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PRODUCCIÓN DE ENZIMAS LIGNOCELULOLÍTICAS A PARTIR DE RESIDUOS DE

FLORICULTURA UTILIZANDO PLEUROTUS OSTREATUS


ABSTRACTO
La floricultura es un sector agroindustrial vital en la economía colombiana; La exportación de
flores afecta positivamente al empleo ya la balanza comercial. Sin embargo, esta industria podría
tener un impacto negativo en el medio ambiente si sus productos de desecho no se manejan
adecuadamente. Estos residuos de flores, ricos en lignina, hemicelulosa y celulosa, podrían ser una
materia prima rentable para producir enzimas. En este sentido, evaluamos la producción de
enzimas lignocelulolíticas por degradación de los residuos de Crisantemo y Rosa utilizando
Pleurotus ostreatus, y sulfato de manganeso y sulfato de cobre como inductores. De los dos
residuos, se obtuvieron lacasa, peroxidasa de manganeso, endoglucanasa, exoglucanasa y β-
glucosidasa. El uso de inductores, favoreció todas las actividades enzimáticas, excepto para β-
glucosidasa. Las enzimas que presentaron mayor actividad fueron la lacasa (4,693.4 U / L y 2.640 U
/ L de los residuos de Chrysanthemum y Rosa, respectivamente) y β-glucosidasa (9.513 U / L y
6.811.9 U / L). La enzima que mostró la menor actividad fue endoglucanasa (11,5 U / L y 15,4 U /
L). En las condiciones evaluadas, el mejor sustrato para la producción de enzimas es el desecho de
crisantemo; Los extractos obtenidos tenían una mayor actividad enzimática que los extractos de
los residuos de Rosa.

INTRODUCCIÓN
Las actividades forestales y agrícolas como la producción de papel, madera y muchas otras
agroindustrias generan grandes cantidades de residuos. Estos residuos se consideran un problema
de contaminación ambiental. Un alto porcentaje de estos residuos se queman
indiscriminadamente, generando gases de efecto invernadero, y su descomposición al aire libre
genera lixiviación en los cuerpos de agua y promueve la proliferación de plagas (Asocolflores
2002).

La lignocelulosa es el principal componente estructural de las plantas leñosas y no leñosas y


representa una importante fuente de materia orgánica renovable. La lignocelulosa contiene
lignina, hemicelulosa y celulosa, compuestos con propiedades químicas que aumentan el potencial
biotecnológico del sustrato lignocelulósico (Malherbe & Cloete 2002). Para aprovechar el potencial
de la lignocelulosa como materia prima para producir productos de alto valor añadido, siempre es
necesario un proceso de pretratamiento físico, químico o biológico para modificar su estructura
tridimensional. Algunos pretratamientos biológicos han sido estudiados, entre ellos; Degradación
utilizando enzimas producidas por hongos (Stajić et al., 2006), incluyendo la degradación
lignocelulósica con P. ostreatus (Isikhuemhen & Mikiashvilli 2009, Quevedo-Hidalgo 2012,
Membrillo et al., 2008, Bettin et al., 2011, Větrovský et al. , Thakur et al., 2013).

P. ostreatus es un basidiomiceto de pudrición blanca que crece en una variedad de residuos


lignocelulósicos agrícolas y produce un gran número de enzimas extracelulares. Por ejemplo,
Baldrian et al. (2005) informaron la producción de enzimas celulolíticas y hemicelulolíticas endo-
1,4-β-glucanasa, exo-1,4-β-glucanasa, 1,4-β-glucosidasa, endo-1,4-β- xilanasa, 1 , 4-β-xilosidasa,
endo-1,4-β-mananasa y 1,4-β-manosidasa, y enzimas ligninolíticas tales como Mn-peroxidasa y
lacasa, creciendo P. ostreatus en paja de trigo en presencia y ausencia de Cu, Mn, Pb, y Zn.
Elisashvili et al. (2006) estudiaron la producción de celulasa, xilanasa, lacasa y peroxidasa de
manganeso en fermentación sumergida de cáscaras de mandarina y hojas de árboles. Thakur et al.
(2013) informaron la producción de enzimas ligninolíticas utilizando P. ostreatus de paja de trigo
biológicamente y químicamente pretratada y sustratos de tallos de banano.

