la completa inmersión de
las mismas. Si son descartables, pueden desecharse en la caja con bolsa roja que se destina a los
residuos patológicos.
17. El laboratorio debe mantenerse limpio y ordenado. Evitar el desorden guardando el
equipamiento y el material de trabajo.
18. Al final de la jornada, descontaminar con lavandina 10 % todas las superficies de trabajo.
Eliminar la cubierta absorbente de la superficie en la caja destinada a residuos patológicos.
19. Todas las personas que trabajen tienen que utilizar la vestimenta de seguridad acorde al tipo de
tarea que realicen en función de prevenir la exposición a sustancias peligrosas.
20. Se debe mantener una actitud serena y responsable dentro del laboratorio.
21. Plan de emergencia: se debe disponer de un plan para responder a emergencias que sucedan
en el laboratorio. A pesar de las precauciones y organización de un laboratorio, pueden suceder
situaciones que expongan al personal al contagio con diversos agentes patógenos. En todos los
casos, es necesario una vez producido el incidente, tratar de mantener la calma para resolver la
situación lo más adecuadamente posible y sin pérdida de tiempo, pues este es irreversible: ya se
produjo.
Se recomienda en estos casos:
a) Suspender inmediatamente la tarea que se estaba realizando.
b) Avisar al encargado de bioseguridad, que será la persona idónea para decidir los pasos a seguir
en cada caso.
c) Determinar con qué material se produjo el accidente y en qué condiciones, para evaluar el riesgo
potencial e iniciar, si fuera necesario y posible, un plan de inmunización pasiva-activa.
No obstante estas recomendaciones, enumeraremos las conductas inmediatas a seguir en el caso
de accidentes más comunes.
a) cortes, raspaduras, pinchazos: lavarse la herida inmediatamente con agua y jabón.
b) salpicaduras en los ojos: enjuagar inmediatamente con agua o solución fisiológica,
repetidamente y sin cerrarlos.
c) aspiración o salpicaduras en la boca: enjuagar repetidamente con agua, sin efectuar ningún
movimiento de deglución.

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d) manchas de sangre u otros materiales en la piel: lavar con hipoclorito de sodio diluído y luego
agua y jabón.
e) manchas de sangre u otros materiales en las ropas: frotar con hipoclorito de sodio y luego agua.

DESCONTAMINACIÓN Y DESINFECCIÓN
Antes de discutir cómo tratar los materiales destinados a descarte o al lavado, resulta útil la
definición de algunos términos:
Desinfección: es la eliminación de la mayoría de los microrganismos patogénicos de los objetos
inanimados, a excepción de las esporas bacterianas. En general, se lleva a cabo utilizando
sustancias químicas líquidas.
Descontaminación: es la destrucción de microrganismos hasta un nivel mínimo aunque no
necesariamente nulo.

