pengantar

Akuakultur yang melibatkan peternakan ikan dan kerang ikan sirip komersial yang penting berkontribusi
terhadap produksi protein ikan yang murah dan bergizi (Uddin et al., 2015). Dalam budidaya, berbagai
antimikroba digunakan untuk mengendalikan penyakit (Rodgers dan Furones, 2009). Intensifikasi praktik
akuakultur telah menyebabkan perkembangan berbagai penyakit yang disebabkan karena patogen dan
masalah kualitas air (Bondad et al., 2005). Penggunaan antibiotik untuk pengendalian penyakit bakteri
dalam budidaya telah terbukti tidak berkelanjutan dan tidak efektif karena perkembangan resistensi
antibiotik pada patogen (Cabello, 2006) yang dapat menyebar ke mikroba lain melalui transfer gen
horizontal melalui plasmid dan elemen genetik lainnya dari ikan budidaya dan manusia (Moriarty, 1996;
Holmstrom et al., 2003). Probiotik digunakan dalam budidaya untuk degradasi bahan organik yang
mengurangi pembentukan lumpur dan lendir, menghasilkan kualitas air yang meningkat dan
mengurangi kejadian penyakit (Rajinikanth et al., 2010) dan untuk meningkatkan kesehatan usus pada
ikan (Ige, 2013) . Probiotik yang ideal harus efektif pada berbagai suhu ekstrem dan variasi salinitas
(Fuller, 1989) dan menekan pertumbuhan patogen (Parker, 1974). Meskipun efek menguntungkan dari
probiotik telah didokumentasikan oleh berbagai peneliti, penelitian terbaru menunjukkan adanya dan
ekspresi gen resisten antibiotik dalam probiotik yang digunakan dalam makanan dan akuakultur
(Gryczan et al., 1984; Hummel et al., 2007 dan Wong et al., 2015). Karena probiotik sedang banyak
digunakan dalam operasi akuakultur, pengetahuan tentang seberapa efektif mereka mengendalikan
bakteri patogen, kepekaan mereka terhadap antibiotik yang digunakan dalam pengobatan penyakit
bakteri dalam budidaya dan keberadaan gen resisten antibiotik sangat penting. Oleh karena itu,
penelitian ini dilakukan dengan tujuan untuk mempelajari efisiensi penghambatan bakteri, sensitivitas
antibiotik dan keberadaan gen resisten antibiotik dalam isolat bakteri dari produk probiotik komersial
yang dipilih.

Bahan dan metode

Strain bakteri dan kondisi kultur
Sampel produk probiotik dikumpulkan dari peternakan ikan dan udang di Tamil Nadu dan Andhra
Pradesh, India. Lima produk probiotik yang berbeda dipilih secara acak dan strain bakteri diisolasi dari
produk setelah metode penyebar tersebar pada tryptic soya agar (TSA) dengan dan tanpa garam (1%).
Koloni individu sub-kultur, dimurnikan dan lima isolat dipilih secara acak, satu isolat perwakilan dari
setiap produk probiotik, dikodekan sebagai PB-1, PB-2, PB-3, PB-4 dan PB-5 dan digunakan untuk
penelitian . Isolat bakteri patogen yang dikonfirmasi yaitu, Aeromonas hydrophila, Streptococcus sp.,
Edwardsiella tarda, Flavobacterium columnare, Vibrio alginolyticus dari koleksi budaya laboratorium
rujukan Negara untuk kesehatan hewan akuatik, Universitas Perikanan Tamilnadu atau ATCC digunakan
untuk mempelajari aktivitas penghambatan bakteri dari isolat probiotik. Budaya muda dari bakteri
patogen yang tumbuh dalam kaldu kedelai tryptic (TSB) dengan atau tanpa NaCl atau Brain heart
infusion (BHI) broth digunakan. Isolat probiotik secara serial dilarutkan, disebar berlapis pada TSA dan
suspensi pra-tumbuh bakteri patogen (10 μl) terlihat pada lempeng, dibiarkan menyerap dan diinkubasi
pada 37o C selama 24 hingga 48 jam dan pengamatan dicatat.
Antibiogram dari isolat probiotik
Sensitivitas isolat bakteri probiotik (PB-1, PB-2, PB-3, PB-4 dan PB-5) ke oxytetracycline (OTC) dinilai
dengan teknik difusi cakram agar pada Mueller Hinton agar (Bouer et al., 1966 ). Pelat agar-agar
diinkubasi pada 35 ± 2oC selama 24 jam dan diameter zona inhibisi (mm) diukur. Kepekaan terhadap
oxytetracycline dinilai berdasarkan grafik interpretasi ukuran zona (CLSI, 2012).

PCR mendeteksi gen yang resisten

Kehadiran gen resisten antibiotik dalam probiotik isolat PB-1, PB-2, PB-3, PB-4 dan PB-5 disaring oleh
PCR. Gen yang ditargetkan termasuk protein tetrasiklin eflux yaitu, tetan dan tetl, protein perlindungan
ribosom yaitu, tetm dan teto. DNA diekstraksi menggunakan kit ekstraksi DNA komersial (Qiagen,
Jerman) dari isolat bakteri probiotik. Penyaringan PCR untuk tetK, tetL, tetM dan tetO dilakukan
mengikuti protokol yang diterbitkan (Tabel 1). Produk PCR dianalisis pada gel agarose 1,5% yang
mengandung 0,5 μg / mL ethidium bromide dalam buffer 1x Tris-borat-EDTA (TBE) dan divisualisasikan
di bawah transilluminator UV.