Un sistema celulolítico fúngico típico comprende múltiples enzimas. Las celulasas son
generalmente mezclas de varias enzimas, principalmente endoglucanasa, exoglucanasa y β-
glucosidasa (Sun & Cheng 2002). Las endoglucanasas hidrolizan internamente las cadenas de
celulosa, las exoglucanasas hidrolizan externamente las unidades de celobiosa de los extremos no
reductores o reductores de las microfibras de celulosa y la 1,4-β-glucosidasa hidroliza los enlaces
que unen moléculas de glucosa (Baldrian & Valášková 2008). Mediante la catalización de la
hidrólisis de alquil- y aril-β-glucósidos, diglucósidos y oligosacáridos, la 1,4-β-glucosidasa juega un
papel considerable en la descomposición de sustratos lignocelulósicos; Hidroliza la celobiosa en
glucosa, evitando así la inhibición del producto final de las exoglucanasas (Huang, 2011).

Las celulasas y otras enzimas con vías enzimáticas similares o complementarias se utilizan en las
industrias de alimentos, cerveza, vino, alimentación animal, textiles, lavandería y papel, así como
en la investigación agrícola (Bhat 2000). La lacasa y la peroxidasa de manganeso son enzimas que
tienen aplicaciones industriales potenciales porque estas enzimas eliminan compuestos fenólicos
oxidados y una variedad de compuestos aromáticos. La conversión de compuestos tóxicos y tintes
textiles presentes en aguas residuales y el blanqueo y eliminación de lignina de fibras de madera y
no maderables son dos ejemplos de aplicaciones industriales de estas enzimas (Lundell et al.,
2010).

La floricultura es una de las principales actividades del sector agropecuario en Colombia, con una
participación del 13% en el comercio mundial de flores, ocupando el segundo lugar después de los
Países Bajos, que tiene una cuota de mercado del 42%. Según Asocolflores (2010), se producen
más de 50 tipos de flores en un área de 7.266 hectáreas en Colombia. Los principales tipos de
flores son Rosa (33%), claveles (12,7%), mini claveles (6,7%), crisantemo y pompones (8%)
(Asocolflores 2010). El sector de la floricultura genera aproximadamente 1,5 m3 / ha / día o entre
0,8 y 1 t / ha / semana de residuos vegetales, dependiendo del tipo de flor y del ciclo de
producción. Aproximadamente 9.591 t / mes de residuos son generados por la producción de
Rosa, mientras que 2.325 t / mes son generados por cultivos de crisantemo. Los residuos son el
resultado de los pasos iniciales de corte, poscosecha y plantación.

En este artículo se evalúa la producción de enzimas a partir de la degradación de residuos de


lignocelulosa de Rosa y Crisantemo utilizando P. ostreatus, considerando el volumen de residuos
de floricultura generados en Colombia y el hecho de que la producción enzimática de residuos de
floricultura no se ha informado previamente. La producción de lacasa, peroxidasa de manganeso,
endoglucanasa, exoglucanasa y β-glucosidasa se evaluó después de un proceso de fermentación
sumergida utilizando residuos de flores y P. ostreatus. Los extractos enzimáticos que contienen
todas las enzimas mencionadas anteriormente se obtuvieron a partir de los dos residuos
evaluados. El proceso utilizando los residuos de Crisantemo produjo los extractos con las
actividades enzimáticas más altas.
MATERIALES Y MÉTODOS
Los Cultivos del Norte (Tocancipá, Colombia) suministraron los restos de Crisantemo y Rosa (tallos
y hojas). Los residuos se analizaron para determinar el contenido de lignina, celulosa y
hemicelulosa utilizando el método de fibra en detergente neutro (FDN) (Van Soest et al., 1991). El
contenido de fósforo, calcio, potasio, zinc, magnesio, cobre y manganeso se evaluó mediante
espectrofotometría de absorción atómica de llama (Thermo Scientific ICE3000) siguiendo el
procedimiento descrito en ASTM D1971-11 Práctica B para la digestión y ASTM D4691-11 para
medir los elementos. El contenido de nitrógeno se determinó mediante el procedimiento descrito
en ASTM D5373-08 (Tabla 1). Antes de la degradación, los residuos se secaron a 104 ° C durante 24
h y se molieron hasta un tamaño de partícula inferior a 1 mm. Todos los reactivos utilizados en
este estudio fueron de calidad analítica. P. ostreatus (HPB / P3) se obtuvieron del Laboratorio de
Biotecnología de la Pontificia Universidad Javeriana (Bogotá, Colombia). Los cultivos de este hongo
se mantuvieron en agar de salvado de trigo a 4ºC.