PROCEDIMIENTOS UTILIZADOS PARA DESCARTAR O TRATAR LOS RESIDUOS


PELIGROSOS GENERADOS EN EL LABORATORIO:
1) Desinfección química:
Un desinfectante apropiado es aquel que mata o reduce el número de agentes microbianos
“blanco” hasta un nivel aceptado.
Las sustancias usadas son: alcoholes, componentes liberadores de cloro, fenoles, iodóforos y
sustancias de amonio cuaternario. En general estas sustancias son combinadas con detergentes
para mejorar la capacidad de lavado de los mismos. Es importante tener en cuenta el tipo de
sustancia a utilizar en relación a el/los agentes a desinfectar.
También hay que poner atención en la manipulación de soluciones concentradas de desinfectantes
porque generalmente son tóxicos al ser ingeridos, inhalados y al contacto.
La efectividad de los desinfectantes para matar o inactivar agentes infecciosos depende de
distintos factores:
a) tipo de microrganismo
b) grado de contaminación: este factor determinará el tiempo requerido para desinfectar y la
cantidad de desinfectante a utilizar
c) contenido proteico: el material que contiene proteínas (sangre, plasma, materia fecal, tejidos,
etc.) absorbe e inactiva a algunos desinfectantes. Los halógenos (por ejemplo el cloro) se
combinan directamente con las proteínas. Por esto, cuando hay materiales proteicos en los
desechos, debe agregarse una cantidad suficiente para que exista un exceso que pueda reaccionar
con el microrganismo.
d) tipo de sustancia química: de su naturaleza dependerá el modo de acción y los niveles de
actividad. Por ejemplo, la lavandina resulta inefectiva en condiciones ácidas o alcalinas porque el
ácido hipocloroso no queda disponible para penetrar en la pared celular, por lo tanto, es incapaz de
desinfectar.
e) concentración del agente químico: muchas sustancias poseen un rango de concentraciones
posibles para usarlas.
f) tiempo de contacto: debe ser suficiente para permitir la acción sobre los microrganismos. El
tiempo requerido será proporcional al grado de contaminación.
g) otras consideraciones: temperatura, pH, formación de agregados de microrganismos.
Desinfectantes más usados:
a) lavandina 1:10: debe prepararse diariamente. También hay que tener en cuenta que puede
corroer las superficies de acero inoxidable si no son enjuagadas abundantemente con agua.
b) etanol 70 %: se usa generalmente para desinfectar superficies. Aunque es efectivo como
desinfectante general, es inflamable.
c) iodóforos: son buenos desinfectantes, sobre todo para áreas de trabajo con ADN recombinante.
No son inflamables ni corrosivos.
d) fenólicos: son tóxicos por lo que deben tomarse precauciones para manipularlos.

ESTERILIZACIÓN
Esterilización: es la eliminación completa o la destrucción de todas las formas de vida microbianas.
Se realiza mediante procesos físicos o químicos. Los métodos utilizados son el calor húmedo

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(autoclavado), calor seco (estufa de esterilización), óxido de etileno (esterilización con gases) y
sustancias químicas.
Esterilización por autoclave.
Es recomendada para tratar distintos líquidos infecciosos, por ejemplo: sangre, suero, plasma,
cultivos, desechos de fermentación y otros líquidos que no contengan sustancias químicas o
radiactivas. Se debe tener en cuenta que las botellas donde se autoclaven líquidos tengan
ventilación a fin de evitar la explosión durante la esterilización. No deben autoclavarse sustancias
químicas inflamables o explosivas. Los materiales infecciosos sólidos, que incluyen desechos
patológicos, agujas y cortantes, placas de cultivo, frascos, tubos y contenedores, pueden
descontaminarse antes de eliminarlos

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PREPARACIÓN DE STOCKS VIRALES

Los sistemas hospedadores para la propagación de virus disponibles en el laboratorio son: 1)


animales de experimentación, 2) huevos embrionados y 3) cultivos celulares.

1) Animales de experimentación: Antes de que comenzaran a utilizarse los cultivos celulares, los
virus sólo podían propagarse en animales enteros o huevos embrionados. Los animales enteros
podían incluir el hospedador natural o animales de laboratorio (ej. conejo, rata, ratón, hamsters,
etc). En el caso de los animales de laboratorio los ratones lactantes o recién nacidos suelen ser los
mejores hospedadores. Se utilizan animales que sean sensibles al virus que se quiere propagar.
Las vías de inoculación viral más comúnmente usadas son la intravenosa, intramuscular y
subcutánea, pero también pueden utilizarse las vías intracraneal e intraperitoneal. Los efectos de la
replicación viral en el animal infectado incluye un amplio espectro de síntomas, que van desde
lesiones en la piel, en mucosas digestiva/respiratoria o desórdenes neurológicos, disfunciones
inmunes, fallas en un órgano específico (hepatitis o miocarditis) hasta la muerte. Los virus pueden
ser aislados del animal infectado a partir de sus excretas o secreciones, sangre o tejidos. Hoy en
día, el uso de los animales de laboratorio está más aplicado para estudios de patogénesis que para
producción de stocks virales. En Virología veterinaria se tiene la ventaja de poder utilizar los
animales que son hospedadores naturales de los mismos. Para el desarrollo de la Virología
humana se utilizan modelos animales que reproduzcan los procesos infecciosos que ocurren en el
hombre. Si bien uno de los modelos más cercanos al del hospedador natural sería el del
chimpancé, el más utilizado es el del ratón lactante, que es especialmente sensible para arbovirus y
virus coxsackie A.
Históricamente, perros, gatos, conejos, ratas, hamsters, ratones y pollos han sido muy útiles en
estudios de investigación en el laboratorio. Este sistema presenta una serie de desventajas:
elevado costo; los animales inoculados pueden tener virus endógenos que se reactivan en las
manipulaciones del laboratorio y se confunden en el aislamiento con el virus inoculado y además
pueden no ser susceptibles a un número de virus.