Hasil dan Diskusi

Penilaian aktivitas penghambatan patogen bakteri dari isolat probiotik PB-1, PB-2, PB-3, PB-4 dan PB-5
menunjukkan bahwa isolat PB-3 dan PB-5 memiliki aktivitas penghambatan tertinggi terhadap F.
columnare dan V. alginolyticus. F. columnare adalah yang paling dihambat oleh semua lima isolat
probiotik. Sedangkan, E. tarda adalah yang paling tahan atau paling tidak dihambat oleh isolat probiotik
(Gambar 1 dan Tabel 2). Antibiogram untuk isolat probiotik terhadap oksitetrasiklin menunjukkan
bahwa isolat PB-1 sendiri bersifat sensitif intermediet dan isolat-isolat lain PB-2, PB-3, PB-4 dan PB-5
resisten terhadap oxytetracycline. Semua lima isolat bakteri probiotik diamati untuk membawa gen
resisten antibiotik pengkodean protein tetrasiklin eflux yaitu, tetK dan tetL. Namun, gen tetm dan teto,
yang terlibat dalam perlindungan ribosom bakteri tidak ada dalam probiotik isolat bakteri (Gbr. 2).
Dalam budidaya, penggunaan probiotik memberikan efek menguntungkan pada spesies yang dikultur
dengan mengurangi stres yang disebabkan karena berbagai faktor biotik dan abiotik dalam kondisi
lingkungan yang buruk, nutrisi yang tidak seimbang (Kautsky et al., 2000). Dalam beberapa dekade
terakhir, pencegahan dan pengendalian penyakit hewan telah difokuskan pada penggunaan bahan kimia
dan antibiotik, yang menghasilkan risiko signifikan terhadap kesehatan masyarakat dengan
mempromosikan pemilihan, propagasi, dan persistensi strain yang resisten terhadap bakteri (FAO, 2006
dan WHO, 2012) . Probiotik dianggap sebagai alternatif yang aman dan layak untuk manajemen
kesehatan untuk peningkatan produksi dalam budidaya (Martinez et al., 2012). Penelitian terbaru
menunjukkan adanya gen yang memberikan resistensi antibiotik sehingga menimbulkan bahaya
penularan gen tersebut ke bakteri patogen melalui transfer gen horizontal (Imperial et al., 2016). Gen
tahan tetrasiklin yaitu, tetK, tetL tet M, tetO yang terkait dengan resistensi tetrasiklin telah dilaporkan
dalam isolat bakteri. The tet K dan tetL gen kode untuk penghabisan protein, yang mencegah tetrasiklin
dari terakumulasi dalam sel tetm dan kode teto untuk protein perlindungan ribosom, yang mengurangi
afinitas tetrasiklin ke ribosom (Ullah et al., 2012). Kehadiran gen tahan tetrasiklin (Uddin et al., 2015)
dan determinan genetik yang memberikan resistensi terhadap aminoglikosida, eritromisin, tetrasiklin
tetK, tetL dan tetM, dan lincosamides lnu (A) dan lnu (B) telah didokumentasikan dalam probiotik
bakteri isolat (Munoz-Atienza et al., 2013). Aktivitas penghambatan bakteri terhadap bakteri patogen
yang diamati dalam penelitian menunjukkan bahwa probiotik dapat digunakan untuk mengendalikan
penyakit bakteri pada ikan. Berbagai mekanisme yaitu, sekresi zat antimikroba, kepatuhan kompetitif
terhadap mukosa dan epitel telah didokumentasikan terkait dengan efek antagonis probiotik pada
mikroorganisme (Collado et al., 2010).
Antibiotik secara luas dan intensif digunakan dalam akuakultur untuk pengendalian dan pencegahan
penyakit mikroba, namun, hasil penggunaan sembarangan dalam prevalensi dan persistensi bakteri
resisten antibiotik dan penentu resistensi mereka di lingkungan (Dang et al., 2007). Peraturan yang tepat
tentang penggunaan probiotik dalam budidaya akan menghindari potensi risiko transfer gen resisten
antibiotik ke mikroba lain dalam sistem budaya dan kemudian ke mikroflora udang lain yang memiliki
potensi transfer risiko kepada konsumen.

Probiotik digunakan dalam budidaya untuk meningkatkan kualitas air dari sistem produksi dan untuk
meningkatkan kesehatan usus dan kekebalan pada ikan budidaya. Hasil penelitian ini menunjukkan
adanya gen resisten antibiotik seperti tetK dan tetL dalam probiotik komersial yang digunakan dalam
budidaya yang menimbulkan bahaya transfer gen resisten antibiotik terhadap mikroflora asli di
lingkungan akuatik. Oleh karena itu, disimpulkan bahwa penting untuk mengajukan peraturan yang
sesuai pada penggunaan probiotik dalam akuakultur untuk menghindari risiko penyebaran resistensi
antibiotik dalam sistem eko perairan.