PRODUCCIÓN DE ENZIMAS DE CHRYSANTHEMUM Y ROSA


Se realizaron dos ensayos para cada residuo, uno con y uno sin adición de inductores (en un total
de cuatro cultivos, cada uno por triplicado) para evaluar la producción de enzima a partir de
crisantemo y Rosa.

El inóculo fúngico se cultivó en un cultivo estático a 30 ± 2ºC en matraces Erlenmeyer de 250 ml


que contenían 50 ml del siguiente (por litro): 50 g de residuos de floricultura, 2 g de extracto de
levadura, 5 g de peptona, 0,075 g de MnSO₄H₂O, 1 g de KH₂PO₄, 0,5 g de MgSO₄7.H₂O, y 175 g de
salvado de trigo. Este medio se inoculó con diez discos fúngicos (5 mm de diámetro) tomados del
borde del micelio cultivado en agar extracto de salvado en placas petri (de 7 días de edad).
Después de siete días, se obtuvo la biomasa micelial y se inoculó (5% de micelio seco basado en el
volumen del sustrato) hasta la etapa de degradación.

La degradación de los residuos de Chrysanthemum y Rosa se realizó en un biorreactor de 1.5 L


(TECFERM, Procesos Biotecnológicos y Medioambientales, Bogotá, Colombia) con una velocidad
de agitación de 240 ± 5 rpm y una tasa de aireación de 2 vvm durante 24 h, con P. ostreatus en
Fermentación sumergida bajo las condiciones óptimas determinadas por Quevedo-Hidalgo et al.
(2012) para reducir los azúcares. Las condiciones óptimas para los restos de Chrysanthemum y
Rosa fueron de 6,3% (p / v) de concentración y pH 5,6 y concentración de 11,8% (p / v) y pH 5,6
(Quevedo-Hidalgo et al., 2012). Para los ensayos sin inductores, las concentraciones de Cu + 2 y
Mn + 2 fueron las mismas que las originalmente presentes en cada residuo. Para los ensayos con
inductores, se añadieron sulfato de cobre y sulfato de manganeso simultáneamente; Cada
concentración era 7,5 mM.

El cultivo se separó de la biomasa de hongos y los componentes insolubles del medio de cultivo
por centrifugación (a 22.000 g durante 15 minutos) a 4ºC, seguido de filtración usando una
membrana Millipore (0,45 μm). El extracto se almacenó a -20ºC y se usó para determinar la
presencia de las siguientes enzimas: lacasa, peroxidasa de manganeso (MnP), endoglucanasa,
exoglucanasa y β-glucosidasa.
Finalmente, debido a que los restos de Chrysanthemum y Rosa contienen Zn + 2 y Cu + 2,
añadimos Zn + 2 o Cu + 2 a concentraciones finales de 20, 40 y 80 ppm para evaluar la actividad de
la lacasa en los extractos. Cada ensayo se realizó por triplicado. Las actividades de lacasa con Zn +
2 o Cu + 2 añadido se compararon con las actividades obtenidas sin la adición de estos metales.

EVALUACIÓN DE LA FRACCIÓN SÓLIDA OBTENIDA DEL PROCESO DE DEGRADACIÓN DE


LOS RESIDUOS DE CRISANTEMO Y ROSA
Debido a que la fracción sólida de los residuos puede contener enzimas adsorbidas, se lavaron 5
veces por centrifugación con agua destilada (a 1.500 g durante 10 minutos a 4ºC). Los sólidos
restantes se resuspendieron con tampón citrato de sodio 50 mM pH 5,0 y se agitaron a 150 rpm
durante dos horas a 4 ° C. El sobrenadante se separó por centrifugación a 10.800 g durante 10 min
a 4 ° C, luego se filtró a través de una membrana Millipore de 0,45 μm y se usó para medir las
actividades enzimáticas. La actividad enzimática de la fracción sólida se relacionó con el extracto
para determinar el porcentaje de adsorción. El proceso se evaluó con y sin la adición de estos
inductores para establecer los efectos del sulfato de manganeso y cobre sobre la actividad
enzimática.