2) Huevos embrionados: Antes de la década del 50', la infección de huevos embrionados era el
método estándar de propagación de algunos virus. Se utilizan huevos embrionados de 10-14 dias
de incubación post fertilización. El huevo embrionado ofrece varios tejidos distintos: amnios,
allantoideo, chorion y el saco de la yema, que sirve para el crecimiento de una amplia variedad de
virus: ortomixovirus, paramixovirus, rabdovirus, togavirus, herpesvirus y poxvirus. Miembros de
cada una de estas familias pueden replicar en varios tejidos de un huevo embrionado en desarrollo,
o la replicación puede ser confinada en un tipo de tejido. Cada uno de los virus de las familias
mencionadas causan focos característicos o discretos cuando se introducen en la membrana
corioalantoidea de huevos embrionados, y puede ser útil como método de identificación, para
cuantificar virus o para evaluar la patogenicidad viral. Si bien los huevos embrionados han sido
reemplazados por los cultivos celulares, aun sigue siendo el método más adecuado para la
obtención de stocks de alto titulo de algunos virus, y continúan siendo utilizados en laboratorios de
investigación y de producción de vacunas. Además, la aparición de formaciones similares a
pústulas (pock) en la membrana corioalantoidea es un método para diferenciar cepas de poxvirus
hemorrágicas (pocks rojos hemorrágicos) o blancos (cuando hay infiltración de lesiones con células
inflamatorias). Este sistema requiere menos infraestructura y cuidados que los cultivos celulares y
menos espacio que los animales de experimentación. Los huevos embrionados como sistemas
hospedadores ofrecen una amplia variedad de tipos celulares embrionarios aptos para la
propagación viral y de rutas de inoculación. Las rutas de inoculación más utilizadas son: la ruta
amniótica, la membrana corioalantoica y el saco de la yema. Aún hoy, es un sistema de elección
para virus aviares y virus de influenza. Se utiliza también para la producción de otras vacunas
humanas, como las de rabia y fiebre amarilla.

3) Cultivos celulares: Los cultivos celulares (cultivo primario, cepa celular o línea celular
establecida) son muy utilizados ya sea para el aislamiento o para la propagación de un gran
número de virus. Tienen la ventaja de ser sistemas hospedadores más controlados que los otros

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mencionados y han reemplazado en gran medida el uso de animales para la propagación de virus.
No obstante, algunos virus presentan una gran dificultad para replicarse en cultivos celulares y
otros sólo lo hacen en animales. Para que se produzca el crecimiento de un virus en un cultivo
celular las células deben ser permisivas para la replicación viral. Luego de la inoculación
(infección) del virus y durante la incubación las células deben ser monitoreadas al
microscopio óptico para evidenciar signos resultantes de la replicación tales como: efecto
citopático, transformación celular, formación de sincicios, presencia de cuerpos de
inclusión, etc. Estos métodos son los más simples, sin embargo no todos los virus causan efecto
citopático. En esos casos se deben usar otros métodos para detectar la infección viral. Un ejemplo
es la hemadsorción, que es una medida indirecta de la infección ya que detecta la síntesis de
proteínas virales en células infectadas mediante la adsorción de eritrocitos a su superficie.
Se basa en la capacidad de proteínas de envoltura virales expuestas en la superficie de la célula
infectada de interaccionar con el ácido siálico que es abundante en eritrocitos. La hemadsorción se
puede visualizar como áreas que se tiñen de color rojo luego de la exposición de células infectadas
a preparaciones de eritrocitos. Este ensayo es útil para detectar infecciones con virus que apenas
tienen o no tienen efecto citopático.

Se denomina stock viral a la progenie de una infección productiva de un determinado virus


en un sistema celular o animal huésped adecuado. En su obtención se trata de lograr la
mayor relación:
Número de UFP/unidad de volumen.