ENSAYOS ENZIMÁTICOS
Todos los ensayos se realizaron por triplicado usando un espectrofotómetro termico Evolution 60
UV / Visible. Se determinó la actividad de la lacasa (EC 1.10.3.2) con el sustrato ABTS (2,2'-azinobis
(ácido 3-etilbenztiazolino-6-sulfónico) (Sigma, St. Louis, MO, EUA) La mezcla de ensayo contenía
100 μl de 0,5 mM ABTS, 100 μL de 60 mM de tampón de acetato sódico (pH 4,5) y 800 μl del
filtrado del cultivo, se llevó a cabo la reacción durante 3 minutos. La oxidación de ABTS se
monitorizó midiendo el aumento de la absorbancia a 436 nm (ξ436 = 29.300 M Una unidad de
actividad de lacasa se definió como 1 μmol de ABTS + formada por minuto (Bourbonnais et al.,
1997, Tinoco et al., 2001).

La actividad de la peroxidasa de manganeso (MnP, EC 1.11.1.13) se determinó mediante la


oxidación de 2.6-dimetoxifenol (2.6-DMP) (Sigma, St. Louis, MO, USA) a 468 nm (ξ468 = 49.600 M -1
cm -1 ), Y la mezcla de reacción contenía 450 μl de sobrenadante de cultivo, 500 μL de 10 mM
2.6-DMP in 100 mM en tampón de acetato sódico (pH 5.0), 50 μL of 0.4 mM de MnSO4 y 30
μL de 22 mM H2O2; Esta reacción se llevó a cabo durante 3 min (Santoyo et al., 2008). Dado que
tanto el MnP como la lacasa pueden oxidar el 2,6-DMP, la actividad de la lacasa se restó usando
datos de los experimentos de control realizados en ausencia de H2O2 y manganeso. Una unidad
de actividad de MnP se definió como 1 μmol de 2,6-DMP oxidado por minuto.

La actividad de endoglucanasa (EC 3.2.1.4) se midió con carboximetilcelulosa (CMC) (baja


viscosidad, Sigma, St. Louis, MO, EE.UU.). La mezcla de reacción contenía 1 ml de sustrato al 2% (p
/ v) en tampón de citrato de sodio 50 mM (pH 5,0), y 1 ml de muestra (Ghose 1987). La mezcla de
reacción se incubó a 40ºC durante 60 minutos; La reacción se detuvo por ebullición de la muestra
durante 5 minutos. La muestra se enfrió entonces durante 5 minutos y se centrifugó a 2.500 g
durante 15 min. La cantidad de azúcares reductores liberados se determinó usando el método de
Somogy-Nelson (Somogy 1952). Se obtuvo una curva estándar usando glucosa. Una unidad de
actividad enzimática se definió como la cantidad de enzima liberando 1 μmol de azúcares
reductores como glucosa por minuto.

La actividad de la exoglucanasa (EC 3.2.1.91) se determinó usando p-nitrofenil-β-D-celobiosido


(PNPC, Sigma, St. Louis, MO, EE.UU.). La mezcla de reacción contenía 160 μl de 5 mM PNPC en
50mM en un tampón de acetato de sodio (pH 5,0) y una muestra de 40 μl. Las mezclas de
reacción se incubaron a 40ºC durante 60 min. La reacción se detuvo añadiendo 100 μl de
carbonato de sodio 0,5 M, y se leyó la absorbancia a 400 nm. La actividad enzimática se calculó
usando una curva estándar de p-nitrofenol. Una unidad de actividad enzimática se definió como la
cantidad de enzima que liberó 1 μmol de p-nitrofenol por minuto (Valášková & Baldrian 2006).

La actividad de β-glucosidasa (EC 3.2.1.21) se determinó usando p-nitrofenil-β-D-glucósido como


sustrato (PNPG, Sigma, St. Louis, MO, EE.UU.) con el mismo método descrito para exoglucanasa
(Valášková & Baldrian 2006).

ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Para establecer diferencias significativas entre los residuos de Chrysanthemum y Rosa como
sustratos y con y sin inductores, se realizó un ANOVA con prueba de Tukey utilizando un intervalo
de confianza del 95% (α = 0,05). Los datos se sometieron a prueba de normalidad (Shapiro-Wilk) y
se sometieron a la prueba de Levene para la homogeneidad en las varianzas del grupo. En todos
los casos, las diferencias de p <0,05 se consideraron estadísticamente significativas. Se utilizó SAS
9.0 para Windows.
RESULTADOS
PRODUCCIÓN DE ENZIMAS DE CHRYSANTHEMUM Y ROSA
De acuerdo con el ANOVA, se observaron diferencias estadísticamente significativas para la
actividad enzimática de la lacasa, exoglucanasa y β-glucosidasa (p <0,0001), y para la
endoglucanasa (p = 0,0007) entre los diferentes cultivos terminados.

Las actividades enzimáticas de los residuos de crisantemo fueron superiores a las de los residuos
de Rosa, excepto para la endoglucanasa (Figura 1). Con respecto a las enzimas implicadas en la
degradación de la lignina, la lacasa y la MnP, la actividad enzimática máxima para ambos residuos
se obtuvo añadiendo inductores. El comportamiento de endoglucanasa y β-glucosidasa fue
diferente y la actividad enzimática máxima para ambos residuos se obtuvo sin inductores (Figura
1). La adición de inductores no aumentó la actividad enzimática de la exoglucanasa.

Las actividades enzimáticas para la degradación de los residuos de crisantemo fueron 4,693.4 U / L
y 673,8 U / L para la lacasa y para MnP, respectivamente (Tabla 2). La actividad de la lacasa fue 4,8
veces mayor cuando se añadieron los inductores Cu + 2 y Mn + 2, mientras que la actividad MnP
fue 62% mayor. Por otro lado, el comportamiento de endoglucanasa y β-glucosidasa fue diferente,
y la presencia de inductores disminuyó su actividad. La adición de inductores redujo la actividad
enzimática alrededor del 34% y 14%, respectivamente. Cuando se añadieron inductores, la
actividad de la exoglucanasa disminuyó a menos del 6%.

En cuanto a las enzimas implicadas en la degradación de la lignina a partir de residuos de Rosa, la


actividad enzimática máxima fue de 2.640 U / L para lacasa y 439.2 U / L para MnP cuando se
usaron inductores (Tabla 3). Cuando se añadieron Cu + 2 y Mn + 2, las actividades de estas enzimas
aumentaron seis veces y 36%, respectivamente. Como se ha descrito para los residuos de
crisantemo, la adición de inductores redujo la actividad enzimática de la endoglucanasa y β-
glucosidasa. Sus actividades se redujeron alrededor de 14% y 28%, respectivamente. A diferencia
del comportamiento observado con los residuos de crisantemo, la actividad de exoglucanasa
aumentó 7% cuando se añadieron inductores.

La adición de Cu + 2 aumentó la actividad de la lacasa en todos los casos (Tabla 4), mientras que la
adición de Zn + 2 la disminuyó en los extractos de Chrysanthemum y Rosa (Tabla 4). La reducción
máxima de actividad se encontró en el extracto de Rosa.

EVALUACIÓN DE LA FRACCIÓN SÓLIDA OBTENIDA DEL PROCESO DE DEGRADACIÓN DE


LOS RESIDUOS DE CRISANTEMO Y ROSA
Se evaluó la presencia de enzimas en la fracción sólida para comprobar si estaban adsorbidos en el
residuo. Para ambos residuos, en todos los casos, la actividad enzimática fue mayor en la fracción
líquida que en el sólido (Tabla 5). El porcentaje de enzimas de lacasa adsorbida fue bajo para
ambos residuos. Aproximadamente el 30% de la endoglucanasa fue adsorbida para ambos
residuos.

DISCUSIÓN
PRODUCCIÓN DE ENZIMAS DE CHRYSANTHEMUM Y ROSA
La actividad de la lacasa obtenida en este estudio fue mayor que la actividad reportada por otros
investigadores utilizando P. ostreatus y midiendo la actividad enzimática con ABTS. Por ejemplo,
Isikhuemhen y Mikiashvilli (2009) obtuvieron 164,6 U / L de lacasa de paja de trigo mezclada con
residuos sólidos obtenidos de la digestión anaerobia de la hojarasca a partir de la producción
comercial de pollos de engorde. Otro ejemplo es el estudio desarrollado por Větrovský et al.
(2013); Estos autores informaron 16,7 mU / ml cuando la lacasa se produjo a partir de un medio
CLN sintético con celulosa como fuente de carbono y alta relación C / N típica de la madera. La
mayor actividad de lacasa obtenida por estos autores fue de 206,8 mU / ml utilizando Fomes
fomentarius.