Propagación de virus en cultivos celulares


Sólo algunos virus crecen en una amplia variedad de tipos celulares. En general, los virus crecen
en un determinado tipo de células (rango de hospedadores). Los cultivos celulares son el sistema
de elección para la propagación de virus en pequeña escala. Distintas variables del proceso
pueden ser controladas (densidad celular, edad del cultivo, multiplicidad de infección, composición
del medio de cultivo, tipo celular, sistema de cultivo, duración del tiempo de adsorción, temperatura
de incubación, etc). A continuación se describe la influencia que algunas de estas variables tienen
sobre el crecimiento viral:
Tipo celular: La célula elegida deberá ser permisiva a la replicación del virus. El virus deberá estar
adaptado al tipo celular en el cual se prepara el stock.
Esto significa que, si el virus "semilla" fue obtenido en otro sistema hospedador - línea celular o
animal- deberá ser crecido repetidas veces en el nuevo sistema hasta que adquiera la velocidad y
características de crecimiento adecuadas.
Multiplicidad de infección (multiplicity of infection) (m.o.i) = Nº de partículas virales infectivas/célula).
En general los stocks virales se preparan a partir de infecciones con bajas m.o.i. (<1) para evitar la
formación de virus defectivos, vacíos, incompletos, etc. Si se trabaja con m.o.i. elevadas (>1), la
producción de partículas infectivas es menor y por lo tanto aumenta la relación de partículas virales
totales (infectivas+no infectivas) / partículas virales infectivas que se obtienen como resultado de
una infección.
Sistema de cultivo: Es conveniente utilizar recipientes para cultivo que ofrezcan la mayor relación:
número de células/volumen de medio de infección. En el laboratorio virológico se requiere
generalmente obtener pequeños volúmenes de stocks de trabajo. Para este tipo de preparaciones
pueden ser útiles botellas de cultivo comunes, o bien las botellas rodantes (rollers), que ofrecen
una gran superficie de pegado y crecimiento de células que están en contacto en forma alternada y
sucesiva con el medio de crecimiento líquido y con la fase gaseosa.
A nivel industrial se requiere la producción de una gran masa de virus para la elaboración de
distintos productos tales como antígenos virales para vacunas. En estos casos se recurre a los
hipercultivos: cultivos en grandes tanques con agitación que permite mantener las células libres en
suspensión o ancladas a microsoportes o microcarriers (esferas de polímeros de dextrano) que
permanecen en suspensión. Los microsoportes se utilizan para el crecimiento de células que no
pueden superar su necesidad de anclaje a una superficie.

Preservación de virus

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En general los virus son poco estables al calor, muy pocos pueden mantenerse 24 h a 4ºC sin
pérdida significativa de la infectividad. Los stocks virales deberán ser fraccionados en alícuotas
pequeñas (libre de restos celulares) para ser conservados durante largos períodos de tiempo. Así
acondicionados serán sometidos a un único ciclo de congelado-descongelado antes de su
utilización.
Distintas condiciones de almacenamiento son aconsejables para preservar virus durante meses o
incluso años, con poca disminución de la infectividad viral:
A temperaturas de -70ºC (temperatura de hielo seco o freezer de baja temperatura).
A temperaturas de -196ºC (nitrógeno líquido). A la suspensión viral se le adicionarán proteínas (ej:
seroalbúmina, suero, etc) para estabilizar al virus durante el almacenamiento. Se recomienda no
guardar en el mismo tanque criotubos con células.
Liofilizadas y almacenadas a 4ºC o -20ºC. Para evitar pérdidas significativas de infectividad las
muestras deberán rehidratarse con soluciones salinas balanceadas.

Ensayos para la cuantificación de virus


Los virus pueden detectarse empleando ensayos biológicos y ensayos físicos.
Los ensayos biológicos, como son los ensayos de formación de placas y la titulación por punto
final, son métodos que miden partículas infectivas. Por otro lado, los ensayos físicos como la
visualización de partículas virales mediante microscopía electrónica, técnicas inmunológicas, o
detección de genomas virales por PCR en tiempo real miden todas las partículas (infectivas y no
infectivas).

Medidas de Unidades de Infección


El título viral se define como la concentración de virus en una muestra. Este parámetro se
determina inoculando diluciones seriadas de virus en un cultivo celular para luego detectar la
multiplicación viral. Esta respuesta puede ser cuantitativa (ensayo de formación de placas) o de
todo o nada donde se mide presencia o ausencia de virus (dilución por punto final)

ENSAYO DE FORMACIÓN DE PLACAS


El ensayo de formación de placas es la metodología más utilizada para cuantificar virus. Luego de
la infección de una célula, la multiplicación viral resulta en la liberación de la progenie que propaga
la infección hacia las células vecinas. Sucesivas rondas de propagación forman una zona circular
de infección en la monocapa celular llamada placa. Este ensayo utiliza un medio de cultivo
semisólido que confina la propagación de la infección y la formación de placas se revela mediante
tinción de las células infectadas.
Cuando la infección viral provoca la lisis de las células infectadas se podrán distinguir placas de
lisis en la monocapa de células. Cuando las placas de lisis son lo suficientemente grande se
pueden ver a simple vista.
La idea del ensayo es poder identificar la dilución viral en la que se puedan contar entre 20 y 100
placas. Se realizan aproximadamente 4 a 6 diluciones para poder abarcar el rango en el cual se
pueden contar las placas.
En general, para la mayoría de los virus animales hay una relación lineal entre el número de
partículas infectivas y la cuantificación de placas. En otras palabras, una partícula infectiva es
suficiente para iniciar una infección y formar una placa.

El titulo de un stock viral se calcula como Unidades Formadoras de Placas por mililitro (UFP/ml).

Replicación viral
La infección viral de células hospedadoras culmina con la liberación de una progenie de partículas
virales. El rendimiento de virus que resulta de la infección de una célula en una generación viral se
denomina “burst”, debido a que los virus causan el estallido/explosión de la célula infectada.
La cantidad de virus que produce una célula es limitada por la maquinaria celular, y en virus
citopáticos coincide con la muerte de la célula infectada. Algunos virus no matan a la célula
infectada, que produce partículas virales en tanto se mantenga viva.

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Curvas de crecimiento viral
Análisis del crecimiento en un paso
La infección puede sincronizarse para
estudiar un único ciclo de replicación viral
empleando un inóculo de alto título de
forma tal de asegurar que la mayoría de las
células en cultivo se infecten. Luego de la
infección se remueve el inóculo que
contiene a las partículas no adsorbidas y se
agrega medio de cultivo. La curva de
crecimiento se construye determinando el
título en el sobrenadante de cultivo a
distintos tiempo post infección. En la curva
se observa que el número de virus nuevo
no aumenta de forma lineal como ocurre
con las bacterias. En el caso de los virus
hay una fase inicial lag seguida de un
incremento rápido en la producción viral
que luego pasa a una fase estacionaria.
Cuando se analiza la cinética de producción
intracelular de virus determinando el título
de virus en los extractos de las células
infectadas se observa que la primer fase
llamada período de eclipse abarca el
momento en que el virus pierde infectividad
(no se detectan virus en el sobrenadante ni
en el extracto de células infectadas) debido
a que la partícula se desensambla al
penetrar a la célula y el periodo de latencia
que es el tiempo que el virus tarda en
replicar, ensamblarse y liberar las partículas
virales produciendo la lisis celular, “burst”.
La multiplicidad de infección puede
aumentarse hasta el punto en el que la
producción de virus alcanza un máximo,
reflejando que la capacidad de las células
para producir virus es finita.
El análisis de las curvas de crecimiento en
un paso puede emplearse para estudiar
virus mutantes y determinar qué etapa del
ciclo de replicación está afectada por una
mutación particular en el genoma viral.
Cuando las células son infectadas con una
baja multiplicidad de infección pueden
ocurrir varios ciclos de replicación viral.
Como el efecto de una mutación en cada ciclo se multiplica por varios ciclos, estas curvas
amplifican el efecto de las mutaciones. Además, estas curvas pueden revelar defectos en la
propagación célula-a-célula de un virus.