Como se mencionó anteriormente, la adición de inductores aumentó la actividad de la lacasa 4,8


veces con crisantemo y 6 veces con Rosa. Otros autores han informado sobre el efecto de los
inductores, el cobre y el manganeso, en la mejora de la actividad de la lacasa dependiendo del
sustrato, el organismo, el cultivo y las concentraciones de estos metales (Giardina et al., 2000,
Stajić et al. 2006, Lu & Ding, 2010). Por ejemplo, Baldrian et al. (2005) informaron que la actividad
media de la lacasa aumenta un 79% con la adición de Cu en cultivos de P. ostreatus sobre paja de
trigo. Stajić et al. (2006) informaron picos de actividad de lacasa, crecidos en cáscaras de
mandarina seca, que dependían de la concentración de Cu + 2, el tiempo de cultivo y la cepa P.
ostreatus.

Según la caracterización de los residuos (Tabla 1), los contenidos de cobre en los residuos de Rosa
y Crisantemo fueron de 8,99 ppm y 24,6 ppm, respectivamente. Esta diferencia explica por qué la
actividad de la lacasa fue mayor cuando se usaron restos de crisantemo como sustrato. El cobre
induce la actividad de la lacasa, como se informó en cultivos de Trametes versicolor (Collins 1996),
P. ostreatus (Palmieri 2000), Trametes pubescens (Galhaup y Haltrich 2001) y Botryosphaeria sp.
(Dekker & Barbosa 2001), y P. ostreatus (Tinoco et al., 2011). Sin embargo, algunos estudios han
demostrado que las altas concentraciones de cobre pueden ser inhibitorias (Murugesan et al.,
2009).

El contenido de lignina es otro factor que puede influir en la diferencia encontrada en la actividad
de lacasa de estos residuos. El contenido de lignina fue 17,5% para los residuos de crisantemo y
14,8% para los residuos de Rosa (Tabla 1). Tinoco et al. (2011) observaron que la adición de lignina
al medio de cultivo tuvo una fuerte influencia positiva en la producción de lacasa por P. ostreatus.
Cuando se añadió cobre simultáneamente, la actividad de esa enzima fue mayor que la suma de
los valores determinados usando cada inductor por separado; Esto muestra un efecto sinérgico
sobre la producción de la enzima (Tinoco et al., 2011). Los contenidos de lignina y cobre en los
residuos de crisantemo son mayores que los de los residuos de Rosa (Tabla 1), explicando por qué
las actividades de lacasa fueron mayores en el residuo anterior.

La actividad de MnP aumentó 62% y 36% con la adición de inductores para los residuos de
Crisantemo y Rosa, respectivamente. La adición de Mn + 2 puede tener efectos positivos o
negativos sobre la actividad MnP; Como resultado, este metal debe ser evaluado para cada
proceso. Por ejemplo, Giardina et al. (2000) produjeron MnP utilizando P. ostreatus en un cultivo
sólido de serrín de álamo; Informaron un aumento en la actividad de MnP como consecuencia de
la adición de Mn + 2 al cultivo. Por otro lado, Baldrian et al. (2005), informó que la actividad MnP
se vio afectada negativamente por la presencia de Mn + 2, Cu + 2 y Pb + 2 y que la actividad MnP
fue menor en presencia de Mn + 2 que en ausencia de este metal cuando P Se cultivó ostreatus
sobre lignocelulosa.

Con respecto a la evaluación de las enzimas implicadas en la degradación de la celulosa, los


resultados muestran que el complejo enzimático necesario para hidrolizar celulosa estaba
presente en el extracto obtenido. De acuerdo con los resultados de este trabajo, la actividad de β-
glucosidasa subraya la producción de los residuos de Crisantemo y Rosa, con o sin inductores, ya
que las actividades son superiores a los valores reportados por otros estudios. Por ejemplo,
Větrovský et al. (2013) obtuvo una actividad de 3,88 U / ml utilizando un medio sintético mientras
que el valor obtenido en nuestro trabajo fue de 9,513 U / L utilizando residuos de Crisantemo sin
inductores. Las actividades de endo- y exo-glucanasas fueron diferentes con y sin inductores, por
lo que podemos afirmar que el cobre y el manganeso tienen efecto sobre la actividad de estas
enzimas, aunque esto es menos importante que el efecto de estos inductores sobre la lacasa y
MnP.

La actividad de β-glucosidasa fue 14% menor cuando el proceso se realizó con la adición de cobre
y manganeso. Esa reducción puede explicarse porque el cobre es un inhibidor según lo informado
por Lin et al. (2010). Estos autores encontraron que la presencia de Cu + 2 (0,1 mM) inhibía la
actividad de β-glucosidasa, y esta actividad no se incrementó mediante la adición de Mn + 2 (0,1
mM).

Las enzimas que exhibieron actividad después de la degradación de los residuos de Crisantemo y
Rosa tienen varios usos industriales. Por ejemplo, la lacasa se utiliza en procesos industriales tales
como blanqueo de manchas y la degradación de hidrocarburos aromáticos policíclicos; La β-
glucosidasa también desempeña un papel importante en la degradación de los sustratos
lignocelulósicos. La adición de β-glucosidasa acelera la producción de azúcar, que es el producto
final de la degradación de sustratos lignocelulósicos. Esta enzima cataliza la hidrólisis de celobiosa,
evitando la inhibición de la endoglucanasa y la síntesis de exoglucanasa (Kumar et al., 2008). Por lo
tanto, el establecimiento de las condiciones de producción para obtener β-glucosidasa con alta
actividad (9,513 U / L) y productividad (396,4 U / L / h) es una contribución esencial al estudio de
la hidrólisis de la celulosa.

Debido a que los efectos del cobre y el zinc sobre la actividad de la lacasa pueden ser positivos o
negativos, llevamos a cabo experimentos de adición de estos metales a reacciones
laccasecatalizadas. Los resultados mostraron que la actividad de la lacasa aumentó con la adición
de Cu + 2 y disminuyó con la adición de Zn + 2. El efecto del zinc puede explicarse por los
resultados de Murugesan et al. (2009). Sus resultados indicaron que la actividad de la lacasa
aumentó cuando los iones Ca + 2, Cu + 2, Co + 2 y Zn + 2 se añadieron al medio de cultivo a bajas
concentraciones (hasta 1 mM) y disminuyeron si las concentraciones de Cu + 2 y Zn + 2 se
aumentaron a 5 mM. Entonces es posible que la concentración inicial de Zn + 2 en los residuos
evaluados en este trabajo pueda ser superior a la concentración inhibidora límite y que la adición
de zinc reduzca la actividad de la lacasa. Aunque la concentración límite inhibitoria no se
determinó en este trabajo, la concentración inicial de Zn + 2 fue mayor en Rosa que en Crisantemo
(Tabla 1). El anterior explica por qué la reducción de la actividad de la lacasa es mayor en el
residuo anterior con la misma concentración final de Zn + 2 en la reacción enzimática.

EVALUACIÓN DE LA FRACCIÓN SÓLIDA OBTENIDA DEL PROCESO DE DEGRADACIÓN DE


LOS RESIDUOS DE CRISANTEMO Y ROSA
Los porcentajes de adsorción para exoglucanasa y MnP dependen en gran medida del tipo de
residuo. En general, más enzimas fueron adsorbidas en Rosa que en los residuos de Crisantemo
(Tabla 5); Otros investigadores observaron un comportamiento similar. Por ejemplo, Valášková y
Baldrian (2006) informaron la presencia de lacasa, MnP, exoglucanasa y β-glucosidasa en la
fracción sólida de un cultivo líquido de P. ostreatus en un medio sintético; Los porcentajes de
adsorción de estas enzimas fueron 38,8%, 5,4%, 87% y 65%, respectivamente. Como en este
estudio, el porcentaje de adsorción de exoglucanasa fue el más alto. Este comportamiento se
puede explicar por la adsorción irreversible de las celulasas por el residuo, específicamente por la
celulosa, y se recomienda la adición de tensioactivos. Los tensioactivos cambian la tensión
superficial entre las fases líquida y sólida y minimizan la unión de las celulasas a la celulosa (Sun &
Cheng 2002).

CONCLUSIÓN
En este estudio, las ligninasas y las celulasas se produjeron a partir de residuos de crisantemo y
Rosa utilizando P. ostreautus en un cultivo sumergido. Bajo las condiciones evaluadas aquí, el
mejor sustrato fue el residuo de Crisantemo; El extracto obtenido tenía mayor actividad
enzimática que los extractos del residuo Rosa. Las actividades enzimáticas más altas para ambos
residuos se obtuvieron para la lacasa y β-glucosidasa y la más baja para la endoglucanasa. La
actividad de la β-glucosidasa fue mayor sin la presencia de inductores, mientras que la actividad
de la lacasa fue potenciada por la presencia de inductores.