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TP Transducción de células con Lentivirus

Stocks
● Virus:
Vectores Lentivirales:
● Células:
- Línea celular HEK-293 (células embrionarias humanas de riñón / CRL-1573™, ATCC®).
- Línea celular VERO (células epiteliales de riñón de mono verde africano Cercopithecus aethiops,
CCL-81™, ATCC®)

Materiales y métodos
● Medios
Medio base comercial: DMEM (Dulbeco’s Modified Eagle Medium, Gibco®)
Medio Completo (MC): DMEM suplementado con 10% suero fetal bovino (SFB) y 100 μg/m de
antibiótico penicilina-estreptomicina.

● Protocolo
El protocolo está descrito con las cantidades requeridas por cada uno de los grupos
1) Producción del Stock de Lentivirus

Día 1 - 06/11: Cultivo de células para transfectar


*Cada grupo cuenta con una placa p60 de células HEK-293*
- Retirar el medio de la p60 y colocar 1 ml de PBS para lavar las células.
- Retirar el PBS, colocar 0,5 ml de tripsina 1X e incubar 5 a 10 minutos en la estufa (37°C 5% CO2).
(Pasado el tiempo golpear suavemente la placa y observar a trasluz o al microscopio como las
células se levantaron)
- Agregar 1 ml de MC y resuspender las células. Sembrar 20 µL de la suspensión de células en la
cámara de Neubauer y contarlas.
- Sembrar 2 pocillos con 300.000 células/pocillo de la línea HEK en una placa de 6 pocillos en un
volumen final de 2 ml de Medio de Crecimiento (MC).
*En este paso los grupos A-B y C-D comparten una misma placa*
- Incubar las células en estufa a 37 ºC con 5% CO2 por 48 hs (hasta que alcancen un número de
1.000.000 células/pocillo o una confluencia del 90% aproximadamente).

Día 2 - 08/11:
a) Cuantificación de plásmido a utilizar
- Preparar un gel de agarosa 1% con 50 ml de buffer TAE 1 X con 3 ul de BrEt.
- Sembrar 1 uL de los plásmidos psPAX2, VSV-G, pLB-GFP, pLB-Rab5-GFP, life actin-CFP y
pMem-GFP en un gel de 1% de agarosa. Colocar 3 uL de marcador de peso molecular.
- Cuantificar la masa de de cada plásmido (en µg) tomando como referencia el marcador de peso
molecular.

b) Transfección en células HEK


*Recordar: Los grupos A-B y C-D comparten una misma placa*

- Rotular 2 eppendorf para realizar los 2 mix de transfección:

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MIX 1:
lipofectamina 2000 2 uL
DMEM 50 uL

MIX 2:
psPAX2 (2 ug finales) __ µL
VSV-G (200 ng finales) __ µL
plásmido* (200 ng finales) __ µL
DMEM 50 µL
*Listado de plásmidos disponibles: pLB-GFP, pLB-Rab5-GFP, plifeAct-CFP y pMem-GFP.

- Incubar 5 minutos cada MIX por separado y luego unirlos.


- Incubar 20 minutos a temperatura ambiente.
- Retirar el medio de la placa y colocar 0,5 ml por pocillo de PBS para lavar las células.
- Agregar 0,7 ml de DMEM al MIX final y sembrar todo el volumen en el pocillo.
- Pasadas 4 horas post transfección lavar las células con 0.5 ml de PBS dos veces, agregar 1 ml de
MC e incubar 48 horas.

Día 3 - 10/11:
a) Cosecha y dilución de los sobrenadantes para titular
- Cosechar los sobrenadantes de las 2 transfecciones en tubos eppendorf bien rotulados y
centrifugar por 5 minutos a 1500 rpm a 4°C. Pasar el sobrenadante a un nuevo tubo.
- Preparar diluciones seriadas al décimo de los stocks cosechados, las diluciones apropiadas son -
2, -3, -4 y -5.
- Preparar una suspensión de células siguiendo los mismos pasos 1 a 3 del día 6/11. La
suspensión debe contar con una concentración de 2x105 células/ml y un volumen final de 10 ml.
- Colocar en tubos Eppendorf 1,17 ml de suspensión celular y 0,13 ml de la dilución del virus.
Mezclar por inversión.
*Atención: Rotular la placa considerando la dilución final de virus en cada pocillo*
- Colocar 0.1 ml de cada suspensión células-virus por pocillo en una placa de 96 pocillos,
realizando 12 réplicas para cada dilución. Conservar pocillos sin infectar solo con la suspensión de
células como control negativo.
- Incubar a 37°C por 72 horas.

Día 4 - 13/11:
a) Titulación de Reed y Muench
- Visualizar cada uno de los pocillos bajo el microscopio TE2000 en un aumento de 20X.
- Marcar en la grilla a continuación los pocillos que presentan fluorescencia en el canal verde como
positivos. Los pocillos sin fluorescencia son considerados negativos.

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- Determinar el título mediante dosis infectiva 50 (ID50) empleando el método de Reed y Muench
detallado con un ejemplo a continuación:

Dilución Pocillos positivos Pocillos negativos Pocillos Totales

-3 12 0 12

-4 8 4 12

-5 1 11 12

-6 0 12 12

Entonces:
Dilución Pocillos positivos Pocillos negativos Pocillos Totales %

-3 =12+8+1+0= 21 =0 21 = 21/21= 100%

-4 =8+1+0= 9 =0+4= 4 13 = 9/13= 69%

-5 =1+0= 1 =0+4+11= 15 16 =1/16= 6%

-6 =0 =0+4+11+12= 27 27 =0/27= 0%

Para calcular la ID50, se determina la distancia proporcional (PD) de la siguiente manera:


PD = (% mayor al 50 - 50) / (%mayor al 50 - % menor al 50)
PD = (69 - 50) / (69 - 6)
PD = 0.305
LogID50 = log de la dilución mayor a 50 -PD
LogID50 = -6 -0.305
LogD50 = -6.305
LogD50 = 10-6.305
ID50 = 2,02 x 106

b) Pasaje de células Vero para infectar

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*Cada grupo cuenta con una placa p60 de células Vero*
- Retirar el medio de la p60 y colocar 1 ml de PBS para lavar las células.
- Retirar el PBS, colocar 0.5 ml de tripsina 1X e incubar 5 a 10 minutos en la estufa (37°C 5% CO2).
(Pasado el tiempo golpear suavemente la placa y observar a trasluz o al microscopio como las
células se levantaron)
- Agregar 1 ml de MC y resuspender las células. Sembrar 20 uL de la suspensión de células en la
cámara de Neubauer y contarlas.
- Colocar sobre 5 pocillos un vidrio cubreobjetos y agregar 0.3 ml de MC, realizar presión con la
punta del tip para hundir el vidrio al fondo del pocillo.
- Sembrar 5 pocillos con 50.000 células/pocillo de la línea Vero en una placa de 24 pocillos en un
volumen final de 0.4 ml de Medio de Crecimiento (MC).
*En este paso los grupos A-B y C-D comparten una misma placa*
- Incubar las células en estufa a 37 ºC con 5% CO2 por 48 hs (hasta que alcancen un número de
100000 células/pocillo o una confluencia del 90% aproximadamente).

Día 5 - 15/11: Transducción


*En este paso cada grupo utiliza las 4 variantes de virus producidos en el trabajo práctico. Para ello
tener en cuenta los títulos obtenidos en la titulación de Reed y Muench para cada uno de ellos.*
- Realizar una alícuota de 0.2 ml de la dilución correspondiente.
- Mezclar en un tubo Eppendorf 0.1 ml de la dilución con 0.1 ml de MC y 0.1 ml de Polybrene.
Realizar esto para cada virus.
- Colocar todo el mix en el pocillo.
- Centrifugar la placa 30 minutos a 2500 rpm a temperatura ambiente.
- Incubar en la estufa por 2 hs. Luego remover el sobrenadante y completar con MC.
- Incubar en la estufa por 2 días luego de la infección.

Día 6 - 17/11:
a) Montaje
- Descartar el sobrenadante y lavar las células con PBS dos veces.
- Agregar 0.2 ml de PFA 4% e incubar 20 minutos.
- Lavar el PFA con PBS e incubar con 0.2 ml DAPI 1:10000 en PBS 0.1% Tritón X100.
- Lavar dos veces con PBS y montar los vidrios sobre un portaobjetos utilizando 3 μl de solución de
montaje.

b) Visualización al microscopio
- Observar los preparados en los microscopios 80i o TE2000.

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